食物繊維グアーガムによる腸内細菌叢代謝および腸管免疫活性の変化は、大腸炎症への感受性を高める

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腸内微生物
第16巻 20

食物繊維グアーガムによる腸内細菌叢代謝および腸管免疫活性の変化は、大腸炎症への感受性を高める

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19490976.2024.2341457

Devendra Paudel,Divek V. T. Nair,Sangshan Tian,Fuhua Hao,Umesh K. Goand,Grace Joseph, すべて表示
論文 2341457｜2023年8月22日受理、2024年4月4日受理、オンライン版公開：2024年4月17日
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https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2341457
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要旨
腸の健康と有益な腸内細菌の増殖を促進する食物繊維（DFs）への関心が高まる中、加工食品に精製されたDFsを配合する例が増え続けている。グアーガムなどの精製された食物繊維が腸内細菌叢の活性や炎症性腸疾患（IBD）の病態にどのような影響を及ぼすかはまだ不明である。本研究では、幅広い加工食品に一般的に含まれる発酵性DF（FDF）であるグアーガムが、大腸炎発症に及ぼす影響とその基礎的メカニズムを明らかにした。その結果、グアーガム含有食（GuD）は大腸炎感受性を増加させた。具体的には、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)投与により、グアーガム食群はセルロース食対照マウスと比較して、体重減少、下痢、直腸出血、結腸長短縮などの重篤な大腸炎を呈した。血清アミロイドA(SAA)、リポカリン2(Lcn2)および大腸における炎症性マーカーの上昇、および大腸構造の広範な破壊は、GuD投与群がDSS介入により対照群よりも重篤な大腸炎を示すことをさらに確証した。抗生物質で前処置したGuD群における大腸炎の改善は、GuDが介在する腸炎症の悪化における腸内細菌叢の重要な役割を示唆している。腸内細菌叢の組成と糞便および糞便内容物の代謝物分析から、グアーガムは主に放線菌、特にビフィドバクテリウムを豊富にすることが明らかになった。また、グアーガムはバクテロイデス門とファーミキューテス門に属する複数の属を変化させた。このような腸内細菌叢組成の変化は、GuDを与えたマウスにおいて、中間代謝産物であるコハク酸および乳酸の管腔内蓄積を促進した。大腸のIL-18とタイトジャンクションマーカーもGuD食群で減少した。重要なことは、組換えIL-18で前処置したGuD飼育マウスでは、大腸炎が抑制されたことである。これらのことから、グアーガム摂取による腸内細菌叢活性の好ましくない変化が、乳酸およびコハク酸の管腔内蓄積、大腸IL-18の減少、腸管バリア機能の低下をもたらし、大腸炎感受性の亢進に関与していることが示唆された。

結論
グアーガムは大腸炎感受性を増加させた

グアーガムによる大腸炎の増悪は腸内細菌叢に依存する。

グアーガムにより誘導された微生物叢組成の変化は、管腔中間代謝産物であるコハク酸および乳酸の蓄積を促進した

グアーガムを与えたマウスでは、大腸のIL-18とタイトジャンクション分子のレベルが低下した。

外因性IL-18の投与は、グアーガム誘発大腸炎感受性を部分的に改善した。

キーワード：食物繊維の添加による腸内環境の悪化炎症性腸疾患コハク酸乳酸ビフィズス菌インターロイキン-18（IL-18）
はじめに
グアーガムは水溶性食物繊維で、Cyamopsis tetragonoloba L.の種子から抽出される。グアーガムは、アイスクリーム、ヨーグルト、プロセスチーズ、ベーカリー製品、サラダドレッシング、飲料などの市販食品に頻繁に使用されている。健康な腸内では、グアーガムが腸内細菌叢の組成を良好に変化させ、SCFA産生菌を増加させることが、いくつかの臨床および前臨床研究で示唆されている。

クローン病（CD）や潰瘍性大腸炎（UC）を含むIBDは、腸内細菌叢の組成と活性の乱れを伴う消化管の炎症をもたらす有害な免疫反応によって特徴づけられる。IBDの根底にあるメカニズムは完全には解明されていないが、遺伝的素因と、腸管免疫の恒常性を乱す非定型的な腸内細菌叢活性を含む環境的誘因の組み合わせが、疾患の発症と進行に大きく寄与しているCitation6,Citation7。Citation8,Citation9腸内細菌叢が産生する短鎖脂肪酸（SCFAs）、分岐鎖アミノ酸（BCAAs）、コハク酸などの主要代謝産物は、IBDの腸管炎症の制御に関与している可能性がある。SCFAにはプロピオン酸、酢酸、酪酸が含まれ、主に発酵性食物繊維（FDF）の細菌発酵によって産生される。引用10 BCAA（バリン、ロイシン、イソロイシン）を含む特定のアミノ酸は、CD患者において高濃度で検出され、タンパク質やアミノ酸の多い食事は実験的大腸炎を悪化させることが示されている。 引用11,引用12 トリカルボン酸（TCA）サイクルの中間産物であり、腸内細菌叢によって産生される代謝産物であるコハク酸は、IBDのヒトおよびマウスモデルにおいて上昇することが示されている。 引用13,引用14,引用14-17 さらに、CD患者ではコハク酸受容体(SUCNR1)の腸管発現が増加しており、Sucnr1を欠損したマウスでは腸の炎症と線維化の両方から保護されている。 引用15 総じて、腸内細菌叢組成の非典型的な変化に加えて、食事由来の微生物代謝産物の産生における変化が、腸内細菌叢が大腸炎症の進行に影響を及ぼす主な方法の一つである。

インターロイキン-18（IL-18）は、腸管上皮細胞（IEC）で構成的に発現するIL-1ファミリーサイトカインである。恒常的な条件下では、IECはIL-18の主要な供給源であり、腸管免疫応答を制御し、粘膜病原体に対する防御を提供している。プレボテラ属（Prevotella intestinalis nov.sp.）のコロニー形成が誘発する微生物組成および代謝のシフトは、大腸IL-18を減少させることが示されている。 引用21 タウリンは、タンパク質が豊富な食品に天然に存在するアミノ酸であるが、NOD様受容体（NLR）ファミリーメンバーであるNLRP6インフラマソームを活性化することにより、大腸摘出物においてIL-18の分泌を誘導することが示されている引用22 実験的知見から、IL-18は大腸炎の進行において二面的な役割を果たしていることが示された引用23 Nowarski R et al. 一方、Iljazovic Aらは、大腸炎を誘発する前に大腸IL-18産生が低下すると腸の炎症が悪化し、IL-18を補充すると腸の炎症が抑制されることを報告している。IL-18はDSS誘発大腸炎の重症度を改善することが示されており、おそらく上皮の修復に関与するIL-22の産生をアップレギュレートすることにより、上皮の再生効果を有することが判明している。引用21,引用23 正常な条件下では大腸上皮細胞によるIL-18のユビキタスな産生と、腸管バリアの完全性の維持と免疫応答の制御におけるIL-18の多面的な役割から、グアーガム誘発大腸炎感受性における大腸IL-18の役割を探索することになった。

