合成マイクロバイオームへの病原性ウイルスの再導入によるファージホスト集団動態の評価

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リソース|32巻5号768-778.e9頁2024年05月08日

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合成マイクロバイオームへの病原性ウイルスの再導入によるファージホスト集団動態の評価

https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(24)00114-8

ジェイコブ・ワイルド
ランディ・ボイズ
エイブリー・V・ロビンソン
クリスティン・V・マクファーソン
エリザベス・マロリー
エマ・アレン＝ヴァーコー 4
すべての著者を表示

脚注を表示オープンアクセス掲載:2024年4月22日DOI:https://doi.org/10.1016/j.chom.2024.04.001

ハイライト

数理モデルは感染コロニーの頻度を正確に予測する

糞便から分離されたコロニーでは、強毒ウイルスが激減している

病原性ウイルスの再導入は、感受性微生物とそのプロファージに影響を与える

病原性ウイルスは73株の群集の構造と代謝に最小限の影響しか与えない。
まとめ
マイクロバイオームは、多様な細菌とバクテリオファージとの複雑な相互作用を特徴としている。合成マイクロバイオームは、このような相互作用を研究するための強力な方法であるが、細菌分離の過程で代表的なバクテリオファージ集団を得ることが大きな課題である。我々は、コロニー分離によって、糞便のようなビリオンとバクテリアの比率が低いサンプル源から病原性ウイルスを確実に排除し、「病原性ウイルスを含まない」対照を作成できることを実証した。ヒト大腸のバイオリアクターモデルにおいて、73株の合成腸内細菌叢に病原性dsDNAウイルソームを再導入したところ、病原性ウイルスは、群集構造や代謝を大きく変化させることなく、感受性株を標的とした。さらに、病原性ウイルスの捕食に関連するプロファージ誘導のシグナルを検出した。全体として、我々の知見は、希釈に基づく分離法は、病原性ウイルスを含まないとは言わないまでも、著しく枯渇した合成腸内細菌叢を生成し、そのようなウイルスが再導入された場合、群集の形成、代謝、およびプロファージの複製に標的を定めた影響を及ぼすことを示している。
図解抄録
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キーワード
バクテリオファージ
腸内細菌叢
合成コミュニティ
ビローム
病原性
溶菌性
コロニー分離
希釈
プロファージ
crAssphage
はじめに
ヒトの腸内細菌叢には分類学的に多様なファージコミュニティが大量に存在し、生後間もなく細菌コミュニティとともに成熟する。知っていることの多くは、ハイスループットのメタゲノムスナップショットから得られたものである。健康な人の細胞外腸内ビロームは、個人特異性が高く、3,8長期間安定しており、8,9,10病原性ウイルスの集団に支配されていることが多い。8,11,12このような病原性集団の不在は、炎症性腸疾患やその他の健康上の悪い結果と関連している13,14,15。最近報告されたCrassvirales目（crAssphagesまたはcrAss-like phages）は、ヒトの腸内ビロームの中で特に広く見られるウイルスであり、11,16,17,18 ヒトの腸内メタゲノムの約半分15,19で検出され、個体によっては全ウイルスDNA量の90％以上を占める。crAssphageとヒトの微生物叢との密接な関係は、ヒトの進化において広範囲に及んでおり、他の霊長類の系統にも及んでいる20。この深いパートナーシップは、これらのウイルスがバクテロイデータの宿主と安定した共存を維持する能力によって強化されている。CrAssphage感染は宿主細胞の死滅に至ることが多いが、集団レベルでの増殖率に大きな変化はない。
crAssphageのような病原性ウイルスの研究は、個々の細菌宿主への影響を明らかにしたが、複雑な群集動態への集団的影響についてはあまり理解されていない。注目すべきは、この理解不足は実験ツールの不足によるものではないということである。合成マイクロバイオームは、実験的制御を維持しながら複雑な群集動態を研究するために、よく開発されたシステムである。合成マイクロバイオームに含まれるすべての菌株は、あらかじめ複雑なサンプルから分離・精製されている。これらの個々の菌株を組み立てて、無菌マウスやバイオリアクターモデルへの接種に使用することで、各構成員を除去したり操作したりすることが可能な合成群集における因果関係やメカニズムへの扉を開くことができる。
ウイルスの動態を研究するために合成マイクロバイオームを使用する際の重要な課題の一つは、細菌の分離過程で病原性ウイルスが失われる可能性があることである。これは、希釈とコロニー分離によって細菌細胞が他の細菌細胞から分離されるだけでなく、遊離ウイルス粒子からも分離されるために起こる。ライフサイクルのほとんどを宿主細胞外で過ごすウイルスは、希釈による排除に対して特に脆弱であることが予想されるが、ライフサイクルのほとんどを宿主内で過ごすウイルス（すなわち、プロファージとしての温和なウイルス）は、それほど脆弱ではないはずである。したがって、現存するほとんどの合成マイクロバイオームには、通常存在する病原性ウイルスが欠落しているか、あるいは減少していると予想されるが、この減少の程度は未知数である。
このことは、合成マイクロバイオーム・モデルの妥当性に疑問を投げかけるものであるが、同時に実験的な可能性を見出すものでもある。例えば、起源となるウイルス群集を精製し、合成腸内細菌叢に再導入すれば、病原性ウイルスが微生物叢の表現型に与える集団的影響を推測することができる。本研究では、糞便サンプルから標準的なコロニーを分離した後にウイルスが排除される確率を控えめに推定した。さらに、1つの糞便サンプルから分離した73の細菌株からなる合成腸内マイクロバイオームを開発し、バイオリアクターモデルを利用して、感染源コミュニティから精製バクテリオファージを再導入した場合の影響を調べた。
研究結果
合成腸内細菌叢には病原性ウイルスが欠乏している
私たちはまず、標準的な分離手順において、遊離ウイルス粒子が分離コロニーの境界の外にどれくらいの頻度で落下するかを推定しようとした。私たちはまず、対話型ツール（https://randyboyes.shinyapps.io/viral/）として自由に利用できる簡単な数学モデルを開発することから始めた。このモデルのパラメータには、プレーティング面の面積、各コロニーの面積、サンプルのウイルス／バクテリア比（VBR）、プレーティングされたコロニーの数が含まれる。どのコロニーについても、そのコロニーの領域内にウイルス粒子が着床する確率（「コロニー感染」）は、コロニーの面積とプレートの面積の比としてモデル化される。この確率に基づいて、複数のウイルスが存在する場合の感染確率、感染コロニー数の期待値、感染コロニー数の期待値分布など、関心のある結果を計算した。
モデルの妥当性を検証するため、大腸菌BL21とファージT4を用いた実験結果とモデルの結果を比較した（図1A）。プレートあたりの感染コロニー数（スポットアッセイによるスクリーニング）は、観察された分布とモデル化された分布の間に有意な差はなく、このことは、モデルが試験された両希釈度における実際のコロニー播種の動態に近似していることを示している。当然のことながら、我々のモデルは、より希釈されたサンプルをプレーティングすることで、どのVBRにおいても、プレートあたりの感染コロニー数の期待値（図1B）だけでなく、単一のコロニーが感染する可能性（図1C）も常に減少することを示している。しかし実際には、高度に希釈したサンプル（すなわち、プレート当たり1～5コロニー）をプレーティングすることは、あらゆる培養努力の効率を大幅に制限する。研究者がサンプルのおおよそのVBRを知っていれば、我々のモデルを用いて、研究者の目的に応じて、効率的なプレーティング密度とコロニー感染のリスクのバランスをとることができる。VBRが不可能であると判断した場合、研究者は公表されているデータセットからの近似値を用いることができる（ヒト糞便、海洋、堆積物、土壌など様々な環境からのVBR分布についてはKnowlesら27を参照）。
図のサムネイルgr1
図1コロニー感染は数学的モデルを用いて正確に予測できる。
キャプション
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我々のモデルはコロニーからウイルスが排除される確率を推定するのに用いることができるが、研究者が視覚的な手がかりを用いて感染したコロニーを単純に回避できる可能性は考慮していない。コロニーの形態が感染の信頼できる指標となるかどうかを調べるため、ピコポンプ・マイクロインジェクターを用いて、大腸菌BL21細胞をバクテリオファージT4から正確な距離で固体寒天培地表面に沈着させた。コロニーは直径約3mmになるまで成長させた後、太いピペットチップで取り出した。T4の750-1,500μm以内に接種したコロニーは正常な形態を示したが、スポットアッセイ（図1D）および増殖曲線（図S1）ではT4陽性であった。このことは、高感受性コロニー（BL21）が強毒性ファージ（T4）に遭遇した場合でも、コロニーの形態は感染の信頼できない指標であることを示唆している。もし研究者が感染したコロニーを避けるために視覚的な手がかりに頼ることができないのであれば、効率的なプレーティング密度を維持しながらウイルス排除の可能性を最大化するために、我々のようなモデル（https://randyboyes.shinyapps.io/viral/）が必要となる。
