細菌は漏出するのか？細菌交配における代謝物外部化のメカニズム

ホーム
0

メールを保存
細菌は漏出するのか？細菌交配における代謝物外部化のメカニズム
微生物学年報

第77巻:277-297 (2023年9月発行)
総説として2023年6月7日に初出
https://doi.org/10.1146/annurev-micro-032521-023815

ジェームズ・B・マッキンレー

米国インディアナ州ブルーミントン、インディアナ大学生物学部; email: jmckinla@iu.edu

PDFをダウンロードする
転載 ダウンロード 引用アラート

著作権は著者に帰属します。本作品はクリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下でライセンスされており、原著者および出典のクレジットを明記することを条件に、いかなる媒体においても無制限の使用、配布、複製を許可する。ライセンス情報については、本記事中の画像またはその他の第三者の素材のクレジット行を参照のこと。
セクション
概要
キーワード
はじめに
定義
細胞エンベロープの透過性制約
社会的に価値のある代謝産物はどのように外部に排出されるのか？
代謝物排泄の生理学的説明
結論
まとめ
今後の課題
情報開示
イメージ
要旨
細菌細胞の代謝はその境界を越えて広がり、しばしば他の細胞の代謝と結びついて、地域社会、さらには地球規模にまで広がる代謝ネットワークを形成する。最も直感的でない代謝のつながりとして、細胞内代謝物の相互供給が挙げられる。これらの細胞内代謝産物は、どのようにして、そしてなぜ外部に排出されるのだろうか？バクテリアは単に漏れやすいだけなのだろうか？ここでは、細菌がリーキーであることの意味について考察し、クロスフィーディングの文脈から代謝物の外部化のメカニズムについて概説する。一般的に言われていることとは裏腹に、ほとんどの細胞内代謝物が膜を越えて拡散することはありえない。その代わりに、受動的および能動的なトランスポーターが関与している可能性が高く、ホメオスタシスの一環として過剰な代謝物をパージしている可能性がある。生産者による代謝物の再取得は、クロスフィーディングの機会を制限する。しかし、競合的なレシピエントは代謝物の外部化を刺激し、相互クロスフィーディングのポジティブフィードバックループを開始することができる。

キーワード
クロスフィーディング、排出、リーキー、微生物間相互作用、微生物生態、微生物代謝

1. はじめに
ほとんどの生態系は微生物の多様性に富んでおり、毒素の拮抗的な分泌から協力的な相互摂食まで、数え切れないほどの関係が存在する。微生物の相互摂食は一般的かつ重要である。相互摂食反応は、農業、人間の健康、地球の気候に影響を与えるネットワークを形成する(40, 85)。クロスフィーディングはまた、バイオレメディエーションやバイオ燃料生産など、社会に利益をもたらす仕事を遂行するために、合成微生物群集を安定化させることもできる（10, 150）。

細胞からの代謝産物の放出は、クロスフィーディングの前提条件である(101)。クロスフィードされる栄養素は、発酵産物などの代謝廃棄物である可能性がある。この場合、細胞は老廃物を効率的に排出するメカニズムを持っていると予想される。ここでは、生合成前駆体のような、一般的に細胞内で役割を果たすと考えられている代謝物を取り上げる。このような代謝産物は共同体として価値があり、生産細胞を含め、それを獲得できるあらゆる細胞に利益をもたらす。従って、細胞はこれらの代謝産物を最大限に保持すると考えられる。このような代謝産物の外部化が、どのように、そしてなぜ有益な相互摂食につながるのか、注目されている(19, 33, 91, 101)。条件が許せば、代謝物の外部化は隣人からの相互摂食につながり、それによって相互に有益なフィットネス向上につながる。しかし、そもそも共同体として価値のある代謝産物は、どのようにして、そしてなぜ放出されるのだろうか？

ここでは、なぜ細胞内代謝産物が受け手の集団を支えることができる量だけ外部に放出されるのか、その分子機構と生理学的理由について概説する。ここでは細菌に焦点を当てるが、古細菌、真核微生物、およびいくつかの宿主-微生物相互作用にも当てはまることがある(15)。細胞外皮を介した代謝産物の移動に焦点を当てるにあたり、高分子分解酵素など細胞外で生成される代謝産物は取り上げないが、このような活動は交差摂食につながる可能性がある(40)。クオラムセンシングシグナル、シデロフォア、細胞外小胞、 バイオフィルムマトリックス成分、その他主に細胞外での役割に 関連する分子も除外しているが、場合によってはクロスフィード 栄養素として機能することもある（9, 58, 129）。また、リークネスを扱う際、ナノワイヤーや論争の的になっているナノチューブなど、接触依存性のクロスフィードは除外している（33, 40, 101）。本明細書で使用したいくつかの値と参考文献は、BioNumbers (88)とMetacyc (17)を使って見つけた。

2. 定義
2.1. 代謝物の外部化はいつクロスフィーディングとみなされるか？
先に詳述したように(40)、クロスフィーディングは以下の場合に起こる： (a)代謝物が生産者によって外部化され、受容者によって消費される、(b)代謝物が同化される、またはエネルギー変換に関与する、(c)代謝物の移動によって受容者および/または生産者の適合度が変化する、(d)代謝物の移動が遺伝子型または表現型的に異なる(亜)個体群間で起こる。これらの基準は、捕食、解毒、クオラムセンシングのような細胞間コミュニケーションなど、代謝物の外部化を伴う他の関係を除外するものである。

2.2. 細菌細胞が漏出するとはどういうことか？
多くの自然環境および実験室環境において、共同利用価値のある代謝産物のクロスフィーディングが観察されている。必須アミノ酸を合成できない大腸菌のアミノ酸補助栄養細菌が、アミノ酸の過剰生産や排泄を操作することなく、互いに助け合っている例もある（25, 87, 143）。このような観察から、細菌細胞は透過性が高く、アミノ酸のような化合物は細菌細胞から自然に漏出するという印象がある。ここでは、これらの仮定が正しいかどうかを論じる。しかしその前に、リーク性という用語について述べる。リーク性という用語は、グループによって意味が異なるため、明確化が必要であり、自制が必要であることは言うまでもない。

