宿主の飢餓と藻類共生体の宿主内分解が、カシオペア-シンビオジナ共生体の熱ストレス応答を形成する

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公開: 2024年2月29日
宿主の飢餓と藻類共生体の宿主内分解が、カシオペア-シンビオジナ共生体の熱ストレス応答を形成する

https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-023-01738-0?utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter


ガエル・トゥーレック
ニルス・レーデッカー
...
アンダース・メイボム
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マイクロバイオーム12巻、記事番号：42（2024） この記事を引用する
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指標詳細
概要
背景
地球温暖化は、サンゴ礁のような主要な海洋生態系の根幹をなす刺胞動物と共生生物の大規模な崩壊を引き起こしている。しかし、熱ストレスがこれらの共生パートナーシップを乱すメカニズムは、まだ十分に理解されていない。そこで、逆さクラゲのカシオペアが有力な実験モデル系として浮上してきた。
実験結果
我々は、制御された熱ストレス実験と同位体標識および相関SEM-NanoSIMSイメージングを組み合わせ、宿主の飢餓が、最終的にカシオペアホロビオントの崩壊につながる一連の現象の中心的な要素であることを示した。熱ストレスは、藻類共生体からの光合成物の供給が減少すると同時に、異化活性の上昇と未給餌宿主の炭素貯蔵量の枯渇を引き起こした。このような宿主の飢餓状態は、藻類共生体の顕著な分解を伴っており、これはカシオペアの熱ストレス反応の特徴かもしれない。興味深いことに、この共生藻の分解による損失は、飢餓動物の体の縮小によって隠蔽され、その結果、「目に見えない」白化現象が生じた。
結論
全体として、本研究はカシオペアホロビオントの熱ストレス応答における栄養状態の重要性を浮き彫りにした。他の共生刺胞動物と比較して、カシオペアの大きな中漿膜は、構造的に糖分とタンパク質を含んでおり、飢餓を遅らせることができるエネルギー貯蔵庫を構成している可能性がある。この解剖学的特徴は、急速に温暖化する海洋において、これらの動物が比較的高いストレス耐性を持つことに、少なくとも部分的に寄与していると考えられる。
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はじめに
刺胞動物宿主とその細胞内渦鞭毛藻類共生体との間の光共生の膨大な多様性と普及率は、今日の（亜）熱帯海洋における彼らの生態学的成功の証である[1, 2]。刺胞動物と藻類の共生では、藻類は光合成によって大量の無機炭素を固定し、その後、光合成産物のかなりの割合を宿主に伝達する [3,4,5,6,7]。この光合成産物の効率的な移動は、刺胞動物宿主のエネルギー代謝を促進し、その呼吸炭素要求量をカバーするのに十分である [8]。一方、刺胞動物宿主は、藻類共生体に自身の代謝から無機栄養素、特にCO2を供給する [9, 10]。この有機栄養塩と無機栄養塩の効率的な循環により、刺胞動物と藻類の共生は、高度に貧栄養な熱帯環境でも繁栄することができる [11]。
しかし、この生態学的成功は、地球規模の気候変動、特に地球温暖化によって脅かされている [12]。深刻で長引く熱ストレスは、この共生を乱し、最終的にその崩壊をもたらす可能性がある [13, 14]。この感受性は、何億年もの間、サンゴ礁生態系の機能的基盤を構成してきたサンゴと藻類の共生において特に顕著である [2, 15, 16]。熱ストレスによってこの共生が破壊されると、サンゴの白化現象と呼ばれ、藻類共生細胞と光合成色素が失われ、サンゴの組織が透けて見え、その下にある白い炭酸カルシウムの骨格が見えるようになります [17]。長期の熱ストレスが続くと、白化によってサンゴの主なエネルギー源である藻類の光合成物質が奪われ、飢餓状態に陥り、最終的には死に至ります。実際、過去数十年間、度重なる大量白化現象によってサンゴが大量死し、多くのサンゴ礁が生態系崩壊の危機に瀕している [14, 18,19,20] 。
刺胞動物-藻類共生の崩壊は、どちらかの共生パートナーの耐熱限界の結果であるだけでなく、それらの相互作用にも依存している [21, 22]。この観点から、最近の研究では、熱ストレス時に共生栄養交換の不安定化がサンゴ-藻類共生の崩壊に先行することが示されている [23,24,25,26]。また、従属栄養摂食がサンゴ-藻類共生の熱ストレスに対する耐性や回復力を高めることも確立されている [27,28,29]。したがって、これらの動物の耐暑性は、宿主の栄養状態と密接に関連しているようである。しかし、熱ストレス時の刺胞動物-藻類共生の破綻における栄養循環と共生パートナーの栄養状態の役割については、まだ十分に記録されておらず、理解されていない。
共生クラゲ（Schyphozoa, Rhizostomae）の一属であるCassiopeaは、刺胞動物-藻類共生研究の新たなモデル生物である[30,31,32]。サンゴと同様に、カシオペアもシンビオディナ科の渦鞭毛藻類と共生している。しかし、サンゴやイソギンチャクが宿主の胃表皮細胞に藻類を共生させているのとは対照的に、カシオペアメダカは主に中層内のアメーバ細胞内に共生している [33, 34]。これらのアメーバ細胞内から、藻類はおそらくグルコース、脂質、アミノ酸の形で光合成物質を供給し、メデューサの同化成長を支えている [6, 33, 35,36,37] [1, 38]。しかし、サンゴとは対照的に、カシオペアは急速に変化する環境条件下でも繁栄するように見え、最近、いくつかの種が多くの（亜）熱帯地域に侵入していると報告されている [39,40,41,42]。いくつかの非共生性のスキアシクラゲ [43] と同様に、カシオペアは比較的暑さに強いと考えられている。実験によると、カシオペア属の体節の色素喪失は、ほとんどの造礁サンゴよりも高い温度で起こることが示唆されている [44,45,46,47,48,49]。さらに、自然界におけるカシオペアの白化現象は、非常に限られた数しか報告されていません [50]。この比較的高い耐熱性と高い栄養的可塑性のためもあり、カシオペアは、人為的に変化しつつある海洋環境において生態学的な「勝者」となり、顕著な存在量の増加と分布範囲の拡大を示すと予想されている [44, 46, 47, 49, 51,52,53] 。
カシオペアの熱ストレス応答における重要なプロセスを解明することは、この侵略的クラゲの生態学的成功に重要な洞察を与えるとともに、刺胞動物と藻類の共生における熱耐性の基礎となるメカニズムの概念的理解を深めることになる。具体的には、共生パートナーの栄養状態と相互作用がカシオペアホロビオントの熱ストレス応答の重要なドライバーであり、それによって造礁サンゴのような他の光共生刺胞動物で見られるプロセスに似ているという仮説を立てた。ここでは、カシオペアホロビオントが急性暑熱ストレスに徐々に応答し、その後崩壊する際の生理的、生体エネルギー的、共生的、細胞的メカニズムを調べることを目的とした。
この目的のため、制御された熱ストレス実験において、共生相互作用とカシオペア属メデュサーの栄養状態を研究した。未給餌のカシオペア・アンドロメダ・ホロビオン（Forskål, 1775）の長時間の高温に対する本質的な熱ストレス応答を調べた。生理学的分析と元素分析を同位体標識と相関走査型電子顕微鏡（SEM）およびナノスケール二次イオン質量分析（NanoSIMS）イメージングと組み合わせて、共生パートナーの代謝に対する熱ストレスの影響を研究した。このアプローチにより、サンゴやイソギンチャクなど他の光共生刺胞動物の熱ストレス応答との類似点が明らかになった。また、カシオペアホロビオントの高い耐熱性を説明する可能性のある特徴も明らかになった。