グアーガムのような精製FDFを加工食品に配合することは、植物由来の食物繊維を十分に摂取することが胃腸の健康に有益であるというエビデンスに基づいて、食事の質を高めるために積極的に推進されている。しかしながら、単離されたFDFが全食品に含まれる天然のFDFと同等に有益であるかどうかについての理解はごくわずかである。本研究の目的は、単離されたグアーガムが腸内細菌叢の構成と腸炎症の発生に及ぼす影響を理解することであった。グアーガムは健常人に有益な効果をもたらすが、IBD患者におけるこの効果はまだ証明されていない。我々は、グアーガムが誘発する腸内細菌叢組成の非典型的シフトが、中間代謝産物（乳酸およびコハク酸）の蓄積を引き起こし、大腸IL-18産生を抑制し、マウスを大腸炎に罹患させることを報告する。

結果
グアーガムは大腸炎症への感受性を高める
大腸炎症に対するグアーガムの影響を調べるため、C57BL/6野生型（WT）マウスにセルロース（10％w/w、コントロール）またはグアーガム（7.5％グアーガム＋2.5％w/wセルロース）含有飼料（GuD；表1）を4週間与えた後、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）含有水を1週間与えた。一般に、C57BL/6 WTマウスに大腸炎を誘発するために、DSSは2.5% w/vから3% w/vの範囲で投与される。Citation25,Citation26 そこで、4週間後、マウスを2.8% w/vのDSSを含む飲料水に切り替えた。予想に反して、対照群およびGuD投与群ともに4日目から体重減少および直腸出血が認められた。2.8％DSSを投与されたGuD投与マウスのかなりの数が7日目に死亡した（50％；6匹中3匹、生存曲線は示していない）。この高い死亡率から、同様のデザイン（2.8％DSS）で別の実験を行ったが、より早い6日目で実験を終了した（図S1a）。DSS投与6日後でさえ、GuD投与群では体重が著しく減少した（初期体重の20%以上）（図S1b）。特に、対照群と比較して、GuD投与マウスでは、早期（4日目）の急激な体重減少、広範な直腸出血、血清リポカリン2（Lcn2）の高値、および死亡が観察され（図S1b-i）、グアーガムがDSS誘発大腸炎を悪化させたことが示された。注釈として、DSS介入前の4週目に3連で行った1時間糞便排出量測定では、Con群とGuD群との間に有意差は認められなかった（図S2）。このことは、腸管通過時間Citation27がこれら2群間で同等であることを示している。GuDをマウスに与えると大腸炎を起こしやすくなるかどうかをさらに検討するため、次にDSS濃度を従来よりも低濃度（1.4%）にして大腸炎を誘発した（図1(a)）。同様に、投与量を減らしたところ、GuD投与群は対照群と比較して有意な体重減少と結腸長の減少を示した（図1(b,c,e)）。DSSを投与したGuD投与マウスは、DSSを投与した対照群と比較して、ばらつきは大きいものの、脾臓重量が増加傾向を示した（図1（d））。さらに、組織学的解析の結果、GuD投与群では陰窩構造が比較的破壊され、粘膜および粘膜下層に広範な免疫細胞の浸潤が認められ（図1（fi,g））、グアーガムが大腸炎感受性を亢進させることが確認された。さらに、DSSを投与したGuD投与マウスは、アルシアンブルー染色面積およびムチン2免疫染色の減少から明らかなように、大腸ムチンの大幅な減少を示した（図1(fii-iii)）。免疫組織化学的染色では、GuD投与群ではDSS投与対照群と比較して大腸Lcn2発現が高いことが明らかになった（図1（fiv））。しかしながら、近位領域におけるELISAに基づく大腸Lcn2の測定では上昇傾向が認められたが（図1（h））、この差は統計学的有意差には至らず、これはおそらく近位結腸においてGuD投与群内で観察される変動性が高いためであろう。注目すべきは、DSSを投与したコントロールと比較して、GuDを投与したマウスは、全身のLcn2と血清アミロイドA（SAA）の有意な上昇を示したことである（図1(i,j)）。これらの観察と一致して、GuD投与群では大腸炎の重症度スコアが上昇した（図1（k））。基礎レベルでは、対照マウスとGuD投与マウスの間に大腸炎症マーカーに顕著な差は認められなかった（図1）。これらの結果から、GuDは上皮傷害によって引き起こされる大腸炎症と粘膜傷害を悪化させることが示された。

図1. グアーガムはDSS誘発急性大腸炎を悪化させた。

(a) 急性大腸炎に対するグアーガム（GuD）の影響を調べるために採用した実験デザイン。4週齢のWTマウス（各群n=6-7）をコントロール（Con）またはGuDで4週間飼育した後、DSS（1.4% w/v）含有水に7日間切り替えて大腸炎を誘発した。(b）体重の変化率。(c)結腸の外観 (d)脾臓の重量 (e)結腸の長さ (e) 結腸長。(f i-iv)の代表的画像： H&E(i)およびアルシアンブルー(ii)染色結腸切片（原倍率100倍）。(iii-iv)ムチン2（Muc2）（iii、緑）およびLcn2（iv、赤）に対する免疫組織化学的染色を示した結腸切片。核を可視化するためにDAPIを用いた［青、（原倍率、×200）］。(g) H&E染色した結腸切片の盲検評価による病理組織学的スコア。(h-j) 大腸と血清のLcn2とSAA。(k) 疾患の重症度は、体重減少、便の硬さ、便潜血、および病理組織学的変化のスコア（0-4）を合計することにより評価した。値は平均値±SEMで示した。(d-eおよびg-k）一元配置分散分析、多重比較検定。*p< .05、***p< .01、***p< .001、***p<.0001。
図1. グアーガムはDSS誘発急性大腸炎を悪化させた。
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表1. コントロールおよびグアーガム食餌組成。

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腸内細菌叢はグアーガム摂取マウスにおける大腸炎の増悪を媒介する
Citation28,Citation29具体的には、欧米食や抗生物質への曝露などの環境因子は、大腸炎発症を促進する微生物叢組成の不均衡を誘導する。腸内細菌叢の役割を調べるため、抗生物質と抗真菌剤のカクテル（Abx）を飲水で投与し、腸内に存在する微生物群集を破壊した。3週間GuDまたは対照食で維持したAbxマウスと無処置マウスを、7日間DSS含有水に切り替えた（図2（a））。Abx混合水はDSS介入期間中は中止した。驚いたことに、Abxの介入は対照群のDSS誘発大腸炎を予防できなかった（図2（b-k））。注目すべきことに、微生物叢の枯渇はGuDを与えたマウスの大腸炎を改善し、それは体重回復の改善、脾臓重量の減少、およびDSSのみの群よりも増加した結腸長によって証明された（図2（b-e））。H&Eおよびアルシアンブルー染色、ならびにMuc2およびLcn2免疫染色により、DSS投与対照群と比較して、陰窩の破壊がかなり少なく、杯細胞が増加し、ムチンの産生が亢進し、Lcn2の発現が減少していることが明らかになった（図2(f,g)）。これらの観察と一致して、Abx投与群では大腸および血清Lcn2レベル、ならびに血清SAAが有意に減少した（図2（h-j））。重要なことは、Abxの介入により、DSSで治療したGuD食群では、全体的な疾患重症度スコアが低下したことである（図2（k））。これらの結果は、腸内細菌叢がグアーガム媒介性大腸炎に対する感受性を悪化させる役割を果たしていることを示した。

