野生型サルモネラ・チフスムリウムの病原性を選択する腸内環境は微生物叢によって形成される

研究論文
野生型サルモネラ・チフスムリウムの病原性を選択する腸内環境は微生物叢によって形成される

https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3002253

Ersin Gül, Erik Bakkeren, Guillem Salazar, Yves Steiger, Andrew Abi Younes, Melanie Clerc, [...view 9 more...], Wolf-Dietrich Hardt

バージョン2
ハイライト
野生型S. Typhimurium感染症では、病原性のコストとベネフィットのトレードオフは微生物叢に強く影響される。
抗生物質投与マウスにおける野生型病原性は、微生物叢を不可逆的に破壊し、その結果、弱毒化hilD変異体による長期的な腸内コロニー形成が選択される。
微生物叢の移植は、野生型S. Typhimurium感染におけるhilD変異体への選択を防ぐことができる。
微生物叢の移入は、hilDが優勢なサルモネラ集団を腸管内腔から追い出すことができる。
要旨
サルモネラ（Salmonella Typhimurium）は、HilDが制御する病原性因子を高コストで発現させることにより、腸炎を誘発する。この炎症は、微生物叢が介在するコロニー形成抵抗性（CR）を緩和し、病原体の増殖を促進する。しかし、炎症を起こした腸内環境は、炎症を誘発したり維持したりすることができないhilD変異体を選択し、病原体の病原性を失わせることもある。このことから、S. Typhimuriumの病原性の維持にはどのような条件が必要なのかという疑問が生じる。実際、野生型hilD対立遺伝子が天然分離株で優勢である理由は依然として不明である。本論文では、感染していない宿主あるいは回復した宿主からの微生物叢の移入が、病原性を減弱させたhilD変異体の迅速なクリアランスをもたらし、その結果、S. Typhimuriumの病原性遺伝子型の維持に寄与していることを示す。様々な微生物叢の構成と抗生物質や炎症による微生物叢の破壊を特徴とするマウスモデルを用いて、我々は微生物叢の不可逆的破壊がhilD変異体の蓄積につながることを見出した。対照的に、微生物叢が一過性に破壊されたモデルでは、LachnospiralesとOscillospiralesに支配された微生物叢が再生することによって、hilD変異体の選択は阻止された。驚くべきことに、不可逆的な微生物叢破壊の後でも、感染していないドナーからの微生物叢の移入はhilD変異体の増加を防いだ。この結果は、S. Typhimuriumの強固な腸内コロニー形成は、宿主に対する最適な操作にかかっていることを立証するものである。一過性で穏やかな微生物叢の撹乱は、病原体が炎症を起こした腸内で繁栄し、かつ病原性の損失を最小限に抑えるのに好都合である。さらに、微生物叢はCRをもたらすだけでなく、高価な腸内病原体の病原性メカニズムを維持するという新たな結果をもたらすかもしれない。

引用 微生物叢は、野生型サルモネラ・チフスムリウムの病原性を選択する腸内環境を整えている。PLoS Biol 21(8): e3002253.

学術編集者 サム・ポール・ブラウン, ジョージア工科大学, アメリカ合衆国

受理された： 2023年4月28日受理： 受理：2023年4月28日; 受理：2023年7月13日; 掲載：2023年8月31日 発行：2023年8月31日

Copyright: © 2023 Gül et al. 本論文は、クリエイティブ・コモンズ 表示ライセンスの条件の下で配布されるオープンアクセス論文であり、原著者および出典のクレジットがあることを条件に、いかなる媒体においても無制限の使用、配布、複製を許可する。

データの利用可能性 著者らは、研究結果の基礎となるすべてのデータが制限なく完全に利用可能であることを確認する。すべての関連データは論文およびそのSupporting Informationファイル内にある。すべての図のグラフに使用したソースデータはS1データファイルに記載されている。すべての16S rRNAシーケンスデータは、European Nucleotide Archive（ENA；アクセッション番号：PRJEB64217）に寄託されている。

資金提供 本研究は、スイス国立科学財団（NRP 72 407240_167121、310030B_173338、310030_192567、NCCR Microbiomes助成金51NF40_180575）およびGebert Rüf財団（GRS-060/18）からWDHに助成金を得た。EGはMonique Dornonville de la Cour財団からWDHへの助成金を受けた。EBはBoehringer Ingelheim Fonds PhD fellowshipを受けた。MDは、SNSFの教授職（PP00PP_176954）およびBRCCHの複数研究者による助成金を受けた。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と解析、発表の決定、原稿の作成には関与していない。

競合利益： 著者らは、競合する利害関係は存在しないと宣言している。

略語 AAM、嫌気性アッカーマンシア培地;BHI、脳心筋注入;CR、コロニー形成抵抗性;EB、溶出バッファー;GF、無菌;LB、溶解ブロス;LCM、低複雑性微生物;mLN、腸間膜リンパ節;NGS、正常ヤギ血清;PCoA、主座標分析;RT、室温;SCFA、短鎖脂肪酸;TTSS、III型分泌系。

はじめに
腸は多様な腸内細菌叢でコロニー形成されており、コロニー形成抵抗性（CR）を含む多くの有益な機能を提供している [1,2]。コロニー形成抵抗性（CR）とは、多様なメカニズム [3] によって腸管内腔における病原体の増殖を阻止する微生物叢の能力のことである。CRを克服するために、腸内病原菌は病原性因子を導入し、宿主に不利益をもたらす腸管内環境および腸組織の構造を変化させる顕著な免疫反応（すなわち炎症）を特徴とする腸疾患を引き起こすことがあります（すなわち腸疾患）。したがって、病原体の病原性は、宿主の体力を低下させるが（腸疾患によって）、微生物叢の競合種を枯渇させることで自らの腸管内腔の成長とその後の感染を促進するという、トレードオフの関係にある [5] 。つまり、宿主、病原体、微生物叢の三者間の相互作用が腸内病原体の病原性の進化に影響を及ぼすと考えられるが、その選択的環境は状況に大きく依存するようである [6-8]。簡略化されたモデル系や無脊椎動物を宿主とする実験では病原性の進化が評価されているが、哺乳類の腸管における病原性の進化に関する研究はまだ少ない[7-9]。真核生物の病原体であるカンジダ・アルビカンスは特筆すべき例外である。エレガントな進化実験では、腸内細菌叢が野生型C. albicansの病原性を選択する一方、無菌マウスでは、菌糸の伸長不全を特徴とする病原性減弱変異体が選択されることが立証された [10,11]。しかし、微生物叢が腸内病原性細菌の病原性の進化に同様の影響を与えるかどうかは不明である。