Morrisら（92）は、リーク性という用語を、複数のコミュニティメンバーが利用できるリソースを生成し、そのリソースを公共財とする生物学的メカニズムを意味するものとして用いている。この広い定義によれば、代謝物の外部化には、受動的排泄、能動的分泌、細胞外酵素や因子の活性（例えばシデロフォア）、細胞内酵素の細胞外への影響（例えば近隣細胞に利益をもたらす細胞内解毒活性）などが含まれる（92）。Gudeら(48)は、このリーク性の広範な定義をさらに拡大し、細胞溶解を含むようにした。このような場合のリーク性は、物理的なものよりも抽象的なものであり、細胞内リソースの損失だけでなく、外部環境から得られたかもしれないリソースも含んでいる。

漏出性のこのような広範な定義は、細胞構造 を考える際に混乱や誤解を招きかねない。偶発的な損失を含む文字通りの定義からすると、リーク性とは、そうで なければ機能的な細胞の細胞外被に欠陥があるために、物質が受動的 に失われることを意味する(70, 134)。例えば、細菌によるアミノ酸の外部放出に関する説明の一つは「リーク仮説」と呼ばれ、「膜の物理的変化」を伴う（70, p. 81）。代謝物が外部に排出されるメカニズムを区別するために、私は以下の定義を提案する。これらの定義の多くは、誤用されることもあるが、よく受け入れられている。

▪
排出： 排出：多くの場合、排出ポンプを介した能動的な外部化（例えば、ATP加水分解やプロトン起電力と連動する）。この用語は分泌とやや類似しているが、分泌が細胞外での役割を持つ化合物やタンパク質に適用されるのに対し、より一般的には、細胞内に蓄積すると毒性を示す化合物に適用される。

▪
排泄： 排泄：分子の受動的な外部化で、多くの場合、トランスポーター（パーミアーゼまたはチャネル）を介した促進拡散を伴う。分子の性質によっては、膜を越えて拡散が起こることもある。排泄は多くの場合、細胞から老廃物を取り除くため、偶発的な損失を意味する漏出性とは区別される。

▪
排出： タンパク質の細胞質膜またはペリプラスムへの輸送。この用語は、グラム陰性菌のペリプラスムへの代謝産物の運搬を表すこともある。しかし、これはグラム陽性菌の分泌と機能的には同じである。従って、混乱を避けるため、本明細書ではこの用語の使用を控える。

▪
外部化： 代謝産物が細胞内から外部環境へ移動するあらゆるメカニズム（受動的、能動的、溶解など）。

▪
漏出： 漏出性：細胞の欠陥（膜や輸送体など）の結果として代謝物が受動的に外部に排出され ることで、ある条件下ではフィットネスが不利になるが、交差摂食の文脈では必ずしも不利にな らない（例えば、漏出性は相手からの有益な相互作用を刺激する可能性がある）。NH4+/NH3のような膜透過性の高い化合物は細胞から漏れると考えられる。上記の排泄との区別を参照のこと。

▪
溶解： 細胞死を伴う細胞膜の完全性の喪失により、細胞内の代謝産物が非特異的に環境中に放出されること。

▪
分泌： 分泌：タンパク質または代謝産物の能動的な外部化（例えば、ATP加水分解またはプロトン起 動力と結合）。分泌には活性トランスポーターが必要である。上記の排出との区別を参照のこと。

3. 細胞膜の透過性制約
外部環境に到達するためには、代謝産物は複数の細胞外被層を通過しなければならない。グラム陽性菌では、細胞膜はペプチドグリカンの厚い外層と結合している。グラム陰性菌では、細胞膜の周りを薄いペプチドグリカン層が取り囲み、外膜とつながっている（図1）。ここでは、各層の透過性の制約について述べる。

図
図1 グラム陰性菌における代謝物の外部化の例。外膜とペプチドグリカンは、ポリン（❶）とペプチドグリカンの隙間（❷）により、比較的多孔質である（セクション3参照）。エンベロープ内での代謝反応とエンベロープ高分子（❸）のターンオーバーは、外部からの共同利用価値のある代謝産物（4.1節）に寄与することがある。NH3のように膜を容易に通過できる代謝物もあるが(❹)、ほとんどの細胞内代謝物は透過係数を持ち、膜を通過して拡散することはほとんどない(4.2節)。代謝産物は、低浸透圧ストレス時に非特異的なメカノセンシティブチャネル（❺）によって促進される場合、または特異的パーミアーゼ（❻）を介して、受動拡散により細胞質膜を通過することができる（セクション4.3）。細胞死時に膜の完全性が失われるか、溶解（❼）すると、代謝物が外部に排出される（セクション4.4）。代謝産物はまた、TolCと結合することで、ペリプラスムまたは外部環境へ積極的に分泌または排出される(❽)（セクション4.5）。能動的な排出には、ATP加水分解、H+アンチポート、あるいは異なるアミノ酸のアンチポートが関与する。代謝産物の外部排出は、恒常的な代謝産物レベルの維持（5.1節）、代謝産物がよく知られた細胞内での役割とは異なる細胞外での役割を果たすムーンライト（❾）（5.2節）、交配相手からの有益な相互作用（5.3節）など、複数の理由で有益である。略語 AA、アミノ酸；FA、脂肪酸；M、代謝産物；PG、ペプチドグリカン；pep、ペプチド。
全解像度をダウンロードPPTをダウンロード
3.1. 外膜
外膜は小分子に対して比較的多孔性であり、2つの膜の間のペリプラズム空間が外部のpHと急速に平衡化するほどである(142)。ポリンチャンネルは外膜を横切る分子の拡散を促進する。ほとんどのポリンは比較的基質特異性が低く(96)、約0.58-2.0 nmまでの多様な親水性分子を収容する(8, 97)。外膜リポ多糖の負電荷とリン脂質内膜のゲル状の性質は、ほとんどの分子に対してかなりの障壁を形成すると考えられていた(96)。しかしながら、最近の証拠は、多くの分子がポリンを介さずに外膜を通過できることを示唆している。40個のポリンを全て欠損した緑膿菌変異体は、全てではないがいくつかの栄養素に対して野生型の増殖形質を示した(134)。いくつかのジカルボン酸やトリカルボン酸の栄養素はこの変異体では利用できなかったことから、栄養素の拡散はポリンの欠如によって生じた膜の欠陥によるものではないことが示唆された(134)。調べた栄養素の多くは透過係数が低いので、この結果は驚くべきものである（セクション4.2参照）。

