高食餌性銅摂取は腸内細菌叢に摂動をもたらし、宿主卵巣卵胞発育に影響を与える
生態毒性学と環境安全学
255巻、2023年4月15日、114810号
高食餌性銅摂取は腸内細菌叢に摂動をもたらし、宿主卵巣卵胞発育に影響を与える
著者リンク オーバーレイパネルQi Wang a b 1, Yan Sun c d 1, Aili Zhao a 1, Xuefen Cai c, Aili Yu c, Qian Xu a, Weili Liu a, Nan Zhang a, Siyi Wu a, Yiqin Chen a, Wenxiang Wang a d
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https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2023.114810Get 権利と内容
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ハイライト
食事性Cuの摂取量が多いと、PCOSのリスクが高まる。
PCOSの患者さんは、腸内細菌叢のバランスが崩れています。
腸内細菌叢は、食事性Cu摂取とPCOSの中間的な役割を担っている。
銅の暴露は、腸内細菌叢の乱れや卵胞の異常な発達を誘発する。
腸内細菌叢はCu曝露と卵胞発育の間に仲介的役割を果たす。
概要
生殖内分泌系や多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）の発症に、腸内細菌が重要な役割を果たしていることを示す証拠が増えてきています。しかし、これらの腸内細菌叢の変化に環境因子が関与しているかどうかは、ほとんど研究されていません。本研究では、Cuによって誘発される卵巣卵胞発育異常に対する腸内細菌叢のアンバランスの重要な役割を探ることを目的としました。PCOS患者181名と対照者181名を対象とした1：1マッチドケースコントロール研究を、傾向スコアマッチングプロトコルを用いて実施しました。食事によるCu摂取に関する情報は、対面式の食事摂取インタビューから得た。腸内細菌叢の変化は、ハイスループット16 S rDNAシーケンスによって検出された。その結果、食事性Cu摂取量はPCOSのリスクと正の相関があり、リスク閾値は約1.992mg/dであった。食事性Cu摂取量が1.992mg/dより低い人と比較して、食事性Cu摂取量が多い人はPCOSのリスクが1.813倍上昇した（OR=1.813、95% CI: 1.150-2.857）．PCOS患者は対照群と比較してバクテロイデスの相対量が少なく（P = 0.003）、バクテロイデスは食事性Cu曝露とPCOSの間に部分的な仲介役を果たした（Pindirect effect=0.026, 95% CI: 0.002-0.072）．さらに、食事による銅曝露の動物モデルでは、銅が腸内細菌叢の乱れを誘発し、血清中のLPS、MDA、IL-6のレベルを上昇させ、宿主の卵巣ステロイド形成を変化させて卵巣卵胞の発達に影響することが示された。ブドウ球菌は、銅曝露とCYP17A1との間に部分的な仲介役を果たした（Pg_Staphylococcus=0.083、95% CI: 0.001-0.228）。全体として、本研究は、高濃度の食事性銅に長期間さらされると、腸内細菌叢の構成に影響を与え、炎症と酸化ストレスを引き起こし、さらにホルモンシグナルを阻害し、最終的に卵巣卵胞の発育に影響を与えることを示しています。
グラフィカルな要旨
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食事性Cu摂取量はPCOSのリスクと正の相関があった。PCOS患者は腸内細菌叢のバランスが崩れており、バクテロイデスは食事性Cu曝露とPCOSの間に部分的な媒介的役割を担っていた。食事によるCu曝露の動物モデルにより、高食餌性Cuへの長期曝露が、腸内細菌叢の組成に影響を与え、炎症と酸化ストレスを発生させ、さらにホルモンシグナルを阻害し、最終的に卵胞発育に影響を与えることがさらに確認されました。
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略語の説明
Cu
銅
ピーシーオーエス
多嚢胞性卵巣症候群
LPSのこと：
リポポリサッカライド（Lipopolysaccharides
MDAのことです：
マロンジアルデヒド
アイエルシックス
インターロイキン6
TBAのことです：
チオバルビツール酸
エライザ
エーエルアイエムエスアッセイ
T:
テストステロン
E2
エストラジオール
ピーアールエル
プロラクチン
RCS
制限付き立方体スプライン
PSM
傾向スコアマッチング
HE
ヘマトキシリン・エオシン
SMDのこと：
標準化平均差
アート
生殖補助医療技術
使用済み燃料プール
特定病原体不使用
DRIのことです：
食事摂取基準量
CYP11A1
P450 コレステロール側鎖切断酵素
CYP19A1です：
アロマターゼ
スター
ステロイドジェニック急性制御タンパク質
HSD3β1
3β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
CYP17A1
P450 ステロイド17αモノオキシゲナーゼ
OTUs（オーツー）：
運用分類学的単位
LH
黄体形成ホルモン
エーエムエイチ
抗ミュラーレリアンホルモン
TC
総コレステロール
ティージー
トリグリセリド
FBGのことです：
空腹時血糖値
エフエスエッチ
エフエスエッチ
WHR
ウェスト・ツー・ヒップ・レシオ
HDLc.