感染生物学では、サルモネラ菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium：S.Tm）、ネズミチフス菌（Citrobacter rodentium）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、クロストリジウム・ディフィシレ菌（Clostridioides difficile）などの腸内病原体が持つ数多くの毒素、注入されたエフェクタータンパク質、自然免疫刺激などを同定してきた。腸内コロニー形成の促進は、これらの腸内病原細菌の病原性の存在を合理化すると考えられているが、腸内病原細菌の病原性の進化に対する微生物叢の影響を探るために実験的進化を活用した研究はほとんどない。

S. Typhimuriumは、鞭毛、接着剤、そして特に2つのIII型分泌システム（TTSS）を発現し、腸表面に接近し、腸組織に侵入し、腸の炎症を引き起こす [17] 。TTSS-1は腸管上皮への侵入を促進し、TTSS-2は宿主組織内での生存と増殖を促進する [18-20]。TTSS-2系によって分泌される病原性エフェクターは、エンドサイトーシス輸送を阻害し、NADPH-オキシダーゼ依存性の殺傷から生存を可能にすることによって、病原体がサルモネラ菌を含む液胞内で細胞内生存することを可能にする [21]。したがって、野生型感染は、C57BL/6のような感受性の高いマウスのように、宿主の寿命を劇的に減少させる可能性がある [18]。ストレプトマイシンで前処理したマウスでは、野生型S. Typhimuriumは腸管内腔で≈109 CFU/g便という高密度にブルームし、腸の炎症（病理組織学、サイトカイン遺伝子発現プロファイリング、または腸の炎症マーカーであるリポカリン-2のELISAで測定）を誘発し、それによって微生物叢の再成長を抑制する[12,19]。機能的なTTSS-1およびTTSS-2機構を欠くS. Typhimurium変異体（構造遺伝子invGおよびssaVを欠く欠失変異体のような）は、腸症を誘発せず、4日以内に腸内細菌叢の再生によって置き換えられる [12]。TTSS-1（機能不全のTTSS-2を持つ；ssaVのような）またはTTSS-2（機能不全のTTSS-1を持つ；invGのような）を保持するS. Typhimurium変異体は、野生型S. Typhimuriumに比べて軽い腸症を引き起こす[20,22,23]。このような変異体はまた、様々なマウス感染モデルにおいて糞便中の病原体量の減少によって示されるように、伝播の減少を示す [12,20,24,25]。

S. Typhimuriumの腸管病原性は、TTSS-1、TTSS-2、鞭毛、およびSiiEアドヘシンをコードする遺伝子を制御するマスターレギュレーターHilDによって厳密に制御されている[26,27]（S1図）。これにより、HilDは腸組織感染、腸管内腔の増殖、およびS. Typhimuriumの感染を制御する一方、抗生物質で前処理したマウスでは微生物叢の再増殖を抑制している[12,17,28-33]。HilDの発現自体は、S. Typhimuriumの病原性発現に関連するフィットネスコストを最小化するために重要な、厳密に制御された制御系に組み込まれている [29]。発現のためのシグナルは、微生物叢と宿主の両方によって由来または制御されているようである[34,35]（S1 Fig）。例えば、これらのシグナルは、S. Typhimuriumの病原性因子の発現を制御するための環境的な手がかりとなり、それぞれの病原性因子が必要とされる感染サイクルの瞬間にのみ、関連するコストが発生する。抗生物質で前処理したマウスでは、腸管上皮への侵入と腸管炎症の引き金に必要な病原性因子（特にTTSS-1、鞭毛、SiiEアドヘシン）の発現にコストがかかることがよく立証されている。そしてHilD制御系は、粘膜浸潤後、それらが不要になるとシャットアウトする [36]。しかしながら、病原性が発現されると、TTSS-1を発現しているS. Typhimurium細胞の増殖速度の低下とエンベロープストレス感受性の悪化という形で、適性コストが現れる（ex vivoで示されている； [37,38]）。実際、これらのコストは、原理実証研究[29]で示されたように、1感染サイクルの間にhilD欠損株よりもhilD変異株を選択するのに十分な強さである。このことは、HilDが制御する病原性のコストが、サルモネラの病原性進化において重要な因子であることを示唆した。しかしながら、この先行研究[29]は、宿主の生存を損なうことなくC57BL/6マウスの感染を最長10日間追跡するために、S. TyphimuriumのssaV変異体に焦点を当てたものであり、限界があった。この研究では、in vivoでのhilD変異体の選択を遅らせる制御機構を発見したが、野生で起こるS. Typhimuriumの病原性を完全に把握することはできなかった。野生型S. TyphimuriumはssaV変異体よりも強い腸疾患を引き起こすので、これは重要である[20,23,24]。さらに、野生型S. Typhimuriumの長期感染実験は行われているが、病原体の進化動態は研究されていない[12]。そのため、野生型S. Typhimuriumの病原性が宿主に感染する過程で腸内でどのように進化するのかは不明であった。

最近の研究で、HilD-regulon変異体が天然のサルモネラ分離株のごく一部で正選択されていることが発見された（100,000株当たり78株のhilDナンセンス変異体）[39-41]。早発停止コドンを特徴とするhilD欠損変異体の頻度は、無選択下にある遺伝子について予想されるよりも≒22倍高かった。これらのデータに基づき、チェリーは、hilD欠損株はほとんどの関連条件下で有利であり、78のhilD欠損変異株は、hilD欠損変異株が選択される未確認の条件が存在することを示唆していると示唆した。これらの観察結果は、病原体がよく理解されていない基本的なトレードオフに直面していることをさらに裏付けるものであった。

ここでは、野生型S. Typhimuriumの病原性進化に微生物叢がどのように影響するかを探るため、マウス感染モデル、宿主内実験進化、および同系株ペア間の競合感染実験を行った。その結果、野生型S. Typhimuriumの感染によって腸内細菌叢が破壊され、腸管内腔の病原体集団が病原性を低下させる方向に進化することが明らかになった。このような変異体の増加と長期的な排出は、微生物叢の移行によって制御できる。これにより、感染宿主内で野生型S. Typhimuriumの病原性が選択される際に、微生物叢が果たすこれまで認識されていなかった役割が明らかになった。

