バイオマスの少ないヒト母乳サンプルにおける微生物組成とシェアリングの解析：DNA分離と配列決定技術の比較

2023年11月10日 19:46

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出版：2023年11月09日
バイオマスの少ないヒト母乳サンプルにおける微生物組成とシェアリングの解析：DNA分離と配列決定技術の比較

https://www.nature.com/articles/s43705-023-00325-6

Johanne E. Spreckels, Asier Fernández-Pato, ...Alexandra Zhernakova 著者一覧を見る
ISME Communications 第3巻記事番号：116 (2023) この記事を引用する

メトリクス詳細

要旨
ヒトミルクマイクロバイオーム研究は、現在、ミルク細菌／ヒト細胞比が低いことが障害となっており、多くの場合、16S rRNA遺伝子配列決定に依存しているため、下流の分析が制限されている。ここでは、乳汁中の細菌を研究し、母親と乳児の微生物叢間の細菌の共有を評価する方法を見つけることを目的とした。4種類のDNA分離法、2種類の細菌濃縮法、3種類のシークエンシング法を、模擬コミュニティ、ミルクサンプル、陰性コントロールで試験した。4種類のDNA分離キットのうち、DNeasy PowerSoil Pro（PS）キットとMagMAX Total Nucleic Acid Isolation（MX）キットは、コンタミネーションが少なく、一貫した16S rRNA遺伝子のシーケンス結果が得られた。いずれの濃縮法も、ヒトメタゲノムシーケンスのリードデプスを大幅に減少させませんでした。ロングリード16S-ITS-23S rRNA遺伝子シーケンスでは、模擬群集組成に偏りが見られたが、コンタミネーションはほとんどなく、牛乳サンプルで一貫した結果が得られた。16S rRNA遺伝子シーケンスとは対照的に、14組の母子ペアから得られたミルク、乳児の口腔、乳児の糞便、および母親の糞便DNAの16S-ITS-23S rRNA遺伝子シーケンスは、無関係なペアと比較して、関連ペア間で有意により頻繁に共有される細菌を検出するのに十分な解像度を提供した。結論として、PSキットまたはMXキットによるDNA分離後に16S rRNA遺伝子配列を決定することで、ヒトの母乳微生物叢を確実に特徴付けることができ、16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列を決定することで、生物量の少ないサンプルにおける細菌伝播の研究が可能になる。

はじめに
母乳育児は乳児に栄養を与え、乳児の健康上の利点と関連している [1, 2]。母乳育児が乳児の健康に影響を及ぼす可能性のある一つの方法は、腸内細菌叢を調節することである [3]。ヒト乳で育てられた乳児が一旦摂取すると、乳汁微生物は発育中の乳児の腸に定着し [11,12,13,14,15,16]、乳児の免疫系の成熟と健康に影響を及ぼす [3, 17, 18]。しかし、ヒトの母乳微生物叢の起源や、乳幼児期の腸への微生物供給源としての母乳の研究は、方法論的な課題によって妨げられてきた。

ヒトの母乳は微生物バイオマスが低く、1mlの母乳あたり～105～106個の細菌細胞を含んでいる[9, 11]。また、ミルクには多くの栄養素が含まれており、これがミルクDNAの分離を複雑にしている[12,19,20,21]。牛乳から分離されたDNAの90％以上は、微生物由来ではなくヒト由来であることが多い[12,19,20,21]。そのため、現在までのほとんどの乳汁微生物相研究は、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングに依存しており、細菌や古細菌は検出されるが、分類学的分類や微生物の移行を研究する能力には限界がある [7]。メタゲノム配列決定は、これらの限界を解決するものであるが、生乳サンプルは生物量が少なく宿主汚染が多いため、方法論的に困難なままである [12,19,20,21]。

本研究では、分類学的解像度を向上させ、低バイオマスのミルクサンプルにおける細菌伝播の研究を可能にするサンプル調製およびシーケンス戦略を明らかにすることを目的とした。試験した4種類のDNA分離キットのうち、DNeasy PowerSoil Pro（PS）キットとMagMAX Total Nucleic Acid Isolation（MX）キットはコンタミネーションが少なく、一貫した結果が得られた。また、メタゲノムシーケンスの前に2つの細菌濃縮法を試験したところ、濃縮は限定的であった。最後に、ロングリード16S-ITS-23S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスは、16S rRNA遺伝子シーケンスと比較して分類学的分類を改善しなかったことを示す。それでも、14組の母子ペアのサンプルを分析したところ、16S-ITS-23S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスは、血縁関係にある母子ペアにおいて、血縁関係にない母子ペアと比較して、ヒトの母乳と乳児の口腔および糞便の間で有意に高い頻度で細菌が共有されていることを検出するのに十分な解像度を提供した。

方法
サンプル
試験法サンプル
オランダのLifelines NEXT出生コホート[22]に参加している3人の母親から、産後1.5ヵ月（ミルク-1）、2ヵ月（ミルク-2）および6ヵ月（ミルク-3）にヒト乳汁検査検体を採取した。Milk-1とMilk-3は3回の汲み取りで採取され、サンプルはプールされ、5分間上下にピペッティングしてホモジナイズされた。分注した（プールした）ミルクは、使用するまで-20℃で保存した。ポジティブコントロールとして、ZymoBiomics Microbial Community Standard（「細菌モックコミュニティ」、D6300、Zymo Research社、米国カリフォルニア州アーバイン）およびZymoBiomics Microbial Community DNA Standard（「DNAモックコミュニティ」、D6305、Zymo Research社）の2種類のモックコミュニティを使用し、製造元の説明書に従った（D6300はバージョン1.1.5、D6305はバージョン1.1.6）。両モックコミュニティ（「理論モック」）の予想組成を表S1に示す。陰性対照には、滅菌した0.45 µm酢酸セルロースフィルター（514-0063, VWR, Radnor, Pennsylvania, USA）でろ過したDEPC処理水（46-2224, Invitrogen, Waltham, Massachusetts, USA）を用いた。

パイロットサンプル
ミルク（n = 14）、母親の糞便（n = 14）、乳児の糞便（n = 14）および乳児の口腔スワブ（n = 14）を、産後3ヵ月のLifelines NEXT母子14組から採取した。母親は、特に乳房組織を洗浄することなく、普段使用しているさく乳器を用いて、深夜0時以降2回目の授乳から、その乳房からの最後の授乳から少なくとも2時間後に、片方の乳房（できれば右側の乳房）から母乳を採取するよう求められた。母親は平均（範囲）90（20～200）mlの母乳を分泌した。母親は母乳を穏やかに振って均質化し、プラスチック製スポイトピペット（H10041、MLS、Menen、ベルギー）を用いてクライオチューブ（122279、Greiner Bio-One、Kremsmünster、オーストリア）に分注した。糞便サンプルを採取し、プラスチック製スポイトピペットを用いてクライオチューブに分注した。乳および糞便サンプルは家庭用冷凍庫で-20℃で保存した。乳児の口腔サンプルは、研究看護師が家庭訪問時に、綿棒（479165、Paul Hartmann、Heidenheim、Germany）を乳児の頬の内側と舌の下に沿って、綿棒が唾液で完全に濡れるまで優しく動かして採取した。綿棒は500μlのPowerBead Solution（12955-4-BS、Qiagen、Venlo、オランダ）を入れたクライオチューブに入れた。その後、研究看護師がすべての検体を輸送可能な冷凍庫で研究室に運び、検体は分析まで-20℃（短期）または-80℃（長期）で保存された。牛乳の平均（範囲）総保存期間は17ヵ月（14～22ヵ月）であり、他の試料タイプでは27ヵ月（24～30ヵ月）であった。