高比重リポ蛋白質コレステロール
LDLc
あくだまコレステロール
ホーマアイアール
インスリン抵抗性のホメオスタシスモデル評価
AFCです：
アントラルフォリクルカウンティング
パルシステム
身体活動レベル
レフセ
線形判別分析 効果量
プコア
原理座標解析
LSD
最小有意差
エルディーエー
線形判別分析
分散分析
分散分析
キーワード
銅
多嚢胞性卵巣症候群
バクテロイデス
ブドウ球菌
16S rDNA配列決定
はじめに
多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）は、生殖年齢にある女性の約6％～20％にみられる有力な内分泌・代謝疾患であり、女性不妊症の主な原因の一つである（Siddiqui et al.、2022年）。近年、PCOSの病因における遺伝学および環境因子の役割が研究されているが（Diamanti-Kandarakisら、2006、Johamら、2022、Yiqinら、2022）、PCOSの正確な基礎的病因は依然として不明である。
Cuはすべての生物に必須の微量金属であり、広範な重要な機能を駆動するさまざまな主要代謝酵素の補酵素として機能する。しかし、Cuの蓄積は細胞毒性を引き起こし、細胞死に至ることさえあり、ウィルソン病、神経変性疾患、癌などのさまざまな病的状態と関連している（Chenら、2022a, Geら、2022b, Tsvetkovら, 2022）。環境中の銅（Cu）汚染は、人間の活動や文明によってありふれたものとなり、最近この問題に対する社会的関心が高まっています（Chen et al., 2020, Zhao et al.） これまでの研究により、生物におけるバイオマグニフィケーション効果によるCuの過剰蓄積は、生殖系を含む一連の健康問題につながることが示されている（Chen et al., 2021, Gitari et al., 2018, Haverroth et al., 2015, Shi et al., 2021）。長期的なCu曝露は、イエローキャットフィッシュPelteobagrus fulvidracoにおいてステロイド生成関連遺伝子発現異常を誘発する可能性があります（Zhang et al.、2016）。さらに、in vitroの研究では、過剰なCuが酸化ストレスを増加させることにより、ブタの卵子の質を低下させることが示されました（Chen et al., 2021）。先行研究では、PCOS患者における血清Cu濃度の上昇が示されており（Celik et al., 2013）、PCOS患者の卵胞液におけるCu濃度の上昇も、我々の先行研究（Sun et al., 2019b）で確認された。これらの結果は、Cu曝露が卵巣卵胞発育に影響を与え、PCOSの開始と発症に重要な役割を果たす可能性を示しています。しかし、その基礎となるメカニズムについては、さらに検討する必要があります。
職業的な曝露よりもむしろ、食物摂取が一般集団における重金属の主な供給源である。現地のPCOS患者は魚介類を多く摂取しており、これは我々の以前の研究（Wang et al., 2022）においてPCOSリスクと関連していた。また、最近の研究では、魚介類の摂取量と卵胞液中の重金属のレベルとの間に相関関係があることが示されています（Butt et al.、2020）。したがって、食事性重金属がPCOSリスクと関連する可能性があると考えるのは妥当である。また、PCOS患者の卵胞液に含まれる同濃度のCuで処理すると顆粒膜細胞がステロイド生成に大きな変化を起こすが、我々が以前に行ったin vitroの研究では同様の臨床表現型（高アンドロゲン血症など）は誘導されなかった（Sun et al.、2019b）。したがって、卵巣卵胞発育に対する銅の直接的な効果（Yiqinら、2022）を除いて、Cuは他の生化学的経路を通じて間接的にPCOS卵巣卵胞発育に影響を与える可能性も高いと思われ、さらなる探求が必要です。
腸内細菌が生殖内分泌系およびPCOSの発症に重要な役割を果たすことを示唆する証拠が増えている（Giampaolinoら、2021、Grahamら、2021、Qiら、2021、Qiら、2019、Torresら、2019）。最近の研究では、腸内細菌叢の障害は、循環LPSレベルを上昇させることで低グレードの炎症を導入し、卵巣テカ細胞の性ステロイド合成と分泌をさらに刺激することが分かっています（Foxら、2019、TremellenとPearce、2012）。さらに、腸内細菌叢は、性ホルモンとの相互作用により生殖系に影響を与える可能性があります（Qi et al., 2021）。これらの最近の研究では、PCOS患者における腸内細菌叢の存在量の変化に焦点が当てられていますが、我々の知る限り、この腸内細菌叢の変化に環境因子が関与しているかどうかは検討されていません。一方、環境要因が腸内細菌叢の変化を通じてPCOSの卵巣卵胞発育に影響を与えるかどうかは、まだ報告されていない。最近の研究では、重金属が腸内細菌叢の組成に影響を与えることが示されています（Brila et al., 2021, Li et al., 2021, Richardson et al., 2018, Shao and Zhu, 2020）。同様に、高用量のCuは、動物実験において、腸内細菌叢の存在量を変化させるだけでなく、腸管透過性を高めることが判明した（Ma et al.、2022）。したがって、食事性Cu曝露が腸内細菌叢を介してPCOSの卵巣卵胞発育に影響を与える可能性があると推測することは妥当であり、さらなる研究が必要である。
以上の観察に基づき、我々は、食事性CuがPCOSのリスクと関連し、このプロセスにおいて腸内微生物が一定の役割を果たすと仮定する。そこで、本研究では、PCOS患者における腸内細菌叢の分布をさらに理解し、食事性Cu曝露と腸内細菌叢の分布との間に考えられる関係を分析するために、傾向スコアマッチ（PSM）ケースコントロール研究を通じて、食事性CuのPCOSへの影響の可能性を探り、そのリスク閾値を評価しました。さらに、Cu曝露が腸内細菌叢および卵巣卵胞発育に及ぼす影響を探るため、動物実験を実施しました。この結果は、PCOSにおけるCuによる卵巣卵胞発育異常の起こりうるメカニズムを明らかにし、今後、食事全体の観点から対策を講じるための重要な手がかりとなる。材料と方法
