相対的存在量データはマイクロバイオームの遺伝率を誤って示す可能性がある

2023年10月16日 14:19

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公開日: 2023年10月09日
相対的存在量データはマイクロバイオームの遺伝率を誤って示す可能性がある

https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-023-01669-w

Marjolein Bruijning, Julien F. Ayroles, ...C. Jessica E. Metcalf 著者を表示
マイクロバイオーム第11巻、論文番号：222（2023）この記事を引用する

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指標詳細

要旨
背景
宿主の遺伝学はマイクロバイオームの構成を形成する可能性があるが、それがどの程度なのかは依然として不明である。この重要な疑問は、他の複雑形質と同様に、マイクロバイオームの遺伝率（h2）-各分類群における存在量の分散のうち、宿主の遺伝的変異に起因する割合-を推定することで解決できる。しかし、ほとんどの複雑形質とは異なり、マイクロバイオームの遺伝率は一般的に相対存在量データに基づいており、分類群特異的な存在量がサンプル中の微生物総存在量に占める割合として表される。

研究結果
絶対量ではなく相対量を用いた場合に得られる遺伝率について、絶対量に関する量的遺伝モデルに基づく解析的近似を導出した。これに基づいて、マイクロバイオームの遺伝率を推定するために相対量を用いた場合に起こりうる3つの問題を明らかにした。この問題は優占分類群について最も顕著である。(2) サンプルサイズが大きいと偽発見率が高くなる。十分な統計的検出力があれば、群集中の遺伝可能な分類群数の過大評価につながる。(3) 微生物の共存量が遺伝率の推定に偏りをもたらす。

結論
この分野を発展させるためのいくつかの解決策について、技術的・統計的な発展を中心に考察し、遺伝率の推定値を解釈する際や、研究間の値を比較する際には注意が必要であると結論づける。

ビデオ要約

背景
代謝から行動に至るまで、マイクロバイオームが様々な疾患リスク因子に影響を及ぼすことが知られている宿主の表現型は増え続けている[1,2,3]。しかしながら、マイクロバイオームの構成形成における宿主の遺伝学的な寄与については、ようやく理解され始めたばかりであり[4,5,6,7,8]、そのような関連性やそのメカニズム（直接的、あるいは間接的、例えば食事との遺伝的な関連性を介したもの）を探求する研究が増えつつある。このような関心は、進化や共進化によって宿主と微生物の相互作用がどのように形成されてきたかを、より短い、あるいは長い（すなわちマクロ進化）時間スケールで理解したいという願望から生じているだけでなく [1,9]、宿主と微生物の相互作用の遺伝的基盤を明らかにすることは、健康への応用においても重要な意味を持つ [10]。これらの疑問を解決するために重要なのは、マイクロバイオーム構成における遺伝的影響と環境的影響の相対的重要性を正しく測定する能力である。

遺伝率は、親子間の類似性の遺伝的基盤の重要な側面を定量化する、量的遺伝学の中心的パラメータである。表現型形質の遺伝率は統計的特性であり、集団における表現型分散のうち遺伝的変異に起因する割合として定義される[11]。マイクロバイオームの遺伝率を推定する場合、対象となる表現型形質は通常、群集組成の指標か、特定の分類群の存在量の指標のいずれかである[12]。ほとんどのマイクロバイオーム構成因子の遺伝率は比較的低いというコンセンサスが得られつつあるが、マイクロバイオーム構成を形成する宿主遺伝的変異の重要性に関する具体的な推定値は、研究によって大きく異なる（表1）。例えば、最近の研究では、ヒヒの腸内微生物の97％が、ゼロではない有意な遺伝率を持つことが判明した [13]が、別の研究では、宿主の遺伝的背景は、ヒトのマイクロバイオーム組成の形成においてわずかな役割しか果たさないと結論付けている [14]。このような研究間の大きな違いをどのように解釈すべきなのだろうか。これらは本当に生物学的な違いを反映しているのだろうか？

表1 微生物分類群の存在量の遺伝率を推定した研究をサンプルサイズ別にまとめたもの。研究ごとの方法論については、Additional file 1: Appendix S4に詳細がある。
フルサイズの表
遺伝学の世界では、遺伝率を指標として用いることがよく行われているが、遺伝率が実際に何を測定し、どのように解釈されるのかは、依然として多くの混乱の原因となっている。遺伝率は定義上、集団固有の推定値であり、環境や集団の遺伝的構造からの影響を受ける。さらに、マイクロバイオームの遺伝率がゼロでないことを検出しても、血縁関係にある個体が平均してより類似したマイクロバイオームを持つようになるメカニズムについては何もわからない。いくつかのメカニズムが考えられる。例えば、経膣分娩や母乳を介して、両親（通常は母親）から子へと微生物が垂直伝播する可能性がある [35, 36]。どちらの効果も、宿主と微生物の遺伝子型の間に密接なつながりをもたらし、その結果遺伝率を上昇させる可能性がある。あるいは、宿主の遺伝子型は、キツツキの種で示されたように、定着できる微生物の種類に直接影響を与える可能性があり［38］、このメカニズムによっても遺伝率が高く見積もられる。逆に、遺伝率がゼロと推定されたとしても、垂直伝播（または親族からの水平伝播）がないことを意味するのではなく、海綿動物で発見されたように、単に環境の影響がはるかに大きく、これらの伝播効果を圧倒していることを意味するかもしれない [39]。

マイクロバイオームの遺伝率を推定する際の方法論的な複雑さは、微生物の絶対量が通常不明であることである。そのため、各サンプルの合計を1として相対量を計算し、いわゆる「組成データ」を作成するのが一般的である。組成データには固有の問題があることは以前から認識されており、相関がまったくない場合でも、変数間に偽相関が生じることが知られている[40]。このことは、例えば、治療群間（例えば、宿主の疾患状態）で異なる量の微生物を検定する場合など、微生物データの文脈でより最近議論されている[41,42,43,44,45,46]。マイクロバイオームの遺伝率の推定は、宿主の遺伝子型間の存在量の差の比較に根ざしているため、同様の問題にさらされる可能性がある。しかし、現在までのところ、微生物の遺伝率の推定値を報告している研究では、組成データの使用に伴う潜在的な問題を明確に考慮していない。