我々のモデルを検証した後、ヒトの糞便中の病原性ウイルスが標準的な分離手順に従って排除される頻度を推定した。コロニーの直径を3 mm、プレートの直径を9.5 cm、プレート1枚当たり1株当たり10コロニーのプレーティング密度を仮定した。これらのパラメーターの下で、我々のモデルは1つのコロニーが感染する可能性を、VBRが1％の場合は1.0％、VBRが10の場合は9.5％と推定した。ヒトの糞便サンプルのVBRは0.01と低い場合があり8、分離されたコロニーは保存または増殖前に数回希釈され分離されることが多く、複雑なサンプル中のすべての株が強毒ウイルスと共存することはまれである。これらを総合すると、標準的な希釈ベースの培養方法は、病原性ウイルスを含まないとは言わないまでも、大幅に減少させた合成腸内細菌叢を作成するのに十分であることが示唆される。このことは、VBRが100にも達する土壌のような生態系には当てはまらないかもしれない27。このような環境からウイルスを含まないコロニーを分離することを目指す研究者は、プレーティングパラメーターを適切に調整すべきである（https://randyboyes.shinyapps.io/viral/）。
複雑な合成腸内細菌叢SM1の作成
標準的なコロニー分離法では、糞便サンプルからウイルス粒子が除外されることが多いことを確認した我々は、病原性バクテリオファージを欠失させた複雑な合成腸内細菌叢の作成に着手した。健康なドナーからのヒト糞便サンプルを連続希釈し、様々なタイプの固体寒天培地上にプレーティングした。10-7から10-9の間で希釈したサンプルから分離コロニーを抽出した。抽出された+1,000コロニーのうち、16S rRNA遺伝子のV3-V6領域の塩基配列を決定することにより、73株（70種）が同定された（図2A；表S1）。これらの73株は「SM1」と呼ばれる群集で、アリスティペス属、アッカーマンシア属、バクテロイデス属、ブラウチア属、ルミノコッカス属、ローズブリア属など、欧米のヒト腸内細菌叢に広く見られるメンバーが含まれていた。16S rRNAアンプリコンシークエンシングによって糞便中に検出された117種レベルのOTUのうち、34種がSM1コミュニティライブラリに含まれていた。これらの34種は、16S rRNA読み取り数で糞便群集の75.21%を構成していた。さらに、Escherichia fergusonii、Akkermansia muciniphila、いくつかのBacteroidesを含む36種が糞便サンプルから培養されたが検出されなかった（図2A-2B）。
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図2糞便からのコロニー分離により、複雑で再現性の高い合成マイクロバイオームSM1が得られた。
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試験管内でのSM1組成の集合性と再現性を評価するために、3つの別々のバイオリアクターに同一のSM1接種液を接種し、確立されたプロトコルを用いて19日間コミュニティを増殖させた28。使用したバイオリアクターモデルは、ヒトの結腸近位部の条件を模倣するように設計されており、自動温度制御、自動pH制御、およびヒト回腸遠位部から排出される消化物を模倣するように設計された複雑な増殖培地を特徴としている（表S2）。
バイオリアクターの条件は、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Ruminococcaceaeのメンバーを含む様々な細菌分類群の増殖をサポートした。16S rRNAアンプリコンシークエンシングにより、1日目から19日目の間に、合計53/73株のSM1株がバイオリアクターで検出された。平均して、バイオリアクターサンプル中の16Sアンプリコンの52.4%が、ソース糞便サンプル中にも検出されたSM1株と一致した（図2B）。サンプル13日目、16日目、19日目にわたって、SM1細菌群集はバイオリアクターの複製間で顕著な類似性を示し（図2C）、群集のアセンブリー、DNA抽出、塩基配列決定が複製間の16S rRNAアンプリコンプロファイルのばらつきに中程度しか寄与していないことが示された。
SM1への病原性ウイルスの再導入
次に、SM1を接種したバイオリアクターで、糞便中に存在する病原性バクテリオファージが減少していることを確認しようとした。糞便とSM1バイオリアクターのビロームを直接比較することも考えたが、そうするとSM1株はその供給源である生物群集に自然捕食者を持たないという可能性が否定できなくなる。SM1分離株が糞便中の感染性ウイルスと共存しており、これらのウイルスがコロニー分離によって排除されていることを証明するために、糞便サンプルからウイルス粒子（糞便ウイルス、「Fv」）を精製し、SM1と一緒に3つの追加バイオリアクターに共接種した（図3A）。1.41-1.5g/mLの密度抽出とクロロホルム処理によるdsDNAウイルスの精製に最適化された、ウイルス抽出に用いた確立されたプロトコル29は、多くの糞便汚染物質を効果的に除去するが、ほとんどの一本鎖DNA（ssDNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、脂質結合ファージも除去する。そこで、SM1に再導入されたdsDNA成分に焦点を当てて解析を行った。
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図3SM1に糞便ビリオンを再導入することで、合成腸内細菌叢には病原性ウイルスが欠乏していることが明らかになった。
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6つのバイオリアクター（各条件につきn = 3）を19日間連続培養し、非感染性の糞便ウイルスを系外に洗い流すのに十分な時間をとった（図S2）。最終日に各バイオリアクターの内容物を採取し、dsDNAウイルス画分のメタゲノム配列決定を行った。代表性の低いウイルスコンティグのアセンブリーを支援するため、1つのFv+SM1バイオリアクターを5,600万リードの深さでディープシーケンスした。続いて、コンティグの非冗長ライブラリーにリードをアセンブルし、残存細菌gDNAコンタミネーションを除去した。最終的に得られた冗長性のないウイルスコンティグライブラリーには、401の配列が含まれており、その中には4つのdinstinct crAssphageと、最近特徴付けられたgubaphage cladeの2つが含まれていた4。
合計で、糞便から検出された24のウイルスコンティグは、Fv+SM1バイオリアクターでも検出されたが、SM1バイオリアクターでは検出されなかった。平均して、これらの24のコンティグは、19日目のFv+SM1ウイルスリードの37.1%に相当した（図3B）。単一のcrAss様ウイルス（contig223；91,979 bp）は、これらのコンティグの中で最も顕著であり、Fv+SM1ビロームの平均20.1%を構成していた。19日目のFv+SM1では、さらに2つのcrAss様クレードが検出された。crAss様contig223のような配列がSM1バイオリアクターに本当に存在せず、メタゲノムプロファイリングの検出閾値以下であることを確認するため、contig223の異なるコード領域をターゲットとする3つの異なるqPCRプライマーペアを設計し、19日目の各バイオリアクターレプリケートでcontig223を定量した。3つのプライマーペアはすべて、各Fv+SM1バイオリアクターで107コピー/mL以上のcontig223を定量したが、各SM1バイオリアクターでは検出限界以下（18-33コピー/mL; Table S3）であった（図3C）。
次に、糞便から移入された24のコンティグが真に病原性であることを示す、より深い証拠を探した。まず、VIBRANT品質が高または中程度のコンティグをすべて同定し、ファージライフスタイルを予測するために設計された3つの異なるアルゴリズムを用いて解析した。3つのアルゴリズムで満場一致で強毒性／溶菌性に分類されたコンティグは、条件FvとFv+SM1では同様に多く見られたが、条件SM1では全く見られなかった（図3D）。糞便からFv+SM1に移された24のコンティグのうち、10がVIBRANT quality highまたはmediumであり、そのうちの7はコンセンサスにより病原性／溶菌性と予測されたが、残りの3つはアルゴリズムによる予測が矛盾していた（表S4）。対照的に、SM1バイオリアクターのコンティグは、強毒性とは予測されず、コンセンサスにより温和と分類されるか、相反するアルゴリズム予測が返されるか、またはVIBRANT品質が低かった（図3D）。これらの結果を総合すると、合成マイクロバイオームには強毒ウイルスが大量に欠乏しているが、強毒ウイルスが再導入された場合にもコロニー形成し、持続する可能性があることが確認された。
病原性ウイルスはSM1のアセンブリと代謝物プロファイルに標的を絞った影響を与える
次に、Fv+SM1バイオリアクターとSM1バイオリアクターの16Sアンプリコンデータの違いを調べた（図4A）。病原性ウイルスで処理したバイオリアクターでは、ユークリッド距離（PERMANOVA、999の並べ替え）やアルファ多様性（ウィルコクソンの符号付き順位、Shannon p = 0.33、Simpson p = 0.15）に基づく有意差は認められず、また、どの菌株の存在量にも有意なシフトは見られなかった（すべてp > 0.05、ウィルコクソンの符号付き順位、Benjamini-Hochberg補正）。しかし、最も大きな効果を示した10株の中には、Bacteroidesの5株が含まれていた（図4A）。これは、再導入されたウイルスの中から検出され、この属のメンバーに感染することが知られているcrAss様バクテリオファージによる調節と一致する。
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図4病原性dsDNAビロームは、SM1のアセンブリー、代謝、プロファージ誘導に標的を定めて影響を与えている。