3.2. ペプチドグリカン
グラム陰性菌では外膜の内側に、グラム陽性菌では最外層に、細胞全体を包むカゴのような分子、ペプチドグリカンがある（137）。ペプチドグリカンには隙間があり、細胞内のツルゴール圧によってその大きさを変えることができる(137)。グラム陰性大腸菌の場合、この隙間の直径は2.0 nmから3.4 nmで（29, 49）、平均20 kDaの分子を許容するが（29）、場合によっては100 kDaを超えるタンパク質の通過を許容することもある（136）。グラム陽性枯草菌の場合、ペプチドグリカンの平均孔径は2.4 nmで、24 kDaもの分子を通すことができる(29)。従って、ペプチドグリカンも外膜も、親水性分子の細胞外への移行を妨げる大きな障壁にはならないと考えるべきである。

3.3. 細胞質膜
細胞質膜は、細胞内外のほとんどの分子の通過を主に制御するバリアである。この膜は、外部環境とは著しく異なる細胞質環境を維持する。細胞質反応によって、ほとんどの代謝産物は、細胞質膜の疎水性内部を通過する受動的損失を制限する荷電形態に維持される(3)。そのため、細胞内分子の濃度は細胞外レベルよりも桁違いに高くなる。多くの大腸菌のヌクレオチド三リン酸、補酵素、解糖代謝産物は低ミリモル域にあり、遊離アミノ酸はサブから低ミリモル域にあり、グルタミン酸は数十ミリモル単位に達する(7)。浸透圧ストレス下では、細胞内代謝産物の一部は適合溶質として働き、モル濃度まで蓄積する(145)。このように、細胞内代謝産物は熱力学的には外部に排出される態勢にあるが、細胞質膜が手強い機能的バリアーとなっている。ペプチドグリカンや外膜は比較的多孔質であるため、代謝物が細胞質から流出した場合、環境中に放出される可能性が非常に高くなる。しかし、この総説で述べているように、能動的取り込みシステムは外部に放出された代謝物を効率的に回収し、交差摂食や搾取の可能性を制限することができる。

4. 共同体として価値のある代謝産物はどのように外部化されるのか？
多様な細胞内代謝物が外部化される。質量分析による代謝物検出感度の向上により、細菌や酵母の上清中にマイクロモルレベルの中心代謝物やアミノ酸が存在することが明らかになっている(100, 107)。他の代謝物を見落とした可能性のある標的メタボロミクスアプローチを用いた場合、消費された総炭素量の約0.3%が外部の中心代謝物とアミノ酸で占められていた(100)。額面通りであれば、使用済み上清を唯一の炭素源として他の個体群を維持するには不十分なレベルに思えるかもしれない。しかし、共培養における交差給餌は、連続給餌あるいは給餌バッチシステムに近いと考えるべきである。外部化された代謝物は一過性に利用可能であり、しばしば産生細胞やそのクローンによって再獲得されるため、単培養では定常状態の外部濃度が低くなる。共培養では、外部化された代謝物が受容体集団によって消費されることで、産生細胞による放出が維持されたり、さらに刺激されたりすることさえある(39, 74, 84)（セクション5.3参照）。以下では、高価な細胞内代謝物が外部に放出される方法と考えられる理由について概説する。

4.1. 細胞膜代謝
代謝反応の中には、細胞膜を越えて細胞膜内で行われるものもあり、その場合、代謝産物が損失しやすくなる。脱窒(45)のような細胞外被での嫌気性呼吸は、電子受容体のクロスフィーディングにつながるが、ここでは細胞外被での生合成とリモデリングに限定して議論する。

細胞外被の代謝産物の源の一つはペプチドグリカンである。グラム陽性菌のようにペプチドグリカンが厚い場合、菌が成長するにつれてペプチドグリカンは切断され、新しいモノマーを取り込んだり、円周方向に拡大したりする(54, 61)。このリモデリングにより、グラム陰性菌でもグラム陽性菌でも、1回の細胞分裂サイクルでペプチドグリカンの50％以上が入れ替わる（61）。しかし、分解されたペプチドグリカンを再捕捉するトランスポーターによって、ペプチドグリカンの損失は最小限に抑えられる(61)。生育中の大腸菌培養では、ペプチドグリカンのアミノ酸の約6-8％が短いペプチドとして失われると推定されている（43）。

ペプチドグリカンから単一アミノ酸が失われることも予想される。新しいペプチド架橋が形成されるたびに、d-アラニンが放出される(61)。ここでも多くのd-アラニンが再獲得される。成長中の枯草菌培養では、細胞外のd-アラニンはほとんど検出されなかったが、d-アラニンパーミアーゼを欠失させると、寒天培地上で交差摂食によりd-アラニンauxotrophを支持するのに十分な0.1 mMまで外部に蓄積した(125)。様々な細菌が、定常期に入るとd-アラニンや他のd-アミノ酸を放出し、ミリモルの低レベルまで蓄積する(72)。これらのd-アミノ酸の放出は、ペプチドグリカンのリモデリングに関連していると考えられるが、細胞間シグナル伝達にも関与している可能性がある(18)。このような代謝産物放出の条件依存性は、交差摂食につながりにくいかもしれないが、ある条件下では、2つの集団による代謝産物放出のラウンドが交互に繰り返され、共存につながる可能性がある（124）。

細胞エンベロープタンパク質(90)や脂質(79, 121)のターンオーバーも予想される。ここでも、ほとんどの物質は積極的に回収される。例えば、大腸菌の外膜でリパーゼによって遊離された脂肪酸は、リポ多糖の生合成を制御する重要なシグナル伝達プロセスの一部として、細胞質へと移動する(82)。

クロスフィーディングに対する細胞外膜のターンオーバーの寄与は、これまでほとんど注目されてこなかった。それにもかかわらず、単一のパーミアーゼ機能喪失変異がクロスフィーティングを支持したという事実(125)は、細胞エンベロープの代謝と関連したクロスフィーティングが、もし利用条件が良好であれば、進化する可能性を示唆している。

4.2. 膜を越える拡散
膜を横切る細胞内代謝産物の拡散は、文字どおりのリーク性の定義に近い。電荷を帯びていない分子、あるいは電荷を帯びていない分子と平衡状態にある分子は、特に膜を越えて拡散しやすい(4)。代謝ネットワークは、膜を拡散したり破壊したりする能力が低い代謝物を好むように進化してきた可能性さえある(4)。