2.1. 対象者
2020年7月から2021年6月にかけて、福建省の地元母子保健病院で生殖補助医療（ART）を受けた地元の被験者を対象に、食事調査を実施した。ロッテルダム基準（Broekmans et al., 2006）に従ってPCOSと診断された患者を症例群に登録した。以下の基準を満たした患者は除外した： (1) PCOSに関連または影響を及ぼす他の疾患（高プロラクチン血症、先天性副腎過形成、糖尿病、甲状腺疾患、クッシング病、癌など）、 (2) 肝・腎機能障害、 (3) 重金属の曝露歴（職業または環境汚染曝露）、 (4) 態度不良や協力拒否。配偶者不妊のためART治療を受けた健康な女性が対照群となった。研究への参加を拒否した参加者、重金属への曝露歴がある参加者、態度が悪い参加者は、対照群から除外した。最終的に、181人の症例と292人の対照を含む、合計473人の被験者を得ることができた。研究プロトコルは、福建医科大学の施設審査委員会（承認番号：2019021、承認日：2019年3月8日）によって承認された。含まれる各対象者は、インフォームドコンセントフォームに署名した。
年齢とウエスト・ヒップ比（WHR）が毛包の発達に大きな影響を与えることを考慮し、均質な症例と対照を得るために、傾向スコアマッチング（PSM）を用いて選択バイアスを最小化した。PSMの結果、各グループに181人の参加者が含まれた。362人の参加者は全員、福建省に住んでいた。参加者の地理的な分布は以下の通りであった： 福州市227人、普天市43人、寧徳市22人、常州市20人、厦門市20人、南平市13人、泉州市11人、三明市6人。PSM後の交絡因子のバランスチェックには、標準化平均差（SMD）を用いた（Austin, 2009）。SMDが10％以下であれば、交絡因子は群間で比較可能であると判断した。本研究では、年齢とWHRのSMDはそれぞれ9.24％と8.63％であった。参加者登録の流れを図S1に示す。
2.2. 参加者の特徴および食事性Cu摂取量の収集
この調査には、人口統計学的特性、身体活動レベル（PAL）、および食事に関する質問が含まれています。ウエストとヒップの周囲径は、人体計測によって測定された。食事欄の質問は、我々の先行研究（Wang et al., 2022）で使用した検証済みの食物摂取頻度質問票から得たものである。食事摂取量が得られた後、中国食品成分表（国立栄養・健康研究所、2019年）を活用して、食事データ中のCuの個人一日摂取量を算出した。計算式は以下の通り：食事性銅摂取量＝ΣCi×FiCi＝特定の食品に含まれる食品銅の濃度Fi＝その食品の1日当たりの摂取量（平均値）
2.3. 動物の治療法
体重64.4±12.4gの21日齢の雌Wistarラット計30匹をBeijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co, Ltd.から入手した。動物は病原体のない動物施設に収容され、12：12時間の明暗サイクルの下で温度と湿度が一定な環境に置かれ、標準的な餌と水を自由に利用できた。すべての動物処置は、実験動物のケアと使用のためのガイドに従って行われ、函南医科大学動物倫理委員会（承認番号：2020372）によって承認された。
ラットは、実験の7日前に実験室の条件に適応させた。適応期間中は、各群の腸内細菌叢を均質化するために、毎日すべてのケージのパディングと糞を各ケージに均等に分配した（Perez et al.、2021）。適応終了後、パディングと糞の混合を停止し、Cu曝露介入を開始した。ラットを体重に応じて対照群、低用量Cu群、高用量Cu群（すなわち、0、1、4 mg/kg BW Cu2+群）にランダムに分け、各群10匹とした（n = 10）。Cuは1日1回胃内投与し、49日（性成熟期）後に投与を中止した。介入期間中、ラットは毎日体重を測定し、一定時間ごとに食物摂取量を記録した。また、実験中のラットの外観と行動活性を観察し記録した。介入後、動物を吸入イソフルランで麻酔した（麻酔は5％イソフルランで誘導し、3％イソフルランで維持した）。右心房から血液を採取し、2時間凝固させた後、2000×gで15分間遠心分離し、血清を得た。採血後、直ちに盲腸全体を摘出し、内容物を無菌手袋で無菌凍結管に静かにしぼった。その後、両側卵巣を分離した。左卵巣4個を無作為に選択し、各群4％パラホルムアルデヒドで固定しHE染色を行い、残りの卵巣組織は-80℃で保存した。
投与量の選択は、本研究の第1部に基づくものであった。低用量レベルは、1日の食事性Cu曝露のリスク閾値（1.992 mg/d）から求め、被験者の平均体重は約50 kgであった。ラットの代謝過程がヒトに比べて速いこと、ラットの耐容量がヒトの約25～50倍であること（Shi, 2000）を考慮し、本研究では1mg/kgを低用量とした。また、制限三乗スプライン（RCS）が示唆する高リスク量8 mg/dと中国人の食事摂取基準（DRI）の最大量に基づき、ラットのCu暴露の高用量レベルは4 mg/kgと設定した。
2.4. 腸内細菌叢の検出
患者の糞便サンプルは、排卵誘発介入開始前にPCOS患者24名と年齢をマッチさせた健康なコントロール24名から採取しました。動物の糞便サンプルは、セカール内容物から採取した。簡単に説明すると、ヒトの被験者は膀胱を空にした後、糞を清潔な収集箱に排泄し、参加者または動物の糞便内容物から約20gの新鮮な糞を滅菌綿棒を用いて収集し、滅菌糞便収集管に入れた。
糞便サンプルを採取したら、直ちにドライアイスでNovogene社に輸送し、ハイスループット16 S rDNA配列決定を行った。すべてのサンプルは、Earth Microbiome Project 16 S Illumina Amplicon Protocol (Caporaso et al., 2011)に従って配列決定した。細菌の16 S rDNA増幅とライブラリ構築は、イルミナの16 S Metagenomic Sequencing Library Preparationガイドに従って実施した。品質フィルタリング後、適格なリードを配列類似度97%以下の運用分類単位(OTU)にクラスタリングした。OTUとそのクラスター化された配列は、次にアノテーションされました。OTUのアノテーションと相対的な存在量に基づいて、分類学的構造を算出した。種のアノテーションに続き、α多様性とβ多様性を算出することで、グループ間の種組成と群集構造の違いを明らかにし、t検定とLEFSeを用いてグループ間の種組成の違いをさらに追求した。