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Fv+SM1においてどの株が強毒ウイルスに捕食されたかを調べるため、5株のバクテロイデス株をそれぞれFv+SM1ウイルスで7日間単培養した。得られた濾液の塩基配列を決定したところ、ウイルスコンティグライブラリーに含まれる24個のウイルスコンティグのうち5個が宿主であることが判明した。病原性コンティグ223 (crAss-like) は、Bacteroides koreensis (B. koreensis) 22-5-S 1 D6 FAA株の濾液から得られたリードの88.9%を占め、病原性コンティグ72、87、270、319、360は、Bacteroides cellulosilyticus (B. cellulosilyticus) 22-5-I 12 FAA株の濾液から得られたリードの92.24%を占めた。コンティグ319と360は互いに密接に配列しており、同じ約85 kbのファージを示している可能性がある。コンティグ72、87、270も非常に類似しており、同じ約40 kbのファージを示している可能性がある。B. koreensisとB. cellulosilyticusを捕食の対象として同定した後、偽発見率（false discovery rate）のコントロールに余裕を持たせて、その存在量を再分析した。B. koreensisはグループ間で有意差はなかったが、B. cellulosilyticusの存在量はFv+SM1バイオリアクターで有意に減少した（平均Log2 fold-change = -2.03, p = 0.006、図4B）。
次に、Fv+SM1で枯渇すると思われる2つの非Bacteroides株に注目した： Phascalarctobacterium succinatutens (P. succinatutens)とLachnoclostridium pacaense (L. pacaense)である（図4A）。バクテロイデス株と同様に、これらの株もFv+SM1ウイルスと一緒に7日間かけてサブカルチャー培養を試みた。P. succinatutensを液体培地で培養することは困難であったが、L. pacaenseの濾液には、ウイルスコンティグライブラリーの24コンティグのうち、さらに3つの病原性コンティグが含まれていた。L.pacaense濾液のリードの85.1%はコンティグ289、326、385にアライメントされ、いずれも10-16 kbの配列であった。バチルスファージɸ29に類似したペプチドグリカンヒドロラーゼの存在とɸ29に類似したゲノム構成から、これらのウイルス配列はポドウイルスに類似した形態を持つ1つまたは複数のファージを表している可能性が示唆された。
増幅データから得られた宿主予測を補強するために、CRISPR配列データベースを用いてファージの宿主を予測するために設計されたアルゴリズムであるCrisprOpenDB31を用いた（表S4）。この解析に基づき、Bacteroides koreensis 22-5-S 1 D6 FAAとBacteroides cellulosilyticus 22-5-I 12 FAAの単培養上清から検出されたコンティグはBacteroides属に感染すると予測され、L. pacaenseの上清から検出されたコンティグはLachnospiraceae科に感染すると予測された。さらに、糞便ウイルス処理によって有意な変化を示さなかった3つの対照Bacteroidesを用いて、7日間のサブカルチャーアッセイを繰り返した： Bacteroides uniformis 22-5-I 1 TSAB、Bacteroides eggerthii 22-5-I 9 D5 FAA、Bacteroides thetaiotaomicron 22-5-I 23 FAAである。これらの菌株の上清からは、Fv+SM1ウイルスと7日間共存培養した後、24の病原性コンティグは検出されなかった。
一般的に、病原性ウイルスとの共培養は、7日目、10日目、13日目、16日目、19日目のSM1群集構造に弱い影響を与えた。B. cellulosilyticus、B. koreensis、L. pacaense、P. succinatutensを除いた場合、log2fold-changeが最も大きかったのはEscherichia fergusonii（-0.65）とCoprococcus comes（+0.54）であった。このことは、病原性ウイルスが、捕食された菌株のサブセットに中程度の存在量シフトを引き起こしたが、群集の残りの部分には大きな連鎖的影響を引き起こさなかったという解釈と一致する（図4C）。
病原性ウイルスが群集の代謝に及ぼす影響を調べるため、各バイオリアクターの流出液に含まれる43種類の主要代謝物（酢酸、酪酸、プロピオン酸などの主要短鎖脂肪酸生成物を含む）の濃度を分析した。4つの代謝物-ギ酸、イソ酪酸、イソバレラート、ヒドロキシフェニルアセテートは、偽発見率を考慮した後、条件間で有意な差を示した（図4D）。これらの特徴レベルの違いにもかかわらず、PERMANOVAで評価したところ、条件間の全体的なBray-Curtis非類似度に有意差は見られなかった（999回の並べ替え、p = 0.34）。このことから、病原性ウイルスは特定の代謝物に影響を及ぼしたが、代謝物プロファイル全体の実質的なシフトは引き起こさなかったことが示唆された。これらの知見を総合すると、複雑な細菌群集に複雑な病原性ウイルソームを再導入することは、SM1群集の菌株と代謝物のサブセットに中程度の的を絞った影響を与えるという解釈と一致する。
病原性ウイルスが先住株のプロファージ複製を促進する
統合されたプロファージに対する病原性ウイルスの影響を調べるために、SM1バイオリアクターで最も代表的な9株のゲノムの塩基配列を決定した。この中には、捕食株であるB. cellulosilyticus 22-5-I 12株とB. koreensis 22-5-S 1 D6 FAA株が含まれる（表S5）。Virsorter2とCheckVを用いて、それらのゲノム内の32の推定プロファージ領域を同定した。全コミュニティショットガンシークエンシングにより、各プロファージ領域と対応する宿主ゲノムのリードカバレッジの中央値を決定することができた。次に、プロファージ／宿主カバレッジ比を計算し（STAR Methods参照）、16日目と19日目にSM1とFv+SM1バイオリアクター間で比較した（各条件につきn = 6）。いずれの条件でも活性があると思われる8/32のプロファージ領域のうち、B. cellulosilyticus 22-5-I内の2つの領域が、強毒ウイルス処理によって有意に変化した。B. cellulosilyticus phi2の平均プロファージ／宿主カバー率比はFv+SM1ではSM1より3.9倍大きく（p = 0.022、対のサンプルt検定）、一方phi3はFv+SM1では3.45倍大きかった（p = 0.026）（図4EおよびS3）。
これらのプロファージが誘導能を有するかどうかを決定するために、我々は高純度の細胞外ウイルスから作成されたウイルスコンティグの非冗長ライブラリに対してそれらの配列を整列させた。phi2とphi3プロファージの配列はどちらも99.5%以上整列した1つ以上の細胞外コンティグによって完全にカバーされており、両ファージが誘導能を持つことを示唆している。観察されたプロファージ効果の主要なドライバーは病原性ウイルスであったという解釈は、単培養においてB. cellulosilyticus 22-5-Iを標的とする複数のFv+SM1ウイルスの発見によって支持される（上記参照）。このことは、ウイルスの捕食とこれらの潜伏ウイルスエレメントの活性化の間に因果関係があることを示唆している。
考察
我々の結果は、現存するほとんどの合成マイクロバイオームが、病原性ウイルスを含まないとは言わないまでも、かなり減少していることを示している。この研究以前は、希釈によって病原性ウイルスがある程度排除されることは広く想定されていたが、この効果の程度はこれまで未知のままであった。バクテリオファージ研究における数理モデリングの長い伝統に基づき、われわれは寒天平板上のウイルス粒子と細胞の空間分布をシミュレートするモデルを開発し、対話型ツールとして利用できるようにした（https://randyboyes.shinyapps.io/viral/）。このモデルにより、ヒトの腸内で観察されるような低いVBRでは、従来の培養パラメーターが単離コロニーからウイルス粒子を確実に排除することが明らかになった。土壌生態系で観察されるような高いVBRでは27、従来の分離パラメータではウイルス粒子はほとんど排除されない。その結果、現存するほとんどの合成腸内細菌叢には、病原性ウイルスが圧倒的に少ないことが推測される。
この理解は、合成腸内細菌叢の生物学的妥当性を問うものであると同時に、複雑なウイルス群集を実験的に操作する道を開くものでもある。限られた数の糞便サンプルから得られた菌株から合成マイクロバイオームを構築すれば、関連する病原性ウイルスを精製して再導入することが可能になる。本研究では、ヒトの糞便サンプルから単離した73株の合成マイクロバイオームを用いて、この原理を検証した。
我々のアプローチにより、2つのcrAssphages（表S4に詳述）を含む、いくつかの異なるdsDNAウイルスを代表する24の病原性コンティグを同定した。dsDNA病原性ウイルスのこのような広範な捕獲は、我々の実験系の際立った長所を活用することで可能となった。第一に、元の糞便サンプルから再導入されたウイルスは、宿主の腸内で共存していたことから、宿主株と感染性を形成する可能性が高い。実際、元のサンプルでは宿主に感染できなかったウイルスは、蠕動運動によって急速に枯渇したであろう32。第2に、長期間共存したウイルスと宿主の相互作用は、本質的に生物学的により意味のあるものである。以前の研究では、外来バクテリオファージが導入され、注目すべき効果が強調されていたが33,34、これらの擾乱は、主に偶然の移民によるものである。腸内におけるファージと宿主の相互作用のほとんどは、長期にわたる共存の枠組みの中で起こっていることに注意することが重要である8,9。このことを認識した上で、我々の実験系では、最近同じ腸管に同居していた病原性ウイルスと宿主を完全に分離してから、制御された条件下で再び同居させる。このアプローチは、単に外来ウイルスによって確立されたコミュニティを破壊するのとは対照的である。
本研究で概説したアプローチにより、ヒトマイクロバイオームにおけるファージ-宿主相互作用の複雑な動態に関する貴重な知見を得ることができた。我々の結果は、先行研究、特に10株または15株の合成マイクロバイオームに病原性ウイルスを導入したHsuら34やReyesら33の研究を発展させたものである。われわれの知見とこれらの先行研究との間に見られる顕著な一致点は、病原性ウイルスとその宿主との間に観察された長期的安定性である。Hsuら34とは異なり、B. cellulosilyticusやL. pacaenseのような菌株の捕食に関連した顕著なノックオン効果は見られなかった。この食い違いは、特に機能的冗長性が群集の多様性に比例して拡大する傾向があることを考慮すると、これらの先行研究で用いられた群集の複雑性が比較的低かったことに起因しているのかもしれない35。