相対存在量を用いた場合に得られる分類群特異的遺伝率の近似値を示す（この推定値をφ2
). この指標は従来のh2推定値とは異なることを示す：φ2
は単に宿主の遺伝的・表現型的分散の関数ではなく、対象となる微生物や群集の他の様々な特性にも依存する。これに基づき、我々は相対存在量データを用いて分類群の遺伝率を推定する際に生じうる3つの主な問題を特定した。第一に、相対存在量は本質的に共分散するため、ある微生物に遺伝性のシグナルがあると、遺伝性のない微生物の遺伝率を偽推定してしまう可能性があること、あるいはその逆に、遺伝性のない微生物が遺伝性のある微生物の遺伝シグナルを隠してしまう可能性があることである。この問題は支配的な分類群に対して最も顕著で、存在量の少ない分類群ではこの問題の影響は小さくなり、2つの遺伝率推定値（h2とφ2
)は収束する。しかし、関連する2つ目の問題も残っています。遺伝しない微生物の推定遺伝率がゼロに近くなることはあっても、完全にゼロになることはありません。多数の宿主をサンプリングした場合、そのような非常に弱い（偽の）遺伝性シグナルでさえも、統計的検出力が高いことを反映して、非常に有意になる可能性がある。群集中の多くの微生物分類群を考慮する場合、結果として遺伝性微生物の全体的な割合をかなり過大評価することになる。第三に、存在量が共分散している微生物分類群（例えば、共有ニッチや微生物相互作用が原因）は、h2とφ2の間に大きな不一致をもたらす可能性がある。
の間に大きな不一致が生じ、系統的に遺伝率の推定値に偏りが生じる。共分散の性質と符号によって、これは真の遺伝率のシグナルを覆い隠したり、大きくしたりする。φ2の近似を導出した後
の近似を導出した後、これらの問題のそれぞれについて詳しく説明する。我々の解析結果は、シミュレートしたデータセットに統計モデルを当てはめて遺伝率を推定した結果と一致することを示す。次に、発表された研究から得られた経験的遺伝率の推定値について、我々の結果を踏まえて議論する。議論では、ここで述べた問題を部分的に解決する可能性のあるいくつかの解決策を概説する。結論として、相対存在量に基づく遺伝率の推定値を解釈し、研究間の値を比較する際には注意が必要であり、微生物の絶対存在量の近似値がこの問題を解決する一助となる可能性がある。

ある分類群の存在量の遺伝率
ある分類群の遺伝率を推定する場合、ある分類群の存在量を宿主の量的表現型形質と見なし、量的遺伝モデルに頼ることになります。宿主jにおける分類群iの絶対存在量（Pij
)は次のように書ける。

Pij=αi+Gij+Eij
(1)
ここでαi
は微生物i の平均絶対存在量、Gij
は繁殖値または宿主の遺伝的寄与（簡単のため、遺伝的優性またはエピスタシスはないと仮定する）、Eij
は環境寄与（残差）であり、G×E相互作用はないと仮定する。式1は、宿主の年齢、性別、季節など、分類群個体数に影響する追加要因を含めることで拡張できる。

宿主個体間において、微生物i の絶対量は平均αi
と分散 VPi
(を持つ正規分布に従うと仮定する（正規分布でないデータは変換またはリンク関数が必要で、例えば[47]を参照されたいが、この原稿の範囲を超えている）。この分散は遺伝的寄与と環境的寄与に分解できる（遺伝子型-環境共分散がないと仮定）：

VPi=VGi+VEi
(2)
遺伝率の定義に従うと、分類群iの遺伝率は

h2i=VGiVPi
(3)
絶対量がわかっている場合，宿主の遺伝的変異に起因する全分散の割合を定量化することによって，分類群の遺伝率を単純に推定することができる（例えば，混合効果モデル[48]をあてはめることによって）。すべての仮定が満たされている場合（例えば、表現型が正規分布している、GxE相互作用がない）、遺伝率が推定できる（この場合、優性もエピスタシスもないと仮定するので、ブロードセンス遺伝率とナローセンス遺伝率は同じであることに注意）。直接的な遺伝的影響と、他の微生物や遺伝的制御下にある行動などによる間接的な遺伝的影響の両方が、ゼロでない遺伝率をもたらす可能性がある。

しかし、私たちは通常、微生物の絶対量を知らない。その代わりにほとんどの場合、宿主個体間で分類群iの相対存在量がどのように変化するかを定量化し、相対存在量の分散のうち遺伝的変異に起因する割合として遺伝率を推定する。以下では、式1-2に示した基本モデルに基づいて、絶対存在量ではなく相対存在量を用いた場合の遺伝率の式を導出する。

相対存在量に基づく遺伝率の近似式
上で概説したように、微生物分類群iの絶対存在量は宿主個体間で次のように分布する。

Pi∼Normal(αi,VPi)
(4)
相対存在量の分布は対象となる微生物に依存するだけでなく、M個の分類群からなる群集全体の絶対存在量にも依存する。群集の絶対存在量C（ここでC=∑MjPj
)も正規分布変数であり、その平均はすべてのM個の分類群の平均存在量の合計に等しい。分散は各分類群における分散に加え、微生物ペア間の各表現型の共分散の合計に依存する。

C∼Normal(∑j=1Mαj,∑j=1MVPj+2∑1≦j<k≦MMcovP(j,k))
(5)
焦点微生物iの相対存在量(fraction fPiと呼ぶ)
)は、焦点となる分類群iの絶対存在量を群集全体の存在量で割ったものとして計算されるため、式4と式5の比として分布する：

fPi∼Normal(αi,VPi)Normal(∑α,∑VP+2∑covP(j,k))
(6)
我々は，var(fPi)
を定量化することに興味がある。
. 同様に、宿主の遺伝子型間で相対存在量がどのように変化するかを、VPi
とVP
をVGi
とVG
に置き換えて、各微生物のペア間の遺伝的共分散covGを考慮する：

fGi∼Normal(αi,VGi)Normal(∑α,∑VG+2∑covG(j,k))
(7)
宿主の遺伝的変異によって説明される相対存在量の分散の割合（すなわち、相対存在量または分数に基づく遺伝率、以降φ2
は

φ2=var(fGi)var(fPi)
(8)
言い換えると、式8は絶対量ではなく相対量を用いた場合に得られる遺伝率を与える。理想的には、絶対存在量の代理として相対存在量を用いれば、絶対存在量を用いても相対存在量を用いても遺伝率の指標は同じになる。
.