材料と方法
動物の飼育
ベルの直径が2cm前後（1.95±0.16cm、平均±SD）で、一般的に健康な外見（無傷で丸いベル、一定の脈動、開いた口腔腕）を持つ48匹のカシオペアメダカをこの実験に使用した。これらのメジナは、当研究所の培養水槽でストロビル化ポリプから繁殖・飼育したものである。この培養は、オランダのDeJong Marinelifeから入手したメデュサーの初期個体群から確立した。この培養から得られた3個体のCOI（ミトコンドリア・チトクローム・オキシダーゼ・サブユニットI）領域の断片の増幅と塩基配列決定による遺伝学的同定から、種はCassiopea andromedaであることが同定された（データは示していない）。200Lの培養水槽で、メダカは海塩（Reefs Salt、Aquaforest）から調製した人工海水（ASW）中で、塩分濃度35ppt、25.3℃±0.2℃、LEDライトから約100μmol photons m-2 s-1を12時間：12時間の昼夜サイクルで照射して飼育した。実験前には、孵化したてのArtemia salina naupliを週に2～3回、自由摂取させた。
熱ストレス実験のデザイン
実験開始の3日前、選別したメダカを馴化のため実験装置に移した。
実験装置は、各条件（すなわち、コントロールと熱ストレス）ごとに1台ずつ、計2台で構成され、それぞれに15Lのメイン水槽、循環ポンプ、温度を均一に保つためのヒーターが含まれていた（図S1）。水槽は蒸発と塩分濃度の変動を避けるため、透明なPVCキャップで密閉された。各水槽内には、6つの独立した500mL透明実験用アクリル容器に透明な蓋をし、常に空気をバブリングして十分に酸素化された状態を維持した（Loft food container, Rotho, Switzerland）。各容器は400mLのASWで満たされ、メインの水槽との水交換はなく、4匹のメダイを収容した。LEDライト（VIPARSPECTRA V165、USA）で約110μmol photons m-2 s-1を照射し、12時間：12時間の昼夜サイクルで飼育した。毎日、実験容器の塩分濃度を測定し、ASWの90%を温浴と同じ温度の新鮮なASWと交換した。浸透圧ストレスと光ストレスの交絡因子を避けるため、実験ユニット内の光と塩分濃度の両方を、動物培養条件と同様のレベルに維持した。馴化期間と実験期間（合計13日間）の間、従属栄養栄養獲得による交絡の可能性を排除するため、動物に餌は与えなかった。
両水槽の温度は、水中温度ロガー（Pendant Temperature/Light 64 K Data Logger, HOBO, US）を用いて常時記録し、メデュエを含まない400mLのASWで満たした別のアクリル容器に入れた。両実験条件とも、2日間の馴化期間中、ユニットは約27℃の温度に保たれた（コントロール：27.3±0.5℃、ヒートストレス：27.0±0.8℃）。実験開始時（1日目）に、熱ストレス条件の温度を最終温度約34 °Cまで徐々に上昇させ、5日目に到達し、その後、実験期間中、すなわち7日間、34.1±0.5 °Cに維持した（図1A）。最終温度34 °Cを熱ストレス条件として選んだのは、以前の研究でカシオペアではこの温度で白化し、ホロビオントが崩壊したことが報告されているからである[46, 48]。対照動物は実験期間中、平均温度27.2±0.6℃のままであった。
図1
カシオペアアンドロメダホロビオントに対する熱処理と毎日の測定。A 実験期間中の2つの熱処理の温度プロファイル。塗りつぶされた円は、毎日の測定開始時の海水温を示す。大きく開いた円内の数字は、対応する時間における各処理の個体数を示す。B 藻類共生体の最大量子収量（Fv/Fm）。Cベル直径とDベル脈動速度の経時変化。塗りつぶし円はコントロール（青）、エラーバーはヒートストレス（オレンジ）処理の平均±SEを示す。アスタリスクはそれぞれの時点における処理間の有意差を示す（*p < 0.050, **p < 0.010, ***p < 0.001）。SP = サンプリングポイント
フルサイズ画像
実験期間中、メデュサエの生理機能に対する温度の影響を評価するため、暗期の終わりに脈動速度、最大量子収量、ベル径を毎日測定した（図1）。同位体標識、インキュベーション、水と12個のメデュサーのサンプリングは、あらかじめ決められた3つの容器から、5日目（SP1）と11日目（SP2）に行った。
脈動速度、最大量子収量、ベル直径の毎日の測定
毎朝、明期前の1.5時間以内に、共生光生理に影響を与えないよう低照度の赤色光を用いて、暗順化したメデュサエの2セットの測定を行った。まず、それぞれのメデューサの鐘状収縮を1分間カウントすることで、夜間の脈動速度を評価した。非同期脈動（痙攣）を示すメデューサは脈動なしとカウントした。ベル組織が「溶けて」崩壊したメデューサは死んだとみなし、実験から除外した。次に、暗順応または最大量子収率（Fv/Fm）を、メデュサの中心をターゲットとする5.5 mmの光ファイバーを備えたMINI-PAM-II（青色バージョン；Walz GmbH、ドイツ）を用いたパルス振幅変調（PAM）蛍光測定法により測定した。
毎日、光のサイクルが始まったら、各実験容器を注意深く目盛り板の上に置き、ベルを完全に広げた状態でメデュサエを撮影し、ベルの直径を記録した。この際、水槽の水が過度に冷えないように、各実験容器を2分以内に水槽から取り出し、水交換を行った。
生理学的パラメータ
2つのサンプリングポイント（SP1およびSP2）それぞれで、SP2の熱ストレス条件（初期死亡のため4匹のみ）を除き、条件ごとに6匹のメダカ（3つの所定の容器から無作為に2匹ずつ、図S1）を生理測定のためにサンプリングした。
メダカによるアンモニウム（NH4+）の取り込みと放出を評価するため、それぞれの処理温度に予熱した40 mLの新鮮なASWを入れたガラスビーカーに個体ごとに移し、対応する水槽に入れた。さらに、メデューサの存在とは無関係に海水中のNH4+濃度が上昇する可能性を評価し、補正するために、海水のみ（メデューサなし）の入ったビーカーを各ウォーターバスに1つずつ入れた。明るいところで 6 時間培養した後、各ビーカーから ASW を回収し、温度を合わせた海水と入れ替えた。採取した水試料は0.22μmのPESフィルターでろ過し（Milli-Q水であらかじめ洗浄し、試料水のアリコートを廃棄）、直ちにNH4+濃度をSmartchem450湿式化学分析装置（AMS Alliance、イタリア）で測定した。
採水後、6個のメデュサエを採取し、湿重量、宿主タンパク質含量、共生藻類密度、クロロフィルa含量を評価した。余分な水分を除去し、メデュサエをあらかじめ加重した5mL丸底培養チューブに入れ、精密天秤を用いて重量を測定した。メデューサの湿重量を考慮し、最終容積が3mLになるように冷たい2×PBSを加えた（PBSの容積は3mLからメデューサの容積を引いたもので、メデューサの重量から推定し、密度を1g mL-1と仮定した）。次に、Polytron Immersion Dispenser（Kinematica, Malters, Switzerland）を用いて、組織スラリーが目に見えて均一になるまで、2×PBS中で少なくとも30秒間、氷上でホモジナイズした。宿主画分と共生生物画分を分離するため、組織ホモジネート1.3 mLを2等分してエッペンドルフチューブに移し、3000 × g、4℃で3分間遠心した。宿主画分を含む上清を2mLの凍結チューブに移し、液体窒素で急速凍結し、宿主タンパク質含量測定のさらなる処理まで-80℃で保存した。共生藻を含むペレットを1 mLの2×PBSに再懸濁し、2 mLの低温チューブに移し、凍結保存した。