われわれのアプローチの長所を生かして、4つの異なる病原性バクテリオファージを表す9つの病原性コンティグの宿主を特定することに成功した。このことは、糞便ビロームの多様性が未解明であること、そしてこの方法が腸内生態系から新規の病原性ウイルスを発見できる可能性を示している。さらに、この実験系は、病原性ウイルスの捕食とプロファージ誘導の間の相互作用にも光を当てることができる。本研究では、病原性ウイルスの再導入が、捕食されたB. cellulosilyticus 22-5-I株における2つのプロファージの複製増加と一致することを示す。DNA損傷によって誘導されないファージが報告されるようになってきており36、この研究は、この特徴を示すプロファージを同定するための合成マイクロバイオームの可能性を強調している。
この実験的アプローチは、複雑な群集におけるファージ-宿主の動態をよりよく理解するための道を提供するものであるが、まだ改良の余地がある。本研究では、糞便から高純度のウイルス抽出物を得るために塩化セシウム勾配とクロロホルム処理を用いたが、その代償としてウイルスの多様性が減少した。クロロホルムでは膜結合型ファージが減少し、1.41-1.50 g/mLの密度画分の塩化セシウム抽出ではssDNAウイルス（1.31-1.40 g/mL）が減少した37。さらに、ファージ-バクテリアのプレーティングダイナミクスの数理モデルは、クラスウイルス（Crassvirales）クレードのメンバーなど、従来とは異なるライフサイクルを持つファージが、バクテロイデス（Bacteroides）コロニーの成長、形態、分離のダイナミクスにどのような影響を与えるかについて、より深く理解することで有益になる可能性がある。このことは特に重要である。というのも、クラッスウイルスに似たウイルスは、宿主細胞を即座に溶解させることなく、あるいはすべての子孫を溶解させることなく感染することが可能であり、バクテリオファージT4のような古典的な捕食者とは異なる排除-希釈特性を持つ可能性があることを示唆する証拠があるからである22。さらに、宿主種によってはコロニーの形や面積がまちまちであるため、このモデルの使用が制限される可能性がある。最後に、病原性ウイルスをより効率的に精製し再導入するためのハイスループット技術を開発することで、病原性ウイルスの再導入プロセスを効率化し、複数のサンプルにわたる実験の再現性を高めることができる。
急速に拡大するマイクロバイオーム科学の分野において、バクテリオファージとその宿主との相互作用を理解することは極めて重要であり、本研究で概説した実験方法は、本稿の範囲を超えて応用できる可能性がある。在来の病原性ビロームを合成マイクロバイオームに再導入することで、研究者はより正確な疾患モデルを開発し、病原性ウイルス群集と温帯ウイルス群集の相互作用についてより深く学び、ヒトの腸から土壌や海洋環境まで、さまざまな生態系における病原性捕食の役割を問うことができる。
STAR★メソッド
主要リソース表
試薬またはリソースソースの識別子
細菌およびウイルス株
大腸菌BL21 (DE3) Venigalla B. Raoより寄贈 NC_012971
Escherichia phage T4 Cezar Khursigaraより寄贈 NC_000866
SM1 - 73 細菌株 本研究 表S1
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
バイオリアクター供給培地 - 19 試薬 表 S2 表 S2
糞便培地 - 19種類の培地 表S6 表S6
SYTO9™ サーモフィッシャーサイエンティフィック Cat# S34854
アンピシリン Sigma-Aldrich Cat# A8351
トリプシン性大豆寒天 Thermo Fisher Scientific Cat# DF0369-17-6
Tryptic Soy Broth サーモフィッシャーサイエンティフィック Cat# DF0370-17-3
Platinum™ PCR SuperMix High Fidelity Thermo Fisher Scientific Cat# 12532016
脱脂粉乳 Carnation https://www.amazon.ca/Carnation-Powdered-Skim-Milk-500g/dp/B01EYBIU9S?th=1
グリセロール Sigma-Aldrich Cat# 56-81-5
ジメチルスルホキシド Thermo Fisher Scientific Cat# D128-1
豚ムチン Lee Biosolutions Cat# 453-11
除細動したヒツジの血液 Hemostat Laboratories Cat# DSB500
腐敗性嫌気性菌寒天 Neogen Cat# NCM0014B
ペクチン Sigma-Aldrich Cat# P9135-1KG
イヌリン Glentham Life Sciences Cat# GC4090-1KG
小麦デンプン Sigma-Aldrich Cat# S5127-500G
D-セロビオース Millipore Sigma Cat# C7252
コリスチン Alfa Aesar Cat# J60915
ナリジクス酸 Millipore Sigma Cat# N8878
寒天 サーモフィッシャーサイエンティフィック Cat# 214010
エタノール Sigma-Aldrich Cat# 459836
塩化ナトリウム Thermo Fisher Scientific Cat# BP358-1
硫酸マグネシウム Thermo Fisher Scientific Cat# M-7506
トリス Thermo Fisher Scientific Cat# BP152-1
ポリエチレングリコール 6000 Sigma-Aldrich Cat# 8074915000
クロロホルム Thermo Fisher Scientific Cat# A88-500
塩化セシウム Sigma-Aldrich Cat# 289329
プロテイナーゼ K サーモフィッシャーサイエンティフィック Cat# AM2548
DNase I シグマアルドリッチ Cat# 10104159001
SYBR gold 10,000x Thermo Fisher Scientific Cat# S11494
Tween-80 サーモフィッシャーサイエンティフィック Cat# 94901L
脳心筋梗塞ブロス BD Difco Cat# DF0037178
塩化カルシウム Sigma-Aldrich Cat# C4901-100G
L-システイン Sigma-Aldrich Cat# 168149-2.5G
ヘミン Sigma-Aldrich Cat# H9039
メナジオン Sigma-Aldrich Cat# M5625
重要な市販アッセイ
SsoAdvanced ユニバーサル阻害剤耐性 SYBR Green スーパーミックス BioRad Cat# 1725017
MicroAmp™ EnduraPlate™ 光学 96 ウェル Fast Clear リアクションプレート Applied Biosystems Cat# 4483485
IS-2 Chenomx 内部標準物質 - DSS-d6 Chenomx Cat# IS-2
CountBright™ アブソリュートカウントビーズ Invitrogen Cat# C36950
QIAamp PowerFecal Pro DNA キット Qiagen Cat# 51804
ファージ DNA 分離キット Norgen Biotek Cat# 46800
Nextera XT Index Kit v2 イルミナ Cat# FC-131-2001
PureLink™ PCR 精製キット Thermo Fisher Scientific Cat# K310001
Qubit dsDNA HS Kit サーモフィッシャーサイエンティフィック Cat# Q32851
イルミナDNAプレップキット イルミナ Cat# 20060059
寄託データ
16S rRNA遺伝子シーケンスデータセット NCBI BioProject： PRJNA1015663; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1015663
生カウントテーブルおよびウイルスコンティグ Figshare https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24183849.v2
Bacteria/Virus Plate Dynamics App ソースコード GitHub https://github.com/rdboyes/viral
オリゴヌクレオチド
16S rRNA プライマー： V3k; 5' - TACGG[AG]AGGCAGCAG Gloor et al.38 N/A
16S rRNAプライマー: V6r; 5' - AC[AG]ACACGAGCTGACGAC Gloor et al.38 N/A
5' - GTGCCAGCMGCCGCGGTAA Caporaso et al.39 N/A
16S rRNA プライマー R806; 5' - GGACTACHVGGGTWTCTAAT Caporaso et al.39 N/A
コンティグ223を標的とするqPCRプライマー - 表S3参照 本研究 表S3参照
組換えDNA
pET21b Sigma-Aldrich Cat# 69741
ソフトウェアとアルゴリズム
Bacteria/Virus Plate Dynamics App ソースコード 本研究 https://randyboyes.shinyapps.io/viral/
R version 4.1.2 R software foundation https://www.r-project.org
QuantStudio™ Design & Analysis Software Thermo Fisher Scientific https://www.thermofisher.com