絶対存在量データではなく相対存在量データを用いた場合の分類群iの遺伝率の近似値は次式で与えられる。

φ2≈A2VG+α2ω-2α(Aγ-ακ)A2VP+α2z-2α(A(γ+↪Ll_3F5)-α(ν+κ))
(9)
(追加ファイル1: 付録S1参照)。遺伝率φ2
は焦点となる分類群の特性の関数で、パラメータVG
とVP
は絶対存在量の遺伝的分散と表現型分散を記述し、α
は平均絶対量を表す（読みやすくするため、添え字iは省略）。式9から、φ2
はまた、対象分類群 i と群集内の他の各分類群との間の遺伝的・環境的共分散の和の関数（γ
と ↪Ll_3F5
の関数である。）最後に、φ2
は（焦点分類群を除く）背景群集の様々な特性の関数である： A はバックグラウンド群集の平均絶対存在量、ω
とz
はバックグラウンド群集の絶対存在量の宿主遺伝的および表現型分散の合計（すなわち、すべての分類群にわたって合計された分散）、κ
とν
はバックグラウンド群集の各対間の遺伝的共分散と環境的共分散の和である。

式3と式9の違いに注目してください。
は（定義上）VG
とVP
h2は（定義上）VGとVPの関数のみであるのに対し、相対現存量を用いた場合に得られる遺伝率の推定値は、焦点となる微生物（α
)、群集全体(A
, ω
z, κ
, ν
)、焦点微生物と群集間の相互作用(γ
, ϵ
). 宿主-マイクロバイオーム系の生物学的性質やデータの特性にもよるが、結果として生じうる3つの問題を特定した。

問題1：分類群間の相互依存性により遺伝率の推定が不正確になる。
相対的な存在量は独立ではないため、ある微生物における遺伝的変異が、他の微生物における偽のゼロでない遺伝率につながる可能性がある。あるいはその逆で、遺伝性のない微生物が遺伝性のある微生物の遺伝的シグナルを隠してしまうこともある。微生物Aの遺伝率が1、微生物Bの遺伝率が0である場合（図1a）。存在量は相対的な存在量にスケールされるため、微生物Bの存在量のばらつきは宿主の遺伝によって形成されるように思われる（図1a）。さらに、両方の存在量を相対的な存在量として表現すると、微生物Aに対する宿主の遺伝的影響が部分的に不明瞭になる。この結果、両方の種の遺伝率は0.5と推定されるが、これはどちらの場合も間違っており、両方の微生物に遺伝性があるという誤った結論になる。

図1
図1
相対的な微生物量は相互に依存しているため、1つの微生物における遺伝性シグナルが、遺伝性のない2番目の微生物における偽の遺伝性シグナルにつながったり、遺伝性のある微生物における遺伝性シグナルを覆い隠したりすることがある。A 例として、2つの微生物を持つ3つの宿主（マウス）の遺伝子型を示す。ここで1つの微生物は完全に遺伝性があり（青、h2 = 1）、1つの微生物は遺伝性がない（赤、h2 = 0）。その結果、微生物ブルーの平均絶対存在量は遺伝子型によって異なり、微生物レッドの平均存在量は一定である。絶対存在量を用いれば（そして十分な宿主複製があれば）、遺伝率を正しく推定できる。しかし、相対存在量は独立ではないので、遺伝する微生物の存在量に宿主の遺伝的シグナルがあると、2番目の微生物にも宿主の遺伝的シグナルが生じ、遺伝子型間で相対存在量のばらつきが生じる。このため、遺伝率の推定値φˆ2=0.5
になる。B 相対存在量に基づく場合、焦点となる微生物とコミュニティー全体の両方の性質が遺伝率の推定値を形成する。ここでは、焦点微生物の平均絶対存在量（α
)を変化させる（x軸はαα+A
). 黒線：焦点となる微生物の遺伝率は0.5；背景となる群集は遺伝しない（A=1
; z=(16)2
; ω=0
VP=(16)2
VG=0.5(16)2
). 灰色線：焦点となる微生物は遺伝しないが、それ以外の群集は平均遺伝率0.5 (A=1
; z=(16)2
; ω=0.5(16)2
VP=(16)2
VG=0
). C αを変化させたときの絶対的または相対的存在量（y軸）に基づく場合の遺伝率の推定値の差（x軸）。
を変化させた場合の遺伝率の推定値の差（y軸）。焦点となる微生物の平均絶対存在量が、群集の残りの部分の平均存在量の合計と比較して低い場合（例えば、多くの微生物分類群の場合）、φ2
と h2 の差は小さくなる。焦点となる分類群 i の h2 は 0.2であり、色つきの線は背景となる群集の様々な遺伝率（h2community=ωz
). A=100
; z=100(16)2
VP=α(16)2
. クロスは、シミュレーションした相対存在量データに混合効果モデルを当てはめて遺伝率を推定した結果を示す。この目的のために、100分類群からなる微生物群集を持つ宿主の集団（500遺伝子型×各遺伝子型内の1000複製）をシミュレートした（詳細は、Additional file 1: Appendix S2.1-2.3を参照）。