膜を横切って拡散しやすい代謝産物として、共同体的に価値のあるものはアンモニウム（NH4+）である。細胞内のほぼ全ての高分子窒素はアミノ基の形をしている。高分子合成のためのアミノ基供与体は通常アミノ酸であるが、一部の細菌はまず、硝酸塩のような窒素源から遊離のNH4+を生成しなければならない。NH4+膜の透過係数は、リポソームの調製法によって、10-1から10-3 cm/sの範囲にあり、水と同等かそれ以上である(122, 140)。大腸菌はまた、環境中のNH4+濃度が20～50μMを超えると、細胞質内へのNH4+の拡散に依存して最大増殖速度を維持することができる(65)。NH4+の高い透過性は、NH3との平衡に一因がある。pH 7では、分子の約0.6%がNH3となる。このわずかな割合でも、N2固定細菌のNH4+/NH3 AmtBトランスポーターを欠失させると、マイクロモルレベルの細胞外NH4+が生じることがいくつかの研究で明らかになった(5, 84, 146, 149)。これらの観察結果は、拡散によるNH4+の損失を抑えるためにはNH4+の再捕捉が重要であることを示している。

他のほとんどの極性代謝産物や荷電代謝産物については、生産者と受容者の集団比が非常に大きくない限り、別の集団を支持しうる速度で膜を通過する拡散は起こらないと予想される。例えば、アミノ酸はpHに依存せず、側鎖の疎水性に依存した方法で脂質膜を通過することができる(21, 68)。このような観察は、アミノ酸の交差供給が膜拡散または漏出によるものである証拠として引用される。しかしながら、アミノ酸の透過係数[10-13-10-10 cm/s (20, 21)]はプロトン[10-7-10-3 cm/s (14, 27, 94)]よりもはるかに低く、膜透過性は電気化学的勾配を維持するのに十分低くなければならない。NH4+/NH3や有機酸とは異なり、非荷電型アミノ酸の割合は生理的条件下では荷電型アミノ酸の106～108分の1である(20)。

発表されている透過係数と特定の化合物の生合成必要量を用いて、膜を横切る拡散によってのみクロスフィーディングが起こった場合のレシピエント対プロデューサーの比率を推定した。セリンとフェニルアラニンは、大腸菌のタンパク質中では同じように表されるが(59)、透過性が異なるので(20)、レシピエントとプロデューサーの倍加時間を等しく1時間と仮定すると、レシピエント対プロデューサーの比率は、セリンクロスフィーディングでは約6×10-7、フェニルアラニンクロスフィーディングでは約9×10-6になると推定した。対照的に、膜を介したNH3の拡散を介したNH4+クロスフィーディングは、生産者細胞あたり300人のレシピエントをサポートすると推定される。この値は、Rhodopseudomonas palustris-大腸菌共培養で観察されたNH4+クロスフィーディングを超えるもので、0.01-0.1レシピエント/プロデューサー比であった(39)。この食い違いは、代謝物の再取得を考慮していないため、私の推定値がリベラルであることを示唆している。実際、R. palustrisと大腸菌は共培養において細胞外NH4+を奪い合う(84)。従って、これらの自由な推定値は、膜を通過する拡散を介したアミノ酸やその他の極性荷電代謝物のクロスフィーディングは考えにくいことを強く示唆している。

以上のことから、過去に観察されたアミノ酸の有意な受動的取り込みと流出は、もっと精査されるべきものである。例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）膜由来の小胞は、側鎖の疎水性と相関する形でアミノ酸の著しい損失を示し、膜を介した拡散を示唆した（32, 68）。しかし、リポソームの大部分を占め、細菌膜を除くとロイシンに対する透過性を示すアソレクチン脂質の寄与の可能性を否定することはできない(32)。さらに不可解なのは、プロリンを合成できないL. lactis株であるが、プロリンを5mM以上の濃度で供給すると高い増殖速度を維持することができ、その動態から膜を横切る受動拡散による取り込みが示唆された(127)。

アミノ酸の拡散が関与している最も珍しい発見の一つは、アラニンを生産するように操作されたZymomonas mobilisに関するものである(119)。この菌株の細胞質アラニン濃度は280mMであった。この高濃度は、膜拡散速度に強い影響を及ぼし、セリンのそれよりも7,000倍以上増加し、生産者一人当たり約5×10-3人のレシピエントをサポートする可能性があると計算した（図2）。しかし、測定された排泄率はさらに高く（119）、生産者一人当たり約30人のレシピエントをサポートできる可能性があった。私の計算では、フェニルアラニンのような疎水性アミノ酸よりもアラニンの方が膜透過性が高くなければ、膜を横切る拡散だけで観察された排泄率を維持することはできない（図2）。残念ながら、この興味をそそる研究を追った研究は見つからなかった。

図
図2 膜を横切る代謝物の拡散から推定されるレシピエント対プロデューサーの比率。参考文献89の式に基づき、(a)生産者の拡散速度とレシピエントの取り込み速度が等しいこと（取り込みにはおそらく能動輸送が含まれるため）、(b)生産者は失われた代謝物を再取得しないこと、(c)生産者とレシピエントの成長速度が等しく、共存が保証されることを仮定している。したがって、以下の3つの方程式を適用することができる。(a）1世代当たりに放出される代謝産物（μmol/生産者細胞）＝透過性（cm/s）×内部濃度（μmol/cm3）×表面積（cm2/細胞）×倍加時間（秒）。(b）生成したレシピエント細胞あたりに必要な代謝産物（μmol/細胞）＝レシピエント必要量（μmol/g）×レシピエント重量（g/細胞）。(c）比率（レシピエント：プロデューサー）＝プロデューサーが放出した代謝物（μmol/プロデューサー）÷必要な代謝物（μmol/レシピエント）。記号の大きさはlog10細胞内濃度にほぼ対応する。アラニン透過性（1.0×10-11cm/s）は、セリンとフェニルアラニン（68）の中間の値を仮定している。アスタリスクは、アラニン透過性（6.3×10-8cm/s）が、100μmol/min/g乾燥細胞（119）のアラニン流出速度の測定値から予測されるレシピエント対プロデューサーの比率34を達成するために推定されたことを示す。細胞内濃度は大腸菌または他の細菌について報告されたもの(7, 65, 119, 120)に基づいた；NH3濃度はNH4+濃度の0.6%と仮定した(65, 120)；アラニン濃度はZymomonas mobilisを操作した値(119)に基づいた。レシピエントアミノ酸および NH4+ 必要量は、大腸菌の報告値(59)と 4.7 × 10-13 g/cell (123)の換算係数に基づく。大腸菌の表面積は4.42 × 10-8 cm2 (110)と仮定した。
フル解像度をダウンロードPPTをダウンロード
膜を通過する拡散の役割を考える上で、利用可能な係数のほとんどが、有機酸（140）のような膜を通過して拡散すると予想される化合物について決定されており、アミノ酸についてはほんの一握りしか示されていないことが明らかになった（20, 21）。クロスフィーディングに関与する外部化代謝物のカタログが拡大するにつれて、外部化に寄与する膜を介した拡散の可能性に対処するための透過性係数が付随することが有用であろう。