2.5. 発情周期の検出
発情周期は、以前に記載されたように決定した（Chenら、2022b）。簡単に説明すると、0.9％正常食塩水で洗浄した後の膣塗抹から膣細胞を採取した。Wright-Giemsa染色後、膣塗抹標本の形態を光学顕微鏡で観察した。細胞種により発情周期の異なる段階を評価し（前駆期は主に円形核細胞と角化細胞、発情期は主に角化細胞、中駆期は角化細胞と白血球、発情期は主に白血球）、各時期の期間を算出した。
2.6. 濾胞数および卵巣組織学
濾胞数および組織学的観察は、以前に記載されたように行った（Chen et al.，2022b）。すなわち、卵巣組織を4％パラホルムアルデヒドで24時間固定し、段階的エタノールで脱水し、キシレンで脱脂した後、パラフィンに包埋した。埋め込まれた組織ブロックは、5μm厚のスライスを作るために連続的に切開され、HEで染色するために10間隔ごとにスライスを収集された。各卵巣の5枚のスライスを得た。卵巣の組織形態学的変化を光学顕微鏡を用いて調べた。原始卵胞、一次卵胞、二次卵胞、成熟卵胞、休止卵胞の総数および黄体の特徴を10倍して、卵巣あたりの卵胞の総数の推定値を得た。
2.7. 血清リポポリサッカライド（LPS）、マロンジアルデヒド（MDA）、インターロイキン6（IL-6）、ホルモン、銅、卵巣および飼料の銅含有量の決定
血清LPS、IL-6、エストラジオール（E2）、およびテストステロン（T）レベルは、酵素結合免疫吸着法（ELISA、Elabscience Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, China）により測定した（Sun et al., 2019b）。MDAは、MDAアッセイキット説明書（Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China）に従い、チオバルビツール酸（TBA）法により検出した（Wang et al.、2012）。血清、卵巣および飼料の銅含有量は、黒鉛炉原子吸光分析法（GFAAS）により検出した（Wang et al.、2012）。
2.8. リアルタイム定量PCR(RTqPCR)
ステロイド生成関連遺伝子Star、Cyp17a1、Cyp11a1、CYP19A1、Hsd3β1のmRNA量は、RTqPCRにより測定した。RNAiso Plus試薬（TaKaRa Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China）を用いて卵巣組織からtotal RNAを抽出した。その後、PrimeScript™ RT Master Mix (TaKaRa Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China)を用いて、RNAをcDNAに逆転写した。最後に、SYBR® Premix Ex Taq™ II (TaKaRa Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China) を用いて、CFX96™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) で遺伝子発現レベルを測定し、β-アクチンを内部参照として使用した。プライマー配列は、表S1に示す。
2.9. ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングは、ルーチンの手順で行った（Guo et al.、2020）。卵巣からの全タンパク質は、全タンパク質抽出キット（Applygen Technologies, Inc.）を使用して抽出した。その後、BCAアッセイキット（Beyotime Institute of Biotechnology）を用いて、タンパク質濃度を測定した。最後に、タンパク質をSDSPAGEゲルにロードして電気泳動分離し、その後、ポリビニルジフルオライド（PVDF）膜に移した。抗体インキュベーション後、タンパク質は強化化学発光によって検出された。
2.10. 統計解析
データは、連続変数については平均値±標準偏差、または中央値と四分位範囲 [M, (P25, P75)] として、カテゴリー変数については数値として記述されている。対応する単変量解析は、Student's t test、Mann-Whitney U test、分散分析（ANOVA）、およびカイ二乗検定を使用して実施した。体重と食物摂取量のデータについては、Cu処理を被験者間因子、時間を反復測定変数として、2因子反復測定ANOVAを実施した。ANOVA結果が統計的有意差（P < 0.05）を示した場合、最小有意差（LSD）法により、グループ間のポストホック多重比較を行った。変量間の関係を探るために、スピアマン相関を実施した。RCSを用いて、食事性Cu摂取量とPCOSのリスクとの間の用量反応関係を分析し、リスク閾値を決定し、さらにPCOSに対するCu過剰摂取（リスク閾値以上）のリスクについてロジスティック回帰により考察した。腸内微生物の媒介的役割を探るために媒介分析を行い、ブートストラップ再抽出法（1000回反復）により有意性を評価した。すべての統計解析にIBM SPSS version 23.0 (IBM SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)とR 4.1.2が使用された。提供されたP値は両側であり、P < 0.05は有意性を示すとみなされた。結果
3.1. 食事性Cuの多量摂取はPCOSと関連する
参加者の基本的な特徴は、表S2および表S3に示すとおりである。PCOS群の黄体形成ホルモン（LH）、T、抗ミュラーレリアンホルモン（AMH）、総コレステロール（TC）、肛門卵胞数（AFC）、インスリン抵抗性の恒常性モデル評価（HOMA-IR）、食事Cuは対照群より高く、卵胞刺激ホルモン（FSH）は低かった（P < 0.05）。その他の変数には有意差はなかった。