フルサイズ画像
これは式9を用いて定式化することができ、遺伝的・環境的共分散がない場合は次のように単純化される。

φ2≈α2ω+A2VGα2z+A2VP
(10)
このことから、平均個体数が非常に少ない対象分類群（すなわち、α≪A
)では，推定遺伝率は絶対存在量に基づくときと同じ値に近づく(式3)：

limα/A→0φ2≈VGVP=h2
(11)
しかし，非常に優勢な分類群（α≫A
)では，真の遺伝率h2
に近づく：

limα/A→∞φ2≒ωz
(12)
ω
とzは、バックグラウンド・コミュニティ全体の遺伝的分散と表現型分散の合計（焦点微生物を除くすべての微生物にわたって合計）であることを忘れてはならない。したがって、非常に優性な微生物では、推定された遺伝率はバックグラウンド・コミュニティの遺伝率に近づき、焦点微生物の遺伝的・表現型分散にはまったく影響されない。

このことは、対象となる微生物とそれ以外の群集の両方の性質によって、遺伝率の推定値が異なる方向に偏る可能性があることを示唆している（図1b）：豊富な微生物が遺伝しにくい群集に生息している場合、その遺伝率を過小評価することになる（図1bの黒線）。一方、宿主の遺伝的シグナルを持たない豊富な微生物は、遺伝しやすい群集の背景に存在すると、やはり遺伝しやすいように見える（図1bの灰色の線）。その結果、遺伝率の誤差（すなわち、φ2
とh2の差の絶対値）の誤差は、焦点微生物の遺伝率とバックグラウンド群集の遺伝率の両方に依存し、一般にバックグラウンド群集に対する存在量が増加するにつれて大きくなる（図1c）。αα+A<0.05
(例えば、群集に20の同じように豊富な分類群がある場合)、期待される絶対誤差は、図1cに示したすべての条件において10%未満となる。ここで、誤差はバックグラウンド群集の総存在量(A)と対象微生物の存在量(α
)に依存するだけでなく、分散zとVP
がそれぞれ A と α
に比例する（図1cでは、VP
はα
).

問題2：サンプルサイズが大きいと偽発見率が高くなる
遺伝性のない微生物でも、相対的存在量の相互依存性により、相対的存在量の測定で遺伝的シグナルを示すことがある。式9を用い、環境共分散がない場合、遺伝性のない微生物の推定遺伝率（VG=0とする）は
)は

φ2≈α2ωα2z+A2VP
(13)
バックグラウンドの群集全体が遺伝性を持たない場合（すなわち、ω=0
)でない限り、式(13)は0より大きくなる。
が0に近づくが
が A に比べて小さくなるとゼロに近づくが、決してゼロにはならないかもしれない。

低いφ2
値が低くても、十分な検出力があれば有意に見えることがある。Rパッケージsimr [49]を用いて検出力分析を行い、宿主遺伝を含むモデルと含まないモデルを比較する対数尤度比検定に基づいて、帰無仮説(H0: φ2=0
が（誤って）棄却される確率を計算する（詳細はAdditional file 1: Appendix S3）。結果もまた、対象となる微生物と群集の残りの部分の両方の性質に依存するが（図2）、一般的にサンプルサイズが大きいほど、遺伝しない微生物が遺伝するとみなされる確率が高くなる。データセットが十分に大きければ、統計的検出力は100％に達する（図2）。

図2
図2
遺伝性のない微生物(VG=0
)の遺伝率が誤って有意(α < 0.05)に見える確率は、R-パッケージsimr (28)を用いた検出力分析によると、サンプルサイズが大きくなるほど高くなる。結果は、焦点となる微生物とその他の群集の特性の両方に依存する：色は、背景となる群集の存在量を一定に保ちながら、焦点となる微生物の異なる存在量（α）を示す。線の種類はバックグラウンド群集の遺伝率を示す（実線：ωz=0.1
点線：ωz=0.25
). VP=(16)2
; A=100
; z=100⋅(16)2

フルサイズ画像
その結果、群集中の遺伝性微生物の数は、特にサンプルサイズが大きい場合、強く過大評価される可能性がある（詳細は、Additional file 1: Appendix S2.4の結果を参照）。高い偽発見率は、例えばサンプリングエラーや交絡因子の問題ではなく、データ収集の努力や質を高めるだけではこれらの問題を解決できないことに注意することが重要である。同様に、クロスバリデーション、並べ替え分析、多重検定の補正などのより高度なモデリングアプローチでは、この問題を完全に解決することはできないだろう。というのも、この問題は相対存在量の使用に固有のものだからである：非好熱性微生物の相対存在量には宿主遺伝的シグナルが本当に存在する（すなわち、1型エラーではない；式13が示すように、φ2
は本当に0より大きい）。

問題3：微生物の共存在が偏った遺伝率の推定につながる
ここまでは、式9の共分散項（すなわち、γ
, ϵ
, ν
およびκ
)はゼロであると仮定した。ここで、この仮定を緩和すると遺伝率の推定値に偏りが生じることを示す。

ゼロでない共分散項は、微生物分類群の共存在を反映する。つまり、宿主の遺伝的相関と環境の相関である。例えば、微生物Aの存在量が平均的に高い宿主遺伝子型は、微生物Bの存在量も高くなる。量的遺伝学の一般的な慣行として、遺伝学以外のすべてのものを「環境」という用語で表現していることに注意されたい。マイクロバイオームの場合、温度や土壌のような生態学的環境因子が微生物の存在量に与える影響を捉え、微生物間でニッチを共有することで環境相関が生じます。残差項はまた、宿主の内部や宿主によって形成された環境の影響、宿主内の他の微生物の存在量、あるいは単に説明のつかないノイズも捉える。宿主内で作用する生物学的プロセスで、環境項を相関させるもののひとつに微生物間相互作用がある。強い相互作用、例えば相互摂食や公共財生産の結果、環境相関は正になる。一方、拮抗的な相互作用は負の環境相関をもたらす。

ゼロでない共分散は、共分散の性質（すなわち、遺伝的か環境的か）、およびその共分散が対象分類群に関与しているかどうか（γ
, ϵ
)や背景群集(ν
, κ
). ここで示す結果では、各微生物のペア（フォーカル・コミュニティとバックグラウンド・コミュニティのメンバーを含む）が同じ遺伝的・環境的相関を持つと仮定する。