4.3. 機械感受性チャネルと促進拡散
細菌は、機械感受性チャネルのような特異性の低いトランスポーターや、基質特異性の高いパーミアーゼを介した受動的拡散によっても代謝物を外部に排出することができる。機械感受性チャネルは、低浸透圧ショック（細胞外の浸透圧が急激に低くなること）に反応する。このショックによって細胞は膨張し、その結果生じる膜の膨張によって機械感受性チャネルは開口し、最大孔径は約2.8nm（24, 141）となり、外膜ポリンやペプチドグリカン間隙の孔径に匹敵するか、それを超える。その結果、浸透圧が緩和されるまで、代謝産物は受動的かつ比較的無差別に放出される。

少なくとも1つの機械感受性チャネルがアミノ酸排泄に関与している。コリネバクテリウム・グルタミカムのMscCGは、以前はビオチンの制限やペニシリンやTweenでの処理に反応する膜の欠陥に起因するとされていたグルタミン酸の排泄に関与している(6, 70)。MscCGは、パッチクランプアッセイではアスパラギン酸を、フェニルアラニン産生大腸菌で発現させるとフェニルアラニンを通過させることができることから、幅広い基質特異性を持っているのかもしれない(51)。これまでのところ、機械感受性チャネルはクロスフィードに関与しておらず、低浸透圧ストレスへの一貫した反復暴露が必要であるため、おそらくその可能性は低い。しかし、バクテリアの多様な機械感受性チャネルについては、他の刺激に反応するものもあるかもしれないので、まだ解明されていないことが多い(24)。

細胞内濃度が十分に高ければ、促進拡散（エネルギーカップリングなし）によって作動する、より厳格な基質特異性を持つトランスポーターも、代謝物の流出を可能にする可能性がある。Streptomyces davawensis由来のこのような可逆的ファシリテーターは、リボフラビン産生B. subtilisで発現させるとリボフラビン産生を促進した(53)。同様のトランスポーターは、環境サンプル由来の低複雑性微生物群集におけるビタミンの相互供給に関与していると推測された(116)。

4.4. 細胞溶解
細胞溶解はしばしばクロスフィーディングのメカニズムとして考えられている。Gudeら(48)によって仮説が立てられたように、細胞死、プログラムされた溶菌、プロファージ誘導、ファージによる溶菌の持続的な頻度が、クロスフィーディングを支える可能性がある。すでに相互扶助的な交雑摂食を行っている細菌にファージを導入した実験では、細胞残渣に含まれる栄養素もあって、ファージを介した交雑摂食の可能性が明らかになった（36）。Shouら（124）は、2つの酵母株による溶菌の振動サイクルが、安定した相互摂食につながることを示した。進化した大腸菌集団における溶菌を介した交雑摂食も実証されている。しかしこの場合、ある亜集団の溶菌は、必ずしも集団の増殖に寄与するのではなく、定常期における別の亜集団の生存に主に寄与していた(118)。

溶菌を介した交差摂食の具体的な例は、他にほとんどない。いくつかの研究では、溶菌は代謝物の外部化に大きく寄与するものではないと結論づけている。細胞外で測定された中心代謝産物のマイクロモルレベルは、細胞の溶解や採取手順とは無関係であると推論された(100)。Mesorhizobium loti から藻類へのビタミン B12 のクロスフィーディングの傾向は、細胞溶解を伴わない計算モデルの予測によく合っていた (46)。また、M. lotiはビタミンB1オーソトロフィーを支持することができず、やはり溶解よりもB12の分泌を示唆した(63)。コア代謝遺伝子を欠く大腸菌変異体によるアミノ酸排泄は、蛍光生死染色によると細胞溶解の増加とは関連していなかった(102)。別の研究では、細胞伸長のために相互栄養を必要とする個々の細胞を視覚的に追跡したが、細胞溶解が観察されたという報告はなく（25）、活発に増殖する補助栄養細胞は互いに支え合っていることが示された。このように、クロスフィーディングを支える溶解の例がある一方で、活発に増殖している細胞が共同的に価値のある代謝産物を外部に排出する他のケースでは、明らかに他の主要なメカニズムが関与している。

4.5. 能動的な外部化
代謝産物の外部化には、能動的な分泌や排出が関与することもある。場合によっては、あるアミノ酸の外部化によって、antiport機構を介した別のアミノ酸の取り込みが促進される。例えば、C. glutamicumのリジン取り込みシステムは、アラニン、イソロイシン、またはバリンの外部化によって駆動される(11, 13)。緑膿菌はアルギニンを異化する際にアルギニン-オルニチンアンチポーターを使用し(80)、また一部の乳酸菌はアスパラギン酸を取り込むためにアラニンを外添する(1)。従って、このようなメカニズムが外来アミノ酸のクロスフィーディングにつながる可能性は考えられる。