SILVA データベース v138.1 Quast et al.40 https://www.arb-silva.de
Muscle v5.1 Edgar41 http://www.drive5.com/muscle.
Trimal v1.4.rev15 Capella-Gutierrez et al.42 http://trimal.cgenomics.org
MrBayes v3.2.7a Huelsenbeck and Ronquist43 https://anaconda.org/bioconda/mrbayes
Treeio v1.16.2 Wang et al.44 https://www.bioconductor.org/packages/treeio/
Ggplot2 v3.3.6 Wickham45 https://ggplot2.tidyverse.org
Ggtree v3.0.4 Yu ら 46 https://www.bioconductor.org/packages/ggtree
DADA2 v1.8 Callahan ら 47 https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/dada2.html
SH800S ソフトウェア Sony https://www.sonybiotechnology.com/us/instruments/sh800s-cell-sorter/
FastQC v0.11.9 Andrews48 https://anaconda.org/bioconda/fastqc
Trimmomatic v0.39 Bolger 他49 https://anaconda.org/bioconda/trimmomatic
SPAdes v3.15.3 Bankevich et al.50 https://anaconda.org/bioconda/spades
Virsorter2 v2.2.4 Guo et al.51 https://anaconda.org/bioconda/virsorter
CheckV v1.01 Nayfach et al.52 https://anaconda.org/bioconda/checkv
Vsearch v2.27.0 Rognes et al.53 https://anaconda.org/bioconda/vsearch
VIBRANT v1.2.1 Kieft et al.54 https://anaconda.org/bioconda/vibrant
Bowtie2 v2.4.4 Langmead et al.55 https://anaconda.org/bioconda/bowtie2
BBMap v38.96 Bushnell56 https://anaconda.org/bioconda/bbmap
BacPhlip v0.9.6 Hockenberry and Wilke57 https://anaconda.org/bioconda/bacphlip
PhageAI Tynecki et al.58 https://phage.ai/
CrisprOpenDB Dion ら 31 https://github.com/edzuf/CrisprOpenDB
Prodigal v2.6.3 Hyatt et al.59 https://anaconda.org/bioconda/prodigal
Chenomx NMR Suite v9.02 Chenomx https://www.chenomx.com/download/
Prism v9.3.1 N/A https://www.graphpad.com/
Biorender N/A https://www.biorender.com/
Ggalluvial v0.12.5 Cory Brunson https://corybrunson.github.io/ggalluvial/
その他
嫌気チャンバー Anaerobe Systems Model： AS-580 嫌気チャンバー
嫌気性ガス；チャンバー；10% CO2、10% H2、80% N2 Praxair Cat# NICD10H1U-K
嫌気性ガス；バイオリアクター；100% N2 Praxair Cat# NI4.8T
SH800S セルソーター Sony https://www.sonybiotechnology.com/us/instruments/sh800s-cell-sorter/
600 MHz Bruker Avance III NMR、クライオプローブ付き Bruker https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html
Quantstudio 7 Pro サーモフィッシャーサイエンティフィック Cat# A43183
Multifors 2 微生物システム（0.4L TV、0.4L TV NW55/70 培養容器付き） Infors HT https://www.infors-ht.com/en/bioreactors/bench-top-bioreactors/multifors2/
Biotek Epoch 2 マイクロプレート分光光度計 Agilent https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/microplate-readers
ワイドボアピペットチップ、1 mL Thermo Fisher Scientific Cat# 14-222-699
96 ウェルフィルタープレート、0.45 μm Norgen Biotek Cat# 298-40018
Sutter P-1000 マイクロピペットプーラー Automate Scientific https://www.autom8.com/shop/micropipette-fabrication/p-1000-puller/p-1000-next-generation-micropipette-puller/
Pneumatic PV820 PicoPump Microinjector World Precision Instruments https://www.wpi-europe.com/products/pumps-and-microinjection/pressure-injection/sys-pv820.aspx
パラフィルム Sigma-Aldrich Cat# HS234526B
50 mL コニカルチューブ Thermo Fisher Scientific Cat# 14955239
0.45 μm PESシリンジフィルター Thermo Fisher Scientific Cat# 13100107
0.22 μm PES シリンジフィルター Thermo Fisher Scientific Cat# SLGPX13NK
14 mL 超遠心チューブ ベックマン・コールター Cat# 344060
SW 40 Ti ベックマン・コールター https://www.mybeckman.ca/landing/ppc/cent/rotors
Qubit 2.0 フルオロメーター Thermo Fisher Scientific https://www.thermofisher.com/ca/en/home/industrial/spectroscopy-elemental-isotope-analysis/molecular-spectroscopy/fluorometers/qubit.html
MWCO 12-14000 KDa メンブレン Sigma-aldrich Cat# D9277
Whatman Anodisc 25mm フィルターメンブレン Sigma-aldrich Cat# WHA68096002
Wilmad 5 mm ガラス NMR チューブ Sigma-aldrich Cat# Z271993
MilliporeSigma 25 mm ガラスフィルターホルダーおよびサポート Thermo Fisher Scientific Cat# XX1012500
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リソースの有無
連絡先
データおよびリソースに関する詳細情報およびリクエストは、Emma Allen-Vercoe博士 (eav@uoguelph.ca) までお願いします。
材料の入手可能性
本試験では新たな試薬は得られていない。
データおよびコードの利用可能性
シーケンスデータはNCBIのBioprojectから入手可能： PRJNA1015663。生カウント表とウイルスコンティグはFigshareリポジトリからhttps://doi.org/10.6084/m9.figshare.24183849.v2。式5（https://randyboyes.shinyapps.io/viral）を利用した対話型ツールの全コードは、https://github.com/rdboyes/viral。
実験モデルと被験者の詳細
ヒト被験者
匿名の健康な白人男性ドナーから糞便サンプルを得た。採取時、ドナーは44歳であった。
本研究で使用する便サンプルの採取に関する倫理的承認は、ゲルフ大学研究倫理委員会（University of Guelph Research Ethics Board）からREB#17-11-014の証明書を得ている。
細菌株
ドナーの糞便サンプルから分離された73株を表S1に示す。特に断りのない限り、菌株は嫌気的条件下（10% CO2、10% H2、80% N2）、37℃で、5%脱血羊血を添加したFastidious Anaerobe Agar（FAA）上で増殖させた。
方法の詳細
コロニー感染頻度のモデル化
モデルを構築する際、以下のパラメータを考慮した：シャーレの半径（rplate）、半径（rcolony）を持つように成長する細菌コロニーの数（ncolony）、およびウイルス粒子の数（nvirus）。まず、単一の細菌コロニーと単一のウイルス粒子の場合を考えました（質問1）。ウイルスとコロニーの両方がプレート上にランダムに分布していると仮定すると、ウイルスがコロニーの領域内に入る確率はそれらの領域の比に等しい：
P(Q1)=
πr
2
コロニー
πr
2
プレート