正の遺伝的共分散を持つ群集では、一般に遺伝率は下方に偏る（図3c）。これは、正の遺伝的共分散は分母よりも分子に対して相対的に大きな（負の）影響を与えるからである（式9）。このことを直感的に理解するために、2つの等しく存在する微生物がともに遺伝率0.5で、しかも強い遺伝的相関（rG = 0.99）を持つというシナリオを考えてみよう。このような強い遺伝的相関は、2つの微生物に対する宿主の遺伝的影響が共分散していることを意味し、2つの微生物は宿主の遺伝子型レベルで共豊性を示す。その結果、両微生物の絶対存在量は宿主遺伝子型によって異なるが、全く同じように変化する（図3a）。相対存在量を計算すると、遺伝子型間の存在量のばらつきは完全に消えてしまうので、どの微生物も遺伝性のシグナルを示さないという誤った結論になる。

図3
図3
微生物間に宿主遺伝相関や環境相関がある場合、相対存在量の使用は偏った遺伝率の推定につながる。A 遺伝的相関の影響を示す。例として、遺伝性の一部（h.2 = 0.5）を持ち、強い遺伝的相関（rG = 0.99）を持つ3つの宿主遺伝子型と2つの微生物を示す。これは、2つの微生物に対する宿主の繁殖値が強い相関関係にあることを意味している。その結果、両微生物の平均絶対存在量は、宿主の遺伝子型によって同じように変化する。これらの絶対存在量を用いれば、遺伝率を正確に推定することができる（両微生物についての推定値：hˆ2＝0.5
). しかし、相対存在量を計算すると、宿主遺伝子型間のばらつきが消えてしまう。このため、両微生物について誤った遺伝率の推定値φˆ2=0
となり、宿主の遺伝的シグナルが完全に隠されてしまう。Bは環境相関の効果を示している。ここでは、強い環境相関（rE = 0.99）を示す3つの宿主遺伝子型と2つの微生物を示している。その結果、遺伝子型内のばらつきが減少している。絶対存在量を用いれば、遺伝率は正確に推定できる。しかし、各遺伝子型内の相対存在量のばらつきが大きく減少するため、誤った遺伝率の推定値φˆ2=1
が得られる。C-E 絶対存在量と相対存在量に基づいて、環境相関(C)、遺伝相関(D)、またはその両方(E)を変化させた場合の遺伝率の推定値の比較；
A=100
VP=(16)2
z=100⋅VP
ωz=0.25
. クロスは、シミュレーションした相対存在量データに混合効果モデルを当てはめて遺伝率を推定した結果を示す。この目的のために、宿主の集団（500遺伝子型×各遺伝子型内の500複製）をシミュレートした（詳細はAdditional file 1: Appendix S2.5）。

フルサイズ画像
ただし、真の遺伝率がゼロに近い場合は例外で、正の遺伝的共分散は真の遺伝率の過大評価につながる（図3c）。これはAγ＜aκ
の場合、式9の共分散項が負になる（分子が増加する）。γ
は分類群iと他の各微生物の間の全遺伝的共分散であるため、VG
がゼロに近づくと小さくなる。その結果、Aγ＜aκ
となり、遺伝率が過大評価される。

群集における正の環境共分散（例えば、高度に相互主義的な群集）は、分母には（負の）影響を与えるが分子には影響を与えないため、ほとんど逆の効果をもたらす（式9）。微生物間の宿主遺伝相関が正であれば遺伝子型間の相対存在量の変動が減少する傾向があるのに対し、環境相関が正であれば遺伝子型内の変動量が減少する傾向がある（図3b）。各遺伝子型内の変異が減少すると、各遺伝子型に固有のマイクロバイオームが形成され、微生物の遺伝性が示唆される。その結果、正の環境共分散は遺伝率に全般的に上方バイアスをもたらす（図3c）。A_3F5<aν
の場合のみ、真の遺伝率が過小評価される。これは、例えば、対象となる分類群に環境変動がほとんどない（すなわち、遺伝率が高い）場合に起こり、ϵが低くなる。
が低くなる。

最後に、群集に正の遺伝相関と環境相関の両方が存在する場合、2つの遺伝率の関係は非常に非線形になり、φ2
(に基づいてh2を予測することは本質的に不可能である（図3e）。

現在の経験的推定範囲の枠組み
我々の結果は、現在までに発表されている遺伝率の推定値の範囲を考える上で、さらなる背景を与えるものである。第一に、我々の結果は、各分類群の存在量が群集全体の存在量に比べて低い場合（そして微生物の共存在がないと仮定した場合）、分類群の遺伝率の推定値が正確であることを示している（図1c）。文献を調べたところ、研究に含まれる分類群の数の中央値は221であることがわかった（表1）。したがって、ほとんどの分類群の相対存在量は低いと考えられるので、個々の（低存在量の）分類群の遺伝率の推定値はかなり正確である可能性がある。さらに、ヒトのマイクロバイオームは少数の優占的な分類群によって特徴づけられることが多く [50]、多くの宿主種でもそうである可能性がある。この結果は、少数の分類群しか含まない研究（例えば、多様性の低い群集や、ほとんどの分類群が希少であるためにフィルタリングの段階で除外されるような群集）、あるいはマイクロバイオーム群集が少数の高度に優性な分類群によって特徴付けられるような研究においては、正確な遺伝率の推定を行うことは困難であることを示している。

サンプリングされた宿主の数に関連する2つ目の問題点として、遺伝性を持つ微生物の割合が、高い偽発見率のためにかなり過大評価される可能性があることを明らかにした。遺伝性微生物の割合の経験的推定値は、サンプリングした宿主の数と正の相関を示している（図4a；二項回帰：p値＜0.0001）。もちろん、サンプルサイズが大きければ、小さな影響を検出する力が強くなるため、常に有意な結果が得られる。ここでの課題は、基礎となるコミュニティーについてもっと詳しく知らなければ、このインフレーションのどれだけが「本当」で、どれだけが誤発見によるものなのか確定できないということである。たとえその絶対量が宿主遺伝学によって全く形成されていなくても、十分な統計的検出力があれば、すべての微生物が最終的に有意な遺伝性を持つように見える可能性があり（図2）、偽発見率アプローチ（Benjamini-Hochbergなど）ではこの問題を解決できない（Additional file 1: Appendix S2.4）。これは、マイクロバイオームのメンバーが他の本当に遺伝可能な微生物と相互依存関係にあるためであり、集団間で遺伝可能な真の割合が一定であっても、サンプルサイズと遺伝可能な微生物の割合の間には正の関係が現れる（Additional file 1: Appendix S2.4）。