図2. 抗生物質を介した腸内細菌叢の減少により、グアーガム投与マウスはDSS誘発大腸炎から回復した。

(a)混合抗生物質の投与スケジュールを示す実験デザイン。実験群には通常飼料（NT）または抗生物質混合飼料（Abx）を与え、Con飼料またはGuD飼料で飼育し、最終週にDSS（1.4% w/v）に切り替えた。(b）体重の変化率。(c)結腸の外観。(d) 脾臓重量。(e）結腸の長さ (f) 結腸の代表的なH&Eおよびアルシアンブルー染色像（i-ii、原倍率100倍）、およびMuc2（iii、緑）およびLcn2（iv、赤）の免疫染色切片（原倍率200倍）] (g) H&E染色結腸切片の盲検評価から得られた病理組織学的スコア。(h) 大腸Lcn2。血清(i) Lcn2と(j) SAA。(k)疾患重症度スコア。平均値±SEMで示されたデータは2つの独立した実験から得られたものである。対応のないt検定。* p < .05、** p < .01、*** p < .001、*** p < .0001。
図2. 抗生物質を介した腸内細菌叢の枯渇は、GuDを与えたマウスを黄砂誘発性大腸炎から救った。
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グアーガムは腸内細菌叢の組成を変化させ、放線菌叢を濃縮する
発酵性食物繊維は、腸内細菌叢の組成および機能の主要な調節因子の一つである。興味深いことに、GuDを与えたマウスでは、微生物叢が減少すると黄砂誘発性大腸炎症が改善した。したがって、我々は、GuDによって誘導された微生物叢組成のシフトが、大腸炎に対する感受性を増大させる可能性があると推測した。次に、炎症のないマウスにグアーガムまたは対照食を5週間与えた後の腸内細菌叢組成の変化を評価した（図3（a））。16S rRNA分析から得られたPrincipal Coordinate Analysis（PCoA）プロットは、高いばらつきはあるものの、グアーガム食と対照食との間で糞便微生物叢組成の違いを示した（図3（b））。さらに、シャノン多様性指数分析により、GuD投与マウスではコントロールと比較して微生物叢α多様性がわずかに減少していることが示された（図3（c））。Microbiome Multivariable Associations with Linear Models（MaAsLin2）ベースの統計解析による詳細な微生物叢組成解析では、放線菌門、バクテロイデス門、およびファーミキューテス門に属する細菌群に特異的な変化がみられた。より具体的には、放線菌門の相対的な存在量は、対照群よりもGuD群で大幅に高かった（図3（d））。Citation32。バクテロイデス門のうち、GuD群ではバクテロイデス属が有意に減少し（図3（f））、アロプレボテラ属は横ばいであった。ファーミキューテス門は、しばしばSCFAやBCAAの産生に関連するが、GuDの介入に反応して最も高い変化を示した（図3(g)）。特に、複合糖質発酵の主要な最終産物として主に乳酸を産生する乳酸桿菌の相対量は、GuD介入に反応して増加した（図3(gi)）。対照的に、GuD投与マウスではClostridia-UCG.014 その減少は、CD患者の健常な近親者におけるバリア機能の低下と関連していることが見出されている。興味深いことに、グアーガム摂取により減少した（上記の）細菌株のほとんどは、UC患者においても同様の傾向、すなわち減少を示した。

図3. グアーガムを与えたマウスは、腸内細菌叢にアクチノバクテリオータを濃縮するシフトを示した。

(a) グアーガム（GuD）摂取マウスにおける腸内細菌叢プロファイルの変化を調べるための実験レイアウト。4週齢のWTマウス（n= 5-7/群）を5週間ConまたはGuD食で飼育した。糞便は無菌的に採取し、16S rRNAの塩基配列決定に用いた。(b-g)コントロールマウスとGuD食マウスの微生物シグネチャー。(b)主座標解析（PCoA）プロットによる微生物叢プロファイルの比較 (c)シャノン指数により算出したα多様性。(d) 門レベルでの微生物組成の相対的存在量と分布。ボックスプロットは、GuD介入後の放線菌の濃縮を表す。(e-g)属レベルで顕著に変化した細菌分類群の平均相対存在量。各図の箱ひげ図は、全リード数に対する相対存在量を百分率でプロットしたもの。値は平均値±SEMで示した。(d-g) MaAsLin2 (Multivariate association with linear models) アプローチを用いて統計解析を行った。q値（Benjamini-Hochberg偽発見率補正）<0.05を有意とみなした。
図3. グアーガムを与えたマウスでは、腸内細菌叢が変化し、アクチノバクテリオータが濃縮された。
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グアーガムは腸管内腔でのコハク酸の産生を促進し、大腸でのコハク酸受容体の発現を上昇させる。
食物繊維は微生物発酵の主要な基質であり、食物繊維発酵由来の微生物代謝産物は腸管免疫ホメオスタシスおよび腸管バリア機能に影響を及ぼす。そこで次に、GuDによる微生物代謝産物の変化を評価するために、1H NMRベースのメタボロミクスによって、糞便内容物中の微生物代謝産物を定量した。Gud摂取群では、コントロールと比較して、SCFAである酢酸、酪酸、プロピオン酸の糞便中レベルは変化しなかった（図4（a））。分岐鎖アミノ酸（BCAA）であるバリンとイソロイシンのレベルは、GuD投与マウスで有意に増加した（図4（b））。特に、腸管内腔での異常上昇が大腸炎の重症度と関連する乳酸は、GuD投与マウスで増加した（図4(c)）。さらに重要なことは、コハク酸受容体1(Sucnr1)Citation13-15,Citation39を介した炎症シグナルを促進するコハク酸が、GuD投与マウスの糞便内容物において大幅に増加（〜4倍）していたことである（図4(d)）。このようなグアーガム介入による管腔内乳酸とコハク酸の増加は、それらの生産者であるビフィドバクテリウム（40倍以上）Citation32（図3(e)）とラクトバチルス（5倍以上）Citation40,Citation41（図3(gi)）の異常な増加と、それらの代謝産物（バクテロイデスおよびラクノクロストリジウム）の減少（図3fiiおよびgvii）と一致していた。Citation15,Citation42コハク酸は、プロピオン酸を生成する中間体に速やかに変換されるため、腸管内腔では通常低値である。低酸素環境下での微生物発酵は、主に、フマル酸がコハク酸に変換されるクレブスサイクル反応の部分的逆転（コハク酸デヒドロゲナーゼ活性の逆転）の結果としてコハク酸を産生する（オキサロ酢酸→リンゴ酸→フマル酸→コハク酸）。Citation43,Citation44 コハク酸の直接の前駆体であるフマル酸のレベルが上昇していることがわかり（図4（e））、TCAの部分的逆転が管腔内のコハク酸蓄積に寄与していることが示唆された。細胞外のコハク酸はSucnr1（別名Gpr91）によって感知されるが、mRNA発現および免疫組織化学的解析から、GuD群ではコハク酸受容体Sucnr1の大腸発現が亢進していることが示された（図4（f,g））。以上のことから、グアーガムによる腸内細菌叢の非定型的な変化は、炎症を起こした腸に一般的に存在する管腔代謝産物の蓄積を促進した。