図1aに示すように、RCS解析の結果、食事性Cu摂取量とPCOSのリスクには線形関係があり、リスク閾値は1.992mg/dでした。ロジスティック回帰の結果、職業、所得、教育、喫煙、飲酒、PAL、空腹時血糖値（FBG）、TC、トリグリセリド（TG）、高密度リポタンパク質コレステロール（HDLc）、低密度リポタンパク質コレステロール（LDLc）、FBGを共変量として調整しても、食事性Cu暴露とPCOSのリスクの関連は統計的に有意であることが示されました。食事性Cu摂取量が1.992 mg/d未満と比較して、1.992 mg/dを超える食事性Cu摂取量はPCOSのリスクを1.813倍（OR=1.813、95% CI: 1.150-2.857） 増加した（図1b）。
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図1. 食事性Cu摂取量とPCOSのリスクとの関連 a. 食事性Cu摂取量とPCOSのリスクとの関連のRCS b. ロジスティック回帰分析における1.992mg/dによる食事性Cu摂取量のカテゴリー別のフォレストプロット。未調整：共変量は調整しなかった。モデルI：教育レベル、職業、月収で調整した。モデルII：PAL、喫煙状況、飲酒状況をさらに調整した。モデルIII：FBG、TG、TC、HDLc、LDLcをさらに調整。PALs、身体活動レベル。FBG、空腹時血糖値。TG、トリグリセリド。TC、総コレステロール。HDLc、高密度リポタンパクコレステロール。LDLc、低密度リポ蛋白質コレステロール。
3.2. 腸内細菌叢はPCOSとコントロールの参加者の間で異なる
腸内細菌叢検出に関与した調査参加者の特徴を表S4および表S5に示す。PCOS群のT、AMH、AFC、食事性Cu摂取量は対照群より高く、FSHは低かった（P < 0.05）。その他の変数に有意差はなく、これはすべての研究参加者の基本的な特徴と一致していた。
レーダー図解析では、PCOS患者の腸内細菌叢が対照群と比較して大幅に変化していることが示されました（図2a）。アルファ多様性解析では、PCOS患者と対照群との間に有意な差は見られなかった（P値はそれぞれ、0.804、0.313、0.856、0.829）（図2b）。しかし、β多様性解析の結果、PCOS群とコントロール群の間で群集構造に違いがあることがわかった（P = 0.001）（Fig.2c）。さらにPCoAの結果、PCOS群のサンプルはコントロール群のサンプルと明確に分かれていることが確認された（Fig. 2c）。LEfSe解析（図2d）、t検定（図S2）、進化ツリー解析（図2e）により、PCOS患者の門レベルのFirmicutes、クラスレベルのClostridia、目レベルのLachnospirales、科レベルのBacteroidaceaeとLachnospiraceaeの存在量はコントロール群と異なっていた。しかし、属レベルでは、PCOS患者のBacteroidesの存在量のみが対照群より有意に低く、Agathobacterの存在量は対照群より高かった。
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図2. PCOS患者およびコントロールの異なる分類レベル（門、綱、目、科、属）における上位5種の相対的存在量のレーダープロット b．b. PCOS患者と対照群のα多様性（Shannon、Chao1、ACE指数に基づく）比較 c. PCOS患者と対照群のβ多様性比較［距離比較原理座標解析（PCoA）を含む］ d. グループ間で差分的に多い属はLEFSe解析により特定した。LDA値の分布ヒストグラムは、PCOS群とコントロール群の間で存在量の差（LDA値スコア）＞2の種を示す。 e. 異なる腸内微生物の属レベルでの系統進化樹。内側から外側へ放射状に広がるドットは、門から属への分類学的レベルを示す。色の範囲は、ツリー内の属を識別する。色のついたバーは、各グループの腸内細菌の相対的な存在量に比例している。PCOSグループはオレンジ色で、コントロールグループは青色で表されている。
3.3. 腸内細菌叢は食事性Cu摂取とPCOSの間に中間的な役割を果たす
スピアマン相関を用いて、食事性Cu摂取量と腸内微生物の存在量との関連を解析したところ、食事性Cu摂取量はBacteroidesの存在量と負の相関があった（図S3）。調停分析の結果、Bacteroidesは食事性Cu曝露とPCOSの間に部分的な調停役割を果たすことが示された（Pindirect effect=0.026, 95% CI: 0.002-0.072） (Table 1).
表1. 媒介分析結果
間接効果の経路推定値ブートストラップ95％CIP値LowerUpper食事性CuがBacteroidesを介してPCOSに及ぼす影響総効果0.1560.0720.2280.002直接効果0.1260.0350.2030.018間接効果 0.0300.0020.0720.026
3.4. Cu曝露はラットの腸内細菌叢の摂理を誘発する
Cu介入中のラットの体重と食物摂取量はいずれも統計的有意性を示さなかったが、卵巣重量と卵巣臓器係数は対照群より高かった（図S4 a-e）。3群のラットの血清Cu濃度は120～150μg/dLであり、これはヒトのそれと同様であった（Styczen et al.、2016）。血清および卵巣の Cu 含有量は 3 群間で有意差はなかった（図 S4 f-g）。飼料Cu含量は9.16mg/kgであった。三相図解析では、グループ間で腸内細菌の存在量が変化していた（図3a）。腸内細菌のα多様性には全群で有意差はなかったが（P＞0.05、図3b）、β多様性には有意差が認められ（P＜0.001、図3c）、PCoAにより高用量Cu群の細菌叢プロファイルは他の2群から分離されていることがわかった（図3c）。LEfSe解析（図3d）、グループ間の一対比較（図S5）、系統進化樹解析（図3e）により、低用量Cu群のRoseburia、Helicobacter、Alloprevotella、高用量Cu群のStreptomyces、Staphylococcusは対照群より相対存在度が高いことがわかった。Akkermansiaの相対存在量は、Cu処理群では対照群よりも少なかった。