研究結果
ストレプトマイシン前処置マウスにおいて、野生型S. Typhimuriumに感染すると、病原性を減弱させた変異体が長期間糞便中に排出される。
野生型S.Typhimuriumの病原性がマウスの腸内でどのように進化するかを評価するため、ストレプトマイシン前処理マウスに野生型S.Typhimurium SL1344（S.TyphimuriumまたはS.Tmと表記）を感染させた。S.Tmの腸内コロニー形成には、自然環境において2つの段階がある：(i)あらゆる種類の微生物叢擾乱によって促進される初期腸内コロニー形成、(ii)炎症腸内でのブルーミングと長期にわたる脱落。ストレプトマイシン前処理マウスモデルでは、感染の24時間前に抗生物質を単回投与することで、一過性にCRが緩和され、研究者は第2段階である炎症腸内でのブルーミングに集中することができる[19,42,43]。したがって、最初の実験では、腸内感染の病原性関連段階に焦点を当てるために、このモデルを選択した。対照として、TTSS-2装置が機能しない弱毒株であり、宿主内進化に関する原理実証研究[29]で使用したS. Typhimurium SL1344のssaV欠失変異株（S.Tm*と表記）を2番目のグループのマウスに感染させた。129SvEvマウスは、野生型S. Typhimuriumに感染すると、ストレプトマイシンで前処理した129SvEvマウスが明らかな腸症を発症することから、最初の実験には129SvEvマウスを選んだ（S2A-S2F Fig）。C57BL/6マウスと同様に、129SvEvマウスも腸管内腔でのサルモネラのブルームを認める。しかし、C57BL/6マウスとは異なり、129SvEvマウスは野生型S. Typhimuriumの全身拡散を制限するのに重要な機能的Nramp1遺伝子を発現しているため、慢性腸内感染の研究だけでなく、感染や持続的な全身感染に関する重要な研究にも用いられてきた[12,24,45]。これは、野生型S. Typhimuriumの全身感染拡大を抑制する免疫不全ヒトの能力に似ている。129SvEvマウスのこのような特徴により、野生型病原体の宿主内進化を長期にわたって研究することができる。我々の129SvEvマウスのコロニーは、衛生的に隔離された状態で飼育されており、複雑で病原体を持たない特定の微生物叢を保有しているため、微生物叢が乱されない限り、高レベルのCRが得られる[25]。この微生物叢を持つ129SvEvマウスをCONXと表記する。CONXマウスのCRを一過性に緩和するためにストレプトマイシン前処置を行い、その24時間後、マウスにサルモネラ菌を自然経口胃から感染させ、新しい微生物株の意図しない侵入を防ぐ厳重な衛生的バリアを形成する個別換気ケージにとどめた（図1A；材料と方法）。

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図1. ストレプトマイシン前処理を施したCONXマウスに野生型S.
TyphimuriumまたはS.Tmに感染させた。(A）パネルB-Dの実験を要約したスキーム。(B-D）ストレプトマイシン前処置したCONXマウスを、野生型S. Typhimurium（SL1344 WT；ピンク色の塗りつぶし円；n＝19；4つの独立した実験）またはS.Tm（SL1344 ΔssaV；黒色の塗りつぶし円；n＝22；3つの独立した実験）に70日間感染させた。(B）選択的抗生物質を添加したMacConkeyプレートを用いて測定した糞便中のサルモネラ菌数。(C）腸の炎症。左：糞便ペレット中のリポカリン-2濃度を測定したELISAデータ。各時点で少なくともn=11匹の動物から採取したサンプルを分析した。点線は検出限界を示す。色付きの線は中央値を結ぶ。右：腸疾患の重症度を評価するための、腸陰窩を示す盲腸組織切片のHE染色代表画像[19]；スケールバー100μm。(D）検出可能なSipCを持たないコロニーの割合（コロニータンパクブロットで測定）。色のついた線は中央値を結ぶ。野生型S. TyphimuriumとS.Tmのデータの比較には両側Mann-Whitney U検定を用いた（p≧0.05有意ではない（ns）、p＜0.05（）、p＜0.01（）、p＜0.001（）、p＜0.0001（**））。ソースデータはS1データファイルにある。(E）パネルB-Dのマウスから再分離したクローンから全ゲノム配列決定を行った。非同義変異の完全な概要はS1-S6表に要約されている。濃いピンク：検出可能なSipC発現のないクローンからの変異（n = 11の独立したクローンを解析）。薄いピンク：SipCが検出されたクローンからの変異（n = 11の独立したクローンを解析）。点線は、たった1クローンで生じた変異に対応するパーセンテージを示す。mutS変異株（すなわちミューテータークローン）のみで変異した遺伝子は除外した。非同義変異と停止コドンまたはフレームシフトによって破壊された遺伝子のみを示す。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.g001

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以前の研究[12,29]と同様に、野生型S.TyphimuriumとS.Tmは感染1～10日目に高密度に腸管内腔にコロニー形成した（≒109 CFU/g便；図1B）。また、両菌株とも感染後3日以内に腸炎を惹起した。腸炎マーカーであるリポカリン-2（図1C、左側）のELISAによる評価では、リポカリン-2は感染粘膜で発現しており[29,46]、腸炎の時間経過を調べるのに適したアッセイ法である。S.Tm感染マウスでは、腸の炎症は20日目から70日目の間に消失した。これは、便中のリポカリン-2濃度の低下、病理組織学的検査（図1C、右側）、サイトカインmRNA発現解析、および70日目の腸組織における好中球染色によって示された（S3A-S3C図）。さらに、S.Tmに感染したマウスでは、25日目から70日目のp.i.の間に、腸管内腔の病原体集団は糞便1グラムあたり105 CFU（CFU/g）以下に減少した（図1B）。このことは、野生型S.Typhimurium感染マウスでは、腸の炎症と糞便中の病原体量が70日目までS.Tm感染群よりもはるかに多いままであったことと比較して、顕著な違いであった（図1B、1C、S3A-S3C）。