試験法試料の DNA 分離
4種類のDNA分離キット（PSキット（47014、Qiagen）、MXキット（AM1840、Thermo Fisher、Waltham、Massachusetts、USA）、Milk Bacterial DNA Isolation（MD）キット（21550、Norgen Biotek、Thorold、Canada）およびQIAamp Fast DNA Stool Mini（FS）キット（51604、Qiagen）を用いて、試験法サンプルからDNAを分離した。DNAは、3.5 mlのサンプルインプットを用いて、3連キット（PSキット）または2連キット（MX、MD、FSキット）でミルクおよび陰性対照から単離した。模擬細菌群集からの DNA は、75 µl の模擬細菌群集サンプルと 3.425 ml の DEPC 処理水を混合し、キットごとに 1 回単離した。単離手順の詳細は後述する。すべてのDNA溶出液は、さらに処理するまで-20℃で保存した。

DNeasy PowerSoil Pro キット
サンプルを 13,000 × g、4 °C で 15 分間遠心した。脂肪分（牛乳サンプルの場合）と上清を除去した。ペレットを800 µlの溶液CD1に再懸濁し、PowerBead Proチューブに移し、短時間ボルテックスした。細胞を溶解するため、サンプルを65℃で10分間インキュベートし、Precellys Evolution Homogenizer（Bertin Instruments, Rockville, Maryland, USA）を用いて4℃で45秒間5000rpmでビーズビートした。その後、サンプルを15,000×g、4℃で1分間遠心した。最後に、「DNeasy PowerSoil Pro Kit with Inhibitor Removal Technology Protocol」（バージョン2018年5月）を用いて、Qiacube（Qiagen）上で溶出量50 µlで600 µlの上清からDNAを自動抽出した。

MagMAX 全核酸単離キット
ビーズチューブを短時間遠心分離し、235 µl Lysis/Binding Solution を添加した。サンプルを13,000×g、4℃で15分間遠心した。脂肪分（牛乳サンプルの場合）と上清を除去した。ペレットを175μlのリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、サンプルをビーズチューブに移しました。サンプルは、Precellys Evolution Homogenizerを用い、4℃で6800rpm、90秒間のビーズビートを2回行った。その後、製造元の説明書（2008 年 7 月版 P/N 4385118 Revision C）に従い、プロトコールステップ B.II.3 から手動で DNA を単離し、30 µl の Elution buffer で溶出した。

ミルク細菌 DNA 分離キット
サンプルを 20,000 × g、4 °C で 2 分間遠心した。脂肪分（牛乳サンプルの場合）と上清を除去した。ペレットを、リゾチームを含む100 µlの再懸濁液Aに再懸濁し、新しいチューブに移した。その後、製造元の説明書（2015年版PI21550-4）に従い、プロトコールのステップ1B.dから DNAを単離し、DNAを50 µlのElution Buffer Bで溶出した。

QIAamp Fast DNA Stool Miniキット
サンプルを13,000×g、4℃で15分間遠心した。脂肪分（牛乳サンプルの場合）と上清を除去した。InhibitEX バッファーをウォーターバスで 42℃に加熱し、結晶が溶解するまで 10～15 分間加熱した。ペレットを500μlのInhibitEX緩衝液に懸濁し、最大速度で1分間ボルテックスした。サンプルを新しいチューブに移し、ヒーティングブロック（5355, Thermomixer Comfort, Eppendorf, Hamburg, Germany）上で95℃で10分間インキュベートした。その後、サンプルを16,300×gで1分間遠心し、200μlの上清を、溶出量100μlの「QIAamp Fast DNA Stool Mini Protocol for Isolation of DNA from Stool from Pathogen Detection」（バージョン2014年3月）を用いて、Qiacubeでの自動DNA抽出に使用した。

パイロットサンプルのDNA分離
各パイロット検体からPSキットを用いてDNAを1回分離した。牛乳検体については、上述のように3.5 mlの牛乳からDNAを単離した。糞便および口腔スワブについては、上述の熱インキュベーションおよび細菌溶解ステップの前に、分離手順を適応させた。約0.2-0.5 gの糞便と800 µlの溶液CD1をPowerBead Proチューブに加え、短時間ボルテックスした。PowerBead溶液中の口腔スワブを3分間激しくボルテックスし、スワブを取り除き、1サンプルあたり～400 µlの溶液をPowerBeadチューブに移しました。最終容量が800 µlになるように溶液CD1を加え、サンプルを短時間ボルテックスした後、熱インキュベーションステップからプロトコルを続けた。DNAはさらに処理するまで-20℃で保存した。

DNA定量
DNA濃度を測定するために、Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit (Q33230, Invitrogen)をメーカーの説明書（バージョンMAN0017455 Rev. C.0）に従って使用した。

定量的PCR
細菌を定量化するために、Supplementary Methodsに記載されているように、16S rRNA遺伝子の定量的PCR（qPCR）を用いた。

16S rRNA遺伝子の塩基配列決定とデータ処理
ライブラリーの調製と16S rRNA遺伝子の塩基配列決定には、ドイツのChristian-Albrecht University of KielのInstitute of Clinical Molecular BiologyでDNAを使用した。細菌16S rRNA遺伝子のV3-V4領域は、3μlのDNAと357F（5′-CCTACGGAGGCAGCAG-3′）および806R（5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′）プライマーペアを用いて、Kozichら[23]のデュアルバーコードアプローチに従って増幅した。PCR産物をゲル電気泳動でチェックし、SequalPrep Normalisation Plate Kit (A1051001, Thermo Fisher)を用いて正規化し、サンプルあたり1.85 ngのPCR産物を用いてプールした。プールしたライブラリーは、Illumina MiSeq v3システム（2×300bpペアエンドシーケンス、Illumina社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）でシーケンスした。

シーケンス後、バーコード配列のゼロミスマッチに基づいてサンプルを非多重化した。Cutadapt（バージョン2.6）を用いてシーケンスリードからアダプターとプライマーを除去した。Trimmomatic（version 0.39、パラメータ：ペアエンドモード、SLIDINGWINDOW:4:25、MINLEN:50）を用いてリードのクオリティトリミングを行った。読み取り品質はFastQC（バージョン0.11.5）とMultiQC（バージョン1.7）で調べた。DADA2パイプラインの改良版（バージョン1.16、https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html）を使用して、アンプリコン配列バリアント（ASV）テーブルを構築した。簡単に説明すると、少なくとも160 bpの長さのトリミングリードを使用して、エラーレートを学習し、ノイズ除去し、ASVテーブルを作成した。キメラは除去され、400-431 bp長のASVのみが保持された。SILVA（バージョン138.1）およびFANGORNデータベース（GTDB Full 207 database, https://melbourne.figshare.com/articles/dataset/Fangorn_rrn_Database/20086916 [24]）を使用してASVに分類子を割り当てた。葉緑体およびミトコンドリアと割り当てられたASVはSILVAデータセットから削除した。相対存在量はSILVAとFANGORNの両データセットについて計算した。