メデュサーの宿主タンパク質含量は、Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher Scientific、ドイツ）を用い、標準マイクロプレートプロトコルの製造元の指示に従って、3テクニカルレプリケートで評価した。組織ホモジネートの宿主画分を氷上で穏やかに融解した。各サンプルのテクニカルトリプリケートを平底96ウェルプレートに移した。タンパク質含量は、BioTek Synergy H1 高感度プレートリーダー（BioTek Instruments、USA）で480 nmの吸光度を測定することにより評価し、メデューササンプルと一緒にアッセイしたウシ血清アルブミン（BSA）タンパク質標準の連続希釈液（標準曲線の範囲は0～2 μg mL-1）の吸光度に対して較正した。
共生藻の密度を評価するため、共生藻ペレットを氷上で静かに解凍し、激しくボルテックスして再懸濁し、10 μlのテクニカルアリクートを4つ、CellDrop™自動セルカウンター（DeNovix, USA）を用いて分析した。自動細胞数測定は、細胞サイズと赤色チャネルのクロロフィル自家蛍光に基づいて行われた。最後に、宿主バイオマスの代用として、各メデューサの平均シンビオジナ科細胞数を宿主タンパク質で標準化した。
クロロフィルa含量は、シンビオジナ科画分の700μlのアリコート（シンビオジナ科細胞をカウントしたのと同じアリコート）から定量した。シンビオジナ科細胞は、まず2回の遠心分離（3000×g、4℃で3分と5分）により洗浄し、その間にペレットを1mLの2×PBSに再懸濁した。その後、ペレットを500μlの氷冷エタノール（95%）に懸濁し、暗所、4℃で一晩（14時間）絶え間なく回転させながらクロロフィル抽出を行った。最後に、各試料200μlを平底96ウェルプレートに移し、ブランク標準化用の溶媒も同様に移した。BioTek Synergy H1 高感度プレートリーダー（BioTek Instruments, USA）を用いて各試料の吸光度を630, 664, 750 nmで測定し、クロロフィルa含量を以下のように算出した（濁度補正あり、Jeffrey and Humphrey,1975）：
Chlorophyll�(�g �L−1)=11.43∗(OD(664)−OD(750))−0.64∗(OD(630)−OD(750))
クロロフィルa含量は、個々のメデューサの宿主タンパク質含量で標準化した。
元素組成
メデューサの全有機炭素と窒素含有量に対する温度の影響を測定するため、各処理とサンプリング地点につき3個体をサンプリングした。海水を注意深く除去した後、メドゥーサをあらかじめ秤量しておいた5 mLの丸底培養チューブに入れ、2×PBSを加えて最終容量を3 mLとした。その後、組織をホモジナイズし、分注し、宿主と渦鞭毛藻のフラクションを分離し、液体窒素でスナップ凍結する前に、シンビオジナ科のためにさらにすすぎのステップを加えてスナップ凍結した（3000×g、4℃で3分間、ペレットを1mLの2×PBSに再懸濁）。凍結した宿主およびシンバイオジニア科植物画分を2日間凍結乾燥した。その後、それぞれの乾燥試料画分約2.5±0.4mgおよび10.5±1.5mgを各試料について二重に秤量し、炭素および窒素分析用にそれぞれアルミニウムに封入した。元素分析/同位体比質量分析（EA/IRMS）は，Carlo Erba 1108（Fisons Instruments，イタリア）元素分析装置を用い，ConFlo IIIスプリットインターフェースを介してDelta V Plus同位体比質量分析装置（Thermo Fisher Scientific，ドイツ）に接続し，連続ヘリウムフロー下で行った[54]。EA/IRMSのピーク面積から炭素と窒素の含有量（wt%）を求め、原子存在量に変換して各試料の原子C:N比を算出した。
栄養追跡と組織学的分析のための安定同位体標識実験
メデュサエとシンビオジナ科植物間の栄養分の取り込みと交換に及ぼす温度の影響を調べるため、各条件とサンプリング地点について、3個のメデュサエを同位体標識したASW中でインキュベートした。
このASWに13C-炭酸水素塩（Sigma 372382）を最終濃度3mMまで添加し、1M NaOH溶液でpHを8.1まで上昇させた。最後に、15N-塩化アンモニウム（Sigma 299251）を最終濃度3μMになるように加えた。十分に混合した後、標識ASWを2つのアリコートに分け、それぞれコントロールと熱ストレス処理の温度で一晩熱平衡化した。
同位体標識した重炭酸塩とアンモニウムを用いたインキュベーションは、明期の初めに、熱平衡化し同位体標識したASW培地40 mLを満たしたガラスビーカーに3個のメデュサを入れ、6時間かけて開始した。培養終了後、メデュサエを採取し、清潔なカミソリの刃で4分の1に切断した。これらの4分の1のうち2つは、SEMとNanoSIMSの相関イメージング用に直ちに固定し（4%パラホルムアルデヒド、2.5%グルタルアルデヒド、0.1M Sorensen緩衝液、9%スクロース）、1つはパラフィン包埋と光学顕微鏡観察用に固定した（4%パラホルムアルデヒド、0.1M Sorensenリン酸緩衝液、9%スクロース）。固定したサンプルは、さらに処理するまで4℃で保存した。非標識の対照試料を得るため、同じサイズのメドゥーサを培養槽から直接採取し、解剖、保存し、同じように処理した。
SEMとNanoSIMSの相関イメージングによる栄養同化と細胞超微細構造
樹脂包埋用に固定したベル組織サンプル（相関SEMおよびNanoSIMSイメージング用）は、4℃で少なくとも一晩固定した後に処理した。まず、ソレンセン緩衝液（0.1 M）でリンスして固定液を除去し、ベルの中心から小さな組織片（約4 mm3）を採取した。サンプルの脂質画分を保存するため、小組織片を四酸化オスミウム（OsO4 1％、0.1M Sorensenリン酸緩衝液中1.5％ヘキサシアノ鉄Ⅱカリウム）で1時間絶え間なく撹拌しながら後固定し、Milli-Q水で20分間2回すすいだ。ティッシュプロセッサーを用いて、サンプルをエタノールで連続脱水し（30、70、100%エタノール、Milli-Q水）、Spurr樹脂の浸透を促進した（30、70、100%Spurr樹脂、絶対エタノール）。浸透後、サンプルを100％スパー樹脂で満たした型に入れ、60℃で48時間硬化させた。Ultracut Sミクロトーム（Leica Microsystems）とダイヤモンドナイフ（Diatome）を用いて樹脂ブロックから薄切片（200 nm）を切り出し、清浄なシリコンウェハー上に採取した。
コントラストをつけ、組織内に存在する細胞内構造を可視化するため、サンプル切片を、エネルギー選択後方散乱検出器（EsB、グリッド130V、Zeiss社製）を用いた走査型電子顕微鏡（SEM、GeminiSEM 500、Zeiss社製；3kV、アパーチャサイズ30μm、作動距離2.9～2.3mm）で撮像する前に、1％酢酸ウラニルおよびクエン酸レイノルズ鉛で後染色した。
SEM像で可視化された細胞内構造内の同位体濃縮分布を画像化するために、同じ切片を12nmの金層でスパッタコーティングし（Leica EM SCD050金コーターを使用）、分析のためにNano Secondary Ion Mass Spectrometry (NanoSIMS) 50 Lに移した[55]。NanoSIMSでは、プレスパッタリングされた試料にCs+一次イオンビームを16keV、約2pAの電流で照射し、約150nmのスポットサイズに集束させた。このビームは、1ピクセルあたり5000μsの滞留時間で、45×45μmの領域にわたってラスターされた。二次イオン12C2-,13C12C-,14N12C-,15N12C-は、電子増倍管検出器で、質量スペクトルにおける潜在的な干渉を解消する約9000の質量分解能（Cameca定義）で個別に計数された。得られた同位体マップ（45×45μm、256×256ピクセル、6枚のドリフト補正画像の重ね合わせ）から、異なる組織区画、すなわちシンビオジナ科、アメーバ細胞（シンビオジナ科を除く）、表皮の周囲に関心領域（ROI）を描いた。各ROIについて、13C12C-/12C2-と15N12C-/14N12C-の比によって確立された同位体比濃縮度を、NanoSIMSソフトウェアL'Image（v.10-15-2021、Larry Nittler博士によって開発された）を用いて、同じ方法で調製・分析された天然の同位体組成を持つ対照試料に対して定量した。同位体濃縮度は以下のようにデルタ（�）表記で報告されている：