図4. グアーガムによる腸内細菌叢代謝の変化は、乳酸およびコハク酸を含む中間代謝産物の内腔蓄積と関連していた。

4週齢のWTマウス（各群n = 7-8）をConまたはGuD食で5週間飼育した。セカ（糞便内容物とともに）をチューブに採取し、直ちにスナップ凍結した。約50mgの糞便内容物を定量的1H NMRによる代謝物分析に用いた。バイオリンプロットは、糞便内容物のμmol/gで測定した代謝物を示す。(a）短鎖脂肪酸（SCFA、酢酸、プロピオン酸、酪酸）（b）分岐鎖アミノ酸（BCAA、バリン、ロイシン、イソロイシン）。(c) 乳酸 (d) コハク酸 (e) フマル酸。(f-g)ConマウスまたはGuDマウスから得た大腸サンプルを用いて、(f)Sucnr1のmRNAレベル、(g)免疫組織化学によるSucnr1の大腸発現パターンを測定した。値は平均値±SEMで示した。(a-cおよびe-f) 対のないt検定、(d) 対のないノンパラメトリックマンホイットニー検定。* p < .05、** p < .01、*** p < .001。
図4. グアーガムによる腸内細菌叢代謝の変化は、乳酸およびコハク酸を含む中間代謝産物の管腔蓄積と関連していた。
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グアーガム摂取マウスでは粘膜バリアマーカーの発現が変化し、粘膜免疫のスイッチが乱れる
粘液層と腸管上皮内膜は重要な防御ラインを形成している。無傷の粘膜バリアは微生物の侵入を制限し、腸管免疫反応を微調整し、腸の炎症を予防するCitation45-47。そこで次に、大腸ムチン、上皮接合分子、炎症マーカーに対するグアーガム摂取の影響を評価した。定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）に基づく解析の結果、グアーガム摂取群では、膜関連ムチン1（Muc1；エピシアリンとしても知られる）の大腸mRNAレベルが対照群よりも低下していた（図5（a））。しかし、分泌型ムチンであるムチン2（Muc2）、膜結合型ムチンであるMuc3、Muc4の発現はコントロールと比較して有意な変化はなかった（図5(b-d)）。タイトジャンクションマーカーであるオクルディン（Ocln）、ゾナオクルディン-1（Zo-1）、クローディンのメンバー（クローディン-8とクローディン-12）は、対照群に比べGuD投与マウスで減少した（図5(e,f,k,l)）。大腸上皮接着因子E-カドヘリン1の発現もGuD群では低下していた（図5(m)）。逆に、クローディン-3（図5(i)）のmRNAレベルは、GuD投与マウスで上昇した。クローディン-1、クローディン-2およびクローディン-7を含むタイトジャンクションタンパク質の発現は、GuD食餌に反応して変化しなかった（図5(g,h,j)）。GuDを与えたマウスでは、粘膜バリア機能マーカーにこのような差のある変化が見られ、大腸炎になりやすかったと考えられる。しかし、グアーガムを介したこれらのバリア機能遺伝子の大腸発現の変化が、どのように大腸炎への感受性を媒介するのかを理解するためには、今後の研究が必要である。

図5. グアーガムはムチンと粘膜バリアタンパク質の大腸mRNA発現を抑制した。

4週齢のWTマウス（n= 5-6/群）をConまたはGuD食で5週間飼育した。(a-d)ムチンMuc1、Muc2、Muc3、Muc4、(e-l)タイトジャンクションタンパク質オクルディン(Ocln)、ゾヌラオクルデンス-1(Zo 1)、クローディン、(m)E-カドヘリン1の大腸mRNA発現。(a-m) 対のないt検定。* p < .05、** p < .01、*** p < .001。
図5. グアーガムはムチンと粘膜バリアタンパク質の大腸mRNA発現を抑制した。
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次に、グアーガムがベースラインレベル（炎症のない状態）で炎症性遺伝子の大腸転写レベルを変化させたかどうかを調べた。コントロールマウスとGuDを与えたマウスの大腸組織における免疫マーカーを比較すると、誘導性一酸化窒素合成酵素（iNos）の発現が亢進し、インターロイキン-6（Il-6）の発現が増加傾向にあった（図6（a,b））。驚くべきことに、GuDを与えたマウスでは大腸のIL-18転写レベルが減少した（図6(c)）。GuDを与えたマウスにおけるIL-18のこのような減少は、大腸タンパク質の測定（図6(d)）および免疫組織化学（図6(e)）によって確認された。図5および図6で報告された結果と合わせて、グアーガム摂取マウスが大腸炎を起こしやすいことは、大腸ムチンおよびタイトジャンクション遺伝子の発現低下と炎症性遺伝子の発現上昇を伴っていることを明らかにした。興味深いことに、大腸のIL-18レベルはmRNAおよびタンパク質の両レベルで大幅に減少していた。

図6. グアーガムを与えたマウスは大腸IL-18の発現が減少した。

4週齢のWTマウス（各群n = 4-5）をConまたはGuD飼料で5週間飼育した。安楽死後、大腸組織を採取し、RNAとタンパク質の抽出と免疫組織化学染色を行った。(a-c)iNos、Il-6、Il-18の大腸mRNA発現。(d）ELISAによる大腸IL-18の評価。(e)大腸IL-18免疫染色（緑）の代表的画像（原倍率、×200）]。値は平均値±SEMで示した。(a-d) 対のないt検定。* p < .05、** p < .01、*** p < .001。
図6. グアーガムを与えたマウスは大腸IL-18の発現が減少した。
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IL-18の補充はグアーガム飼育マウスの大腸炎感受性を部分的に救う
引用48 ノックアウトマウスモデルや外因性組換えIL-18（rIL-18）投与を用いた研究により、IL-18の大腸炎に対する保護作用（引用21,引用49）と有害作用（引用24）の両方が示されている。上記で報告したように、GuDを投与したマウスでは、大腸のIL-18が転写産物レベルでもタンパク質レベルでも減少していることが観察された。これらのマウスでは、特に上皮細胞におけるIL-18の大腸発現も低下していた。そこで、グアーガムによる大腸IL-18の抑制が大腸炎感受性の上昇に寄与していることを理解するために、GuD食で4週間（28日間）飼育したマウスのサブグループにrIL-18を投与した。具体的には、rIL-18を29、30、31日目に投与し、その後マウスを34日目にDSSに切り替えるか、または水での飼育を継続し、1週間大腸炎の発症を観察した（図7（a））。ビヒクル処置群と比較して、rIL-18投与は、体重の回復および脾臓重量の減少によって証明されるように、実際にDSS誘導大腸炎症に対する防御を提供した（図7（b-d））。予想されたように、DSS処置群では結腸が短縮した；しかし、rIL-18処置は結腸の長さの有意な回復を示さなかった（図7（e））。大腸Lcn2レベルは、rIL-18を補充したGuD飼育マウスで減少した（図7（f））。基礎レベルでは、体重、脾臓重量、結腸長およびLcn2において、ビヒクル投与群とrIL-18投与群との間に有意差は観察されなかった（図7（b-f））。DSS誘発大腸炎症からの救済に対するrIL-18投与の効果をさらに特徴付けるために、組織化学的および免疫組織化学的分析によって大腸スイスロール切片を調べた。rIL-18の投与または非投与の非DSS処置GuD飼育マウスの結腸切片は、アルシアンブルーおよびMuc2免疫染色によって証明されるように、無傷の陰窩構造とムチンを含む杯細胞を示した（図7（g））。DSSを投与したGuDマウスでは、陰窩構造が消失し、粘膜下層に免疫細胞が広範囲に浸潤していた。注目すべきことに、rIL-18を投与したDSS処置GuD飼育マウスは、陰窩構造の崩壊および免疫細胞の浸潤が比較的少なく、ムチンを含む杯細胞数が多く、大腸Lcn2発現が減少したことから、rIL-18による前処置がDSS誘発の組織学的崩壊を部分的に予防したことが示唆された（図7（g，h））。さらに、rIL-18は、炎症マーカーであるLcn2およびSAAの血清レベルの低下をもたらした（図7（i,j））。総じて、rIL-18で前処置したGuD飼育マウスは、全体的な疾患重症度スコアの改善を示した（図7（k））。GuDを介した大腸iNosの上昇（図6（a））がマウスを大腸炎に罹患させやすいかどうかを調べるために、iNOS活性阻害剤1400Wでマウスを処理し、DSS誘発大腸炎のマーカーについて調べた（図S3）。興味深いことに、ビヒクル投与群も1400W投与群も同程度の大腸炎を示したことから（図S3b-i）、グアーガムの介入に反応するiNOS誘導は、GuD飼育マウスの大腸炎感受性に寄与していないことが示唆された。総合すると、iNOS活性阻害による大腸炎の改善が見られないこと、およびrIL-18補充による前処置で大腸炎症が改善したことから、大腸IL-18の減少がGuD飼育マウスを大腸炎に罹患させやすくするという観察が強化された。