16S-ITS-23S rRNA遺伝子の塩基配列決定とデータ処理
16S-ITS-23S rRNA遺伝子の塩基配列決定に用いるDNAは、Shoreline WaveTM StrainIDTM kit (WAVESID-A, Shoreline Biome, Farmington, Connecticut, USA)を用い、メーカーの説明書（バージョンUSM-050-0）に従って調製した。ライブラリー調製と配列決定はBaseClear社（オランダ、ライデン）で行った。簡単に説明すると、サンプルには固有のバーコードが付けられ、約2500 bp長の16S-ITS-23S rRNA遺伝子断片がシングルステップPCRで増幅された。アンプリコンをプールし（サンプルあたり5 µl PCR産物）、SMRTbell®ライブラリー調製に使用し（100-938-900, PacBio, Menlo Park, California, USA）、PacBio Sequel System（PacBio）のSequel II SMRT Cell 1台でシーケンスし、サーキュラーコンセンサスリードを作成した。

サンプルは、SBanalyzerソフトウェア（バージョン3.1-2、Shoreline Biome）を使用して、配列決定リードからプライマーを除去した。DADA2パイプラインを16S-ITS-23S rRNA遺伝子シーケンスデータに適応させた。リードはフィルターされ、変更された設定（minQ=2, maxEE=5, trimLeft=20, trimRight=0, minLen=1900, maxLen=3000）でトリミングされ、デリプレートされ、エラーレートの学習、ノイズ除去、ASVテーブルの構築に使用された。キメラは除去された。FANGORNデータベース[24]を用いて分類名を付与し、相対量を算出した。

細菌の濃縮とショットガンメタゲノムシーケンス
低張溶菌・ベンゾナーゼ処理（HL-Benz）[25]と低張溶菌・プロピジウムモノアジド処理（HL-PMA）[26]の2種類の細菌濃縮法を試験サンプルに用い、その後DNA単離とショットガンメタゲノムシークエンシングを行った。これに関する詳細な説明はSupplementary Methodsにある。

統計解析
フィッシャーの正確検定とマン・ホイットニーのU検定を用いて、それぞれカテゴリーパラメーターと連続パラメーターを比較した。連続パラメータを2つ以上のカテゴリー間で比較するには、Kruskal-Wallis検定とDunnのpost hoc検定を用いた。連続変数間の相関を調べるには、スピアマンの順位相関を用いた。

相対細菌量を中心対数比変換し、乳サンプルを固定効果として補正した線形回帰モデルを用いて方法間で比較した。Rパッケージveganのvegdist関数を用いて、分類された属または（未）分類種の相対存在量に基づいてサンプル間のAitchison距離を算出した。これらの距離を用いて、模擬群集または乳および陰性対照サンプルをクラスタリングし、adonis関数を用いて「距離行列を用いた変量解析」を用いてサンプル間の細菌組成を比較した。

ヒトミルクと母乳および乳児サンプル間の細菌ASVの共有を探索するために、少なくとも2つの関連サンプルペアに存在する属に属するASVを選択し、Rパッケージmsaを用いてClustalW法を用いて多重配列アライメント（MSA）で整列させた。MSAに基づいて、snp-dists（バージョン0.7.0、https://github.com/tseemann/snp-dists）を用いて、各属のASVのハミング距離行列を作成した。この行列を用いて、ASV共有の可能性のある事象（サンプルペアにおける同一のASVの存在）を検出し、その頻度をFisherの正確検定を用いて、関連するサンプルペアと関連しないサンプルペア間で比較した。さらに、RAxML-NG（バージョン1.3、https://github.com/amkozlov/raxml-ng）を用い、GTR+Gモデルおよび1000ブートストラップ複製を用いて、Streptococcus ASVの系統樹を作成した。

すべての統計解析はRStudio（バージョン1.1.463）またはR（バージョン4.2. 2）で作成した。Rパッケージape [27]、cowplot [28]、dplyr [29]、FSA [30]、ggplot2 [31]、ggdendro [32]、ggpubr [33]、msa [34]、plyr [35]、reshape [36]、phangorn [37, 38]、seqinr [39]、stringr [40]、tidyr [41]、vegan [42]を用いた。P値はBenjamini-Hochberg法で調整した。偽発見率（FDR）＜0.05を統計的に有意とみなした。

結果
研究デザイン
4種類のDNA分離法、2種類の細菌濃縮法、3種類のシークエンシング法を、細菌およびDNAモックコミュニティ、陰性対照、3種類のヒト乳サンプルを用いて試験した。次に、最も性能の良いDNA分離法の1つ（PSキット）と2つのシークエンシング法（16Sおよび16S-ITS-23S rRNA遺伝子シークエンシング）を14組の母子ペアのサンプルに適用し、ヒトミルク、母体および乳児の糞便、乳児の口腔スワブ間での細菌共有の検出能力を調査した。

DNA分離法の比較
効率的で信頼性の高い母乳DNA分離法を見つけるため、FS、MD、PS、MXキットを試験用サンプルでテストした（図1A）。DNA分離の後、16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定し、SILVAデータベースを用いて分類した。

図1：DNA分離方法の比較。
図1
4種類のDNA分離キットを用いて試験サンプルからDNAを分離し、16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定した。細菌分類はSILVAデータベースを用いて割り当てられ、すべての結果は分類された属に基づいている。A DNA分離プロトコールに関する情報。B 4種類のDNA分離キットで分離した模擬群集、DNA模擬群集（DNA-Mock、ライブラリー調製開始時に追加）、理論模擬群集（Theor-Mock、表S1参照）を含む模擬群集の相対細菌量。模擬群集はAitchison距離に基づいてクラスタ化されている。C 4種類のDNA分離キットで分離したミルクサンプルの相対細菌数。棒グラフの上の数字は、それぞれのサンプルのシーケンスリード数を示す。少なくとも2つのサンプルに存在し、どのサンプルでも相対存在量が少なくとも2％である分類された細菌属のみを示す。より低い有病率および存在量で存在する属、または属レベルの分類がない属は、「その他」に集約されている。D ミルクサンプルと陰性コントロールのAitchison距離行列の主座標分析（PCoA）プロット。PCoAによって説明される分散の割合は、軸のラベルに示されている。ドットの色はサンプル（タイプ）を示す。ドットの形はDNA分離方法を示す。楕円は95％信頼区間を示す。サンプルタイプ、サンプル（ドナー）、DNA分離方法は、乳サンプルのみを比較し、陰性対照を除いた場合を含め、細菌組成に有意な影響を与えた（Adonis、FDR < 0.05）。FS QIAamp Fast DNA Stool Mini kit, MD Milk Bacterial DNA Isolation kit, PS DNeasy PowerSoil Pro kit, MX MagMAX Total Nucleic Acid Isolation kit, LibPrep Library preparation.