(式1)

であり、ウイルスがコロニー内に存在しない確率は補数に等しい：
P(Q1)′=1-πr
πr
2
コロニー
πr
2
プレート

(式2)

次に、1つのコロニーに複数のウイルスをプレーティングした場合を考えてみた(質問2)。複数のウイルスがすべてコロニーの外に落ちる確率は、1回失敗する確率をウイルス数の指数に上げたものに等しい（事象の独立性を仮定）：
P(Q2)=(1-πr
πr
2
コロニー
πr
2
プレート

)nウイルス,(式3)

そして、1つのコロニーが少なくとも1つのウイルスを含む確率は補数に等しい：
P(Q2)′=1-(1-πr
πr
2
コロニー
πr
2
プレート

)nvirus.となる（式4）。

そして、少なくとも1個のウイルスを持つ細菌コロニーの期待数は、細菌コロニーの数に、そのうちのどれかが少なくとも1個のウイルスを持つ確率を掛けたもので与えられる：
E[x]=ncolony×P(Q2)′.(式5)

コロニー感染モデルの検証
アンピシリン耐性を付与したpET21bを含む大腸菌BL21を用いて検証実験を行った。アンピシリン選択は、汚染微生物がコロニー数を混乱させる可能性を減らすために用いた。特に指定がない限り、BL21は50μg/mLのアンピシリン（Sigma-Aldrich）を添加したトリプシン大豆寒天培地（Difco）またはブロス（BD Bacto）で培養した。T4ファージストックを調製し、Bonillaら60の「ファージ・オン・タップ」プロトコルを用いてBL21上で凝集させた。
BL21培養液とT4溶解液を1:1 v/vで混合し、最終密度が50 CFU/プレート、75 PFU/プレートになるように直ちにプレートした。これをさらに高希釈で繰り返した： 5 CFU/プレート、8 PFU/プレート、n=42。コロニーの直径が約4 mmになるまで、37℃で培養した。その後、各コロニーを直径4 mmのワイドボアピペットチップを用いて抽出し、TSB中で一晩培養した後、96ウェル0.45μmフィルタープレート（Norgen社製）を用いて濾過した。T4の存在を検出するために、各ウェルから5μLの濾液を宿主BL21を含む上面寒天培地にスポットした。
ファージ-宿主接種距離の関数としてのコロニー形態
マイクロインジェクション針は、P-1000マイクロピペットプーラー（Sutter Instruments社製）を用いてガラスキャピラリーを引き抜くことにより作成した。PV820 pneumatic PicoPump Microinjector（World Precision Instruments）を用いて、ナノリットル量のBL21培養液をTSAプレートの表面に注入した。ガラス製の10μm校正用目盛りを用いて距離を測定し、T4溶解液（108 PFU/mL）をBL21接種部位から目標距離の位置に沈着させた。これを各接種距離について3回繰り返した。37℃で16時間増殖後、プレートを画像化した。各コロニーをワイドボアピペットチップ（Fisher scientific）を用いて、チップの端がコロニーのファージ対向境界を越えないように抽出した。抽出したコロニー、陽性対照（距離0μm）、陰性対照（純粋なBL21コロニー）を、200μLのTSB中、エポック2マイクロプレートリーダー（Biotek）で37℃、5.5時間インキュベートした。勾配は、各成長曲線の1:05:00～2:05:00の時間枠から算出した。スポットテストは、まず培養液を96ウェル0.45μm PESフィルタープレート（Norgen社製）に通し、濾液を宿主BL21を含む上面寒天培地にスポットすることで行った。
病原性ウイルスが枯渇した合成マイクロバイオームの作成
簡単に説明すると、SM1ドナーの糞便をあらかじめ還元した生理食塩水バッファーに混合し、10-4～10-8の希釈範囲を表S6に詳述する様々な培地タイプにプレーティングした。単離されたコロニーは、嫌気的（10％CO2、10％H2、80％N2）および好気的条件下で採取され、純度の高いストリーキングが行われた。標準的なプライマーを用いた16S rRNA遺伝子V3-V6領域のサンガー配列決定38 により分類学的同定を行い、低温保存用にユニーク株を調製した。約10mgのバイオマスを凍結培地（12% w/vスキムミルクパウダー、1% v/vグリセロール、1% v/vジメチルスルホキシド）中で短時間ボルテックスし、直ちに-80℃に移した。
SM1分離株の非冗長16S rRNA遺伝子配列（V3-V6領域）を用いてSM1株の系統樹を作成した。16S rRNA遺伝子配列（V3-V6領域）のライブラリーは、SILVAデータベース40 バージョン138.1を用いて属レベルに分類された。配列はmuscle v5.141を用いてアライメントし、trimal v1.4.rev1542を用いてstrict modeでトリミングした。スプリット頻度の平均標準偏差が0.02未満になるまでMrBayes v3.2.7a43を実行して系統樹を構築した。得られた系統樹をtreeio v1.16.244を用いてRStudioに取り込み、ggplot2 v3.3.645およびggtree v3.0.4.46を用いて可視化した。
各合成マイクロバイオームの接種用アリコートの調製
精製した細菌単離株を、嫌気条件下、5%脱血羊の血液（Hemostat Laboratories）を添加したFastidious Anaerobe Agar（FAA）（Neogen）で個別に培養した。分離株は純度まで再リークし、16S rRNA遺伝子（V3～V6領域）のサンガー配列決定により菌株の同一性を再確認した。分離株は5mLのあらかじめ滅菌した0.9％生理食塩水にプールした。この生理食塩水懸濁液を上下に静かにピペッティングしてホモジナイズし、95mLの前培養スキムミルク凍結培地（12% wt/volのスキムミルクパウダー、1% vol/volのグリセロール）に移し、ベンチトップで回転させながら静かにホモジナイズした。その後、15mL遠心チューブに5mLずつ分注した。各チューブはパラフィルムで密封し、嫌気チャンバーから取り出し、エタノール-ドライアイスバスで30分以内に瞬間凍結した。アリコートは植菌として使用するまで-80℃で保存した。
バイオリアクターの接種と操作
80℃で保存した合成微生物群のアリコートを嫌気チャンバーに移し、室温で解凍した後、穏やかにピペッティングして混合し、密封したシリンジに移し、200mLの減菌済みバイオリアクター供給培地を入れた0.4L Multifors 2 ケモスタットバイオリアクターシステム（Infors AG、スイス）に直ちに添加した。条件Fv+SM1バイオリアクターには、マッチドナーの糞便から精製したウイルス（約108ウイルス様粒子/mL）を同時に添加した。すべてのバイオリアクターは19日間連続培養された。
培地組成を含むバイオリアクターシステムの操作は、標準化されたプロトコールとして公表されている62： 37℃、pH 7、嫌気的雰囲気はN2ガスでスパージングすることで維持した。ヒトの回腸からの出力を模倣した供給培地を15秒毎に容器に導入した（1日当たり200mL）。バイオリアクターの内容物は、容器底部へのバイオマス蓄積を防ぐために必要な最小速度（50 rpm）で撹拌した。各バイオリアクターは、1 日目（接種 24 時間後）から 3 日に 1 回サンプリングした。19日目に、各バイオリアクターの内容物（200mL）をすべて取り出し、採取後直ちに-80℃の保管庫に移した。
16S rRNA遺伝子配列決定と分類学的割り当て
解凍した糞便およびバイオリアクターサンプルは、QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit（Qiagen）を用い、製造元の指示に従って処理した。シーケンスライブラリーは、Platinum PCR SuperMix High Fidelity（Thermo Fisher Scientific）中で、標準的な16S V4領域プライマー39と400ngのNextera XT Index v2シーケンス（Illumina）、および10ng/μL濃度の2μL gDNAテンプレートを用いた一段階PCR増幅により構築した。PCRは以下のサイクラー条件で行った： 94℃で2分間、続いて94℃で30秒間、68℃で30秒間アニーリング、68℃で5分間伸長を50サイクル行った。アニーリング温度は最初の30サイクルは65℃で開始し、その後55℃で20サイクル行った。PCR産物はPureLink PCR Purification Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて、製造元の指示に従って精製した。正規化および300bpペアエンドシーケンスは、カナダのゲルフ大学Advanced Analysis Center for GenomicsのIllumina Miseqプラットフォーム（Illumina）で行った。
DADA2バージョン1.8.47を使用して、Rソフトウェアバージョン4.3で生配列を処理した。ASVは、SILVAデータベースバージョン138.1.40を使用して、DADA2のassignTaxonomy関数を使用して属レベルに分類した。種レベルの分類は、合成マイクロバイオームの16S rRNA V3-V6配列ライブラリーの最も近いヒットから、97%以上の配列同一性カットオフで割り当てた。このステップに先立ち、各SM1分離株のV4領域が特徴的であることを確認した。このアプローチで分類できなかった糞便ASVは、NCBI 16S rRNA参照データベースに対してクエリーし、E値が最も低いヒットから種レベルの分類を割り当てた。その後、同一の種分類を持つASVのカウントを合計することで、データセットをノイズ除去しました。
糞便およびバイオリアクター廃液からのウイルス粒子の抽出と精製
2.5gの糞便サンプルまたは50mLのバイオリアクター廃液を10容量のSM（塩化マグネシウム硫酸ナトリウム）緩衝液（200mM NaCl、10mM MgSO4、50mM Tris-HCl、pH 7.5）で希釈し、30分間激しくボルテックスした。その後、サンプルを50mLのコニカル遠心チューブ（Thermo Fisher Scientific）に分け、4500×gで45分間遠心した。上清を注意深く集め、新しい50mL遠沈管に入れた。これを2回繰り返した。上清を0.45μmのデッドエンドPESフィルター（Thermo Fisher Scientific）に通した。ポリエチレングリコール6000（ミリポア社製）を10% w/vまで加え、4℃で一晩穏やかに撹拌した。翌朝、サンプルを25,000×gで45分間スピンした。ペレットを7mLの新しいSMバッファーにプールし、ボルテックスし、1mLのクロロホルムと混合した。これを2分間ボルテックスした後、室温で5,000×g、10分間遠心した。水性上層を回収し、0.45μmのPESフィルターを通し、4℃で保存した。
Castro-Mejiaらによる29の記述に従って、クロロホルム抽出ビロームを2層塩化セシウム（CsCl）勾配でさらに精製した。1.41～1.5g/mLに相当する密度画分を回収した。この密度画分がウイルス様粒子（VLP）の大部分を含むことを実験的に検証するために、SM1ドナーの糞便からのビリオンで一連のCsCl勾配を調製した。分析天秤を用いて密度領域をマッピングし、遠心管に沿って0.5cm間隔で採取した200μLサンプルからdsDNAビリオンのエピ蛍光カウントを行った（図S4）。CsCl勾配からの抽出後、サンプルはCastro-Mejiaらの記述に従ってMWCO 12-14,000 KDaメンブレン（Sigma）に対して透析した29。翌朝、サンプルは0.45 μm PESフィルターに通し、4℃で保存した。糞便サンプルは、dsDNAビロームのショットガン配列決定のために3連で抽出した。
ウイルス核酸抽出と配列決定