図7. 外因性IL-18の投与により、GuD飼育マウスの大腸炎の重症度が低下した。

(a）大腸炎の重症度に対する外因性組換えIL-18（rIL-18）の効果を評価するための実験レイアウト。4週齢のマウス（各群n = 4-5）を4週間GuDで飼育し、ビヒクル（PBS）またはrIL-18を1μg/マウス（PBS中）の用量で3日間連続して腹腔内に投与した後、DSS（1.4％w/v）含有水または水のみに7日間切り替えた。(b)体重変化率 (c)結腸の外観。(d) 脾臓重量 (e) 結腸長。(f) 大腸Lcn2。(g i-iv)H&E(i)とアルシアンブルー(ii)で染色した結腸切片の代表像（原倍率100倍）。大腸切片をMuc2（iii、緑）およびLcn2（iv、赤）で免疫染色した（原倍率200倍）。(h) H&E染色結腸切片の盲検評価から得られた病理組織学的スコア。(i) Lcn2および(j) SAAの血清レベル。(k) 疾患重症度スコア。値は平均値±SEMで示した。(b)対応のないt検定、(d-fおよびh-k)一元配置ANOVA、多重比較検定。*p< .05、***p< .01、***p< .001、***p<.0001。
図7. 外因性IL-18投与により、GuD投与マウスの大腸炎重症度は軽減した。
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考察
FDFsの摂取が健康に良いことは何十年も前から報告されている。引用50-53 FDFは腸内細菌叢の主要な栄養源であるため、腸内細菌叢の組成と活性を良好に調節できる可能性がある。健康な腸内では、グアーガムを含むFDFは微生物叢の組成に有益な影響を及ぼす。IBD患者のサブグループでは、ある種の食物繊維を摂取すると耐性が低下し、炎症が亢進することが報告されているため、Citation52,Citation54-56では、グアーガムの摂取が、広範な腸内細菌叢異常によって特徴づけられる進行中の大腸炎症において、腸の健康に有益であるかどうかはよくわかっていない。今回の前臨床研究では、食品添加物であるグアーガムがマウスモデルの実験的大腸炎を悪化させることから、IBD患者の臨床症状を悪化させる可能性があることを証明し、炎症を起こしている腸におけるFDFの効果についての理解を深めた。我々は、グアーガム介入に伴う腸内細菌叢の組成および活性の変化、ならびに腸管バリア機能および免疫の変化が、腸炎感受性の亢進と関連していることを証明した。

1800年代の産業革命の到来に伴い、食生活とライフスタイルの変化により、加工食品の消費量が増加し、それがIBDの出現と一致した。20世紀末までに、IBDの発症率と有病率は、先進工業国と新興工業国の両方で加速した。欧米の食生活において食物繊維が重視され続けた結果、食物繊維を強化した製品が開発され、一般の人々が日常的に摂取するようになったが、これらの精製された食物繊維がIBD患者やIBDのリスクを持つ人々に与える影響はまだ明らかではない。一般に、IBD患者が疾患の再燃を経験した場合、食物繊維の摂取を避けることが実際には推奨されているが、避けるべき特定の種類の食物繊維に関する我々の現在の理解は限られているため、これらの推奨は科学的根拠に基づいていない。驚いたことに、グアーガムは大腸炎誘発物質である黄砂によって誘発された大腸炎を増悪させた。IBDの正確な原因はまだわかっていないが、腸内細菌叢に対する免疫応答の異常とともに、細菌叢の組成と活性の乱れがIBDへの感受性を高める主な要因のひとつである。抗生物質と抗真菌剤のカクテルで前処置した実験マウスは、GuDを与えたマウスの大腸炎をかなり抑制したことから、グアーガムが介在する大腸炎感受性に腸内細菌叢が関与している可能性が示唆された。しかし、対照群では同様の介入を行ってもDSS誘発大腸炎から保護されなかったことは驚くべきことである。このことは、腸内細菌叢とその代謝活性が対照群で観察された大腸炎の主な要因ではない可能性を示唆しているが、抗生物質が介在する黄砂誘発性大腸炎への感受性を含む他の交絡因子を否定することはできない。 引用59 興味深いことに、抗生物質投与は黄砂誘発性上皮傷害を増加させることが示されている。この研究は、抗生物質投与マウスにおいて、残存する微生物叢の量（抗生物質投与後）と制御性T細胞の反応が黄砂誘発性疾患の重症度を調節することを示唆している。対照食とグアーガムが、抗生物質投与後の微生物叢組成と大腸免疫応答をどの程度異なる形で調節するかについては、さらなる調査が必要である。総合すると、抗生物質を投与したGuDマウスでDSS誘発性大腸炎が抑制されたことは、グアーガム存在下で変化した微生物叢組成と活性がマウスの大腸炎を増強するという我々の知見を補強するものである。抗生物質介入法は、グアーガム誘発性大腸炎素因に腸内細菌叢が関与していることを示しているが、それには一定の限界がある。これには、腸内細菌叢の除去が不完全であること、GuD投与マウスにおける大腸炎感受性の亢進に腸内細菌叢が関与していることを立証できないことなどがある。糞便微生物叢移植を含む今後の研究は、グアーガムによって誘導された腸内細菌叢異常がGuD飼育マウスの大腸炎感受性の原因となる役割を決定するのに有用であろう。大腸炎症に対するグアーガムの有害作用が腸内細菌叢によって媒介されることを考慮し、我々はグアーガムによって誘導される腸内細菌叢組成の変化とその代謝活性を調べようとした。その結果、グアーガムが腸内細菌叢の組成をどのように変化させ、宿主を大腸炎に罹患しやすくするのかについて、重要な示唆が得られた。門レベルでは、対照群と比較してアクチノバクテリオータ門の異常な拡大が観察された。まさに、グアーガム摂取マウスでは、ビフィドバクテリウムの増加がアクチノバクテリオータの過剰な増加に寄与していたのである。Citation60ビフィドバクテリウム属に属するB. pseudolongumは一般に抗炎症作用があると考えられており、潰瘍性大腸炎の実験的マウスモデルにおいて疾患の重症度を改善することが示されている。Citation61反対に、活動性のIBD患者では、酪酸産生菌の消失とともにビフィドバクテリウムとラクトバチルスが増加することが報告されており、疾患時のプロバイオティクスとしての使用に注意が必要である。 引用62 腸内細菌叢の組成をさらに解析したところ、グアーガムによってバクテロイデス門とファーミキューテス門の属レベルで変化が起こり、コハク酸および乳酸産生菌（ビフィドバクテリウム属とラクトバチルス属）の増殖を促進し、それらの利用菌（バクテロイデス属）を減少させることで、乳酸やコハク酸などの中間代謝産物の濃縮が促進されることが明らかになった。 Citation63,Citation64,Citation66中間代謝産物の相互供給は、多様性の高い健康な微生物叢に不可欠な要素である。Citation67具体的には、乳酸とコハク酸はその後、DF発酵の主要な最終産物であるSCFAsCitation43,Citation64-66に発酵する。従って、グアーガムを摂取したマウスの腸管内腔にコハク酸および乳酸が蓄積していることは、腸内細菌叢の代謝および交差摂食関係が破綻していることを示しているCitation17,Citation63 さらに、微生物の交差摂食は、盲腸のSCFAレベルに大きな影響を及ぼす。したがって、これらの中間代謝産物の管腔内蓄積は、GuD投与マウスでSCFAレベルが変化しなかった理由を説明する。これまでの研究で、IBDにおけるコハク酸の増加が示され、コハク酸の炎症促進作用が指摘されている。引用13 コハク酸はGタンパク質共役型受容体Sucnr1にシグナルを送るが、その発現は炎症性マクロファージで増加している。 引用文献68 Sucnr1の欠失は、腸の炎症に対して保護効果を示す。引用文献15 我々は、GuDを与えたマウスにおいて、コハク酸受容体Sucnr1の大腸発現の増加を観察し、コハク酸の上昇がSucnr1に関与することによって腸の炎症を増強している可能性を示唆した。腸管内腔では、食物繊維発酵の中間産物として乳酸が生成される。Citation43,Citation63,Citation64内腔に乳酸が蓄積することは、微生物間の相互摂食が阻害されるなどの腸内細菌叢の異常と考えられる。IBD患者は、全身および糞便中の乳酸の上昇を示しCitation38,Citation69,Citation70、腸内炎症との関連において、乳酸は炎症反応の開始と持続の両方に関与する可能性があるCitation70,Citation71。