次に、病原性が減弱した変異クローンが腸管内腔で生じるかどうかを調べた。遺伝的にバーコード化されたS. Typhimuriumの集団を用いた以前の研究から、盲腸内腔における病原体の集団構造は、細菌の増殖、流入、流出、死滅によって確立されること、そして糞便中のサルモネラの集団構造は盲腸内のそれと類似していることが示されていた[46-49]。したがって、糞便を分析することで、宿主（すなわち盲腸内腔）内のサルモネラ菌集団のクローン構成を評価し、新たな宿主に感染しうる病原体集団に関する情報を得ることができる。糞便中のS. Typhimurium集団は、コロニープロテインブロットアッセイ（colony protein blot assay）[29,50]を用いて解析した（Materials and methods）。MacConkey寒天培地に糞便の希釈液をプレーティングし、コロニーをニトロセルロースにレプリカプレーティングし、サルモネラ細胞を溶解して各コロニーで発現したタンパク質をメンブレンに転写した。野生型S. Typhimuriumはこのようなプレート上で検出可能な量のTTSS-1を発現するので、TTSS-1トランスロコンタンパク質SipCに対する抗体を用いて、TTSS-1を発現できるコロニーを検出することができた（S1B Fig; [29,50]）。このアッセイによって、2群のマウスにおける病原体集団の間に、さらに顕著な違いがあることが明らかになった。S.Tm感染マウスでは、TTSS-1を発現するクローン（全コロニーの95％以上でSipCが検出された；図1DおよびS4）が優勢な病原体集団が排出されたが、第2群のマウスでは、そのようなクローンの頻度ははるかに低かった。ストレプトマイシンで前処理し、野生型S. Typhimuriumに感染させたCONXマウスでは、30日目までに糞便中のサルモネラコロニーの2％未満（全マウスの中央値）にSipCが検出され、この割合は70日目まで極めて低いままであった（図1DおよびS4）。全体として、野生型S.Typhimurium感染マウスは、変異型S.Tm感染マウスよりも、SipCを発現できる糞便サルモネラ細胞数が少ない（S4C図）。同時に、SipCを検出できない糞便サルモネラ細胞の絶対数は104倍であった。このことから、ストレプトマイシンCONXマウスにおける野生型S.Typhimurium感染は、病原性を低下させた病原体変異体を選択し、この選択はS.Tm*の場合よりもはるかに顕著であることが示唆された。

検出可能なSipC発現を持たない進化したクローンの遺伝的性質を理解するために、野生型S. Typhimurium感染後、あるいはS.Tm感染後の異なる時期の糞便から、コロニーブロットの表現型（すなわち、SipC検出、未検出、中間）に基づいていくつかのコロニーを単離し、ゲノム配列を決定した。この方法により、SipCを発現しない野生型S.Typhimurium感染から15クローン、S.Tm感染から12クローンを分離した。さらに、SipCを発現しているコロニー（intermediateまたはhigh；野生型S.Typhimurium感染から22個、S.Tm*感染から21個）をコントロールとしてゲノム配列決定した（S1-S6表）。これらのクローン数により、積極的に選択された変異を調査し、選択された変異にヒッチハイクした変異と区別することができるはずだと考えた。p.i.70日目に、SipCの発現が検出されなかったクローンの大部分は、HilDレギュロンに変異を有しており、そのほとんどはマスターレギュレーター遺伝子hilDを破壊していた（図1EおよびS1-S6表）。これはTTSS-1トランスロケータータンパク質SipCの発現におけるhilDの重要な役割と一致しており、野生型S. Typhimurium感染マウスではhilD変異体が選択されていることを示唆している。さらに、LPS生合成、代謝、走化性、あるいは鞭毛の生合成など、サルモネラのコロニー形成や病原性に関与する他の遺伝子に変異を持つクローンが複数観察され、これらはすべて、病原性を低下させる方向への宿主内進化の傾向を示している（図1E；S1本文の補足議論A）。hilDは動物モデルや自然分離株で最も頻繁に変異する遺伝子であることが以前に示されており、抗生物質で前処理したマウスにおけるサルモネラの病原性におけるHilDの中心的役割が以前の研究で確立されていることから[29,41,51,52]、今後の実験ではhilD遺伝子に焦点を当てることにした。

hilD変異体が優勢な進化したS. Typhimurium集団は病原性の低下を示す
野生型S. Typhimurium感染マウスで70日目p.i.までに進化したhilD変異体優位のサルモネラ集団の病原性の低下を調べるために、3種類の感染実験を行った（図1A-1Dより）。最初の実験では、糞便をPBSに懸濁し、ナイーブなストレプトマイシン前処置CONXマウスに3日間経胃的に感染させた（S5A図）。オリジナルの野生型S. Typhimurium株によるコントロール感染と比較して、進化した集団は腸管内腔の密度は同等（糞便1グラムあたり約109個のサルモネラ菌；S5B図）に達したが、糞便中のリポカリン-2濃度の低下から判断すると、腸の炎症は有意に少なかった（S5C図）。2つ目の実験では、自然感染に近づけるため、ストレプトマイシン前処理マウスよりも腸内細菌叢が無傷な系でhilD変異体の病原性減弱を測定しようとした。そこで、我々は「高脂肪食シフト」プロトコルに注目した（図2A）。以前の研究で、CONXマウスを通常の植物性マウス飼料からラードベースの高脂肪食に24時間シフトさせると、一時的に微生物叢が撹乱され、一時的にCRが緩和されることが立証されていた（ただし、ストレプトマイシン前処理マウスよりも効率は低い）。その結果、腸管内腔で野生型S. Typhimuriumが増殖し、糞便中にサルモネラ菌が大量に排出される。自然環境では、このような糞便排出の増加は糞便-経口感染を促進すると予想される。高脂肪食への移行後、野生型S. Typhimuriumの経口感染は3〜4日で腸症を引き起こす。ストレプトマイシン前処置マウスモデルでは感染後8〜12時間で腸症が観察されるのに比べ、この病勢は著しく遅れている。これは、高脂肪食シフトモデルでは微生物叢の摂動が穏やかで、腸内コロニー形成が遅いためであると考えられる。したがって、高脂肪食シフトモデルでは、炎症に依存した管腔病原体集団の開花は、ストレプトマイシン前処置マウスよりも遅く、顕著ではない。CONXマウスを高脂肪食に24時間移行させた後（材料と方法）、野生型S. Typhimuriumまたはその遺伝子を組換えにより欠失させた同系hilD変異体（S.TmhilDと呼ぶ）を経口投与により感染させた。野生型S.Typhimuriumはより高い糞便負荷量を維持し、より顕著な腸症を引き起こしたが、S.TmhilDの負荷量は感染5日間に減少し、リポカリン-2 ELISAおよび病理組織学的検査で判定されるように、遅延した動態で腸症を引き起こした（図2B-2D）。S6 Fig.に示した実験でも、同様の観察がなされた。この実験では、2つの異なる微生物叢を保有するgnotobioticマウスを感染させたが、このマウスは中程度のCRを付与するものであり、したがって、事前に微生物叢を擾乱することなく感染させることができる。これらのモデルでは、以前にも見られたように、野生型S.TyphimuriumはS.TmhilDよりも高い糞便量を維持し、より顕著な腸症を誘発した。これらの証拠から、hilD変異体は野生型S. Typhimuriumに比べて病原性が低下しており、食餌シフトモデルで残存しているような腸内細菌叢によって駆逐される可能性があると結論した。