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図3. 銅曝露後のラットの腸内細菌叢の変化。a. 分類レベルの異なる相対存在量の三相図。ドットの色は異なる腸内細菌叢を表す。ドットの直径は、腸内細菌の相対存在量に比例する。三角形の3つの頂点は3つの異なるグループに対応し、ドットが頂点に近いほど、このグループにおけるこの種の相対存在量が高い。 b. グループ間のα多様性（Shannon、Chao1、ACE指数に基づく）比較 c. グループ間のβ多様性（距離比較、PCoAを含む）比較 d. LEfSe分析によりグループ間の差分存在属を特定した。LDA値の分布ヒストグラムは、異なる用量のCu曝露群間でLDA値スコア＞3の種を示す。 e. 異なる腸内微生物の属レベルでの系統進化樹。色のついた棒は、各群の腸内微生物の相対的な存在量に比例している。C：コントロール群。L：低用量Cu群。H：高用量Cu群。
3.5. Cu曝露によるラットの卵巣卵胞発育異常の誘発
発情周期（図4a）、卵巣卵胞発育（図S6、図4b）、卵巣ステロイド生成（図4c〜図4f）はCu曝露により影響を受けた。対照ラットと比較して、高用量Cu曝露ラットは、休止期が延長し、前方卵胞および休止期卵胞の数が増加したが、黄体は減少した。Cu処理群の血清Tレベルはコントロール群と比較して有意に上昇し（P < 0.05、図4c）、血清E2レベルには有意な差はなかった（P > 0.05、図4d）。ステロイド生成関連遺伝子であるStarとHsd3β1は、コントロールと比較して高用量Cu群で発現量が増加した（PStar=0.003；PHSd3β1=0.008）。また、StARとCYP17A1のタンパク質発現量は、コントロール群と比較して高用量Cu群で増加し（PStAR=0.009、PCYP17A1=0.006）、HSD3β1のタンパク質発現量は両Cu処理群で増加し（それぞれP=0.010、0.005）、CYP11A1のmRNAとタンパク質発現レベルは低用量Cu群で増加した（それぞれP=0.007、0.003）。
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図4. ラットの卵巣卵胞発育に対するCu曝露の影響。 a. 異なるグループのラットの発情周期の平均期間。縦棒内の数字は、各相の平均期間（h）を表す。赤文字は2群間の統計的有意性を示す。P：前駆期、E：発情期、M：発情期、D：発情期 b. 各段階における卵巣卵胞の数を示す。PD：始原卵胞、PR：一次卵胞、SF：二次卵胞、AF：前駆卵胞、CL：黄体、AR：休止卵胞 c. 銅曝露群の血清テストステロン（T）レベル d. 銅曝露群の血清エストラジオール（E2）レベル e. ステロイド生成関連遺伝子の相対mRNAレベル f. ステロイド生成関連遺伝子の相対タンパク質レベル。C：コントロール群。L：低用量Cu群。H：高用量Cu群。
3.6. 腸内細菌叢はCu曝露と卵胞発育の間に媒介的な役割を担っている
Cu処理群のLPS、IL-6、MDAの血清レベルは、対照群のそれと比較して有意に増加した（P < 0.05, 図5a-c）。スピアマン相関分析により、Cu曝露とMDA、IL-6、LPS、Staphylococcus、Streptomyces、starおよびhsd3β1のmRNAレベル、StAR、CYP17A1、CYP11A1、HSD3β1のタンパク質レベル、Tレベルの間に正の相互関係があり、アッカーマンスの存在量と負の相関があった（p < 0.05, 図 S7）．視覚的相関ネットワークマップでは、Cu曝露は主にStaphylococcus、Streptomyces、Akkermansiaと関連しており、これらの腸内細菌はIL-6、MDA、LPSの血清レベルと関連していることが示された。これらの炎症指標は、ステロイド生成関連遺伝子の発現やTレベルの変化と関連していた（図5d）。媒介解析により、ブドウ球菌がCu曝露とCYP17A1発現を部分的に媒介することが示された（Pg_Staphylococcus=0.083、95%CI: 0.001-0.228）(Fig. 5e).
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図5. 銅曝露が腸内細菌叢を通じて卵巣機能に影響を与える可能性のあるメカニズム a-c. 銅曝露後の血清LPS（a）、IL-6（b）、MDA（c）レベル d. 銅、異なる腸内細菌、血清LPS、IL-6、MDA、卵巣ステロイド合成関連遺伝子、Tの相関関係を視覚化したネットワーク図が描かれています。青の連結線は正の相関を、紫の連結線は負の相関を示す。 e. Cu曝露とCYP17A1発現に対するブドウ球菌の媒介効果。C：コントロール群。L：低用量Cu投与群。H：高用量Cu投与群。考察
必須微量金属として、Cu含有酵素は幅広い重要な機能を媒介する。しかし、Cu貯蔵の調節不全は酸化ストレスと細胞毒性を誘発する可能性がある（Ge et al., 2022a）。人体に直接入ることは困難であるにもかかわらず、Cuは食物連鎖の生物学的拡大を通じて人の健康を脅かす可能性がある（Bao et al.、2020）。海水への汚染物質の継続的な排出に伴い、魚介類のCu汚染は過去数十年の間に徐々に世界的な危機となっている（Senez-Mello et al.、2020）。福建省の九龍河口のアオガキは、全組織乾燥重量で19 mg/gという高濃度のCuが検出されました（Tan et al., 2015, Wang et al., 2011）（Weng and Wang, 2014）。これまでの研究（Sun et al., 2019b, Wang et al., 2022, Yiqin et al., 2022）のさらなる進展として、今回の結果、PCOS患者は食事性Cuを多く摂取し、食事性Cu摂取とPCOSリスクには用量反応関係があり、臨界リスク閾値は約1.992 mg/dであったことが示されました。さらに、PCOS患者の腸内マイクロエコロジーは著しく変化しており、食事性Cu曝露はバクテロイデスの媒介によりPCOSに影響を与える可能性があることがわかった。さらに動物実験では、Cu曝露が腸内細菌叢の乱れを誘発し、血清中のLPS、MDA、IL-6の濃度が上昇し、卵巣ステロイド形成が変化し、宿主の卵胞発育に影響を与えることが確認されました。これらの結果は、高レベルの食事性Cuへの長期曝露が、腸内細菌叢の組成に影響を与え、炎症と酸化ストレスを発生させ、ホルモンシグナル伝達経路を通じて卵胞発育を妨害すること、および腸内微生物がCuによる卵巣卵胞発育異常に関与している可能性を示す。本研究で初めて報告された、得られたCu曝露のリスク閾値は、さらなるPCOSの予防と制御のための指針を与えることができます。また、豊富な腸内細菌の発見は、卵胞発育の介入に何らかの参考を与えることができる。