そして
rC(sample)とrC(unlabeled)は、それぞれ試料と非標識対照の13C12C-/12C2-の計数比である。rN(sample)とrN(unlabeled)は、それぞれ試料と非標識対照の15N12C-/14N12C-の計数比である。
測定されたROIのデルタ値の平均が、非標識サンプルの同様のコンパートメントで測定されたデルタ値の平均より2標準偏差以上大きい場合のみ、コンパートメントは有意に濃縮されているとみなされた。コンパートメントとサンプルごとの画像とROIの数は、補足情報（表S1）に報告されている。
宿主の代謝に対する共生細菌の寄与を推定するために、宿主アメーバ細胞とその藻類共生細菌の13C濃縮度の比の平均を計算した：アメーバ細胞の各13C濃縮度の値を、このアメーバ細胞内にホストされている共生細菌の13C濃縮度の平均で割った。有意に濃縮された生存アメーバ細胞と共生細胞のみがこの計算に含まれた。
光学顕微鏡によるベル組織中の組織構造と細胞密度の組織学的特徴づけ
パラフィン包埋用に固定したベル組織は、エタノールで連続的に脱水した後、キシレンで浸潤し、パラフィンに包埋した。パラフィン包埋したサンプルの厚さ4μmの切片を切り出し、スライドグラスに載せ、脱脂し、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）で染色した。各サンプルについて、口腔表皮、胃腔、および周囲の中漿膜を含む3枚の画像を同一の倍率と設定で撮影した。口腔表皮と胃表皮の間に位置し、渦鞭毛藻の大部分を宿す口腔中漿膜と、胃表皮組織層の下に位置し、渦鞭毛藻の宿す数が少ない内漿膜である。各画像に存在する口腔内および内側中漿膜全体の面積は、ImageJ（ImageJ2、バージョ ン：2.920/1.53t）を用いて手動で評価した。各領域の藻類共生細胞および宿主核の数を手作業で数え、各画像の対応するメソグレア面積で正規化して共生細胞または宿主核密度を求めた。
統計解析
すべての分析はR（バージョン4.2.0、[56]）で行った。すべての反応パラメータは処理群間で毎日測定し、ANOVA（正規分布データの場合、Shapiro-Wilk検定でp＜0.05のとき真とみなす）またはKruskal-Wallis（データの正規分布の仮定に違反した場合）を用いて実験日ごとに分析し、その後、偽発見率（FDR）に基づくp値の多重比較補正を行った。
生理学的測定と宿主アメーバ細胞とその藻類共生体間の13C濃縮比については、2要因分散分析（Shapiro-Wilk検定によりデータの正規分布が確認され、p > 0.05）を用い、Tukeyの正直有意差（HSD）事後ホック比較により、データに対する処理とサンプリング地点の影響を分析した。ANOVAの結果が処理とサンプリング・ポイント間の有意な交互作用を示したが、Tukey's HSDでは個々のサンプリング・ポイントについて処理効果を解決できなかった場合には、個々のサンプリング・ポイントについて1要因ANOVAを用いた（図では括弧内にアスタリスクを付した）。ANOVAに必要な分散の均質性を保証するために、分析前に負の値を避けるために定数を追加し、アンモニウム取り込みデータを平方根変換した。3つの生物学的複製を確率変数として導入した線形混合モデル（LMM）を用いて、処理とサンプリングポイント間の同位体濃縮を分析した。続いてTukey's HSDポストホック比較を行った。LMMの結果が処理とサンプリング・ポイント間の有意な交互作用を示したが、個々のサンプリング・ポイントについてTukey's HSDで処理効果が解決されなかった場合には、個々のサンプリング・ポイントについて一要因分散分析（one-factorial ANOVA）またはクラスカル・ウォリス（Kruskal-Wallis）を用いた（図中、括弧内にアスタリスクで示す）。
最後に、サンプリングポイント2の中漿膜の細胞密度または核密度の処理間差は、3つの生物学的複製を確率変数としてLMMで解析した。本文中のデータはすべて、特に断りのない限り、平均値±SDで示した。
結果
海水温上昇に対するCassiopea andromedaの反応
実験の傾斜期間中（図1A）、海水温の上昇はメダイの生理機能に検出可能な影響を与えなかった（図1B-D）。しかし、5日目に最高温度（34℃）に達すると、カシオペアホロビオントは対照試料と比較して、熱ストレスに対する最初の反応を示し始めた。藻類共生体の最大量子収量（Fv/Fm）は、対照条件下では経時的に安定したままであったが、熱ストレスを受けたものは実験5日目から有意な減少を示した（ANOVA、F = 14.61、FDR調整p < 0.001；図1B）。この減少は時間の経過とともにますます顕著になり、実験最終日には、対照条件（Fv/Fm = 0.73±0.06）と比較して、熱ストレス条件下（Fv/Fm = 0.42±0.10）では43%の減少に至った（ANOVA, F = 77.19, FDR調整 p < 0.001）。
藻類共生体の光生理学的反応に加えて、宿主の指標も熱ストレス処理によって目に見える影響を受けた。メデュサエのベル径は、ランピング期間中はどちらの処理でも同様に増加する傾向があったが、熱ストレスを受けたメデュサエのベル径は6日目から有意な減少を示し（ANOVA、F = 5.98、FDR調整p = 0.046；図1C）、その結果、実験終了時には対照メデュサエと比較して平均33%減少した。同様に、熱ストレスを受けたメデュサエの脈動率は9日目以降有意に減少し（ANOVA、F = 10.28、FDR調整p = 0.016）、実験終了時には75％減少した（図1D）。熱ストレスを受けたメダイのこの脈動速度の低下は、個体によっては痙攣や完全な無動も伴っていた。
最終的に、実験終盤の10日目から、熱ストレスを受けたメデュサエで最初の死亡例が観察された（図1A）。
熱ストレスはカシオペア・アンドロメダの生理と栄養状態を変化させる。
カシオペアの宿主は、34℃に達した数日後（すなわち、実験6日目と7日目あたり；図1）からすでに熱ストレスに対する明らかな生理的反応を示し、この傾向は実験終了まで続き、その結果、2つのサンプリングポイントSP1（5日目）とSP2（11日目）の間でいくつかの顕著な違いが見られた（図2）。
図2
熱ストレスに曝されたカシオペアホロビオントの生理と栄養状態。A 体重。B 宿主タンパク質含量。C ホロビオントの正味アンモニウム摂取率。D 宿主原子のC：N比。E 宿主タンパク質あたりの共生体密度, F 宿主タンパク質あたりのクロロフィルa含量. G 共生体原子C:N比。サンプリングポイントは実験5日目（SP1）と11日目（SP2）に対応する。個々のグループはTukey's HSDを用いて比較した（箱ひげ図の上に表示）。アスタリスクは処理間の有意差を示す（*p < 0.050, **p < 0.010, ***p < 0.001）。括弧内のアスタリスクは、SP2のみを考慮した場合の有意差を示す。条件ごとの生物学的複製数： A、B、C、E、F n = 6 ただし、熱ストレス下のSP2はn = 4; D、G n = 3
フルサイズ画像