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モックコミュニティとネガティブコントロール
細菌モックコミュニティからのDNA収量は、MDキットが最も高く、PS、MX、FSキットがそれに続いた（表1A）。シーケンスリード数が最も多かったのはFSキットで、次いでMD、MX、PSキットの順でした（表1A）。分離した模擬細菌群集の細菌組成を、理論的模擬組成（表S1）およびDNA模擬群集の結果の両方と比較した。4つのDNA分離法すべてから、模擬群集で予想される8つの細菌属すべてが検出されたが、それらの相対的な存在量は方法によって異なっていた（図1B）。MXキットとPSキットで分離された模擬細菌群集の組成は、理論的組成に最も近かった（図1B）。一方、MDキットとFSキットで分離された模擬細菌群集は、さらに離れてクラスター化し、Bacillus属とLimosilactobacillus属（MDキット）またはEscherichia-Shigella属（FSキット）が増加し、Staphylococcus属（両キット）が減少した。細菌の種レベルの特性解析は、模擬シーケンスリードの0.5～3.4%でのみ可能であった（表1A、図S1）。FSキットで分離した模擬細菌群集では、予想外にビフィドバクテリウムの痕跡が検出された（相対存在量0.02%未満）。

表1 4つの異なるDNA分離法で分離した模擬群集（A）、陰性対照（B）、および牛乳サンプル（C）のDNA収量とシーケンスパラメーター。
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すべての陰性コントロールのDNA濃度はメソッドの検出限界以下であり、リードカウントも低かった（中央値（範囲）： 742（0-4 890）リード）であった（表1B）。MXキットで分離した陰性コントロールのリード数の中央値が最も低く、次いでPS、FS、MDキットの順であった（表1B）。分離陰性対照からは、Cutibacterium、Enhydrobacter、Escherichia-Shigella、Pelomonasがよく検出された（図S2、表S2）。

牛乳サンプル
牛乳サンプルからの DNA 収量中央値は、MD および FS キットに比べ、PS および MX キットで有意に高かった（FDR=0.001、表 1C）。MDキットはFSキットおよびPSキットより有意にリード数が多く、MXキットはPSキットより有意にリード数が多かった（FDR < 0.05、表1C）。牛乳から検出された細菌属数の中央値は、分離方法間で同程度であった（表1C）。

9つの細菌属が生乳サンプルの少なくとも70％に存在した： Acinetobacter、Corynebacterium、Cutibacterium、Enhydrobacter、Gemella、Rothia、Staphylococcus、StreptococcusおよびVeillonellaであった（図1C、表S3）。生乳サンプルで最も多く検出された細菌属（生乳サンプル1つ以上で相対存在量15％以上）は、Staphylococcus属（全キット）、Streptococcus属（全キット）、Cutibacterium属（FSおよびMXキット）、Corynebacterium属（FSおよびPSキット）、Gemella属（MDキット）およびExiguobacterium属（FSキット）であった（図1C）。

乳汁全体の細菌組成（β多様性）は母親間で有意に異なっていた（R2 = 0.37、FDR = 0.002、図1D）。DNA分離法も乳汁のβ多様性に有意に影響し（R2 = 0.19、FDR = 0.01、図1D）、乳汁中で最も頻度の高い9属のうち5属の相対量がDNA分離法間で有意に異なっていた（コリネバクテリウム属、クチバクテリウム属、ロチア属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、すべてFDR < 0.05、表S3）。重要なことに、牛乳の細菌組成は陰性対照のそれと有意に異なっていた（R2 = 0.17、FDR = 0.002、図1D）。さらに、全陰性コントロールのシーケンスリード数の中央値（742リード）は、全乳サンプル（37,093リード、p < 0.001）よりも有意に低かった。牛乳および陰性対照で検出された細菌を表S4に示す。クチバクテリウムは4キットすべてで、エンヒドロバクターは3キットで、生乳および対応する陰性対照から検出された（表S4）。

次に、生乳サンプルの結果における潜在的な汚染の程度を定量化した。生乳サンプルと対応する陰性コントロールの両方から検出されたASVは、潜在的な汚染物質とみなされた。DNA分離法を比較したところ、汚染の可能性のあるASVを含むシーケンスリードの割合に有意差は見られなかった（表1C）。しかし、陰性コントロール中のASVに対応するリードの割合は、FSキットとMXキットで分離した生乳サンプルで最も差が大きく、MDキットとPSキットで分離した生乳サンプルで最も差が小さくなりました（表1C）。単離とライブラリー調製の陰性対照を比較すると、コンタミネーションはDNA単離時には頻繁に（DNA単離法全体で0.1～39.1％の範囲）導入されるが、ライブラリー調製時には非常にまれ（0～0.7％の範囲）であると結論づけられた（表S4）。また、DNA収量とコンタミネーションの割合の間には有意な負の相関が見られたが（Spearman's rho = -0.56, FDR = 0.005）、ミルクシーケンシングリード数とコンタミネーションの割合の間には見られなかった（FDR = 0.98）。

これらの分析から、PSキットとMXキットは模擬群集をよく表現し、コンタミネーションが少なく、生乳サンプルの複製で同様の16S rRNA遺伝子シーケンス結果が得られたことから、生乳DNA分離に最も適していると結論づけた。(1)ネガティブコントロールと共有するシーケンシングリードの最大パーセンテージがPSキットの方がMXキットよりも小さかったこと、(2)PSキット用のDNA分離ロボットがラボにあったこと、(3)MXキットの溶出ステップでミルクDNA溶出液から磁気ビーズを分離するのに苦労したこと。次の試験を続ける前に、PSキットがヒトミルク1mlあたり中央値で105の16S rRNA遺伝子コピー数を検出したことをさらに示した（表1C）。

細菌の濃縮とメタゲノム配列決定
次に、メタゲノム配列決定に先立ち、牛乳の細菌DNAを濃縮することを目的とした。ここでは、HL-BenzとHL-PMAという2つの細菌濃縮法とメタゲノミックシークエンシングを組み合わせて試験サンプルで試みた（表S5）。HL-Benz法で調製したサンプルでは、ライブラリーの調製やシーケンシングはうまくいかず、HL-PMA法で調製した9つのミルクサンプルのうち4つと細菌モックコミュニティでのみ成功した。配列決定できた9つの非濃縮乳サンプルと5つのHL-PMA濃縮乳サンプルについて、配列決定リードの少なくとも98.8%はヒト由来であり、微生物由来は中央値でわずか1%未満であった（表S5）。したがって、これらの細菌濃縮法ではヒト由来のリードの割合が大幅に減少することはなく、したがってメタゲノムシーケンスと組み合わせてヒト乳サンプルに使用するのは効率的ではないと結論した。