ウイルスdsDNAは、プロテイナーゼK処理（Ambion）を施したファージDNA分離キット（Norgen）を用いて抽出した。抽出の前に、組換えDNase I（Sigma Aldrich）を200μg/mL加え、1M MgSO4を1% v/vになるように加え、サンプルを37℃で1時間インキュベートした。クリーンアップと溶出の後、Qubit dsDNA HSキットとQubit 2.0蛍光光度計（Thermo Fisher Scientific）を用いてDNA濃度を測定した。ライブラリーを調製し、Advanced Analysis Center for GenomicsのIllumina Miseqプラットフォームで2×300 ntペアエンドシーケンスを行った。SM1ビローム（バイオリアクターおよび糞便）の平均ライブラリーサイズは421±93,000リードであった。SeqCenter（Pittsburgh, Pennsylvania）のIllumina NovaSeq 6000で単一複製物であるFv+SM1 R2もディープシーケンスし、2×151 ntペアエンドリードを5,600万リードの深さで生成した。
ウイルスメタゲノムデータの処理
低品質リード、トリムシーケンス、およびトリムイルミナアダプターを除去するために、Trimomatic v0.3949を以下のパラメータで使用した： SLIDINGWINDOW:4:20、MINLEN:60、HEADCROP:5、ILLUMINACLIP:NexteraPE-PE.fa:2:30:10。この結果、サンプルあたり0.46±0.26万シーケンス（中央値±標準偏差）が得られました。SPAdes v3.15.350をmetaSpadesモードで使用し、条件別にペアエンドライブラリーをアセンブルした。非ウイルスDNAコンタミを除去するために、コンティグライブラリーをVirsorter251で最小コンティグ長1500、CheckV52でデフォルトパラメータでフィルタリングした。得られたコンティグを、Vsearch53を用いて、短い方の配列の90%のローカルアラインメント上で90%の同一性でクラスタリングすることにより、複製を解除した。次に、VIBRANT54を用いて、デフォルトのパラメータで2回目の除染を行った。これにより、401コンティグからなる非冗長ライブラリーが得られた。
Bowtie2 v2.4.455を用い、デフォルトのパラメータ（unclipped alignment）で、各バイオリアクターから得られたTrimomatic処理したリードを非冗長コンティグライブラリーにアライメントした。BBMap v38.9656pileup.shスクリプトを用いて、塩基ごとのカウントテーブルと配列カバレッジを作成した。
ファージライフスタイルの予測は、VIBRANTの完全性が「高」または「中」（n = 55）のコンティグに対して行った。予測は3つのバイオインフォマティクスツールの出力を組み合わせて行った： BacPhlip57（ランダムフォレスト、タンパク質特徴）、VIBRANT54（機械学習、タンパク質特徴）、PhageAI58（機械学習、ヌクレオチド特徴）。ライフスタイル予測は、3つのツールがコンセンサスに達した場合のみ呼び出され、そうでない場合は最終予測は「未割り当て」に設定された。
ウイルスコンティグライブラリーの中からcrAssphageとgubaphageを検出するために、VIBRANTの完全性が「高」または「中」の配列は、E値カットオフ≦10-10のBlastを使用してGut Phage Database4に対してクエリーされた。さらに、BacPhlip、VIBRANT、およびPhageAIのコンセンサスによって病原性であると判断されたコンティグをNCBIヌクレオチドライブラリーに対してクエリーし、以前に特徴づけされた近縁の分離株を検索した。
CrisprOpenDB31を用い、最小スコア50、最大2ミスマッチで、病原性コンティグのバイオインフォマティック宿主予測を行った。
オープンリーディングフレーム（ORF）はProdigal（59）を用いて予測し、選択したORFはNCBIの非冗長タンパク質配列データベースとのアラインメントによって手動で注釈付けした。
qPCRによる病原性ウイルスの有無の評価
コンティグ223に対するプライマーを設計するために、NCBIのプライマーブラストツール（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）を以下のパラメータで実行した：産物サイズ＝70-150；Tm 58-62℃、最適Tm＝60℃；3'末端5塩基の最大GC＝3；3'末端の最大同一塩基＜4；GC％＝30-70；GCクランプ＝2；最大自己相補性： 任意： 5, 3': 3.00；最大ペア相補性： 任意： 5, 3': 3.00；一価陽イオンの濃度＝50；二価陽イオンの濃度＝3。プライマー対がホモ/ヘテロダイマーを形成する可能性は、IDTのOligoAnalyzerツール（www.idtdna.com/calc/analyzer）を用いて予測した。パラメーター [Na+] = 50 mM; [Mg+] = 3 mM; オリゴ濃度 = 25 uM。ホモ二量体デルタG < -5.00のプライマーは除外した；ヘテロ二量体デルタG < -5.00のプライマーペアは除外した。プライマーペアのアンプリコンは、www.idtdna.com/UNAFold にあるUNAFold GUIを使って解析した。融解温度が50℃以上のアンプリコン構造を予測したプライマーペアは除外した。アンプリコンの二次構造Tmおよびホモ／ヘテロ二量体Delta-Gが最も低い上位3組を以降の解析に使用した（表S3）。
すべてのqPCR反応は、SsoAdvanced universal inhibitor-tolerant SYBR green supermix (BioRad) を用い、MicroAmp EnduraPlates (Applied Biosystems) に10μLの反応容積で行い、QuantStudio 7 Pro (Applied Biosystems) を用いて以下のパラメータで読み取った：98℃で60秒ホールドして開始し、98℃で10秒、60℃で20秒を40サイクル。非標的増幅を同定するため、各qPCRサイクルの最後にメルトカーブを行った。実験は1サンプルにつき6テクニカルレプリケートで行った。コピー数の絶対推定値は標準曲線を用いて計算した。検出限界」は、標準曲線において5/6テクニカルレプリケートで増幅が成功したテンプレートの最低濃度と定義した。
contig233標準曲線用の鋳型として使用するアンプリコン支配ストックを作製するために、Fv + SM1のdsDNAビロームのDNAを1/100に希釈し、鋳型として各プライマー対で40サイクルのPCRに使用した。短いqPCRサイズのアンプリコンを得るために、20秒の伸長時間を用いた。産物を104倍に希釈し、2回目、3回目のPCR反応の鋳型として使用した。溶原性ファージが最初のメタゲノムに含まれるDNAの1%を占め、1回の反応で106コピーのアンプリコンが生成されたと仮定すると、約100bpのアンプリコンは最終PCR産物のDNA量の99.99%を占めることになる。これらの産物を広帯域qubitで定量し、アンプリコンのサイズに基づいてコピー数を計算し、平均塩基対の質量を660g/moleと仮定した。アンプリコンの変性の影響を減らすため、qPCRアッセイは定量後すぐに行った。
1D 1H NMRスペクトロスコピー
合成群集バイオリアクターから採取した無菌濾過サンプルを、既述の方法で 1D 1H NMR 用に調製した。CSIは、5 mMの4,4-ジメチル-4-シラペンタン-1-スルホン酸（DSS）と0.2%（w/v）のアジ化ナトリウム防腐剤を99.9%D2Oに溶解した溶液であった。転倒混和後、サンプルをWilmad 5mmガラスNMRチューブ（Sigma Aldrich）に移し、4℃で一晩保存した。スキャンする前に、サンプルを少なくとも10分間室温に戻した。スキャンは、NMRセンター（Advanced Analysis Center、University of Guelph）にあるBruker Avance 600 MHzスペクトロメーターで行った。スペクトルは、混合時間100ms、捕捉時間4s、緩和遅延1s、スペクトル幅12ppmの1次元NOESYパルスシーケンスの最初のインクリメントで得られた。
各サンプルの代謝物プロファイルを表すNMRスペクトルは、スペクトル処理、化合物の同定、および化合物の定量のためにChenomx NMR Suiteバージョン9.02（Chenomx Inc）にインポートされた。スペクトルは、Chenomx の自動ツールを使用して位相とベースラインを調整し、必要に応じて DSS 内部標準物質に対して手動で調整しました。ターゲット・プロファイリングは、NMR スペクトル中の化合物を同定するために、前述したように使用された。63 簡単に言えば、ターゲット・プロファイリングは、ソフトウェアの 600 MHz プロジェクション・ライブラリから選択された既知のスペクトル・ピーク・プロジェクションを、処理された 1 次元 1H NMR スペクトル中の観測されたスペクトル・シグネチャーに適合させようとする自動化ソフトウェア・ツールである。予想されるスペクトルのピークと観測されたピークの適合性、およびChenomxソフトウェアのデータベースに記載されている化合物の特性の両方が、化合物同定の信頼性に影響を与えた。いったん同定されると、DSS内部標準の既知濃度は、各スペクトルで同定された他のすべての化合物の濃度を計算するために使用された。
細菌細胞数
各時点（7 日目、10 日目、13 日目、16 日目、19 日目）で 3 レプリケートを使用して、処理間の細菌細胞数を比較した。希釈したバイオリアクターサンプルを 6000×g で 10 分間遠心し、細菌バイオマスをペレット化した。ペレットを2回洗浄し、1 mLの0.5×SYTO9™染色液（Thermo Fisher Scientific）に懸濁した。これを暗所で15分間インキュベートした。インキュベーション後、CountBright™ Absolute Counting Beads（Invitrogen社製）を激しくボルテックスし、各染色サンプルに既知濃度で添加した。フローサイトメトリーは、ベンチトップ型SH800Sセルソーター（ソニー）を用い、分析モードで行った。センサーの利得は、前方散乱と後方散乱について、それぞれ13%と24.5%に設定した。検出された蛍光シグナルが真実であり、得られたイベントが正確であることを確認するために、いくつかのコントロールを使用した。これらには、「サンプルのみ」、「ビーズのみ」、「SYTO9™ ステインのみ」の調製が含まれる。次に、細胞数を、カウントビーズ集団の1秒あたりのイベント数を基準にして、蛍光集団の1秒あたりのイベント数に基づいて計算した。解析はSH800Sソフトウェア（ソニー）を用いて実施した。
エピ蛍光顕微鏡によるVLPカウント
CsClグラジエントで精製したビリオンを、25 mmの真空フィルターホルダ ーとサポート（Fisher Scientific）を用いて0.02 μmフィルター（Whatman Anotop）に通した。Anotopフィルターを0.25×SYBR gold（Fisher）で染色し、乾燥させ、顕微鏡スライドに貼付した。VLPはLeica DM 5000B顕微鏡とHamamatsu Orca-Flash4.0カメラで観察し、Volocityイメージングソフトウェアでカウントした。この基本プロトコールは、バイオリアクターサンプル用にさらに最適化された。バックグラウンド蛍光を最小化するために、3つの方法が試された：バイオリアクターの濾液をMWCO12-14,000 KDaの膜に対して透析する方法、SYBR-goldの最小濃度（0.25×）を用いて、SYBR染色したAnotopフィルターを0.02μm濾過したPBSでリンスする方法、100μLのPBSの上に置いて染色後のフィルターをリンスする方法。これらの方法のうち、最後の2つはバックグラウンド蛍光を減少させるのに最も成功した（データは示さず）。アノトップフィルターを介したVLP分布のエントロピーを最大化するために、2つの方法を試行した。すなわち、投入液のメニスカスの影響を低減するために、より大量（10mLのPBSで10μLの濾液）を濾過する方法と、ビリオンの凝集を抑制するためにTween-80を0.01%に添加する方法である。これらの方法のうち、前者はVLP数の標準偏差を減少させることに最も成功した（データは示さず）。
全コミュニティショットガンシーケンスによるプロファージ複製の定量化