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図2. 高脂肪食シフトモデルにおけるS.TmhilDの病原性の低下。
(A）実験スキーム。高脂肪食に1日シフトさせたCONXマウス（感染当日は維持食に戻す）を、野生型S.Typhimurium（灰色、空丸、n＝13匹）またはS.TmhilD（赤色、空丸、n＝12匹、5×107 CFU、経口投与）に5日間感染させた。(B)選択的抗生物質を添加したMacConkeyプレートを用いて測定した糞便中のサルモネラ負荷量。(C）ELISA法で測定した糞便中のリポカリン-2濃度。点線は検出限界。色付きの線は中央値を結ぶ。(D）HE染色した盲腸組織切片の代表的画像；スケールバー100μm。データは2回の独立した実験で得られた。野生型S. TyphimuriumとS.TmhilDのデータの比較には、両側Mann-Whitney U検定を用いた（p≧0.05有意ではない（ns）、p＜0.05（）、p＜0.01（）、p＜0.001（）、p＜0.0001（***））。ソースデータはS1データファイルにある。

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これまでのデータから、野生型S. Typhimuriumはストレプトマイシン前処理をしたマウスに感染する間に進化し、hilD（および他の）変異体が優勢な病原体集団を生み出し、そのような弱毒化された変異体は糞便中に数ヶ月間高密度に排出されることが明らかになった。これらの進化した変異体は、次の宿主に感染しても逆転の兆候を示さず、代わりに腸疾患を誘発する能力の低下を示した。このように、野生型S. Typhimuriumは病原性を低下させる方向に進化したのである。このことは、今回の研究で対照となったS.Tmを用いた実験で再現された以前の研究とは著しく異なっていた。これらの実験では、hilD変異体に対する一過性の選択のみが観察され、腸管内腔のサルモネラ集団は20〜60日後までに退去し、進化した変異体は蓄積されなかった。全体として、S.Tm感染よりも野生型S.Typhimuriumの方が、病原性の減弱がより強く、より長期間にわたって選択された。しかし、野生型S. Typhimurium感染において、野生型病原体、微生物叢、宿主の免疫応答の三者間相互作用のどの特徴が病原性低下の選択を促進するのかは不明であった。

微生物叢の移行は、hilD変異体によって支配される腸管内腔サルモネラ菌群を駆逐する
まず最初に、病原性を低下させる方向に進化したサルモネラ菌集団を排除する微生物叢の役割を調べた。具体的には、野生型S. Typhimuriumの感染によって腸内細菌叢が破壊され、感染時に選択されたhilD変異体優位の病原体集団を追い出す能力を失うのではないかという仮説を立てた。炎症は腸内微小環境を変化させ、微生物叢の再成長を抑制し、サルモネラ属菌や関連する腸内細菌の腸管内腔での増殖を促進することが知られていることから、このような顕著な微生物叢の崩壊はもっともらしく思われた［12,31,32,53］。さらに、ストレプトマイシンを前投与したマウスでは、野生型S. Typhimuriumによって誘発された腸の炎症は、炎症に適応した病原体の腸管内腔負荷でさえ、感染2日目には一過性に10～10,000倍に減少するほど顕著な抗微生物防御を引き起こす[48,49]。このような過去の知見と上記の我々のデータから、野生型S. Typhimuriumは腸内細菌叢を「戻れないほど」破壊し、病原体集団の病原性が低下しても再生できないため、感染終了時に変異型が優勢な腸管内腔集団を置き換えることができないのではないかという仮説を立てた。上記の実験（および我々の以前の研究[12,28,29,52]）は、個別に換気されたケージを用いて行われたことに注意することが重要である。このように衛生的に隔離することで、他からの微生物叢へのアクセスを防いでいる。そのため、微生物叢の特定のメンバーが一度失われると、自然に再獲得することはできない[54]。我々は、野生型S. Typhimuriumに感染したマウスにおけるHilD-regulon変異体の長期的流行は、衛生的隔離によって促進されるのではないかと推論した。

微生物叢移植実験は、マウスの生理学および疾患研究においてマイクロバイオームの機能を実証するためのゴールドスタンダードである[55]。hilD変異体が優勢なサルモネラ菌群を駆逐する微生物叢の役割を調べるため、2種類の微生物叢移植実験を行った。どちらのアプローチも、サルモネラ感染マウスへの微生物叢の移入を仲介することが以前の研究で確立されていたため、同居に依存していた[56]。第一に、複雑な微生物叢を持つナイーブな宿主（すなわち未感染のCONXマウス）からの微生物叢移行が、野生型S. Typhimurium感染で上昇するhilD変異体優位のサルモネラ集団による継続的な腸内コロニー形成を停止させることができるかどうかを検討した。図1A-1Dに示した実験の終盤（すなわち、野生型S. Typhimuriumを投与して70日目のp.i.）に、未処置のCONXマウスを同居させた（図3A）。同居させない対照マウスと比較すると、糞便中のサルモネラ総量および検出可能なSipCを含まないサルモネラクローンの割合は有意に減少し、120日目にはほとんどのマウスで検出限界以下となった（<103 CFU/g糞便；図3Bおよび3C）。さらに、検出可能なリポカリン-2が減少したことに加え、サイトカインmRNA発現、好中球染色、病理組織学的に、同居により腸の炎症が消失したことが示された（図3DおよびS7）。