16Sおよび16S-ITS-23S rRNA遺伝子シーケンスの比較
次に、乳微生物叢プロファイリングの分類学的解像度を向上させることを目的とした。そのために、PSキットを用いて試験サンプルDNAを単離し、16S-ITS-23Sおよび16S rRNA遺伝子配列決定の両方に供した（図2A）。シーケンス法間の結果を比較するため、全長16S-ITS-23S rRNAオペロン配列を含むFANGORNデータベース[24]を用いてすべての細菌を分類した。

図2：配列決定法の比較。
図2
DNeasy PowerSoil Proキットを用いて被験試料からDNAを分離し、16Sおよび16S-ITS-23S rRNA遺伝子の塩基配列を決定した。細菌分類はFANGORNデータベースを用いて割り当てられ、すべての結果は分類された属に基づいている。A シークエンシング法に関する情報。B 各配列決定法で配列決定された単離された模擬群集DNAと理論的模擬群集（Theor-Mock、表S1参照）を含む模擬群集の相対細菌量。模擬群集はAitchison距離に基づいてクラスタ化されている。C 16Sおよび16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定によって得られた乳サンプルの相対的細菌量。棒グラフの上の数字は、それぞれのサンプルのシーケンスリード数を示す。少なくとも2つのサンプルに存在し、どのサンプルでも相対存在量が少なくとも2%である分類された細菌属のみを示す。有病率や存在量が低い、または属レベルで分類されていない属は、「その他」に集約されている。D ミルクサンプルと陰性コントロールのAitchison距離行列の主座標分析（PCoA）プロット。PCoAによって説明される分散の割合は、軸のラベルに示されている。ドットの色はサンプル（タイプ）を示す。ドットの形は配列決定法を示す。楕円は95％信頼区間を示す。サンプルの種類とサンプル（ドナー）は、乳サンプルのみを比較した場合と陰性コントロールを除いた場合を含め、乳および陰性コントロールの細菌組成に有意に影響した（FDR = 0.02）。シーケンス方法は細菌組成に有意な影響を与えなかった。

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モックコミュニティと陰性対照
16S rRNA遺伝子配列決定により、模擬群集の8属すべてが同定され、細菌組成は理論組成に酷似していた（表2A、図2B）。16S-ITS-23S rRNA遺伝子シーケンスを用いた場合、模擬群集の8属のうち5属のみが検出され（バチルス属、腸球菌属、リステリア属、サルモネラ属、ブドウ球菌属）、エシェリヒア属、リモシラクトバチルス属、シュードモナス属は検出されなかった（表2A、図2B）。FANGORNデータベースを用いることで、細菌の種レベルの特徴付けは改善されたが、Bacillus subtilisとEscherichia coli（検出された場合）は誤分類されたため、種レベルの分類は信頼できなかった（図S3）。16S-ITS-23S rRNA遺伝子シーケンスで配列決定されたネガティブコントロールは、最大7リードであった（表2B、表S6）。

表2 16Sおよび16S-ITS-23S rRNA遺伝子シーケンスを用いた模擬群集（A）、陰性対照（B）、および乳サンプル（C）のシーケンスパラメータ。
フルサイズの表
牛乳サンプル
牛乳サンプルで得られたシーケンシングリードの数は、16S-ITS-23Sと16S rRNA遺伝子シーケンシングの間で差はなかった（表2C）。平均して、牛乳では16S-ITS-23S rRNA遺伝子シーケンスよりも16Sで4属多く検出された（FDR=0.046、表2C）。7つの細菌属（Corynebacterium、Cutibacterium、Gemella、Rothia、Staphylococcus、StreptococcusおよびVeillonella）が、16Sおよび16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定の両方でプロファイリングされた生乳サンプルの少なくとも70％に存在した（表S7）。最も豊富な属（1つ以上の生乳サンプル中の相対存在量が15％以上）は、Staphylococcus属とStreptococcus属（両方の方法）、Cutibacterium属とGemella属（16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定）、およびCorynebacterium属（16S rRNA遺伝子配列決定）であった（図2C）。乳検体の全体的な細菌組成は、母親間で有意に異なり（R2=0.63、FDR=0.002）、陰性対照の細菌組成とも有意に異なっていた（R2=0.30、FDR=0.002、図2D）。配列決定方法は、乳汁ベータの多様性に有意な影響を及ぼさなかった（FDR=0.21、図2D）。16S-ITS-23Sでは、16S rRNA遺伝子配列決定と比較して、コリネバクテリウムとブドウ球菌の相対量が多く、連鎖球菌とベヨネラの相対量が少なかった（すべてFDR=0.01、表S7）。

母親と乳児のペアにおける細菌の共有
最後に、16Sおよび16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定法を用いて、ヒトの母乳と乳児の口腔、乳児の糞便および母親の糞便の間での細菌性ASVの共有を検出する能力を調べた（図3A）。総細菌負荷量（1 ng DNAあたりの16S rRNA遺伝子コピー数）はサンプルの種類によって有意に異なり、ヒトの母乳が最も少なく、母親の糞便が最も多かった（図S4）。また、全体的な細菌組成は、サンプルの種類（R2=0.27、FDR=0.002）および配列決定方法（R2=0.03、FDR=0.002、図3B、図S5）間で有意に異なっていた。各サンプルタイプについてシークエンシング方法の影響を個別に調べたところ、使用した方法は乳児の口腔内細菌組成（R2＝0.15、FDR＝0.002）と母親の糞便細菌組成（R2＝0.28、FDR＝0.002）に有意な影響を及ぼしたが、ミルク（FDR＝0.16）と乳児の糞便細菌組成（FDR＝0.59）には影響を及ぼさなかった。16S rRNA遺伝子配列決定では、16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定よりも有意に多くの属が各サンプルタイプで同定された（図S6）。興味深いことに、16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定（図2B）で配列決定された模擬群集に欠けていた細菌属、Escherichia、LimosilactobacillusおよびPseudomonasが、一部の牛乳および糞便サンプルで16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定により検出された（図S5、表S8）。