また、代謝物の分泌や排出がトランスポーターの唯一の目的である場合もある。もともとC. glutamicum (138)でリジンの流出を仲介することが発見されたが、その後、H+駆動型のLysEスーパーファミリートランスポーターは、RhtBとRhtC (148)によるホモセリンとスレオニンの流出、LysO (105)によるリジン、ArgO (93)によるアルギニン、LeuE (71)によるロイシン、メチオニン、ヒスチジン、そしておそらく他のアミノ酸の流出に関与している。他のファミリーに属するアミノ酸トランスポーターとしては、(a)分岐鎖アミノ酸(64)とメチオニン(133)の排出に関与するC. glutamicumトランスポーターBrnFEと、スレオニンとセリンの排出に関与するThrE(126)、(b)アラニンの排出に関与する大腸菌トランスポーターAlaE(56, 66)と分岐鎖アミノ酸の排出に関与するYgaZH(103, 104)がある。また、ATP結合カセット（ABC）トランスポーターは、アミノ酸によっては生理的濃度でも逆流する可能性があるとも論じられている（57）。

代謝物の排出は、しばしば多剤排出ポンプと呼ばれる排出ポンプを介して起こることもある。この後者のラベルはやや誤解を招きやすく、いくつかの排出ポンプはかなり限られた範囲の基質に対して作用し(132)、多くは一般的な細胞内代謝産物に対して、おそらく優先的に作用することができる(131)。実際、細胞内代謝物の排出系のいくつかは、多剤排出ポンプファミリーに属している(13, 62, 81, 131)。例えば、大腸菌では、フラビンはプロトン駆動型多抗菌薬排出ファミリートランスポーターYeeOによって排出され(83)、芳香族アミノ酸は薬物代謝産物トランスポーターYddGによって排出され(31)、システインの排出には、major facilitator superfamily (MFS)H+-antiporterであるBcrが関与している。Resistance-nodulation-cell division (RND)スーパーファミリーのトランスポーターは、大腸菌(75)やPseudomonas fluorescens(2)の脂肪酸排出に関与している。その他の大腸菌MFSタンパク質は、アラビノース（YdeA）(67)、イノシン（YicM）(47)、糖（SetA）(77)の排出に関与している。葉酸中間体であるp-アミノ安息香酸の排出に関与するタンパク質は、スルホンアミド系抗生物質にも耐性を示した(28)。いくつかの排出ポンプが幅広い基質特異性を持つことを考えると、トランスポーター機能の冗長性が他の代謝物排出ポンプの発見の妨げになるかもしれない。すべての排出ポンプを欠損させ、単一のトランスポーターを導入できるようにした変異体は、代謝物排出における単一の排出ポンプの役割に取り組むための実用的なアプローチとなる(132)。

5. 代謝物排泄の生理学的説明
なぜ細胞内代謝物は外部に排出されるのか？他の場所でも述べられているように、クロスフィーディング自体が、互恵的なパートナーからの利益によってコストが上回れば、代謝物の外部化を選択する可能性がある(19, 33, 91, 101)。しかし、代謝物の外部化にはクロスフィーディングとは独立した生理的役割があるかもしれない。したがって、通常の生理学的プロセスが、交雑摂食関係を発展させるための舞台を整えているのかもしれない。

5.1. リリーフバルブ
共同体的に価値のある代謝産物は微生物群集にとって価値があるだけでなく、その多くは人間社会にとっても価値がある。そのため、代謝産物流出の発見の多くは、代謝工学的な研究によって動機づけられたものである。律速トランスポーターを同定するための一般的な戦略は、目的の化合物または毒性アナログの毒性レベルに対して耐性を持つ変異体を選択することである（31, 47, 56, 64, 66, 71, 93, 103-105, 114, 126, 130, 133, 135, 138, 148）。このアプローチが繰り返し成功したことから、細胞内代謝産物の排出に生理的役割がある可能性が示唆された。代謝物の濃度が恒常性レベルを超えると、専用の輸送体がその代謝物を排出する。いくつかのグループは、このような恒常的な排出がクロスフィーディングにつながるという仮説を立てている(15, 48, 78)。アイデアの繰り返しをアイデアの証拠と誤解しないように注意しなければならないが、以下に述べるように、リリーフバルブ理論にはさらなる根拠がある。

5.1.1. 本来の代謝物の排出。上記のトランスポーターのほとんどは、代謝物のクロスフィーディングの必要性を否定するような、法外に高い代謝物レベルが提供されたときに発見された。したがって、これらの排出ポンプは、ペプチドを唯一の炭素源とした場合に放出されるアミノ酸のような、一般的な代謝物が過剰な場合に最も重要になる可能性がある(70)。しかし、代謝物の流出は、このようなストレスの多い条件下以外でも、恒常性維持プロセスとして起こる可能性がある。代謝物の中には、複数の経路を同時かつ最適に通過するために、高レベルに維持されなければならないものがあると論じられてきた(15, 48)。実際、細胞内の代謝物レベルは、それを利用する酵素を飽和させることが多い(7)。飽和する代謝物レベルに遺伝子発現ノイズ(34)が加わると、代謝ノイズ(15, 48, 78)となり、代謝物レベルが変動して毒性濃度に達したり(44, 67, 115)、他の酵素に干渉したり(23, 60, 95)する可能性がある。代謝物の比率を維持することも重要である(93)。代謝物濃度が過剰であったり、代謝物比率が不利な条件下では、細菌は代謝物を分解して後で再合成する（リサイクル）か、あるいは代謝物を分泌することで対応する可能性がある。
過剰な代謝産物の分泌はコストがかかるように思われるかもしれない。しかし、排出タンパク質はしばしば制御されており（22、56、64、71、93、103、104、130、133、135）、その結果、コストをある程度削減できる可能性がある。より一般的には、細菌は、一見不必要に見えるが、最終的には生存に重要な進化的トレードオフの一部である可能性が高い、多様なプロセスを実行することが多い(86)。大腸菌がコストのかかるアミノ酸の分解経路を持たないのは、代謝物のリサイクルよりも排出の方が有益な戦略だからだとする説もある(15, 48)。問題のアミノ酸のいくつかは、コンビナトリアル大腸菌クロスフィーディング研究でも、共培養の増殖に関連していた(87)。実際、アミノ酸の取り込みは、細胞外に流出するアミノ酸の外部からの利用可能性を制限する重要な因子であるようだ。プロリンの異化と取り込みが欠損した大腸菌変異体（113）やリジンの取り込みが欠損した大腸菌変異体（50）は、それぞれのアミノ酸の細胞外レベルが高いことを示した。おそらく、代謝物を再取得する機会が、排出のコストを最小化するのであろう。多くの環境では、隣人はクローンである可能性が高いため、競合相手の利益になるリスクは限られている。