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図3. 非感染CONXマウスからの微生物叢の移入は、野生型S.
Typhimurium感染マウスのサルモネラ個体群を排除した。(A）実験スキーム。野生型S. Typhimurium感染70日目以降（図1A-1E；n＝12）、マウスは未処置のCONXマウスと同居させるか（ピンク、グレーの塗りつぶし円；n＝6匹；各感染マウスは健常マウスとケージに入れた）、衛生的に隔離した（ピンクの塗りつぶし円；n＝6匹）。(B）選択的抗生物質を添加したマッコンキープレートを用いて測定したサルモネラの個体数サイズ。(C）コロニープロテインブロットアッセイでSipCシグナルが検出されなかったサルモネラ菌集団のサイズ。検出可能なSipCシグナルが検出されなかったコロニーの割合と病原体集団（Bに示す）を掛け合わせて求めた。(D）腸の炎症。左：ELISA法で測定した糞便中のリポカリン-2濃度（各時点で少なくともn＝6匹のマウスの糞便ペレットを分析）。点線は検出限界を示す。線は分析日の中央値を結ぶ。右：HE染色した盲腸組織切片の代表画像；スケールバー100μm。(E）120日目と160日目の糞便サンプルの微生物群集分析。サンプル内の多様性はShannon Indexを用いて測定した（ピンクの丸：同居なし、ピンクとグレーで塗りつぶした丸：同居あり、グレーの丸：ドナーマウスの糞便（つまりCONX動物が摂動していない））。示したデータは、両群の比較を含む2回の独立した実験から得られた。両側Mann-Whitney U検定を用いて、各時点における同居の有無のデータを比較した（p≧0.05有意ではない（ns）、p＜0.05（）、p＜0.01（）、p＜0.001（）、p＜0.0001（***））。ソースデータはS1データファイルにある。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.g003

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同居させない対照マウスでは、SipCが検出されないサルモネラクローンの割合は高いままであり（図3Bおよび3C）、病原体集団はさらに変異を蓄積した（160日目p.i.、中央値＝クローンあたり8変異；S8図およびS3表）。このように、衛生的隔離下では、HilD-regulon変異体が優勢であった。

同居により微生物叢の移入が達成されたことを確認するため、図3B-3Dのマウスから採取した糞便サンプル（120日目および160日目p.i.）の16S rRNA配列決定を用いて、両群のマウス間の腸内微生物叢組成を比較した。同居マウスは、対照マウスと比較して有意に高い群集多様性を再び獲得した（図3E；シャノン指数で測定したサンプル内多様性）。実際、同居マウスは、CONX「ドナー」マウスで観察されたのと同じような多様性を、サンプル内で再確立した（図3E、赤線を引いた灰色丸と引いていない灰色丸を比較）。これと同様に、160日目のBray-Curtis非類似度に基づく主座標分析（PCoA）と微生物叢組成分析（S9図）によって示されるように、共同飼育によって微生物叢組成が少なくとも部分的に回復した。

総じて、この最初の移植実験から、複雑な微生物叢を移植することで慢性腸炎を解決し、野生型S. Typhimurium感染時に進化した腸管内腔HilD-regulon変異体優位の病原体集団を置き換えることができることが示唆された。

微生物叢の移植により、S.Tm感染マウスの微生物叢は、hilD変異体が優勢なサルモネラ菌集団を置換する能力を保持していることが示された。
別のタイプの微生物叢移植実験では、1回のS.Tm感染後に残った腸内細菌叢が、野生型S.Typhimurium hilD変異体を駆逐する能力を持つかどうかを調べた。このようなS.Tm感染（図1A-1Dのコントロールと同様）の終了時には、微生物叢の再成長が腸管内腔のサルモネラ菌群を置換すると考えられていることから、「回復した」微生物叢は、野生型S.Typhimurium感染宿主で選択されるhilD変異体優位の病原体集団をも置換する能力があるのではないかと推論した。ここでは、hilD変異体に対する選択をより正確に定量化するために、実験のセットアップを少し変更した。そのために、ストレプトマイシンで前処理したCONXマウスに、抗生物質選択マーカーを持つ組換えhilD欠失変異体とその同系のhilD欠損欠損体を感染させた。これにより、糞便中の各集団のサイズを正確にモニターすることができた。さらに、これらのマウスを70日間ではなく40日間感染させたが、これはhilD変異細胞が集団を支配するのに十分だったからである（図1A-1E）。我々は、hilD欠損変異体（S.TmhilD）よりもhilD欠損細胞の方が10倍あるいは100倍多くなるように接種した（図4A）。S.Tmの余剰量が多いのは、図1A-1Dの実験による選択的環境を模倣するために選ばれた。具体的には、S.Tmを条件とした炎症環境を感染初期に腸管内腔に発生させ、初期には希少なhilD変異体を選択できるようにした。この競争的感染によって、再生した微生物叢が腸管内腔のサルモネラ集団をうまく追い出し、hilD変異体のさらなる選択を防いだことを確認することができた。

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図4. S.Tm感染マウスからの微生物叢移植は、野生型S.
Typhimurium感染時に選択される変異型病原体集団を置き換えることができる。(A）実験スキーム。1.ストレプトマイシン前処理のCONXマウスに、S.Tm対S.TmhilDの1:10（n=6匹）または100:1（n=7匹）を40日間感染させた（黒丸に白抜き；n=13匹；5×107 CFU、経口投与）。40日目のp.i.までに、このグループはドナーマウス（黒）を得た。2. 無胚芽C57BL/6マウスをS.Tm対S.TmhilDの100:1混合で40日間感染させた（白塗りの緑色記号；n=5匹；5×107 CFU、経口投与）。3.および4. ストレプトマイシンで前処理したCONXマウスを、S.Tm対S.TmhilDの1:10（n=8匹）または100:1（n=20匹）の混合物（それぞれピンクの記号に青の塗りつぶし、またはピンクの記号に白の塗りつぶし；5×107 CFU、経口投与）で40日間感染させた。40日目のp.i.までに、2つの実験グループが得られた。3. 40日目に、グループ3のマウス（n = 7匹）をグループ1のマウスと同居させ、80日目まで感染を追跡した。4. (B)選択的抗生物質を添加したMacConkeyプレートを用いて測定した糞便中の総サルモネラ負荷量。(C）選択的プレーティングデータから計算した、それぞれの群におけるhilD欠損株対hilD欠損株の競合指数。(D) ELISA法で測定した糞便中のリポカリン-2濃度（各群5〜14匹のマウスの糞便ペレット、各群および各時点で示した）。色のついた線は中央値を結ぶ。各群について、少なくとも2回の独立した実験からのプールデータを示す。グループ2は2コホートによる1実験からのデータを示す。両側Mann-Whitney U検定を用いて各群を比較した：黒印：第1群vs.第4群（p.i.0-40日目間）、緑印：第2群vs.第4群（p.i.0-40日目間）、青印：第3群vs.第4群（p.i.0-80日目間）。(p≧0.05有意ではない（ns）、p＜0.05（）、p＜0.01（）、p＜0.001（）、p＜0.0001（**））。ソースデータはS1データファイルにある。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.g004