図4
図4
遺伝性を持つ分類群の割合（A）と、すべての有意な遺伝性を持つ微生物を含む分類群の平均遺伝率（B）の経験的推定値を、サンプルサイズ、すなわちサンプリングした宿主の数に対してプロットした（x軸の対数スケールに注意）。ドットは表1の値を示し、各ドットの数字は表1の「番号」列に対応する）。テール線は、Aは二項回帰（ここでは試行数は分類群の数）、Bは線形回帰に基づく平均予測値を示す。Bでは，点線が平均遺伝率と各研究で発見された最も低い遺伝率と最も高い遺伝率とを結び，開いた点として示されている

フルサイズ画像
遺伝可能な分類群の割合から分類群の遺伝率に焦点を移すと、この量（有意な遺伝性シグナルを持つ分類群のみを含む）は研究間だけでなく研究内でも大きく異なり（図4b）、ほぼ0-1の範囲全体をカバーしている。研究間で報告された有意な遺伝率の最低値は0.008、最高値は0.84であった。群集における有意な遺伝率の平均は0.30であり、研究間の範囲は0.056から0.58である。サンプルサイズと平均遺伝率の間には負の相関があり、宿主個体数が多い研究ほど平均遺伝率が低いことが経験的推定から示唆されていることは注目に値する（図4b；線形回帰：p値=0.002）。これは、小規模な研究において、より高い遺伝率の推定値を好む出版バイアスがあるためと考えられ、真のマイクロバイオームの遺伝率は、時々報告されるよりも低い可能性を示唆している。しかし、サンプルサイズが大きい研究ほど、推定遺伝率が低い分類群の数が多くなり、本当に遺伝性があるか、偽陽性である可能性があるため、平均遺伝率が低下している可能性もある。

収録された研究は、生物学的（例えば、宿主系、集団と組織、分類学的レベル、その他の共変量）、方法論的（例えば、データ収集、有意性の尺度、統計モデル）の両方において、サンプルサイズ以外の多くの面で明らかに異なっている。遺伝性微生物の真の割合や平均遺伝率が、研究間で同じであると期待する理由はない。さらに、サンプルサイズでは説明できないばらつきがあることは明らかであり、他の要因（方法論的な要因だけでなく生物学的な要因も考えられる）も作用していることを示している。しかし、サンプルサイズのばらつきだけで、遺伝性微生物の割合（擬似R2 = 37%）と平均遺伝率（R2 = 39%）の両方において、研究間でかなりのばらつきが説明できる。

最後に、我々の結果は、φ2
のh2に対する偏りは、h2の大きさと遺伝的・環境的相関の基礎となるパターンの両方に依存することが示された（図3）。微生物間の（絶対量の）相関の性質と強さについてはほとんど知られていないため、この偏りが現在までに発表された結果に与える影響を解釈するのは難しい。しかし、これらの結果は、共存在パターンを推定するさらなる努力の重要性を強調している。

考察
微生物の遺伝率を推定するために、絶対存在量の代用として微生物の相対存在量データが一般的に用いられているにもかかわらず、相対存在量の統計解析から生じうる固有の問題を考慮した研究はほとんどない。その性質上、相対存在量データは独立ではなく、絶対値では存在しない変数（微生物存在量）間の相関関係が生じる。ここでは、(1)このことが、特に分類群の少ないマイクロバイオームや高存在の分類群の場合、遺伝率の不正確な推定につながる可能性がある。(2)サンプルサイズが大きいと、偽発見率が高くなり、遺伝性のある微生物の割合が過大評価される可能性がある。(3)ほとんどの生物系で一般的であると思われる微生物共存在パターンは、遺伝率の推定にさらに偏りをもたらす。微生物の存在量差分析でも同様の課題が実証されており、高い偽発見率を抑制することは困難である[42, 46, 51,52,53,54] 。このような問題の根底にあるメカニズムを明らかにすることは、微生物分類群の数とその存在量、宿主の数、共存量のパターンから、どのような場合にこのような問題が発生するのか、またどのような方向にバイアスがかかるのかを特定するのに役立ちます。相対的存在量に基づく遺伝率が誤解を招く可能性があるのは、絶対的存在量に対する宿主の遺伝的制御について推論を行いたい場合、つまり相対的存在量を絶対的存在量の代用として使用する場合のみであることに注意することが重要である。もし関心のある指標が、実際には相対存在量の遺伝率であれば、φ2
の真値に直接アクセスできる。しかし、最近の研究では、絶対量がより多くの生物学的情報を提供する可能性が提唱されており [55, 56]、例えば総細菌量とクローン病 [57] との関連が示されている。また、φ2
は、対象となる微生物と群集全体の特性の両方の関数であるため（式9）、その生物学的解釈は難しい可能性がある。残念ながら、ここで述べた問題に完全に対処する単純な解決策はないようであるが、以下にこの分野を発展させるためのいくつかの可能性のあるアプローチについて述べる。

相互依存的な相対存在量データの問題を明らかに解決する一つの解決策は、分類群（またはグループ）の絶対存在量を定量化することである。特定の微生物分類群に関心がある場合、そのような分類群は、定量的PCR（qPCR）、液滴デジタルPCR（ddPCR）、フローサイトメトリー[43,57,58,59]などの存在量推定に的を絞ったアプローチを用いて直接定量することができる。さらに、容易に培養可能な微生物については、培養によるコロニー形成単位（CFU）のカウントが絶対量を推定する方法として役立つ。しかし、これらのアプローチは、あるマイクロバイオームを構成する数百から数千の分類群に関わるマイクロバイオーム全体の研究にとっては、依然として困難である。ひとつの可能な解決策は、微生物の相対存在量データをサンプルの総微生物負荷量の推定値と統合することである。例えば、ある分類群がサンプル中の16S rRNA遺伝子の読み取りの1％を占めている場合、その1％に16S rRNA遺伝子アンプリコンの総数（例えば、同じプライマー、ngのDNA、PCRサイクル数を用いたqPCR推定値から得られる）を掛け合わせることで、その分類群の絶対存在量を推定することができる。このようなアプローチをさらに改良するために、研究者は16S rRNA遺伝子ではなく、既知のシングルコピー遺伝子、例えばrpoBをターゲットにすることができる[60]。絶対的存在量と相対的存在量を用いた場合の推論を比較する研究が出始めているが [43, 61]、マイクロバイオームの遺伝率の文脈でこれを取り上げた研究は知らない。