メデューサの湿重量は、SP1では変化しなかったが（Tukey's HSD, p = 0.891）、熱ストレス下のSP2では61%の有意な減少を示した（Tukey's HSD, p < 0.001;図2A）。メデューサあたりの宿主タンパク質含量は、SP1では熱ストレスによる有意な影響は見られなかったが、SP2では（有意ではないものの）25%減少した（ANOVA, F = 2.87, p = 0.107；図2B）。正味アンモニウム摂取率は、SP1ではすでに熱ストレス下で51%有意に減少していた（Tukey's HSD, p = 0.009）。また、実験終了時には、負の速度（すなわち、アンモニウムの周辺海水への正味放出）さえ示した（Tukey's HSD、p < 0.001、図2C）。熱ストレスを受けた宿主メデュサーのC:N比は、SP1では安定したままであったが（Tukey's HSD, p = 0.828）、SP2では同じ時点の対照個体と比べて16%の有意な減少を示した（Tukey's HSD, p = 0.059）。対照動物の平均宿主C:N比は、実験期間中に有意ではない14%の増加を示した（Tukey's HSD, p = 0.154、図2D）。
このような宿主の生理的変化にもかかわらず、熱ストレスを受けたメデュサエは視覚的な白化の兆候を示さず、実験中も色素の喪失は観察されなかった（図S2）。それにもかかわらず、共生体の生理と元素組成は、いずれのサンプリング時点でも熱ストレスによって明らかに影響を受けた（図2E-G）。熱ストレスを受けた動物の宿主タンパク質量に対する共生細胞密度は、SP2で46％有意に減少した（SP2のみを考慮したANOVA、F = 9.54 p = 0.015；図2E）。共生細菌のクロロフィルa含量（宿主タンパク質1mgあたり）は、熱ストレス中に有意に減少し（ANOVA, F = 7.29, p = 0.015）、SP2では対照条件と比較して55％減少した（Tukey's HSD, p = 0. 011, 図2F)、共生細菌のC:N比は熱ストレス中に有意に減少し、SP2では対照条件と比較して16%減少した(ANOVA, F = 5.55, p = 0.046) (SP2のみを考慮したANOVA, F = 20.66, p = 0.011, 図2G)。しかし、メデューサの湿重量で正規化すると、共生細菌の密度もクロロフィルa含量も、熱ストレスに有意な影響を受けなかった（湿重量あたりの共生細菌の密度： 湿重量あたりの共生細菌密度：LMM, F = 0.02; p = 0.894；湿重量あたりのクロロフィルa： LMM, F = 0.45, p = 0.513; Figure S3）。
熱ストレスは共生における栄養同化を減少させる
全体として、NanoSIMS 分析から、熱ストレスは共生パートナーによる 13C-炭酸水素同化と 15N-アンモニウム同化に顕著な影響を及ぼすことが明らかになった（図 3）。
図3
熱ストレスを受けたメデュサエにおける同位体標識された炭素と窒素の濃縮と（細胞内）局在に対する温度効果。A藻類共生細胞に同化した13C-重炭酸塩（H13CO3-）からの13C濃縮と、B宿主アメーバ細胞への移行。C 宿主アメーバ細胞と藻類共生細胞間の13C濃縮の比率。D 15N-アンモニウム（NH4+）の藻類共生細胞への同化によって誘導された15N濃縮と宿主アメーバ細胞への同化によって誘導された15N濃縮。サンプリングポイントは実験の5日目（SP1）と11日目（SP2）に対応する。個々のグループはTukeyのHSDを用いて比較した（箱ひげ図の上に表示）。アスタリスクは処理間の有意差を示す（*p < 0.050, **p < 0.010, ***p < 0.001）。括弧内のアスタリスクは、SP2のみを考慮した場合の有意差を示す。F-K SP2における対照条件下（F-H）と熱ストレス下（I-K）のメデューサ切片の相関SEM（F, I）とNanoSIMS（G, H, J, K）同位体比画像。対応する12C2-および14N12C-画像は図S5にある。SEM画像は人工的に着色されており、口腔表皮(oral epi)はベージュ色、中層(m)は青色、アメーバ細胞(am)は黄色、アメーバ細胞核は紫色、共生細胞(s)は緑色、脂質滴(ld)は緑色である。NanoSIMS画像のカラースケールは対数である。
フルサイズ画像
対照条件と比較して、熱ストレスは、藻類共生体（LMM, X2 = 64.54, p < 0.001, 図3A）、共生体を含む宿主アメーバ細胞（LMM, X2 = 24.86, p < 0.001, 図3B）、および宿主表皮（LMM, X2 = 7.30, p = 0.006, 図S4A）の13C濃縮を有意に減少させた。より詳細には、SP1では、アメーバ細胞の13C濃縮度は熱ストレス動物で有意に低かったが（Tukey's HSD, p = 0.189）、藻類共生体の13C濃縮度は比較的安定していた（Tukey's HSD, p = 0.115）。SP2において、熱ストレス下のアメーバ細胞と共生細菌の13C濃縮度は、それぞれ94%と82%減少した（宿主：Tukey's HSD, p = 0.006; 共生細菌：Tukey's HSD, p < 0.001; Fig.） さらに、アメーバ細胞とその藻類共生体（有意な濃縮のない藻類-アメーバ細胞ペアを除く）における13C濃縮の比率の平均は、対照条件（Tukey's HSD, p = 0.012、図3C）と比べて60％減少した（ANOVA, F = 6.57, p = 0.013）。
13C濃縮におけるこのような量的変化は、SP2で熱ストレスを受けたメデュサーの組織内における細胞内空間分布の顕著な違いを伴っていた（図3F,G,I,J）。対照動物の宿主組織では、強い13C濃縮は脂質滴に対応するホットスポットに集中していた（SEM画像ではオスミウムで染色された暗色構造、図3F,G）。しかし、熱ストレス下では、これらの脂質滴は表皮ではあまり見られず、アメーバ細胞ではほとんど見られなかったことから、宿主での13C濃縮が低くなったものと考えられる（図3I,J）。
共生体では、対照条件下では13C濃縮は主にピレノイドと脂質滴の周辺に位置していた（図3G）。しかし、熱ストレス下では、共生細胞では13C濃縮のホットスポットは全体的に目立たなくなり（図3J）、13C濃縮がほとんど検出されない細胞もあった。
熱ストレスは共生パートナーによる15N-アンモニウム同化にも影響を与えたが、その程度はそれほど顕著ではなかった。熱ストレスは、宿主表皮（LMM, X2 = 0.37, p = 0.541、図S4B）、アメーバ細胞（LMM, X2 = 2.07, p = 0.150、図3E）、およびそれらが含む藻類共生体（LMM, X2 = 2.57, p = 0.109、図3D）において、サンプリングポイント間で15N-アンモニウム同化に全体的に有意な影響を与えなかった。さらに、サンプリング時間と熱ストレス因子の交互作用は、宿主表皮の15N濃縮度の減少には有意な影響を与えなかったが（LMM, X2 = 0.41, p = 0.521）、アメーバ細胞（LMM, X2 = 5.77, p = 0.016）と藻類共生体（LMM, X2 = 5.12, p = 0.024）には影響を与えた。時点ごとに分析すると、熱ストレスを受けたメデュサーのアメーバ細胞と共生生物における15N濃縮度は、SP1では対照処理と比較して安定したままであった（アメーバ細胞： アメーバ細胞：SP1でのクラスカル・ワリス、X2 = 1.85, p = 0.172；共生生物：SP1でのクラスカル・ワリス、X2 = 1.85, p = 0.172： アメーバ細胞：SP1でのKruskal-Wallis, X2 = 2.43, p = 0.119）。しかしSP2では、アメーバ細胞（-60％、SP2でのクラスカル・ワリス、X2 = 23.86, p < 0.001）と藻類共生体（-84％、SP2でのクラスカル・ワリス、X2 = 87.09, p < 0.001）で有意な減少（それぞれ60％と84％）が観察された。これは、SP2における温度処理間の15N-アンモニウム濃縮の細胞内空間分布の違いを伴っていた（図3F,H,I,K）。具体的には、15N-アンモニウムの濃縮は宿主組織においてほぼ均一であり、対照条件下では共生体において強く濃縮された（図3F,H）。しかし、熱ストレス下では、15Nの濃縮は宿主組織ではあまり顕著ではなく、共生体では大幅に減少し、一部の細胞では識別可能な濃縮が見られなかった（図3I,K）。