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この実験の第一段階では、4群のマウスを作製した。第1群は「微生物叢ドナー」マウスである。第2群は、第1群の腸管内サルモネラ菌群を駆逐する微生物叢の重要性を探ることを目的とした。この目的のため、無菌C57BL/6マウスに、第1群に用いたのと同じ接種片（S.Tm対S.TmhilD；100：1）を感染させた。第1群とは対照的に、第2群（すなわち無菌マウス）は40日目までS.TmhilDを主成分とする高密度のサルモネラ菌群を排出した（≒109 CFU/g糞便；図4Bおよび4C）。驚くべきことに、2番目の群では、リポカリン-2濃度が低下しているにもかかわらず、S.TmhilDの高いコロニー形成が維持されており、これはp.i.30～40日目までに腸の炎症が消失したことを示している（図4D）。これらの観察結果は、微生物叢がS.Tm*感染経過中に進化する腸管内腔病原体集団を駆逐するのに必須であるという仮説を支持した（最初のグループや我々の以前の研究で観察されたように）[29]。また、これらのデータから、hilD変異体の選択は異なるマウス系統（C57BL/6と129SvEv）で起こることが確認され[29]、リポカリン-2レベルの低下（p.i.3日目の105 ng/g以上の糞便からp.i.30～40日目の101 ng/g糞便まで低下）によって示されるように、腸症は微生物叢の不在下で（少なくとも部分的に）消失しうることが確認された。

第3群と第4群は、移植実験の実験群であった。第3群と第4群では、ストレプトマイシンで前処理したCONXマウスに、野生型S.TyphimuriumとS.TmhilDの10:1または100:1の混合物を感染させた（図4A；S.Tm: S.Tm hilD）。この実験セットアップにより、野生型S.TyphimuriumとS.TmhilDのユニークな抗生物質耐性を利用したディファレンシャル・プレーティングによるhilD変異体の選択を正確に定量することができた（表1）。さらに、野生型S.Typhimuriumによって調整された炎症性腸管内腔環境を確立し、hilD変異体が最初はまれで、その後選択されて腸管内腔を支配する状況を作り出した（p.i.1-40日目；図4B-4D）。最初の40日間のデータは、図1A-1Dに示した野生型S.Typhimurium感染の結果と一致していた（つまり、野生型S.TyphimuriumよりもS.TmhilDが選択されることが観察され、≈109 CFU/g糞便に達した）。40日目に、第1群のマウスを「微生物叢ドナー」として第3群のケージに入れた。この結果、糞便中のサルモネラ総量は減少し、S.TmhilDの選択率は、ドナーマウスを用いなかった第4グループと比較して低下した（図4Bおよび4C）。hilD変異体が支配的であった腸管内腔のサルモネラ集団の移動は、病理組織学的検査で示されるように、腸の炎症のわずかな改善とともに進行した（S10図）。しかし、腸症の消失は不完全で、糞便中のリポカリン-2濃度は非感染マウスよりもはるかに高いままであり、グループ3と4の間に差はなかった（図4D）。このデータから、S.Tm*誘発性大腸炎からの回復過程で再確立する腸内細菌叢は、野生型S.Typhimurium感染マウスで選択された腸管hilD変異体優位の病原体集団を置換する能力を保持していることが示された。この置換は、野生型S. Typhimurium感染マウスでp.i.40〜80日目までに観察されたように、腸の炎症に直面しても起こりうる。

我々の2つの微生物叢移植実験から、hilD変異体が微生物叢によって置換されることが立証された。微生物叢の欠如（無菌マウスのように）あるいは不可逆的な破壊（野生型S. Typhimuriumに感染させたストレプトマイシン処理CONXマウスのように）は、病原体の病原性低下への宿主内進化を促進する。したがって、サルモネラの病原性の維持を促進する選択的な環境を作り出すには、微生物叢が重要であるようだ。

腸の炎症は、S.Tm株の背景とは無関係にhilD変異体を選択する
ここまでの実験から、野生型S.Typhimurium感染症はS.Tm感染症とは異なり、hilD変異体を選択する傾向があること、そしてこれらの病原性を減弱させた変異体が数週間から数ヶ月にわたって糞便中に大量に排出されることが明らかになった。さらに、我々のデータから、これは腸症を誘発し、それによって腸内細菌叢を撹乱するこれら2株の能力の違いに起因する可能性が示唆された。しかし、例えば、野生型S.Typhimuriumと比較してS.Tmによる組織コロニー形成を減弱させるssaV欠失変異など、菌株のバックグラウンドに関連する多面的効果が、腸管内腔におけるhilD変異株の選択に寄与している可能性も残されていた。我々は2つの異なるアプローチを用いてこの問題に取り組んだ。

S11 Fig.に示したアプローチでは、S.Tmの同系株の混合物を接種原として用い、10,000倍過剰に与えられた株は、腸内環境を「炎症を起こしていない」状態（invG ssaVを欠くS.Tm；S.TmAvir；実質的な腸炎を誘発できない）、あるいは野生型腸症（野生型S.Tm）を特徴とする状態にした。10,000倍過剰のコンディショニング株の中に、S.TmAvirまたは野生型S.Tmバックグラウンドで構築されたhilD欠損または-欠損S.Tm変異体である競合株を1:1の割合で混合した（S11A図中のスキーム）。こうすることで、hilD変異体が株背景によって選択されるのか、それとも炎症腸内環境によって選択されるのかを明らかにすることができた。これら4つの条件下で、同系S. Typhimurium株ペアの間の競合を解析した。驚くべきことに、腸内環境を "非炎症 "状態にした場合（つまり10,000倍過剰のS.TmAvirを使用した場合）、hilD陽性株とその同種のhilD欠損変異株は、感染の4日間を通して1:1の比率を保った（競合指数、C.I.=1; S11 Fig）。これは、使用した株背景とは無関係であった。対照的に、タグのない野生型S. Typhimuriumを10,000倍過剰に用い、顕著な腸症を引き起こした陽性対照実験では、hilD変異体は4日以内にタグのあるhilD欠損株を1,000倍も上回った。実際、S.TmAvir（S.Tm SL1344 invG ssaV）を10,000倍過剰の野生型S.Typhimuriumの存在下でhilD欠損株と競合させた場合も同様であった（S11図）。このように、腸の炎症は、競合する菌株ペアにおけるssaVの有無や、宿主組織内に侵入して増殖する能力に関係なく、hilD変異株を選択する。