上述したように、多くの代謝産物排出タンパク質は薬物排出ファミリーに分類される。多くの薬物排出タンパク質は染色体上で保存されていることから、代謝物の排出において主に恒常的な役割を果たし、おそらく有益な副作用として毒性化合物からの保護があることが示唆される(131)。この考えを支持するものとして、複数の内膜薬物排出タンパク質の機能に必要な外膜タンパク質であるTolCは、そうでなければ好ましい生育条件下で正常な生育傾向を示すために必要である(52, 117)。TolCはさらに、あるいはその代わりに、乱雑な酵素活性や自発的な代謝産物損傷から生じる毒性産物を細胞から除去するためにも重要である可能性がある（23, 60, 95）。トリプトファンや関連中間体のような芳香族アミノ酸は損傷を受けやすく(60)、TolCが欠損すると活性化するストレス応答経路を誘導するものがあることが示された(22)。

5.1.2. 代謝物の排出に影響する環境因子。リリーフバルブの機能は、外的要因によっても影響を受ける可能性がある。豊富な炭素は、多様な微生物においてオーバーフロー代謝を引き起こし、その結果、中心代謝産物や一部のアミノ酸がマイクロモラーレベルまで外部に排出されると推定された(41, 100, 107)。成長速度も代謝物の外部化に影響を与える可能性がある。成長が比較的速い大腸菌では、グルコース飢餓時に代替炭素異化経路の発現を刺激する細胞内シグナル分子であるcAMPを、マイクロモル量まで外添した（76）。
環境条件の変化もまた、代謝物の流出を引き起こす可能性がある。脂肪酸は、P. fluorescensのRND型排出ポンプを介して、温度擾乱に反応して分泌された(2)。フェッドバッチ反応器における栄養分のシフトも、大腸菌による代謝産物の外部化に影響を与えた(16)。栄養素が枯渇すると、細菌細胞は飢餓に備えなければならないが、これには高分子のターンオーバーも含まれる。リボヌクレオシドH+-アンチポーターは、定常期にRNAが分解される際に放出されるヌクレオシドの毒性蓄積から大腸菌を保護すると推測された(47)。定常期にバリンとウラシルが同様に外部に放出されるのは、タンパク質とRNAの分解に関連していると推測された(100)。

バイオフィルムと呼ばれる細菌の多細胞凝集体は、代謝産物の外部化に影響を与える環境勾配を作り出すことができ、場合によっては交差摂食につながることもある(35)。ある例では、コロニーの無酸素域に存在する大腸菌の亜集団がアラニンを分泌し、そのアラニンが酸化域に存在する別の亜集団によって消費された(30)。アラニンの分泌は、前述の排出タンパク質AlaEによって媒介された(30)。

5.2. 月光を浴びる代謝物？
代謝産物の中には、細胞内での役割を超えて、細胞外でも役割を果たしているものがある。細胞内エネルギーキャリアとしてよく知られているATPは、多様な細菌によって外部化され(128)、健康なマイクロバイオームを促進するために免疫反応を抑制する可能性がある(106, 112)。細胞外での役割を持つ他の代謝産物には、ポリアミンやグアニジンなどがある(131)。リボフラビンは、もともと多剤排出トランスポーターと注釈されていたものを介して、細胞外呼吸に参加するために、いくつかの細菌によって外部化される(69)。プテリンは細胞質内でいくつかの役割を果たすことが知られているが(37)、大腸菌や緑膿菌ではプテリンプールの95%以上が細胞外に存在する(111)。プテリンと結合するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のバイオフィルム形成の重要な制御タンパク質はペリプラスムに存在すると考えられており、プテリンの細胞間シグナル伝達の役割も示唆されている(37)。

タンパク質性アミノ酸であることに加え、システインは細胞外皮内の酸化還元反応にも関与することができる。大腸菌にはシステインを排出するタンパク質が複数存在する（26, 38, 144, 147）。システイン排出タンパク質の一つであるYdeD（26）は、ペリプラスムで活性酸素と戦うためにシステインを輸送していると考えられている（99）。同様の役割はABCトランスポーターCydDC (109)でも同定されており、活性酸素に対抗するためにシステインをペリプラスムに輸送し(55)、ジスルフィド結合の還元を介してペリプラスムタンパク質複合体の構築に寄与している可能性がある(108)。その結果、酸化されたシスチンは高親和性ABCトランスポーターに取り込まれ、細胞質で還元され、このサイクルを続けることができる(98)。この再取得により、システインとシスチンの相互摂取の可能性は減少すると思われるが、外膜の相対的透過性を考慮すると、システインとシスチンは、少なくとも一過性には群集メンバーに利用可能であると推定できる。

5.3. パートナーに刺激された代謝物の排出
上記の例から、ほとんどの代謝物がいつでもクロスフィーディングに利用可能であるように思われるかもしれない。しかし、代謝物の流出は条件付きであることが多い。例えば、比較研究において、異なる微生物は異なる代謝物を外分泌し（41, 100）、大腸菌の従属栄養細菌はどの従属栄養細菌を支持できるかが異なっていた（87, 143）。それにもかかわらず、ほとんどのクロスフィーディング研究が比較的少ない代謝物を対象にしているのは驚くべきことかもしれない。いくつかのクロスフィーディング反応が見落とされている可能性がある。ほとんどのクロスフィーディング研究では、単一の代謝物を必要とする補助栄養体を用いている。そのため、従属栄養生物を救う代謝物が個体群の結果を最も支配することになり、他の交雑栄養は気づかれない可能性がある。例として、NH4+のクロスフィーディングのために操作されたR. palustris-E.coli共培養において、予期せぬプリン・クロスフィーディングが明らかになった(73)。また、H2のクロスフィーディングに基づいたメタン生成-硫酸還元菌共培養において、予期せぬアラニン・クロスフィーディングが見つかった(139)。別の研究では、補助栄養体を満足させるのに必要なアミノ酸のクロスフィーディングが推測され(41)、生産者に利益をもたらす未知の形の相互作用も観察された(42)。