組織と細胞の超微細構造に対する温度の影響
ベル組織の光学・電子顕微鏡観察から、SP2で熱ストレスを受けたメダイでは、中足部における宿主細胞の密度が増加していることが明らかになった。これは口腔の中漿膜で最も顕著で、藻類細胞のホスファイト分解がかなり進んでいた（Fig. 4, S6）。
図4
Cassiopea andromeda medusaeのベル組織の超微細構造と細胞密度に対する温度効果。A-D対照状態（A, C, E、すなわち左列）と熱ストレス状態（B, D, F, H、すなわち右列）におけるメデュサエの光学顕微鏡像とE, F, HのSEM像。EとFは、口腔表皮と胃表皮をベージュ色、中層を青色、アメーバ細胞（複数可）を黄色、アメーバ細胞核を紫色、共生体を緑色で、より見やすくするために人工的に着色した。G CとDに示した口腔内（緑色の点線で区切られた部分）および中層内（赤色の破線で区切られた部分）における共生細胞および宿主核の密度に対する熱ストレスの影響。H 熱ストレスを受けた共生細菌の細胞内分解（白矢印）とチラコイドの乱れ（黒矢印）を示すSEM画像。SW:海水、oral epi:口腔表皮、m:中漿膜、am:アメーバ細胞、n:アメーバ細胞核、s:共生生物、gast:胃表皮、gc:胃腔)
フルサイズ画像
光学顕微鏡で観察したところ、熱ストレスの間、中層における宿主核の密度が顕著に増加した（LMM, X2 = 13.63, p < 0.001、図4A-D）。興味深いことに、この増加は内側中漿膜に比べて口腔中漿膜で顕著であった（それぞれ6倍と3倍の増加；LMM, X2 = 37.09, p < 0.001、図4G）。口腔内の共生藻類密度は加熱処理によって変化しなかった（LMM, X2 = 1.04, p = 0.308）。内中球の共生体密度はわずかに増加したが、これは共生アメーバ細胞が共生体を排出するために胃腔へ移動したためと考えられる（LMM, X2 = 3.88, p = 0.049）。
SEM画像は、光学顕微鏡による観察を裏付けた。対照動物の口腔中膜の宿主核は均一に分布していたが、熱ストレスを受けた動物の宿主核はアメーバ細胞の凝集を示すクラスター状に現れた（図4E,F）。重要なことは、これらのアメーバ細胞クラスター中の共生藻類が、熱ストレス中に異なる程度の劣化を伴う明確なストレスの兆候を示したことである。具体的には、細胞内容物やチラコイドの乱れ、細胞内容物の顕著な内部分解などの症状が見られた（図4H）。
考察
気候変動により、熱帯サンゴ礁の生態系は、その主要な生態系エンジニアである造礁サンゴの死滅に より、地球規模でかつてない規模で衰退している。サンゴでは、この減少の一因として、共生栄養循環の破綻が挙げられ、宿主の飢餓が最終的 にサンゴの白化や死滅につながる[8, 26, 57]。対照的に、逆さクラゲのカシオペアは、同様の光合成共生生物を宿主としているにもかかわらず、現在と将来の条件下で繁栄すると予測されている[53]。ここでは、厳しい熱ストレスが宿主の異化を促進し、カシオペアの代謝に対する藻類共生体の寄与を減少させ、宿主の飢餓状態を作り出すことを示すことができた。このストレス応答はサンゴで観察されるものと似ているが、我々のデータは、共生崩壊のメカニズム的側面がカシオペアホロビオント特有の性質を反映していることを示唆している。具体的には、アメーバ細胞内の藻類共生体のホスファイト内での分解が多く、動物の収縮（すなわち、体長と湿重量が減少）と相まって、遅延した「見えない」白化反応を引き起こした。
熱による宿主の異化と炭素飢餓
この研究では、厳しい熱ストレスが宿主のエネルギー制限を引き起こし、代謝が異化へと切り替わった。
熱ストレスを受けたカシオペアでは、アメーバ細胞内の脂質滴の減少（図3G,J,4E,FおよびS6）と相まって、C:N比の顕著な減少が観察され（図2D）、タンパク質含量の減少はそれほど顕著ではなかった（図2B）。これらの反応を総合すると、宿主の代謝における炭素消費量の増加と備蓄炭素の枯渇が示唆される。外温性動物の代謝活動は温度とともに増加する傾向がある [58]。したがって、急性熱ストレスは、刺胞動物メデューサを含む刺胞動物の呼吸エネルギー需要を刺激する[52, 59, 60]。我々の結果は、カシオペアがこのような暑さによるエネルギー需要の増加に対応して、蓄えたエネルギーを消費したことを示唆している。このことは、熱ストレス時に炭素備蓄、より具体的にはグルコースとグリコーゲンの備蓄が消費されたことを報告した棘皮動物メデューサStomolophus meleagrisの先行研究と一致する[59]。
糖と脂質の消費量の増加に加え、熱ストレス下での同化から異化への漸進的な代謝転換は、ホロビオントの窒素代謝にも直接反映された。SP1におけるアンモニウム同化の減少とSP2におけるアンモニウムの放出（図2C）は、宿主のタンパク質含量（図2B）の減少（有意ではない）と相まって、宿主が熱ストレス下で徐々にタンパク質の異化分解に移行したことを示している。同化状態では、刺胞動物宿主はアンモニウムを同化してアミノ酸合成に炭素骨格を利用する。異化状態では、タンパク質とアミノ酸がエネルギー代謝のための炭素源として利用され、その結果、宿主によって過剰なアンモニウムが生産される [26, 61]。今回の結果から、熱ストレス時のエネルギー要求量の増加により、グリコーゲンと脂質の貯蔵量が徐々に消費され、最終的には宿主のタンパク質が分解された可能性が示唆された。
重要なことは、このような宿主バイオマスの異化消費は、熱ストレス中の動物の表現型と行動に直接反映されたことである。特に、観察されたベルの直径（図1C）と湿重量（図2A）の減少は、熱ストレスに反応してメデュサーのサイズと重量が減少することを記録した過去の報告と一致している[46,47,48,59]。熱ストレス中の宿主の炭素飢餓を考慮すると、この縮小は主に中層部のムコ多糖類とコラーゲンマトリックスの異化分解によって引き起こされると考えられる。これらの構造的な糖やタンパク質が失われ、水分を保持する能力も失われることで、熱ストレスを受けたメジナでは水分が失われ、その結果、体が縮んだと考えられる [62,63,64]。この仮説は、熱ストレスに曝されたカシオペアの水分含量が同様に急激に変化したという報告 [52]や、熱ストレスを与えない飢餓状態におけるカシオペアとオーレリア・アウリタ・エフィラエの同様の収縮 [65, 66]によって裏付けられる。さらに、脈動が減少し（図1D）、宿主の死亡が始まった（図1A）ことから、餌を与えていないカシオペアの個体は、7日間という長期間にわたって、厳しい熱ストレスによる代謝の制約を補うことができなかったと考えられる。
熱ストレス中の共生代謝交換の乱れ
暑熱ストレスを受けたカシオペアとは対照的に、対照条件（すなわち27℃）の動物は炭素制限の兆候を示さなかった。実験中に観察された共生体密度の低下とC:N比の増加は、ホロビオントにおける窒素利用可能量の減少を示唆しているが、これらの動物は実験期間中成長を続け、安定したタンパク質含量を維持した（図1C、2A、S2）。C:N比の増加（図2D）とアンモニウムの継続的な正味取り込み（図2C）は、藻類による光合成物の放出が、対照条件下でエネルギー的炭素要求量を満たし、宿主の同化を支えるのに十分であったことを示している。しかし、熱ストレス下では、宿主の炭素飢餓と体の収縮が見られ、NanoSIMSで観察された同化作用の13C同化作用の低下とともに、藻類由来の有機炭素がメデュサーのエネルギー要求を満たすには不十分であったという考えが裏付けられた（図3A,B）。このように13C濃縮が減少したのは、熱ストレス時に代謝産物の同化と移動が減少し、異化消費が促進されたためと考えられる。共生パートナーの両方がこの傾向（すなわち、SP1とSP2の13C濃縮度の減少）を示したことから、熱ストレスはカシオペアホロビオント全体の代謝に対する光合成産物の相対的寄与を減少させたと考えられる。さらに、熱ストレス下では、アメーバ細胞の13C濃縮の比率が共生細胞のそれよりも低下することが観察された（図3C）。このシフトは、熱ストレス中、共生体よりも宿主の方が炭素同化作用の低下が顕著であったことを示している。具体的には、共生藻は光合成物プールの大部分を代謝に利用し、その分、宿主への輸送が犠牲になった可能性がある。藻類共生体における光合成物の生産と利用可能性の低下によって促進される同様の炭素保持は、他の共生刺胞動物でも報告されている [23, 67]。