図3：シークエンシング法による母体および乳児の身体部位と乳汁の細菌共有。
図3
A 研究デザイン。DNeasy PowerSoil Pro（PS）キットを用いて、ヒトの乳汁、乳児の口腔スワブ、母体および乳児の糞便からDNAを分離した。サンプルは16Sおよび16S-ITS-23S rRNA遺伝子の塩基配列を決定し、FANGORNデータベースを用いて細菌分類を行った。母親の糞便サンプル1個は16S rRNA遺伝子配列決定に失敗した。B 母体および乳児の異なるサンプルで分類された細菌属のAitchison距離行列の主座標分析（PCoA）プロット。PCoAによって説明される分散の割合が軸のラベルに示されている。ドットの色はサンプルの種類を示す。ドットの形は配列決定法を示す。楕円は95％信頼区間を表す。サンプルの種類と配列決定方法の両方が細菌組成に有意に影響した（FDR=0.002）。C シークエンシング法ごとの、ヒト母乳と乳児口腔、乳児糞便と母体糞便間の細菌ASVの共有（上段＝16S-ITS-23S rRNA遺伝子シーケンス、下段＝16S rRNA遺伝子シーケンス）。棒グラフは、示された属が両方のサンプルタイプに存在しない（薄い灰色）、存在するが両方のサンプルタイプに共有されない（濃い灰色）、または両方のサンプルタイプ間で共有される（色付き）、関連する（R）および関連しない（UNR）サンプルペアの割合を示す。プロット内のパーセンテージは、共有しているペアのパーセンテージを示す。両方の配列決定法で少なくとも2つのサンプルペアに存在する属のみを示す。16S rRNA遺伝子配列決定によるヒトミルクと母親の糞便データのリンクを除き、比較には14の関連ペアと182の非関連ペアが含まれ、13の関連ペアと169の非関連ペアが含まれる。統計的に有意な結果（フィッシャーの正確検定）： *FDR<0.05、**FDR<0.01、***FDR<0.001。D 16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列データに基づくレンサ球菌の系統樹。点の形はサンプルの種類を示す。ドットの色は母子ペアのIDを示す。系統距離はプロットのために対数変換した。16S rRNA遺伝子配列データに基づくレンサ球菌の系統樹を図S8に示す。

フルサイズ画像
ヒト母乳と、関連する母子ペアの別のサンプルタイプの両方で検出された属数（共有の可能性がある属数）は、16S-ITS-23S rRNA遺伝子シーケンスを使用した場合よりも、16Sを使用した場合の方が一貫して多かった（ヒト母乳-乳児口腔では21属対10属、ヒト母乳-乳児糞便では14属対5属、ヒト母乳-乳児糞便では5属対1属、図S7）。我々は、両方の配列決定法で少なくとも2つのサンプルペアで検出された共有の可能性のある属について、正確なASVマッチングに基づく細菌の共有の調査に焦点を当てた（図3C、図S7）。これらの潜在的共有属について、調査した属の少なくとも1つのASVを共有する無関係なサンプルペアの割合は、16S-ITS-23S rRNA遺伝子シーケンス（範囲0～3％、すべてFDR<0.05、図3C、表S9）よりも16S（範囲10～93％）の方が有意に高かった。16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定では、無関係なペアと比較して、近縁のヒト乳幼児口腔スワブサンプルペアが、Gemella属、Pauljensenia属、Rothia属、Streptococcus属、Veillonella属に属するASVを有意に多く共有していた（図3C）。16S rRNA遺伝子の塩基配列決定でも、関連性のあるヒト乳幼児口腔ぬぐい液のペアでは、関連性のないペアと比較して、Gemella属、Streptococcus属、Veillonella属ではなく、Pauljensenia属とRothia属の共有が有意に多く検出された（図3C）。

ヒトミルクと乳児の糞便を比較した場合、16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定では、無関係なペアと比較して、関連ペア間でブドウ球菌とレンサ球菌の共有が有意に多く検出されたが、16S rRNA遺伝子配列決定では検出されなかった（図3C）。16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定では、母親の糞便とヒトの母乳の間で細菌の共有は検出されなかった（図3C）。対照的に、16S rRNA遺伝子配列決定では、連鎖球菌の共有が認められたが、関連するペアと関連しないペアの間に有意差はなかった（図3C）。ストレプトコッカスは4つのサンプルタイプすべてで共有される可能性があると同定されたので、16Sおよび16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定データの両方に基づいて、ストレプトコッカスの系統樹を構築した（図3D、図S8）。16S rRNA遺伝子シーケンスデータの解像度は細菌株を分離するには低すぎ、サンプル内およびファミリー内のクラスタリングの研究の妨げとなったが（図S8）、16S-ITS-23S rRNA遺伝子シーケンスはより高い系統学的解像度と豊富な分岐を提供し、無関係な個体と比較して個体内およびファミリー内でより高いASV類似性を明らかにした（図3D）。

まとめると、16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定では、細菌群集の完全な表現または信頼できる種レベルの分類は得られなかったが、潜在的な汚染の影響ははるかに少なかった。16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定法では、乳児の口腔および糞便とのヒト乳汁細菌の共有は検出できたが、母親の糞便との共有は検出できなかった。

考察
DNA分離法は微生物叢の結果に影響する
我々が試験したDNA分離法、またはその以前のバージョンは、他のグループ（FSキット[43,44,45,46,47]、MDキット[48]、PSキット[15,21,49]）または我々の研究室（MXキット）で、ミルク微生物叢研究のためのDNA分離に使用されてきた。優れたDNA分離法は、サンプル中の細菌をすべて溶解し、相対的な群集組成の偏りを最小限に抑え、下流の分析に十分なDNAを提供し、汚染物質を混入させないものでなければならない。これまでの研究では、DNA分離方法が微生物叢の結果に影響を与えること、そして効率的なDNA分離とグラム陽性菌の正確なプロファイリングには機械的溶解が重要であることが報告されている[50,51,52,53,54]。これと一致するように、我々の16S rRNA遺伝子配列決定結果はDNA分離方法によって異なっていた。サンプルの遠心分離設定、溶解方法、DNA捕捉技術の違いなどの分離手順の違いが、DNA収量や微生物相の結果に影響したと考えられる。ビーズビーティングを用いたDNA分離キット、PSキットとMXキットは、予想される模擬群集を最もよく再現していた。また、これらのキットは乳汁中のDNA収量が最も高く、細菌をより効果的に溶解したことが示唆された。重要なことは、生乳のDNA収量が高いほどコンタミネーションが少ないことが再確認されたことである[52]。

コンタミネーションの評価と最小化は、生物量の少ないサンプルでは特に重要である [55]。我々が分離した4つの高バイオマス細菌モックコミュニティのうち3つには、予期せぬ細菌に属する16S rRNA遺伝子のシーケンシングリードがなかったのに対し、低バイオマスのネガティブコントロールとミルクサンプルは汚染の可能性があったことから、我々の結果はこのことを強調している。(1)分離陰性コントロールはライブラリー調製陰性コントロールよりも汚染が多く、(2)すべてのサンプルは同じ環境で処理され、(3)汚染の程度と性質はキットによって異なっていたことから、汚染物質はDNA分離キットに由来する可能性が高い。実際、我々が同定した潜在的な汚染菌、例えばCutibacterium（旧Propionibacterium）は、以前にもキットの汚染菌として示唆されている[55]。シーケンスデータから潜在的な汚染物質を同定し除去するための様々なアプローチがありますが[55]、潜在的な汚染シグナルを除去することと真のシグナルを保持することのバランスをとることは依然として困難です。そのため、できるだけコンタミネーションを起こさないDNA分離方法を選択することが重要である。PSキットで分離した牛乳サンプルは、対応するネガティブコントロールとシーケンシングリードの中央値でわずか3%、最大で10%を共有しており、他のキットで分離したサンプルよりも潜在的なコンタミネーションの影響を受けにくいことが示唆された。