最近の研究では、PCOS患者における腸内細菌叢の変化が報告されています（Giampaolino et al., 2021, Qi et al., 2019, Rizk and Thackray, 2021）。腸内細菌叢の変化には、Bacteroides、Escherichia、Shigella、Streptococcus、Akkermansia、Ruminococcaceae、Porphyromonadaceaeなどがあります（Jobira et al., 2020, Liu et al., 2017, Qi et al., 2019）．本研究では、属レベルで、最も影響を受けるマイクロバイオームがBacteroidesであることを明らかにした。腸内細菌叢の結果の多様性は、これまでの研究で焦点が当てられることが少なかった食事などの明確な環境要因に関連している可能性があります。今回の結果は、Bacteroidesが食事性Cu曝露とPCOSのリスクとの関連を部分的に仲介していることを示すものである。バクテロイデスは、ヒトの腸内細菌叢において最も豊富な細菌属であり（Bornet and Westermann, 2022）、宿主由来のアミノ酸や単糖を病原体と奪い合い、SCFAを生産し、腸の炎症を抑え、腸の免疫バリアを強化し、病原細菌のコロニー形成や伝播から宿主を保護できる（Hudcovic et al, 2009, Jacobson et al, 2018, Sequeira et al, 2020）．これまでの研究で、Cu曝露が腸内細菌叢の存在量を変化させることが判明しています（Ma et al.、2022、Sun et al.、2022）。さらに、腸内細菌叢が宿主の性ホルモンと相互作用し、宿主の生殖健康にさらに影響することを示す証拠がある（Qi et al.、2021）。したがって、我々の結果は、Cuがバクテロイデスの存在量を変化させることにより、PCOSにおける卵巣卵胞発育異常を誘導することを実証している。
我々の動物実験の結果は、Cu曝露量の増加により、早期の卵胞閉鎖、卵胞成熟の阻害、および複数の卵胞の形成を引き起こし、これはCuが紡錘体／染色体構造を損なうことと関連している可能性を示した（Chen et al.、2021）。腸内細菌叢解析の結果、高Cu曝露ラットではAkkermansiaの相対存在量が有意に減少し、StaphylococcusとStreptomycesの存在量が有意に増加し、先行研究（Meng et al., 2018, Song et al., 2018）と一部一致した。また、Cu高用量群ではBacteroidesの存在量が減少したが、ラットでは存在量が非常に少ないため、その差は有意ではなかった。Cu曝露後のBacteroidesの存在量の減少は、別の先行研究（Sun et al.、2022）でも確認されています。アッカーマンシアは、健康に関連する厳密に嫌気性のグラム陰性細菌で、腸のバリアの完全性の維持（Everardら、2013）、代謝の調節（Everardら、2013、Ottmanら、2017）、抗炎症効果の発揮（Ansaldoら、2019）など、多くの疾患において保護効果を提供できる（Eerrienら、2008）。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌は、様々な感染症を引き起こし、ヒトや動物に健康被害を与えます（Yuan et al., 2021）。以前の研究では、バンコマイシン処理後にAkkermansiaの相対量が減少し、Staphylococcusの相対量が増加しました（Džunková et al.、2016）。本研究でも、Cu曝露後の腸内細菌叢に同様の変化が見られ、StaphylococcusのCuに対する耐性や腸内細菌叢のアンバランスが関係している可能性がある。また、Cu高用量群ではStreptomycesの存在量が増加したが、これはCuがStreptomycesの分化と二次代謝を促進するためと考えられる（Cancela et al.、2022）。これらの結果から、高食餌性Cuへの曝露は腸内細菌叢の乱れを誘発し、その結果、有益菌の減少と有害菌の増加をもたらすことが示唆された。
BacteroidesとAkkermansiaはともに抗炎症作用を持ち、過剰なCuはバリア機能を破壊し（Song et al., 2018）、細菌のトランスロケーションやLPSなどの細菌内毒素の循環への侵入を促進し、代謝性内毒素血症を引き起こして炎症を誘発する（Martel et al., 2022）可能性がある。循環系における過剰なLPSおよび炎症因子は、膀胱間質細胞におけるアンドロゲン生合成に関与する主要遺伝子の発現をアップレギュレートし、アンドロゲン産生を増加させ得る（Foxら、2019、TremellenおよびPearce、2012）。卵巣ステロイド生成プロセスにおいて、コレステロールはステロイド急性調節タンパク質（STAR）活性によりミトコンドリアに移動します。その後、コレステロール側鎖リアーゼ（CYP11A1）により、プレグネノロンに変換されます。CYP17A1の活性により、プロゲステロンはアンドロステナジオンへ変換されます。プレグネノロンは、3β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（3β-HSD）の活性により、プロゲステロンに変換される。