全体として、熱ストレス時に共生生物における炭素利用可能性が低下するというこの考え方は、観察された15N同化のパターンによって支持される（図3D,E）。暑熱ストレス中の共生パートナーによる15N同化の減少は、宿主代謝における「非標識」アンモニウムの異化生産の増加と、アンモニウム同化のための炭素骨格の利用可能性の減少の複合的な結果を反映していると考えられる[68]。
これらを総合すると、熱ストレスによってカシオペアホロビオントは窒素制限状態から炭素制限状態に移行したことが示唆される。光合成炭素の固定が減少したこと、および／または宿主の炭素含有物（糖、脂質、アミノ酸）の異化消費が促進されたことは、藻類による光合成物の保持が促進されたことと一致した。さらに、熱ストレスは宿主から藻類共生体の栄養的利益を奪うだけでなく、ストレスを受けた藻類を宿主に与える有害な影響（活性酸素種の放出など）を緩和するために、宿主にさらなるエネルギー要求を課す可能性もある。
このように、熱ストレスは刺胞動物の宿主にとって藻類を共生させるという生態学的利益を効果的に損ない、共生がかえってエネルギー的な負担になる可能性がある。
共生藻の分解による "見えない白化"
サンゴの白化現象がよく知られているのとは対照的に、本研究では、熱ストレスを受けたカシオペアでは色素の明らかな消失は見られなかった（図S2）。それにもかかわらず、熱ストレス下では、藻類共生体の最大量子収量の顕著な低下（図1B）、共生体細胞の密度と宿主タンパク質で規格化したクロロフィルa含量の低下（図2E,F）、宿主の死亡が観察された（図1A）。したがって、目に見える白化がなかったからといって、カシオペアのホロビオントで共生体の分解が起こらなかったということにはならない。むしろ、藻類共生体の損失は、宿主の飢餓と水分損失による熱ストレスを受けたメデュサーの縮小によって隠蔽された可能性が高く、湿重量で規格化した場合の安定した藻類共生体密度とクロロフィルa濃度によって示された（図S3）。しかし、カシオペアの色素が目に見えて減少することを特徴とする白化現象は、同様の最終温度と培養時間での実験的熱ストレスの間に、以前に報告されている [47, 48]。したがって、本研究で目に見える白化が見られなかったことから、カシオペアの熱ストレス反応は、種だけでなく、環境や飼育条件、ライフステージ、特にメデュサーの栄養状態にも依存する可能性があることが明らかになった。本研究ではメダカに餌を与えなかったため、宿主の飢餓とそれに伴う体の収縮が促進され、それに伴う共生体の損失が他の研究よりも隠されていた可能性がある。in situ条件下でのさらなる実験が必要であるが、今回観察された「目に見えない」白化現象は、カシオペアで記録された白化現象の数が少ないことを部分的に説明できるかもしれない[47, 50]。
サンゴや他のほとんどの共生刺胞動物では、白化には共生生物の排出、ホスファイトの分解、宿主細胞の剥離など、多くのメカニズムが関与している [69]。これらのメカニズムの中で、これまでの研究では、共生体の排出が白化時の共生体喪失の最も重要な経路であることが示唆された [70]。胃表皮における共生体の存在は、藻類の排出が起こったことを示唆しているが、今回の実験では、熱ストレスを受けたカシオペアにおけるこのメカニズムの重要性を評価することはできなかった。しかしながら、我々の超微細構造観察から、カシオペアでは他のメカニズムが共生体の消失に強く寄与していることが示唆された。具体的には、アメーバ細胞内に損傷が激しい藻類共生細胞が多く存在すること（図4F,H, S6）と、藻類の栄養同化が低下していること（図3A,D）から、共生細胞のホスファイト内分解が多く起こっていることが示唆された[71]。サンゴやイソギンチャクとは対照的に、棘皮動物の共生藻類は、動物の胃脈管腔と直接接触することなく、中層内のアメーバ細胞宿主細胞内に存在する [33, 34, 50]。したがって、このユニークな細胞組織が共生体の排出を制限し、これらのメデュサエで観察されるホスファイト内共生体分解の高い発生率を説明するというのはもっともらしい。ホスファイト内での分解は排出よりも比較的遅く、動物の体の縮小と相まって、カシオペアにおける目に見える白化の遅れに寄与している可能性がある。
熱ストレスに対するカシオペアのオートファジー免疫反応？
藻類共生体のホスファイト内での分解は、中層における宿主核の密度の全体的な増加を伴っていた。この増加は、藻類共生体の密度も最も高い口腔中漿膜で顕著であった（図4G）。この中脳における宿主核密度の増加は、部分的には宿主体の収縮によるものかもしれないが、光学顕微鏡とSEM画像から、口腔中脳におけるこれらの核の多くは、損傷した共生細胞を取り囲むアメーバ細胞クラスターの一部であることが示された（図4D, FおよびS6）。Anthozoaでは、アメーバ細胞は免疫反応におけるエフェクター細胞として以前に報告されている。アメーバ細胞は傷害や感染部位に移動し、外来細胞、機能不全細胞、損傷細胞を貪食する [72,73,74]。したがって、熱ストレスを受けたカシオペアの中漿膜で観察されるアメーバ細胞のクラスターは、損傷を受けた細胞の存在に対する自食作用による宿主免疫反応の一部と考えることができる [79]。私たちは、損傷した共生細胞（そして潜在的にはそれを宿主とする損傷アメーバ細胞）が中層に存在することで、共生細胞から解放されたアメーバ細胞が、損傷した細胞を貪食するために引き寄せられるのではないかと考えている。
現時点では、藻類共生体のホスファイト内分解の基礎となるメカニズムについては、さらなる研究が必要であることは明らかである。一方では、免疫反応は、熱ストレス（壊死）によって損傷を受けた藻類共生体の直接的な結果である可能性もある。一方では、活性酸素種の産生亢進 [13, 21]、栄養伝達の低下 [26]、共生体の寄生行動 [23] などが、アメーバ細胞にとって共生体細胞を分解したり、宿主細胞のアポトーシスを開始したりする手がかりになるかもしれない。
イソギンチャクAiptasiaや共生八胞体では、熱ストレス応答において壊死とアポトーシスが共存しているようである [80,81,82,83,84,85]。アメーバ細胞の可動性と貪食活性を評価するための組織学的・免疫学的研究をさらに進めるとともに、共生制御におけるアポトーシスまたはネクローシス経路の重要性を評価することは、熱ストレス時のカシオペア共生崩壊の根底にあるメカニズムを解明するために不可欠であろう。
生態学的関連性
宿主の収縮と共生体の分解は、目に見える白化反応を補い、遅らせたと考えられるが、34℃という厳しい熱ストレスに長時間さらされたことは、本研究におけるカシオペアホロビオントの耐熱性を明らかに超えた。温度閾値は種や状況に依存するが、本研究で測定された温度上限は過去の報告 [46,47,48]と一致している。したがって、カシオペアは急性の熱ストレスに弱い 兆候を示したが、その耐熱性はほとんどの強殖サンゴの耐熱性を超えている可能性が高い [47, 86]。
今回の結果から、カシオペアの耐熱性は、宿主の栄養状態に依存する部分があることが示唆された。私たちの研究では、熱ストレスの際に動物が収縮することが観察されたことから示唆されるように、中足部は重要なエネルギー備蓄として機能し、徐々に枯渇していったと考えられる。カイメンクラゲの中殻は、ほとんどの強胞子性サンゴの中殻よりもかなり大きいので、この追加的なエネルギー備蓄が、熱ストレス時のカシオペアの代謝要件を支え、その高い耐暑性に寄与していると考えられる。加えて、効率的な従属栄養摂食によって、カシオペアは熱ストレス時の光合成物の移動の減少を緩和できる可能性がある。われわれの研究では、従属栄養摂食がないため、カシオペアの耐熱性はin situ条件と比較して低下したと考えられる。耐熱性には種による違いが存在すると考えられるが [87]、したがって、大きなエネルギー備蓄と高い従属栄養能力によって、カシオペアは変化し、温暖化し、人為的な影響を受けた環境でも繁栄することができると考えられる。