細菌濃縮法は生乳メタゲノムシーケンスデータを改善しなかった
HL-PMAおよびHL-Benz濃縮法は、低バイオマス唾液サンプル（HL-PMA）[26]および喀痰サンプル（HL-Benz）[25]において、ヒトメタゲノミックシーケンスリードデプスを減少させ、微生物メタゲノミックシーケンスリードデプスを増加させることが以前に示されている。いずれの方法も、ヒト細胞の低張溶解と、細菌DNAを濃縮するための遊離DNAの枯渇に依存している。残念ながら、ヒトの母乳に適用した場合、濃縮したサンプルはシーケンシングに失敗するか、98.8%以上のヒトリードが残っていました。HL-PMAを含む、ミルク中の細菌濃縮法の性能を調査した1つの先行研究では、さらなる解析には不十分なDNAしか得られなかったと記述されている[56]。ヒトの乳には、DNA分離を阻害する可能性のある栄養素が豊富に含まれており[12]、その他のヒト乳成分も細菌の濃縮を阻害する可能性が高い。このため、ヒト宿主の汚染を効果的に低減し、ヒト乳でのメタゲノム配列決定を可能にする濃縮法は、まだ見つかっていない。

シーケンス方法は微生物叢の結果に影響する
16S-ITS-23S rRNA遺伝子アンプリコンの塩基配列決定により、乳児の腸内細菌株の追跡が可能になったことから[57]、16S-ITS-23S rRNA遺伝子塩基配列決定により細菌の分類を改善し、低バイオマスのヒトミルクサンプルにおける細菌共有事象を検出できるかどうかを検証した。模擬細菌群集の結果から、細菌はしばしば種レベルで分類されたが、この分類は必ずしも正しくないことが示された。16S-ITS-23S rRNA遺伝子の塩基配列決定では、血縁関係のないペアと比較して、血縁関係のある母子ペアにおいてより多くのASV共有が検出されたことから、約2500 bp長の16S-ITS-23S rRNA遺伝子アンプリコンには、属レベル以下の分類学的情報を提供するのに十分な情報が含まれていることが示唆された。ITS領域の変異が大きいため、参照データベースとのアライメントが複雑で、16S-ITS-23S rRNA遺伝子の配列を持つデータベースはさらなるキュレーションが必要かもしれない。

16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定では、模擬細菌群集中のEscherichia、Limosilactobacillus、Pseudomonasを見逃した。しかし、重要なことに、これらの細菌は16S rRNA遺伝子シーケンスで模擬細菌群集から検出され、16S-ITS-23S rRNA遺伝子シーケンスで牛乳と糞便から検出された。これは、これらのDNAが模擬細菌群集から分離されたが、16S-ITS-23Sライブラリー調製中にうまく増幅されなかったか、シーケンスリードがバイオインフォマティクス処理中にそれぞれの分類に割り当てられなかったことを示唆している。選択したプライマー、シーケンス方法、データベースはすべて微生物群の結果に影響を与える可能性があり[58, 59]、16S-ITS-23S rRNA遺伝子のシーケンス結果にも影響を与える可能性が高い。実際、16S rRNA遺伝子配列決定と比較して、16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定は、乳児の経口および母親の糞便サンプルの微生物叢結果を変化させたが、ミルクおよび乳児の糞便の結果は変化させなかった。後者については、サンプル数が少なすぎてシーケンス方法による違いを検出できなかった可能性がある。ポジティブな点としては、16S-ITS-23S rRNA遺伝子の塩基配列決定では、汚染が極めて少ないことが示された。最終的には、手法の限界とそれがもたらす可能性のあるバイアスを評価し、報告することが重要であることに変わりはない。

16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定法は細菌伝播を検出できる
16S rRNA遺伝子シーケンスに基づく研究で、母乳細菌が他の母体および乳児の身体部位と共有されていることが報告されていても［5、6、9、13、16、60、61、62、63］、16S rRNA遺伝子シーケンスは、細菌伝播の研究能力において限界がある。全長16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンスと、16S rRNA遺伝子と23S rRNA遺伝子の間のITS領域のターゲットシークエンスの両方が、これまでの研究で解像度を向上させた [64, 65]。予想されるように、16S-ITS-23S rRNA遺伝子の複合シークエンシングアプローチは、〜450 bp長の16S rRNA遺伝子アンプリコンと比較して、〜2500 bp長の16S-ITS-23S rRNA遺伝子アンプリコンでより多くの変異を検出することにより、細菌伝播研究の解像度を向上させることができる。

ヒト乳汁細菌の起源はまだ研究分野である。母体の乳輪皮膚と乳児の口腔は、逆行性移行を介して乳腺に到達しうる細菌を宿主とすることが示唆されており［5、7、8］、一方、腸-乳腺経路仮説は、母体の腸内細菌が乳腺に移動してヒトの乳汁に入ることを示唆している［4、7、8、60、66］。しかしながら、ヒトの乳汁中細菌移行に関する研究は、高分解能の乳汁中細菌プロファイルを得ることが困難であるため、複雑なものとなっている。我々の研究では、16S-ITS-23S rRNA遺伝子のシーケンスデータを用いて、ヒトの母乳は乳児の口腔とRothia、Streptococcus、Gemella、PauljenseniaおよびVeillonellaを共有しており、母親の母乳と乳児の口腔の間で口腔内細菌が共有されていることを報告した16S rRNAシーケンスに基づく研究を支持している[16, 61]。残念ながら、我々のアプローチでは、潜在的な細菌の移動の方向性を調べることはできなかった。腸-乳腺経路仮説を支持する小規模な先行研究 [8, 60, 66]とは対照的に、例えば、培養と（縮小）メタゲノム配列決定を用いて母親の糞便と乳汁で共有されるビフィドバクテリウム株を同定することにより、母親の糞便と乳汁の間で細菌が共有されることはなかった。16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定によって乳児の糞便からビフィドバクテリウム属が検出されたにもかかわらず、母親の糞便と乳汁のペアで共有される可能性のあるビフィドバクテリウムは検出されなかった。ヒト乳汁細菌群集の形成における母体と乳児の異なる部位の役割をより明確にするためには、高解像度データを用いたより大規模な研究が必要である。

乳児の口腔と共有するヒト乳汁中の細菌に続いて、乳児の糞便と共有するヒト乳汁中のレンサ球菌とブドウ球菌も検出された。この知見は、母親の母乳と乳児の腸内細菌の移行を示唆する他の発表と一致している[5, 6, 8, 9, 10, 13, 16, 60, 61, 63]。今回報告された16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定法は、生物量の少ないヒトの母乳サンプルと乳児の体内部位間の細菌共有の同定に役立つ可能性がある。それでもなお、乳児の口腔および腸内細菌のコロニー形成におけるヒト乳由来細菌の役割をさらに探求するためには、今後の研究が必要である。例えば、共有細菌の機能は依然として不明であり、最近の研究では、ヒト乳汁には生菌と非生菌が存在することが示されたが[67]、乳児への影響はまだ解明されていない。