グアーガムによって腸内細菌叢がどのように乱されると大腸炎に罹りやすくなるのかを明らかにするための継続的な取り組みとして、腸管バリア機能と免疫マーカーの基礎レベルでの変化を調べた。その結果、大腸のタイトジャンクションマーカーの発現が減少し、誘導性一酸化窒素合成酵素（iNOS）をコードするNos2のmRNAレベルが上昇した。引用72 興味深いことに、iNOSの選択的阻害剤である1400Wによる介入は、GuD飼育マウスにおける黄砂誘発性大腸炎の進行に影響を与えなかった。このことは、グアーガム摂取による大腸iNOSの上昇が、大腸炎感受性の亢進に寄与していない可能性を示唆している。注目すべきは、グアーガム摂取マウスでは大腸IL-18が大幅に減少したことである。腸管IL-18が腸の炎症を促進するのか抑制するのかについてはまだ議論の余地がある。NowarskiらによるIL-18シグナル伝達に関連した複数のKOマウスモデル（上皮細胞特異的KOマウスを含む）を用いたエレガントな研究24は、IL-18が大腸炎を促進することを示した。最近、Chiang HYCitation20による別のエレガントな研究では、IL-18が宿主防御を高めることによってIL-22依存性の防御効果を媒介することが示された。事実、IL-18-/-マウスは、細菌クリアランスが損なわれ、AIEC感染に対してより感受性が高いことが判明した。腸の炎症に対するIL-18のこのような相反する作用は、ノックアウトマウスを用いたり、リコンビナントIL-18を外因的に投与したりした複数の研究で観察されている。我々の研究では、グアーガムを与えたマウスでは大腸のIL-18が減少し、rIL-18を投与したGuDマウスはDSS誘発大腸炎から救済された。このことは、グアーガムによる大腸IL-18の抑制が、GuD飼育マウスに大腸炎を引き起こしやすくしていることを示している。これと同様に、Iljazovic Aらによる研究（引用文献21）でも、rIL-18の投与がマウスの大腸炎症の重症度に対して保護効果を示した。Citation21。我々の研究では、同じPrevotellaceaeに属するAlloprevotellaは、コントロールマウスとグアーガム食マウスの間で同程度であったことから、大腸IL-18の抑制は別のメカニズムで起こることが示唆され、大腸IL-18抑制の正確なメカニズムを解明するためにさらなる研究が必要である。大腸炎症におけるIL-18の役割は時間依存的であり、病気の初期にはIL-18は保護的な役割を持ち、後期には有害な影響を及ぼすと考えられる。さらに、IL-18は上皮の修復に関与するIL-22をアップレギュレートすることが分かっている。我々の結果と既存の研究とを合わせると、外因性IL-18の保護作用が示された一方で、DSS誘発大腸炎における内因性IL-18の役割は十分に理解されていない。IL-18をマウスに前投与すると、黄砂誘発大腸炎を抑制することができる引用23。したがって、黄砂介入前にIL-18を投与したGuDマウスで観察された大腸炎の改善は、黄砂誘発大腸炎に対するIL-18の一般的な効果かもしれない。グアーガム摂取による大腸炎の後期におけるIL-18の減少の役割については、さらなる検討が必要である。

グアーガムによって誘発された微生物叢組成の変化は、腸管内腔に乳酸とコハク酸を蓄積させた。このような中間代謝産物の異常蓄積は、腸管バリア機能の変化や免疫恒常性の破綻（大腸IL-18の減少）とともに、グアーガム摂取マウスにおける大腸炎感受性を総体的に増大させた。本研究は、活動性IBD患者やIBD発症リスクの高い人々など、一部の人々には精製グアーガムの摂取を控えるよう注意を促している。さらなる研究、特にヒト集団におけるIBD関連合併症に対するグアーガム摂取の効果をより明確に示すことができるランダム化臨床試験または集団ベースの研究が必要である。グアーガムによって誘発される微生物活性の変化、特に炎症を起こしている腸における変化の役割についてさらに調査を進めることで、食物繊維-腸内細菌叢の相互作用とIBD発症への影響についてより深い理解が得られるであろう。グアーガム摂取により大腸炎を発症しやすくなることは、グアーガムが主に超加工食品に添加されていることから特に重要である。

材料および方法
マウスおよび飼料
C57BL/6バックグラウンド、野生型（WT）マウスは、ペンシルベニア州立大学（University Park, Pennsylvania）で特定の病原体フリー条件下で飼育された。マウスは飼育され、コーンコブを敷き詰めたケージ（4～5匹/ケージ）に入れられた。マウスは餌と水に自由にアクセスできた。実験条件は、ペンシルバニア州立大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeの承認を得た。サンプルサイズ計算により統計的に有意なデータを得るための遺伝子型ごとの最小マウス数は4～7匹とした（α = 0.05, β = 0.80）。実験飼料はResearch Diets, Inc.（ニュージャージー州ニューブランズウィック）で調製し、グアーガム繊維はTIC Gums Inc.（米国メリーランド州）から供給された（純度88%）。食物繊維セルロースとグアーガムの供給源を含む全飼料の組成は表1に示す。