従って、カシオペアの熱ストレス応答における従属栄養摂食の役割を解明し、in situ条件下で観察された応答を検証するためには、今後の研究が必要である。さらに、カシオペアホロビオントに含まれる原核生物の機能的重要性については、今のところよくわかっていない。カシオペアにおける窒素循環、抗酸化物質生産、あるいは免疫反応への微生物の寄与に取り組むことで、これらの生物の高い耐暑性についてのさらなる洞察が得られるだろう。
結論
熱ストレスを受けたカシオペアの白化表現型は、他の光共生刺胞動物と異なる可能性がある一方で、強殖サンゴやイソギンチャクで報告されているプロセスとの重要な共通点もあることが示唆された [26, 88]。特に、熱ストレス下では、宿主のエネルギーと炭素が制限されるため、宿主の代謝が急速に正味異化状態に移行し、宿主の栄養に対する藻類の光合成物の相対的な寄与が大幅に減少する。このように、今回の結果は、カシオペアが熱ストレスに直面した光共生刺胞動物の代謝反応を研究する上で、非常に適切な実験室モデル生物であるという考え方を補強するものである。また、宿主の生体エネルギー状態が、共生刺胞動物の熱ストレス応答を形成する重要なパラメーターであることも示された。
さらに、カシオペアの「目に見えない」白化現象と相対的な耐熱性は、そのユニークな解剖学的構造と細胞組織の結果である可能性が高い。他の光共生刺胞動物と比較して中眼球が大きいこと、アメーバ細胞内に藻類共生体が隔離されていることは、カシオペアが急速に変化する極限環境に耐え、拡散する能力に寄与する適応的な利点である可能性がある。
データおよび資料の入手可能性
本研究に関連するすべての生データは、zenodo.orgのリポジトリhttps://doi.org/https://doi.org/10.5281/zenodo.8020430。
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謝辞
カシオペア培養水槽のメンテナンスにご協力いただいたN.H. Lyndby、海水サンプルのアンモニウム測定にご協力いただいたK. Vernez、EM用サンプルの前処理についてアドバイスをいただいたJ. DaraspeとD. De Bellis、組織学的検査についてアドバイスをいただいたC. Göpfertに感謝する。組織学的サンプル調製はEPFL Histology Core Facilityの協力を得た。著者らは、本原稿に建設的な意見を寄せてくれた編集者と2名の査読者に感謝したい。
資金提供
GT、NR、GBP、AMは、スイス国立科学財団の助成金200021_179092および212614の支援を受けた。CPは、フランス国立研究庁のジュニア教授助成金（ANR-22-CPJ2-0113-01）およびフランス国立科学研究センター（CNRS）の生態環境研究所（INEE）のスタートアップ助成金の支援を受けた。
著者情報
著者および所属
スイス連邦工科大学ローザンヌ校（EPFL）建築・土木・環境工学部生物地球化学研究室（École Polytechnique Fédérale de Lausanne, 1015, Switzerland
Gaëlle Toullec, Nils Rädecker, Claudia Pogoreutz, Guilhem Banc-Prandi, Stéphane Escrig, Cristina Martin Olmos & Anders Meibom
PSL パリ大学 EPHE-UPVD-CNRS, UAR 3278 CRIOBE, ペルピニャン大学, 52 Avenue Paul Alduy, Perpignan Cedex, 66860, France
クラウディア・ポゴレウツ
ローザンヌ大学電子顕微鏡施設、ローザンヌ、1015、スイス
クリステル・ジェヌー
ローザンヌ大学地球科学研究所先端表面分析センター、ローザンヌ、1015、スイス
クリスティーナ・マルティン・オルモス＆アンダース・メイボム
ローザンヌ大学地球表面力学研究所、ローザンヌ、1015、スイス
ホルヘ・スパンゲンベルク
貢献
GT、CP、NR、GBP、AMが実験を構想した。GT、CP、NRが実験を行った。GT、CP、NR、SE、CG、CMO、JSがデータの取得と解析を行った。GTは原稿の第一稿を執筆した。著者全員が原稿の査読と改訂に貢献した。
著者
Gaëlle ToullecまたはAnders Meibomまで。
倫理宣言
倫理承認および参加同意
該当なし。
出版への同意
全著者が論文掲載に同意している。
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
追加情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
補足情報
追加ファイル1：
図S1. 横と上から見た実験セットアップの概略図とサンプリングデザイン情報。図S2. 実験1日目と10日目にSP2で採取した、対照処理と熱ストレス処理のメデュサーの写真。図S3. クロロフィルa含量と湿重量あたりの藻類共生体密度に対する熱ストレスの影響。図S4. 熱ストレスを受けたメジナの表皮における同位体標識炭酸水素塩とアンモニウムの同化による濃縮に対する温度効果。図S5. 図3に示した相関SEMとNanoSIMS像に対応するSEMと12C2-および14N12C- NanoSIMS像。図S6. H&E染色を伴う光学顕微鏡とSEMで観察したSP2におけるコントロールとヒートストレスを受けたメダイの組織と細胞の超微細構造。表S1. 生物学的複製ごとの NanoSIMS 画像の数と、同位体濃縮解析のために定義されたカシオペアコンパートメントごとの関心領域（ROI）の数。
権利と許可
オープンアクセス この記事はクリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされています。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合を示す限り、いかなる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製を許可します。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表記に別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを閲覧するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの権利放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジット表記に別段の記載がない限り、この記事で利用可能となったデータに適用される。
転載と許可
この記事について
この記事を引用する
Toullec, G., Rädecker, N., Pogoreutz, C. et al. 宿主の飢餓と藻類共生体の宿主内分解が、カシオペア-シンビオジナ共生体の熱ストレス応答を形成する。Microbiome 12, 42 (2024). https://doi.org/10.1186/s40168-023-01738-0
引用文献のダウンロード
2023年6月12日受領
受理2023年12月11日
2024年2月29日発行
DOIhttps://doi.org/10.1186/s40168-023-01738-0
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