限界と長所
本研究にはいくつかの限界があった。サンプル数が少ないため、統計的検定と結論を導き出す能力に限界があった。サンプルの保存が結果に及ぼす影響については調査しなかったが、先行研究[68,69,70,71,72,73]に基づくと、（長期）低温保存が非生存微生物叢に及ぼす影響は限定的であると予想される。さらに、DNA分離の前に牛乳から脂肪を除去したため、脂肪層内の細菌が失われた可能性が高い[53,74]。我々が試験したDNA分離法では、生菌と非生存菌を区別することはできなかった。16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定法では、16S rRNA遺伝子配列決定法に比べて検出された細菌数が少なく、異なるサンプルタイプに含まれる（共有）細菌を見逃す可能性があった。この研究の大きな強みは、同じサンプルで様々な方法をテストし、研究対象外のステップにも同じ方法論（DNA単離、シーケンス、バイオインフォマティック処理）を適用したことである。DNA単離と塩基配列決定の際に追加したモックコントロールとネガティブコントロールにより、バイアスや潜在的な汚染物質を同定することができた。また、PSキットを牛乳以外のサンプルに適応させる方法についても報告する。最後に、ショートリードの16S rRNA遺伝子シーケンスではなく、ロングリードの16S-ITS-23Sを使用することで、より高解像度の乳汁細菌伝播の研究が可能となった。

結論
結論として、PSキットまたはMXキットによるDNA分離と16S rRNA遺伝子配列決定により、乳汁中の微生物叢を確実にプロファイリングすることができ、解析は14組の母子ペアに限定されたが、ロングリード16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定により、母乳育児の母親から乳児への細菌移行を示す証拠が得られたが、母親の腸から母乳への細菌移行は示されなかった。我々の知見は、大規模な母乳微生物叢研究に道を開くものであり、16S-ITS-23S rRNA遺伝子配列決定は、低バイオマス（ヒト母乳）サンプルにおける細菌伝播の研究に役立つ。

データの利用可能性
シーケンスデータはEuropean Genome-phenome Archive (EGAS00001007592)にアップロードされている。データファイルは補足資料の一部として利用できる。データを処理・解析するためのスクリプトはGitHub (https://github.com/GRONINGEN-MICROBIOME-CENTRE/MilkMethods2023)にある。

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参考文献ダウンロード

謝辞
本研究は、オランダ研究評議会からの資金援助（AZへのNWO-VIDI助成金016.178.056、JFへのNWO-VICI助成金VI.C.202 .022 to JF、NWO gravitation grant Exposome-NL 024.004.017 to AK and AZ、NWO gravitation grant Netherlands Organ-on-Chip Initiative 024.003. 001をJFへ）、オランダ心臓財団（IN-CONTROL CVON2018-27をJFへ）、欧州研究会議（ERC starting grant 715772をAZへ、ERC consolidator grant 101001678をJFへ）、EASI-Genomics助成金（PID7780をTSとAZへ）、De-Cock Hadders財団（2021-57をJESへ、 2021-08にSG）、International Society for Research in Human Milk and Lactation（ISRHML、JESに個人助成金）、Winston Bakker Fonds（WB-08、TSに助成金）、欧州連合のHorizon 2020研究革新プログラム（824110）。SGとTSはそれぞれ、オランダ・フローニンゲン大学の医学研究科とジュニア・サイエンティフィック・マスタークラスから奨学金を得ている。Lifelines NEXTコホート研究は、University Medical Center Groningen Hereditary Metabolic Diseases Fund、Health~Holland (Top Sector Life Sciences and Health)、Ubbo Emmius Foundation、EU、Northern Netherlands Alliance (SNN)、Friesland州とGroningen州、Groningen市、Philips、Société des Produits Nestléから資金援助を受けている。Lifelines NEXT研究へのすべての親と乳児の参加に感謝する。Lifelines NEXTチームのプロジェクト管理、運営、参加者の募集、データおよびサンプルの収集と登録における継続的な努力に感謝する。また、私たちのサンプルの塩基配列決定をしてくれたドイツのChristian-Albrecht University of KielのInstitute of Clinical Molecular Biologyのマイクロバイオーム研究所のスタッフ、特にCorinna BangとオランダのLeidenにあるBaseClearに感謝する。オランダのUniversity Medical Center GroningenのGenomics Coordination Centerには、データインフラと高性能計算クラスターへのアクセスを提供していただいた。論文の校閲をしてくれたKatherine Mc Intyreに感謝する。

著者情報
著者および所属
オランダ、フローニンゲン、フローニンゲン大学およびフローニンゲン大学医療センター遺伝学科

Johanne E. Spreckels、Asiier Fernández-Pato、Marloes Kruk、Alexander Kurilshikov、Sanzhima Garmaeva、Trishla Sinha、Jingyuan Fu、Ranko Gacesa & Alexandra Zhernakova

フライブルク大学感染予防・病院疫学研究所医療センター（ドイツ、フライブルク

ヒレン・ゴーシュ

オランダ、フローニンゲン、フローニンゲン大学およびフローニンゲン大学医療センター、医療微生物学教室

ハーミー・ハルムセン

オランダ、フローニンゲン、フローニンゲン大学およびフローニンゲン大学医療センター小児科

ジンユアン・フー

オランダ、フローニンゲン、フローニンゲン大学・フローニンゲン大学医療センター、消化器・肝臓科

ランコ・ガセサ

貢献
研究デザイン、JES、RG、AZ、プロジェクト管理、JES、AZ、監督、JF、RG、AZ、資金獲得、AZ、試料調製、JES、MK、バイオインフォマティクス処理、JES、AFP、AK、RG、統計解析、JES、AFP、RG、データ解釈、JES、AFP、RG、AZ、執筆-原案作成、JES、執筆-査読-編集、AFP、MK、AK、SG、TS、HG、HH、JF、RG、AZ。すべての著者が本論文の掲載版を読み、同意した。

責任著者
Alexandra Zhernakovaまで。

倫理宣言
競合利益
JES、AFP、MK、AK、SG、TS、HG、HH、JF、RG、AZは競合する利益を有していない。資金提供者は、研究デザイン、データ解析、データ解釈、論文執筆、出版決定には一切関与していない。

倫理的承認
本研究はヘルシンキ宣言のガイドラインに従って実施された。Lifelines NEXT研究はUniversity Medical Center Groningenの倫理委員会（METC UMCG METc2015/600）の承認を得ている。参加者またはその両親/法定後見人は、参加前に書面によるインフォームド・コンセントを行った。

追加情報
出版社注：シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

補足情報
補足的な方法と図
補足表
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データセット2
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権利と許可
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転載と許可

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この記事の引用
Spreckels,J.E.、Fernández-Pato,A.、Kruk,M. et al.低バイオマス人乳サンプル中の微生物組成および共有の分析：DNA分離および配列決定技術の比較。ISME COMMUN. 3, 116 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00325-6

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受領
2023年5月25日

改訂
2023年10月18日

受理
2023年10月26日

発行
2023年11月09日

DOI
https://doi.org/10.1038/s43705-023-00325-6

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シーケンス
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