DSS誘発大腸炎
WTマウス（雄または雌；4-5週齢；食餌のみ群（n = 6-7）および食餌+DSS群（n = 6-8））を、コントロール（Con）（セルロース10% w/w）またはグアーガム（GuD）含有食餌（GuD 7.5% + Con 2.5% w/w）で4週間飼育した。その後、1.4％DSS（w/v）を7日間飲水投与し、大腸炎症を誘発した。DSS投与期間中、すべてのマウスはそれぞれの食物繊維を含む飼料で飼育された。大腸炎の指標として、体重、軟便、血便、軽度の下痢などの重症度をモニターした。DSS投与7日目にマウスを安楽死させ、サンプルを採取した。急性大腸炎に対するグアーガムの効果を調べるため、腸内の生理的・代謝的変化、リポカリン2や血清アミロイドA（SAA）などの炎症性サイトカインの発現、大腸の肉眼的外観、大腸の長さ、脾臓の重量、体重、組織化学的染色を調べた。

広域抗生物質混合投与
WT雄マウス（各群n = 4-6）を6週齢までチョウ飼料で飼育した。その後、投与群のマウスには、1週間はチャウ食、3週間はGuD含有食を与え、4週間は飲料水を介して広域スペクトル抗生物質を投与した。対照群のマウスは抗生物質なしで同様の治療を受けた。抗生物質は広域スペクトル抗生物質［アンピシリン（1 g/L）、ネオマイシン（1 g/L）、メトロニダゾール（1 g/L）、バンコマイシン（0.5 g/L）］と抗真菌剤［アムホテリシンB（10 mg/L）］を混合した。3週間後、抗生物質の投与を中止し、両群に1.4％DSSを7日間飲水投与して大腸炎症を誘発した。7日目にマウスを安楽死させ、サンプルを採取した。体重、軟便、血便、軽度の下痢などの疾患症状の重症度をモニターし、臨床転帰を読み取った。

組換えIL-18（rIL-18）による介入
4週齢のWTマウスにGuDを4週間与え、4群に分けた（各群n＝4-6）。rIL-18の介入手順は、Seregin SSらによる研究（引用76）およびLevy Mらによる研究（引用22）から採用した。29日目から31日目まで、2群に遺伝子組換えマウスインターロイキン-18（rIL-18、1μg/マウス；BioLegend）を投与し、別の2群にはビヒクルを腹腔内（i.p.）投与した。最後の注射から2日後、実験群はDSS（1.4％w/v）を含む水に切り替えるか（GuD＋veh.＋DSSおよびGuD＋rIL-18＋DSS）、通常の水を継続した（GuD＋veh.＋水およびGuD＋rIL-18＋水）。DSS投与7日後、マウスを安楽死させ、大腸炎マーカーを分析するためのサンプルを採取した。マウスは試験期間中GuDで維持した。

iNOS阻害剤1400Wによる処置
上記のrIL-18介入手順に記載したように、マウスをGuD給餌4週間後に2群に再編成した（1群あたりn＝4〜6）。次に、両群とも、veh.または選択的iNOS阻害剤N-[3-(アミノメチル)ベンジル]アセトアミジン(1400W、Calbiochem)を5mg/Kg体重の用量で7回i.p.注射した(1日1回)。1回目の注射後、1群にはDSS（1.4％w/v）を投与し、もう1群には水を飲ませた。DSS投与7日後に両群を安楽死させ、サンプル採取とその後の解析を行った。実験期間中、すべてのマウス群にGuDを投与した。

マウスの安楽死とサンプル採取
実験マウスは二酸化炭素（CO2）曝露により安楽死させた。その後、門脈から血液を採取し、血清分離チューブ（Becton Dickinson）に移した。血清分離チューブ中の血液を遠心分離すると、溶血のない血清が得られた。大腸組織を氷冷PBSで洗浄し、直ちに液体窒素またはドライアイスを入れた容器に移し、蛋白抽出を行った。RNA分析用の大腸組織は、RNA late solution（Sigma Aldrich）中に-20℃で保存した。大腸の組織学的検査では、近位端から遠位端までスイスロールを形成し、中性緩衝ホルマリン（NBF）に24時間浸漬した。その後、大腸を70％エタノールに浸し、パラフィンブロックに包埋して5μmの断面を作成し、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色を行うためにPenn State Universityの動物診断研究施設に提出した。

疾患の重症度評価
大腸炎症の重症度を評価するために、以前に記載された方法（引用77,引用78）に若干の修正を加えた複合重症度評価法を開発した。表2に概略を示すように、各マーカーに対して0〜4のスコアを割り当てた： 1）初期体重に対する体重減少、2）便の硬さ（下痢の有無）、3）便中の血液の有無、4）組織学的スコア。最終的なスコアは、各マーカーのスコアを合計して算出した。

表2. 重症度評価のための複合スコアリングシステム。

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RNA単離cDNA調製および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
定量的PCR（qPCR）は免疫機能とタイトジャンクションマーカーをコードする大腸遺伝子の発現を評価するために利用された。RNA extraction kit (GE Healthcare)およびqScriptTM XLT cDNA supermix kit (QuantaBio)を用い、それぞれメーカーのプロトコールに従って、RNA later (Sigma)溶液に保存した大腸組織を用いて全RNAを抽出し、相補的DNA(cDNA)に変換した。抽出した RNA の濃度と純度は NanoDrop spectrophotometer（Thermo Scientific）で測定した。マイクログラム（1μg）のRNAを逆転写し、cDNAを調製した。免疫機能とタイトジャンクションマーカーをコードする遺伝子の発現は、QuantStudio 3 Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いて測定した。本研究で評価した遺伝子のプライマー配列を表3に示す。転写レベルの差はハウスキーピング遺伝子36B4で正規化して定量し、データは2 -ddCTとして報告した。

表3. プライマー配列。

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酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）
大腸組織を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を添加した抽出バッファー（50mM Tris, pH7.4, 250mM NaCl, 5mM EDTA, 50mM NaF, 1mM Na3VO4, および1％洗剤を含む；Invitrogen™）中でホモジナイズした。大腸ホモジネートを13,000×g、4℃で12分間遠心し、上清を分析まで-80℃で保存した。大腸IL-18およびLcn2のレベル、ならびに血清SAAおよびLcn2のレベルは、製造業者の手順（R&D Systems）に従ってELISAにより測定した。大腸IL-18およびLcn2のレベルは、組織タンパク質含量で正規化し、組織タンパク質mgあたりとして示した。