実験技術に加えて、新たなデータ解析アプローチも有益である。マイクロバイオーム研究（ゲノム研究（遺伝子発現）、地質学（鉱物組成）、化学（化学組成）も含む）に関連する、組成データの解析方法に関する文献（Aitchison [1982]によって開拓された）は数多く存在する。利用可能な全ての手法の包括的な概要を提供することは本稿の範囲外であるが、このような手法を微生物データに適用した研究については[41, 51, 62, 63]を参照されたい。ここでは、これらのアプローチの背後にある主な直感と、これらが遺伝率の推定精度を向上させるためにどのように役立つかを簡単に説明する。

データの正規化は、絶対量のより良いプロキシを得るための最初の解決策である。分類群ごとのリード数をサンプルの総リード数で割る代わりに、総リード数をある正規化係数で割る。これには、適切な「参照」値を選択すること、つまり、各サンプル内で適切な比較対象を決定することが必要です。各分類群のリード数を設定した基準と比較する利点は、サンプルに含まれる他の分類群の影響を受けにくくなることです。さらに、組成データを対数比として表現することが推奨されます。これにより、データが単純空間から実空間に変換され、標準的な統計学的検定により適するようになる [64, 65]。

さまざまな正規化と変換方法の利点は、選択した参照によって決定的に異なります。サンプル間で存在量が一定であることが知られている「参照」分類群がある場合、各サンプルをこれらの参照分類群のリード数で割ることで、各サンプルの相対的な存在量をサンプル間で比較可能な存在量に変換し（これは遺伝子発現データを正規化するために参照遺伝子を使用するのと同様である）、対数比を計算することができる（相加対数比変換）[52, 65]。また、各分類群と全分類群の幾何平均との対数比を計算することもできます（中心対数比変換）[66]。あるいは、少数の微生物分類群のみがサンプル間で異なる存在量であると考えられる場合、各サンプルのカウント分布の分位数（例えば中央値）に基づいて正規化係数を計算することもできます（累積和スケーリング）[67]。

存在量が一定の既知の参照分類群が本当に存在する場合、または平均存在量が本当に全サンプルで同一である場合、適切な正規化／変換を適用することでサンプルカバレッジの違いをうまく補正し、真の遺伝率を求めることができます（Additional file 1: Appendix S5）。しかし、マイクロバイオームの遺伝率に関する研究の中には、データ変換（例えば、中心対数比変換[13, 34]、Box-Cox変換[5]、逆正規変換[29]など）を適用しているものもあるが、そのような変換が正当化され、既存の問題が改善されているかどうかの検証が不足している。現在のところ、適切な正規化係数を選択する指針となる経験的データはほとんどない。

有意に遺伝しやすい分類群の数に注目するよりも、実際の遺伝率の推定値に注目する方がより有益かもしれない。また、結果を「有意」と「有意でない」に二分することは、マイクロバイオームの遺伝率では特に問題となる可能性がある。というのも、相対現存量は相互依存関係にあり、ある分類群の現存量が増加すれば、必然的に他の分類群の相対現存量も減少するからである。このことは、宿主の遺伝的変異が、少数の微生物における絶対存在量に影響し、他の遺伝的変異のない微生物にも遺伝的変異をもたらす可能性があることを示唆している。したがって、帰無仮説（すなわち、マイクロバイオームのメンバーの相対存在量に宿主遺伝的シグナルは存在しない）が真になることは稀であろう。十分なサンプルサイズがあれば、たとえ生物学的に意味のない効果であっても、統計的に有意な効果が得られる [69]（図2）。

効果の大きさに注目することで、生物学的に最も関連性の高い遺伝性分類群を特定することができる。我々の結果は、焦点となる微生物の存在量が群集の他の部分と比較して非常に高いか（図1）、微生物の存在量が共分散していない限り（図3）、相対存在量に基づく分類群特異的遺伝率の推定値は不偏であることを示している。先験的に）遺伝率の閾値を設定し、この閾値を超える遺伝率だけを生物学的に関連性があるとみなすこともできる。例えば、Goodrichら（2016）は推定遺伝率が0.2を超える分類群の結果のみを提示している。

効果量に注目するだけでなく、特定の微生物分類群について累積的なエビデンスを評価することは、真に遺伝性があり生物学的に関連性のある微生物を同定するのに役立つ。Grieneisenら（2021）は、彼らの推定した遺伝率と、以前に報告された研究による推定値の間に相関関係があることを発見した（ただし、彼らの効果量ははるかに小さい）。また、Goodrichら(2016)は、研究間や宿主系間で一貫した非ゼロ遺伝率を持つ様々な分類群を特定した。このような一貫性のある結果を探すことは、特に宿主のパフォーマンスに関連する微生物について、どの分類群がより詳細な研究に値するかを示すことになる。複数の研究が、クリステンセネラ科のメンバーについて高い遺伝率を報告しており、その推定値は30～60％である [5, 6, 22, 29, 70]。Christensenellaceaeのメンバーは、いくつかの宿主の代謝形質に関連している [70]；例えば、相対的存在量が高いほど、低い肥満度と関連している [5]。