SM1バイオリアクターで最も多く増殖している9株を、固体寒天培地で一晩培養した。約10 mgのバイオマスを回収し、全コミュニティの抽出に用いたのと同じ方法に従って核酸を抽出した。SeqCenter（Pittsburgh, Pennsylvania）でゲノムの塩基配列を決定し、2 × 151 ntのペアエンドリードを1株あたり約150万リードの深さで作成した。コンティグはSPAdes50を用いてメタゲノムモードでアセンブルした。得られたコンティグをVirsorter251とCheckV52で解析し、CheckVで「プロウイルス」と同定されなかったウイルス配列は破棄した。この結果、32の推定プロファージ配列からなる最終ライブラリーが得られ、ゲノムあたりの平均プロファージ数は3.4±2.1であった（表S5）。32の推定プロファージのうち、16のVIBRANTクオリティは高または中であった（Dataset S1, panel 'ProphageHost_coverage_ratios', available at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24183849.v2）。バイオリアクターサンプル16日目と19日目の全コミュニティメタゲノムを、SeqCenter（ペンシルバニア州ピッツバーグ）でIllumina NovaSeq X Plusシーケンサーを用いてショットガンシーケンスし、サンプルあたり470±0.8万リードの深さで2×151 ntペアエンドリードを作成した。BBMap（v38.96）のpileup.shスクリプトを使用して、スカフォールド全体のカバレッジを1000 bp単位で計算した56。次に、カバレッジをサンプル内のフィルターされたリードの総数に対して正規化した。次に、各複製サンプルの各プロファージについて、プロファージカバレッジの中央値／宿主カバレッジの中央値の比を計算した（Dataset S1, panel 'ProphageHost_coverage_ratios', at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24183849.v2 を参照）。積極的に複製しているプロファージは、12サンプルにわたって、プロファージ／宿主のカバー率比が1を超える標準偏差を持つものとして定義した。
病原性ウイルスの宿主株の同定
SM1 の 6 株（Dataset S1、パネル「Monoculture_readmapping」、https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24183849.v2 を参照）を液体培地で嫌気条件下で培養した。単一のFv+SM1バイオリアクター（19日目）からの流出液を、孔径0.22μmのフィルターで2回濾過した後、最終濃度5% v/vで6株の培養液それぞれに添加した。培養液を24時間増殖させた後、10% v/vの新鮮培地に継代培養した。再培養を7日間繰り返した後、培養上清を0.22μmのフィルターに通し、4℃で保存した。バイオリアクターおよび糞便からのVLPについて述べたように、ウイルスDNAを抽出し、塩基配列を決定した。スポットアッセイは二層寒天法で行った。対数期の宿主培養を、3.5g/L L-システイン、5μg/mLヘミン、1μg/mLメナジオン添加の脳心筋梗塞ブロスで増殖させた。同じ脳心筋梗塞ブロスに3％寒天、120mg/L硫酸マグネシウム、50mg/L塩化カルシウムを添加した上寒天を調製した。ODが約0.2の宿主培養液200μLを3mLのトップアガーに加え、あらかじめ加温したFAAプレートに2枚ずつ流し込んだ。固化後、各バイオリアクター（19日目）の濾液5μLをプレートにスポットした。プレートを37℃で嫌気培養し、24、48、72時間後にプラークを目視で検査した。
統計分析
RStudio の wilcox.test() 関数（paired = T）を用い、Benjamini-Hotchberg 補正を行った。Wilcoxon 符号順位検定はノンパラメトリックのペアサンプル検定である。バイオリアクターサンプルはタイムポイントとレプリケートでペアにした（例：SM1レプリケート3日目07はFv+SM1レプリケート3日目07とペアにした）。複雑な合成腸内細菌叢を持つInforsバイオリアクターを用いた先行研究65 に基づき、初期の群集形成に関連するばらつきを最小化するため、すべての16S rRNAおよび代謝物分析からサンプル1日目と4日目を除外することにした。すべてのペアの折れ線グラフ（図4Bおよび4D）は、GraphPad Prismバージョン9.3.1を使用して作成した。バイオリンプロット（図1A）および存在量順位付き折れ線グラフ（図4D）は、ggplot2 v3.4.2を用いて作成した。沖積プロット（図2B）はggalluvial v0.12.5パッケージを使って作成した。
細菌群集におけるα-多様性の解析（Dataset S1 at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24183849.v2 を参照）は、R 4.3.1のVegan 2.6-4パッケージを用いて行った。順序付けは、ユークリッド距離を用いた主座標分析（PCoA）を用いて行った。代謝物のβ多様性は、Bray-Curtis非類似度を用いて検定した。多変量解析は、Veganのadonis2()関数を用いたPERMANOVA検定を用いて行った。
謝辞
Alexander HynesとJake Armstrongには、原稿と数学モデルの草稿について有益なフィードバックとディスカッションをいただいた。本研究は、E.A.-V.に授与されたCanada Research Chairs Program（助成金番号232131）の資金援助を受けて実施された。J.W.はオンタリオ州訓練・カレッジ・大学省からの奨学金を受けた。
著者貢献
構想、J.W.、方法論、J.W.、ソフトウェア、R.B.、形式分析、J.W.、調査、J.W.、A.V.R.、A.J.B.、D.J.L.B.、C.V.M、 およびE.M.；執筆-原案、J.W.およびB.A.D.；執筆-総説および編集、J.W.、A.V.R.、B.A.D.、A.J.B.、D.J.L.B.、C.V.M.、E.M.、およびE.A.-V.；監督、B.A.D.およびE.A.-V.；資金獲得、E.A.-V.
利益申告
E.A.-V.はNuBiyota LLC & Companyの共同設立者兼CSOであり、医療応用のためのヒト腸内由来微生物コミュニティの商業化に取り組んでいる。
執筆過程におけるジェネレーティブAIおよびAI支援技術の宣言
本著作の準備中、著者らはChatGPT 4.0を使用して序論と議論の組織的アウトラインを作成し、コミュニケーション不足や受動態の事例を特定した。このツールを使用した後、著者らは必要に応じて内容を見直し、編集し、出版物の内容について全責任を負う。
補足情報
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資料S1. 図S1-S4
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表S1. 図2に関連するSM1コミュニティメンバーのサマリーデータ
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表S2. 図2に関連するバイオリアクター培地試薬
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表S3. 図3に関連するSYBRベースqPCRプライマーのサマリーデータ
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表S4. 図3に関連する、条件Fv+SM1で検出されたがSM1では検出されなかったウイルスコンティグのサマリーデータ
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表S5. 図4およびS3に関連する、gDNA配列決定されたSM1株9株のアクセッション番号
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表S6. STAR Methodsに関連する、糞便分離に使用した寒天培地タイプのサマリーデータ
参考文献
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スコープス (251)
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藤本和彦
木村雄一郎
下肥越雅彦
佐藤 崇
佐藤 聡
トレンメル G.
植松正幸
川口恭子
臼井陽子
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他
腸内ファージ-細菌会合に関するメタゲノムデータが病原細菌に対するファージ療法の開発に役立つ.
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https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.06.005
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ヒト腸内細菌叢由来の189,680個のDNAウイルスのメタゲノム大要。
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スコープス (182)
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グーグル奨学生
シュコポロフ A.N.
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日本学術振興会特別研究員
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ビラ A.V.
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オランダの4つのコホートから得られたヒト腸内メタゲノムにおけるcrAss様ファージの発見、多様性、機能的関連性。
Cell Rep.
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.110204
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日本学術振興会特別研究員
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概要
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PhiCrAss001はヒト腸内で最も豊富なバクテリオファージファミリーを代表し、バクテロイデス腸炎に感染する。
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ヒト腸内細菌のメタゲノム解析から、ユニークなゲノムの特徴を持つ多様なCrAss様ファージが発見された。
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スコープス (25)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
論文情報
出版履歴
出版 2024年4月22日
受理 受理：2024年4月1日
改訂版受理 2024年1月31日
受理：2024年1月31日 受理：2023年9月29日
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.chom.2024.04.001

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図2糞便からコロニーを分離すると、複雑で再現性のある合成マイクロバイオームSM1が得られる。
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