アロマターゼ（CYP19A1）は、アンドロステンジオンをエストロンに、テストステロンをエストラジオールに変換する（Jozkowiak et al., 2022, Wang et al., 2017）。これらはいずれも重要なステロイド生成関連酵素である。血清LPS、IL-6、MDA、ホルモン（T、E2）、卵巣の主要なステロイド生成関連酵素のmRNAおよびタンパク質発現レベルに関する結果から、食事性Cuの大量摂取は、腸内細菌叢の調節を媒介としてステロイド生成を妨げ、その後、卵胞の発達に影響を与えることが確認されました。視覚的相関ネットワークマップの結果から、Cu曝露後、BacteroidesやAkkermansiaなどの有益菌の存在量が減少し、Staphylococcusなどの有害菌の割合が増加し、腸内細菌叢の恒常性が乱されることがわかった。Cu2+高濃度の影響と相まって、腸の透過性が変化するため、血清LPS濃度の上昇につながり、炎症性サイトカインの放出を促進し、膀胱間質細胞のアンドロゲン合成に関わる主要遺伝子の発現を上昇させることでステロイドの発現を阻害し、PCOSの卵胞発育に影響する。
本研究では、ラットに対するCuの影響は、腸内細菌叢の変化というよりも、Cuによって直接誘導された可能性がある。しかし、血清Cu量および卵巣Cu量には、3群間で有意な差は見られなかった（図S4 f-g）。3群のラットの血清Cu量は120～150μg/dLであり、これはヒトの血清Cu量と同様である（Styczen et al.、2016）。ラットの食事性 Cu 含有量は 9.2 mg/kg であり、食事性 Cu 摂取量は約 0.4 mg/kg bw であった。食事性Cu含有量を含めると、低用量ラットのCu摂取量は約1.4mg/kg bw、高用量ラットのそれは約4.4mg/kg bwであった。腸管におけるCu輸送の正確な制御は不明であるが、Cu吸収は摂取量に影響され、摂取量が少ないほど吸収量は高くなる（Collins et al., 2010）。WHO/FAOは1996年にCuの必要量を女性で0.7mg/日、男性で0.8mg/日と推定したが、2004年にはCu推奨量を定めていない（Freeland-Graves et al.、2020）。したがって、Cu投与ラットの血清および卵巣のCu含有量が対照群と比較して有意に増加しなかったことを考慮し、今回の結果と合わせて、現在の曝露量では、Cu（主に未吸収Cu）が主に腸内細菌叢に影響を与え、その後卵胞発育に影響を与えると推察された。この分野ではさらなる研究が必要である。
本研究にはいくつかの限界が存在する。第一に、食事によるCu曝露に加えて、ヒトは飲料水からもCuに曝露されるが、これは含まれていない。したがって、本研究には何らかのバイアスが存在する可能性がある。しかし、福建省の飲料水の水源と水質によると、水質は制限基準を超えていない。さらに、これまでの研究では、水源におけるCuの汚染レベルは非常に低いことが報告されています（Guan et al., 2018, Pan and Wang, 2014）。したがって、飲料水からのCu摂取が今回の結果に与える影響は軽微であると推察されます。第二に、腸内細菌叢に関するヒトと動物の研究結果は、完全に一致しているわけではありません。この相違は、種やサンプリング部位（ヒトは糞便、動物はセカル内容物）の違いに起因していると考えられる。しかし、これまでの研究では、腸内細菌叢の存在量は異なるものの、セカルサンプルと糞便サンプルで同様のコミュニティが観察された（Stanley et al., 2015）。第三に、現在の16 S rDNAパイロシーケンスは、すべての腸内細菌叢を検出するのに十分な包括的なものではありませんでした。したがって、パイロシークエンシングアプローチの実用化にはさらなる改善が待たれる。最後に、他の重金属も腸内細菌叢とPCOSに影響を与える可能性があり、本研究では交絡因子として考慮しなかった。しかし、私たちの以前の研究で、地元のPCOS患者の卵胞液中の22種類の微量元素のレベルをICPMSで測定したところ、9種類の微量元素（Hg、Pb、Cd、Be、Co、Mn、Ni、SbおよびTl）は卵胞液中で検出されなかった（LOD以下）（Sun et al., 2019a）。また、PCOS群とコントロール群の間で、卵胞液中のヒ素濃度に差はありませんでした（Sun et al.、2019a）。そのため、本研究で食事調査を実施する際に、これらの重金属に特に注意を払うことはなかった。しかし、今後の研究では、地元の食品の重金属含有量を検出することで、他の重金属曝露を考慮する必要がある。結論
我々の知る限り、本研究は、腸内細菌叢の摂動を検出することにより、PCOSの卵巣卵胞発育に対する食事性Cu摂取の影響を調査した最初の研究である。我々は、高い食事レベルのCuへの曝露が、腸内細菌叢を擾乱し、炎症と酸化ストレスを誘発し、宿主の卵巣卵胞発育を変化させることを実証した。腸内細菌叢は、銅曝露と卵巣機能の間に中間的な役割を果たすことがわかった。この情報は、PCOSの予防と治療のための新しい経路に光を当てるかもしれません。
資金提供
本研究は、中国自然科学基金（82170908）、福建省自然科学基金（2022J01238）、福建省科学技術革新共同基金（2020Y9137）、福建省衛生委員会の科学技術プログラム重点プロジェクト（2021ZD01002）、福建省衛生家族計画委員会の医療革新プロジェクト（2019-CXB-12）から資金提供を受けました。
CRediTの著者の貢献声明
Qi Wang. 方法論、ソフトウェア、データキュレーション、執筆（原案）。孫燕： 概念化、リソース、執筆-レビューと編集、資金獲得。Aili Zhao. 方法論、バリデーション、データキュレーション。Xuefen Cai：調査。Qian Xu. バリデーション、調査。Weili Liu：調査。Yiqin Chen: データキュレーション、執筆-レビューと編集。Wenxiang Wang. 王文祥：概念化、リソース、監督、プロジェクト管理、資金獲得、執筆-レビューと編集。
利益相反の宣言
著者らは、本論文で報告された研究に影響を及ぼすと思われる、既知の競合する金銭的利益または個人的関係がないことを宣言します。
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