本研究では、各サンプルの合計を1、つまり100%に設定した相対存在量を使用した場合の結果に特に注目した。実世界のマイクロバイオームデータセットの解析には、さらなる課題が伴う。まず、サンプル間のばらつきは、絶対量が不明となるだけでなく、不確実性のレベルが異なることを意味する。例えば、ある分類群について10,000リードのサンプルで100カウントした場合、100リードのサンプルで1カウントした場合よりも、統計的推論がよりロバストに行えることは明らかである。この情報は、データを相対存在量に変換する際に失われてしまう。ここでの1つの解決策は、これらのカウントを直接モデル化できる回帰分析を使用することである[71]。

第二に、サンプリング範囲のばらつきには他の重要な意味がある。宿主のマイクロバイオームがどの程度サンプリングされたのか、すなわち、個々のマイクロバイオームの何割がサンプリングのために採取されたのかがわからない。サンプルが構成するマイクロバイオームの割合を知ることは、絶対量をマイクロバイオームのレベルまで外挿する上で極めて重要である[72]。加えて、サンプルがどの程度徹底的に評価されたのか、すなわちサンプルの全分類群を明らかにするのに十分な配列数だったのか、あるいは配列決定を追加することでより多くの分類群が明らかになるのかがわからない。サンプリング範囲のばらつきは、予想されるサンプリング分類群数に影響し、シーケンシングリードの数が多ければ多いほど、完全に評価された時点まで予想される微生物の豊富さが増加します[73]。これに対処するための解決策としては、レアファイング（rarefying）[74]がありますが、これには批判がないわけではありません[75]。ゼロカウントが過剰になると、データがゼロインフレになり、多くのパラメトリック統計検定の根底にある正規分布残差の仮定に違反する。そのため、データを正規化するために対数変換を行う研究もある。しかし、群集生態学で知られているように、カウントデータを対数変換すると、偏った不正確な推定値になり、任意のオフセットを選択することになる[76]。さらに、対数変換は、例えばBray-Curtis非類似度[77]の推定値が低くなるなど、マイクロバイオーム群集レベルの比較を誤らせる可能性がある。

第三に、各実験段階（抽出、増幅、配列決定など）における系統誤差の累積的な影響により、測定されたマイクロバイオーム組成に大きな偏りが生じる可能性がある[78]。最後に、どのようなモデルでもそうであるように、量的遺伝モデルには一連の仮定があり、マイクロバイオームの遺伝率の推定値の精度は、これらの仮定がどの程度満たされているかに左右される。例えば、しばしばなされる重要な仮定は、GxE相互作用による分散は全分散にほとんど寄与しないため、GxE相互作用の大きさが個体群によって異なるにもかかわらず、無視できるというものである[79]。

ここで述べた問題に加えて、このような複雑な問題がマイクロバイオームの遺伝率推定の頑健性にどのような影響を及ぼすかは、まだ調査されていない。この研究によって、研究者にマイクロバイオームの遺伝率の推定に伴う課題を認識してもらいたい。研究者には、個々の分類群の遺伝率の推定値を解釈する際にも、遺伝可能な微生物の全体的な割合を解釈する際にも、慎重であることを強く求めたい。研究間で一貫した結果を得ることに焦点を当てるとともに、絶対量の近似値を得るための技術的・統計的開発に継続的に投資することで、宿主と最も密接に関連するマイクロバイオームのメンバーを研究する能力が向上すると思われる。

データおよび資料の入手可能性
該当なし。

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謝辞
該当なし。

資金提供
MBはオランダ研究評議会（NWO）の資金援助を受けている（Rubicon grant number 019.192EN.017）。BK、KMM、CJEMは米国国立科学財団（助成金番号1754494）の助成を受けている。LHは米国国立科学財団（Graduate Research Fellowship Program, #DGE1656466 ）の助成を受けている。

著者情報
著者および所属
アムステルダム大学生物多様性・生態系動態研究所（オランダ、アムステルダム、1090 GE

マージョレイン・ブルイニング

プリンストン大学生態進化生物学部、プリンストン、ニュージャージー州、08544、USA

Marjolein Bruijning、Julien F. Ayroles、Lucas P. Henry、C. Jessica E. Metcalf

ルイス・シグラー統合ゲノミクス研究所、プリンストン、ニュージャージー州、08544、USA

ジュリアン・F・アイルレス、ルーカス・P・ヘンリー

ゲノム・システム生物学センター、ニューヨーク大学生物学部、ニューヨーク市、10003、USA

ルーカス・P・ヘンリー

統合生物学部門、カリフォルニア大学バークレー校、カリフォルニア州、94720、USA

ブリット・コスケラ＆カイル・M・マイヤー

貢献
MBはCJEMの助言を受けながら解析を行った。JFA、LPH、KMM、BK、CJEMは原稿の校閲と編集に大きく貢献した。

筆者
Marjolein Bruijningまで。

倫理宣言
倫理承認および参加同意
該当なし。

出版に関する同意
該当なし

競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

追加情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。

補足情報
追加ファイル1：付録S1.
相対存在量に基づく場合の遺伝率の近似。付録S2. 数値シミュレーション結果。付録S3. 検出力分析。付録S4. 公表結果の要約。付録S5. データ変換。

権利と許可
オープンアクセス本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされており、原著者および出典に適切なクレジットを付与し、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合はその旨を示す限り、いかなる媒体または形式においても使用、共有、翻案、配布、複製を許可する。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表記に別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを閲覧するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの権利放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジット表記に別段の記載がない限り、この記事で利用可能となったデータに適用されます。

転載と許可

この記事について
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この記事の引用
Bruijning,M.、Ayroles,J.F.、Henry,L.P.他。相対存在量データはマイクロバイオームの遺伝率を誤って示す可能性がある。Microbiome 11, 222 (2023). https://doi.org/10.1186/s40168-023-01669-w

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受領
2022年5月31日

受理
2023年9月13日

発行
2023年10月09日

DOI
https://doi.org/10.1186/s40168-023-01669-w

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キーワード
絶対存在量
組成データ
遺伝的分散
宿主-微生物会合
微生物相
表現型の多様性
マイクロバイオーム
ISSN: 2049-2618

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投稿に関するお問い合わせ：lyndie.manicani@springernature.com
一般的なお問い合わせ: info@biomedcentral.com
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