外部化代謝産物および/または排出タンパク質の検出もまた、必ずしもクロスフィーディングの機会と一致するわけではない。上述したように、排出タンパク質の制御や外部化代謝産物の再取得は一般的であり、代謝産物の利用可能性を制限する。私のグループは、生産者が外来化した代謝物を再取得できる場合、レシピエントがその代謝物を獲得する競争優位性を持っている場合にのみクロスフィーディングが起こることを示した(84)。レシピエントが代謝物に対して競争力を持つ場合、結果として代謝物プールが引っ張られ、生産者がより多くの代謝物を作るよう刺激される可能性がある。例えば、NH4+ AmtBトランスポーターの欠失によりNH4+の取り込みが阻害されたR. palustris変異体は、R. palustris単培養のNH4+レベルから予測されるよりも多くの大腸菌の増殖を支持した(84)。また、R. palustris ΔAmtB変異体は共培養でより大きなニトロゲナーゼ活性を示したことから、大腸菌によるNH4+の消費が、おそらく窒素飢餓応答として、R. palustrisを刺激してより多くのNH4+を作らせたことが示唆された(84)。

大腸菌によるNH4+の獲得は、NH4+排泄が検出限界以下である野生型R. palustrisとの交差摂食を確立するのに十分でさえあった(39)。大腸菌が窒素掃去能を増強する変異を獲得したことで、NH4+に対して大腸菌が競合的になり、R. palustrisがNH4+排泄を増強することなく、相互摂食の正のフィードバックループが形成されたと考えられる(39)。このように、一時的に利用可能な代謝物にアクセスするレシピエントの能力は、レシピエントが獲得するのにあまり競争力のない他の代謝物よりも、その代謝物のさらなる放出を刺激するのに十分である可能性がある。

M. lotiと藻類のビタミンB12補助栄養体との共培養でも、相手から刺激される交雑摂食が観察された(12, 46)。M. lotiは藻類と共培養した場合、単培養の場合に比べて10倍以上のB12を産生した(46)。M. lotiによるB12排泄の増加は、おそらく利用可能なB12の枯渇によって刺激されたのではないと思われる。というのも、M. lotiの細胞内レベルと上清のB12レベルは、共培養の方が単培養よりも高かったからである(46)。興味深いことに、M. lotiはB12を分泌する能力はあるが、増殖培地中にB12を供給しても取り込まなかった(12)。これらの観察結果は、藻類がM. lotiのB12排泄を刺激する、より洗練されたメカニズムを示唆しているのかもしれない。

6. 結論
バクテリアはリーキーなのか？細胞外皮の欠陥による代謝産物の損失を意味するリーキーという言葉を文字通りに解釈すると、帯電代謝産物や極性代謝産物を含むほとんどの場合、バクテリアはリーキーではないと結論づけられる。NH4+/NH3のような透過性の高い代謝物は例外であり、細胞から漏れると考えられる。ほとんどの場合、共同体として価値のある代謝産物は、恒常的な代謝産物レベルの維持や、細胞質内とは異なる役割を果たすなどの目的のために、促進性トランスポーターや活性型トランスポーターを介して外部に排出されると考えられる。この外部化によって、隣接する細胞が外部化した代謝産物を競合的に獲得できるようになり、生産者によるさらなる放出や受容者による相互作用が刺激される可能性がある。しかしながら、細胞の欠陥による漏出も、クロスフィーディングの可能なメカニズムとして排除されるべきではない。もし搾取から守られていれば、クロスフィーディングの互恵的利益は、非致死的な細胞外被欠陥のデメリットを上回り、その欠陥は生産者集団に固定化される可能性がある。

要点
1.
クロスフィーディングに関する文献では、リーキーという用語が曖昧に使われている。私はこの用語を文字通り、細胞外皮の欠陥による物質の損失を意味するものとして使うことを提案する。

共同体として価値のある代謝産物の外部化には、多くのメカニズムが関与している可能性があるが、アミノ酸のような荷電した極性分子の成長細胞による外部化には、膜を介した拡散よりも、むしろ促進性または活性トランスポーターが関与している可能性が高い。

3.細胞内代謝産物は、酵素の飽和を保証する高い細胞内レベルの騒々しい調節に由来する恒常性レベルを維持するために、一般的に放出されるかもしれない。

能動的な取り込みと排出タンパク質の制御は一般的であり、潜在的な生産者集団による代謝物の外部化を制限している可能性が高い。

5.一時的に利用可能な代謝物を競合的な受容体が獲得することで、生産者による代謝物の外部化がさらに刺激され、相互作用のフィードバックループが形成される可能性がある。

今後の課題
1.
細胞外皮の代謝がクロスフィーディングにつながる自然の例はあるか？

クロスフィーディングの利点は、そうでなければ有害となるような細胞外皮の欠陥や漏出を、どの程度まで選択することができるのか？

同じような増殖条件であるにもかかわらず、なぜ菌や株によって異なる代謝物が外分泌されるのか？

いくつかの排出ポンプの冗長性、あるいは重複する基質特異性が、他の代謝物外部化システムの発見を妨げているのか？

クロスフィーディングの追加層はどの程度見過ごされているのか、また、クロスフィーディングの異なる層はどの程度生産者とレシピエントのフィットネスに影響するのか？

クロスフィーディングに関与する多くの共同利用価値のある代謝物について、透過係数が不明である。

情報開示
著者は、本総説の客観性に影響を及ぼすと思われるような所属、会員資格、資金提供、金銭的保有について、一切承知していない。

謝辞
この総説のテーマは、もともとW. Harcombeとの会話から着想を得たものである。有益な議論をしてくれた研究室のメンバーや同僚に感謝する。特にY.-C.Chuangには感謝している。Chuangは、私でなければ見落としていたであろう文献を見つけ、一緒に議論してくれた。紙面の都合上、多くの模範的な文献を掲載できなかった。著者は、全米科学財団CAREER賞MCB-1749489および米国陸軍研究局助成金W911NF-14-1-0411の支援を受けている。

前の記事へ 次の記事へ
関連記事

引用文献

最もダウンロードされた記事
© Copyright 2023 Contact Us Email Preferences Annual Reviews Directory Multimedia Supplemental Materials FAQs プライバシーポリシー Cookie Settings

トップへ戻る
PDF
ヘルプ
プライバシーポリシーこのウェブサイトでは、マーケティング、パーソナライゼーション、アナリティクスだけでなく、サイトに不可欠な機能を実現するためにクッキーなどのデータを保存しています。プライバシーポリシー
クッキーの設定 すべてを受け入れる