組織化学染色および免疫組織化学染色
組織化学的染色のために、パラフィン包埋結腸切片をLeica autostainer XL（Leica Biosystems）を用いて脱パラフィンした。H&E染色切片を用いて、陰窩構造の変化、潰瘍形成、粘膜肥厚、過形成、免疫細胞浸潤を評価した。製造業者のプロトコールに従って、Alcian Blue Stain Kit（Vector Laboratories Inc）を用いて、酸性粘液を含む杯細胞を同定するために、脱パラフィンした切片でアルシアンブルー染色を行った。次に、ムチン2（MUC2、Abcam）、Lcn2（R&D Systems）およびIL-18（Invitrogen）の発現を評価するために、結腸切片の異なるセットを免疫組織化学染色に用いた。具体的には、まず切片を脱パラフィンした後、あらかじめ温めたクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）にスライドを移し、ウォーターバスで98℃、20分間インキュベートすることにより抗原回収を行った。冷却後PBSで洗浄し、0.3% Triton X-100 (VWR Life Sciences)を含む10%ロバ血清で切片を室温で90分間インキュベートすることにより、非特異的部位をブロックした。一次抗体（Lcn2、IL-18またはMUC2）を1％ウシ血清アルブミン（BSA）と0.3％トリトンX-100を含むPBSで希釈し、切片に塗布して4℃で一晩インキュベートした。その後、切片をPBSで洗浄し、二次抗体Alexa Fluor 488（抗ウサギIgG）と37℃で90分間インキュベートした。組織は、DNA染色用に4',6'-ジアミノ-2-フェニルインドール（DAPI）を含む退色防止試薬でマウントした。画像はすべてLeica DMi8顕微鏡（Leica Microsystems）で撮影した。

病理組織学的評価
Citation26,Citation90簡単に述べると、各結腸は粘膜、粘膜下層、筋層/漿膜の上皮障害と炎症浸潤の程度に基づいて4つのスコアが付けられた。 Citation90 4つのスコアのそれぞれに、変化が限局性であれば係数1、斑状であれば係数2、びまん性であれば係数3を乗じCitation26、結腸ごとの4つのスコアを加算した結果、マウス1匹あたりの総スコア範囲は0-36となった。

1H NMR ベースのメタボロミクスによる代謝物の評価
NMRを用いたメタボロミクスにより、コントロールマウスおよびGuD投与マウスから得られた糞便内容物（～50 mg）中の代謝物を定量した。先行研究（Citation53,Citation91-94）で述べたように、5 mm TCIクライオプローブとSampleJetサンプルチェンジャーを装備したBruker Avance NEO 600 MHzスペクトロメーター（Bruker Biospin）を用いて、糞便内容物抽出物の1Hスペクトルを298 Kで記録した。noesygppr1dパルスシーケンスは、緩和および混合時間中の飽和前水分抑制を伴う1H 1D実験の記録に使用された。使用したパラメータは、スペクトル幅20ppm、時間領域データポイント64K、取得時間2.75秒、緩和遅延5秒、混合時間100ms、スキャン数64（ダミースキャン4）である。すべての1 H NMRスペクトルは、Chenomx NMR Suite（Chenomx Inc.バージョン10）で自動的に処理された後、各スペクトルの位相、ベースライン、化学シフト基準（TMSP、0.00 ppm）を手動でチェックおよび調整し、品質要件を満たした。代謝物を同定し、構築済みライブラリを使用して適合させ、代謝物濃度を内部標準（TMSP、0.29 mM）に従って計算した。

16S rRNA遺伝子配列決定による微生物叢解析
16S rRNA遺伝子の増幅と配列決定は、Earth Microbiome Project（www.earthmicrobiome.org/emp-standardprotocols）のプロトコールに従って、Illumina MiSeqテクノロジーを用いて実施した。簡単に説明すると、16S rRNA遺伝子、領域V4は、それぞれのサンプルからのPCR産物にタグを付けるために使用されるGolayエラー修正スキームで設計された、ユニークな12塩基のバーコードを含む複合フォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、各サンプルからPCR増幅した。 使用した806 Rプライマーは、5'-CAAGCAGAAGACGGCATACAGAGTCAGCCAGCAGCAGCCAGCAGCGCCGGACGACTCACGCGGACTACGCGACTACNVGGGTWTCTAAT-3'である：斜体の配列はイルミナアダプターの3'逆相補配列、太字の配列はプライマーパッド、斜体の太字の配列はプライマーリンカー、下線の配列は保存された細菌プライマー806 Rである。PCR反応は5PRIME HotMasterMix（Quantabio, Beverly, MA, USA）0.2μMの各プライマー、10-100ngの鋳型からなり、反応条件は以下のように設定した： 反応条件は、95℃で3分、95℃で45秒、50℃で60秒、72℃で90秒のサイクルを30回繰り返した。PCR産物をゲル電気泳動で可視化し、Quanti-iT PicoGreen dsDNA assayを用いて定量した。） 精製産物から等モル比でマスターDNAプールを作製し、続いてAmpure磁気精製ビーズ（Agencourt, Brea, CA, USA）で精製した。得られた精製プールをQuanti-iT PicoGreen dsDNAアッセイで定量し、続いてフランス、パリのCochin InstitutにあるGENOM'ICコア施設でIllumina MiSeqシーケンサー（ペアエンドリード、2×250bp）を用いて塩基配列を決定した。

16S rRNA遺伝子配列解析
QIIME2-version 2022を16s rRNA配列の解析に使用した。Citation96 これらの配列は、QIIME2のデフォルトパラメーターでDada2メソッドCitation97を使用して、イルミナアンプリコン配列データを検出および補正するために、デマルチプレックスおよびクオリティフィルターを行い、Qiime2アーチファクトのテーブルを作成した。その後、align-to-tree-mafft-fasttreeコマンドを用いて系統多様性解析用のツリーを作成し、core-metrics-phylogeneticコマンドを用いてαおよびβ多様性パラメータを計算した。主座標分析（PCoA）プロットを用いて実験グループ間の変異を評価した（β多様性）。アルファ多様性はEvenness指数で計算した。分類学的解析では、SILVA参照データベースとのペアワイズ同一性が99%の閾値を持つ操作的分類単位（OTU）に特徴を割り当てた。Microbiome Multivariable Associations with Linear Models (MaAsLin2)アプローチを採用し、有意に豊富な微生物群集を同定した。

統計解析
データの正規分布は、D-Agostino-Pearsonオムニバス正規性検定で検定した。データは平均値±平均値の標準誤差（SEM）で表した。2群間の統計的有意性の検定には、対応のない両側t検定を用いた。2群以上を比較する場合は、一元配置分散分析検定に続いてTukeyの多重比較検定を用いた。p値が0.05未満は統計的に有意とみなされた。すべての統計解析にはGraphPad Prism 7.0プログラム（GraphPad, Inc.）を用いた。

補足資料
補足資料
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謝辞
著者らは、イルミナシーケンスに協力いただいたGenom'ICプラットフォーム（Institut Cochin, Paris, France）に感謝する。

情報開示
利益相反の可能性は報告されていない。

データの利用可能性に関する声明
本研究の結果を裏付ける微生物叢シーケンスデータは、European Nucleotide Archiveのアクセッション番号PRJEB64411で公開される。

補足資料
本論文の補足データは、https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2341457 からオンラインでアクセスできる。

追加情報
資金提供
本研究は、クローン病・大腸炎財団のCareer Development Award [ID# 597229]およびNIH award [R01DK133334-01A1]の支援を受けた。D.P.はNIH助成金[T32DK120509]の支援を受けている。BCの研究室は、欧州連合（EU）のHorizon 2020研究・革新プログラムの下、欧州研究会議（ERC）からのスターティンググラント（助成金契約No. [ERC-2018-StG- 804135]、IdEx Université de ParisのChaire d'Excellence（ANR-18-IDEX-0001）、Kenneth Rainin財団のInnovator Award、Fondation de l'Avenirの賞[AP-RM-21-032]、ANRの助成金EMULBIONT[ANR-21-CE15-0042-01]とDREAM[ANR-20-PAMR-0002]、INSERMの国家プログラム "Microbiote "の支援を受けている。
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