ここでは、同じ株（すなわち、野生型S. Typhimurium）で感染を行ったが、異なるモデルマウスを使用したため、腸内炎症の動態が異なるという実験設定を用いた。そこで、hilD変異体に対する選択が腸内炎症の程度に影響されるかどうかを検討した。この目的のため、2種類の同系C57BL/6マウスで連続感染実験を行った。糞便-経口連続感染により、個々のマウスの感染を3〜4日に制限することができ、それによってC57BL/6マウスの全身的病原体拡散による死亡を避けることができた。C57BL/6マウスは、その微生物叢によってもたらされるCRの程度と疾病動態の両方が異なる2つのグループを使用した。ストレプトマイシンで前処理したC57BL/6（CONE；材料と方法）マウスでは24時間以内に腸の炎症が起こるが、代表的な12種類の微生物叢から構成される定義された微生物叢を持つ未処理のC57BL/6マウス（OligoMM12マウス[57]）では3～4日目のp.i.まで遅れる。どちらのマウスも同じ野生型S. Typhimurium株に感染させた。OligoMM12マウスでは、実験終了までTTSS-1を発現するクローンを中心とした病原体集団が排出された（全コロニーの100%でSipCが検出された；S12図）が、ストレプトマイシン前処理をしたCONEマウスでは、この集団ははるかに早く減少した。従って、hilD変異体の選択は株背景とは関係なく、むしろ腸内炎症と初期微生物叢組成によって形成される腸管内環境によって決定されると結論づけた。

これらのデータを総合すると、野生型S. Typhimuriumが引き起こした炎症の結果として形成された腸内環境は、菌株のバックグラウンド（野生型、ssaV変異体、またはアビルーレントなど）に関係なく、hilD変異体を選択することが示唆された。しかし、野生型S. Typhimurium感染の急性期（例えば、ストレプトマイシン前処理マウス）において、微生物叢移植がhilD変異体の選択を防ぐことができるかどうかは不明であった。

微生物叢の移入は、野生型S. Typhimurium感染の急性期におけるhilD変異体の選択を防ぐことができる。
これまでの結果から、(i)効率的な腸内コロニー形成には腸内炎症が必要であること、(ii)しかし、hilD変異体の減弱も選択されること、(iii)ナイーブあるいは回復したドナーマウスからの微生物叢移植により、hilD変異体が優勢なS.Tm集団が腸管内腔から排除され、間接的に野生型S. Typhimurium遺伝子型の維持に寄与することが示された。次に、野生型S.Typhimuriumに誘発された炎症によって腸内環境が形成されるような状況下で、複雑な微生物叢がhilD変異体の増加を防ぐことができるかどうかを検討した。これを解決するために、我々はストレプトマイシン前処理をしたモデルマウスで、感染の急性期に微生物叢移植実験を行い、hilD変異体の選択の動態をモニターした（図5A）。

この目的のため、ストレプトマイシン前処置したCONXマウス2群に、野生型S. TyphimuriumとS.TmhilDの106:1混合株を40日間感染させた。初回接種時のhilD変異体の割合を可能な限り低くすることで、これらの変異体の自然発生を低い頻度で模倣することを目指した。最初のグループは感染期間中、衛生的隔離（すなわち、同居なし）のままであったが、2番目のグループはナイーブなCONXマウスと同居することにより、乱されていない微生物叢にアクセスすることができた。CONXマウスは4日目のp.i.に加えたが、この時期は腸の炎症がまだ非常に顕著であり（S2図；[44]）、ストレプトマイシンが洗い流され、野生型S. Typhimurium感染の極めて殺菌的な段階（1～2日目のp.i.の間[48]）が終わった後である。これによって効率的な微生物叢の移行が促進され、hilD変異体の選択における炎症環境と微生物叢の影響を切り離すことができると考えた。驚くべきことに、S.Tmの腸内総個体数は両群とも40日間収容能力を維持したままであったが、同居させなかった対照群でのみ、hilD変異体が40日目のp.i.までに糞便中の総病原体数を支配した（図5Bと5C）。これとは対照的に、4日目のp.i.に微生物叢の移植を受けたマウスのほとんどは、感染終了時には野生型S. Typhimuriumにコロニー形成されていた（図5Bおよび5C）。このように、腸疾患の急性期に複雑な微生物叢を移植することは、病原体の腸内コロニー形成効率を損なうことなく、hilD変異体の上昇と蓄積を防ぐのに十分である。

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図5. hilD変異体が糞便集団を支配する前の微生物叢移行の効果を調べるための初期微生物叢移行の実験。
(A）実験スキーム。(B-F）ストレプトマイシンで前処理したCONXマウス（各群n＝8またはn＝9）に、野生型S. Typhimuriumと同種のhilD変異体（5×107 CFU、経口投与）の106：1混合物を感染させた。第1群は衛生的に隔離したまま（コントロール；ピンクの空丸；n＝8）、第2群は4日目からナイーブCONXマウスと同居させた（ピンク、薄緑の塗りつぶし丸；n＝9）。各群は実験終了（40日目p.i.）までこのまま飼育した。(B）選択プレーティングにより糞便中に検出されたサルモネラ総数。点線は検出限界。色付きの線は中央値を結ぶ。(C）選択的抗生物質を添加したマッコンキープレートを用いて測定したC.I.を野生型S.TyphimuriumとS.TmhilDについて示す。点線はC.I.が1であることを示す。 (D) 便中リポカリン-2のELISAを用いて、2群間の腸内炎症を比較した。(E）HE染色した盲腸組織切片の代表画像；スケールバー100μm。(F）サルモネラ臓器負荷量。mLN = 腸間膜リンパ節。示されたデータは、両群の比較を含む2つの独立した実験から得られた。統計解析には両側Mann-Whitney U検定を用いた（p ≥ 0.05 not significant (ns), p < 0.05 (), p < 0.01 (), p < 0.001 (), p < 0.0001 (****) ）。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.g005

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次に、同居群でhilD変異体が選択されない理由が、腸の炎症がないことに起因するかどうかを調べた。意外なことに、腸の炎症は両群で明らかであり、同程度に高かった（図5Dおよび5E）。さらに、全身臓器（mLNと脾臓）の病原体負荷も両群間で同等であった。このように、ナイーブなドナーマウスの微生物叢は、S. Typhimurium腸内感染時のhilD変異体の選択的優位性を、顕著な腸内炎症が続いていても、効果的に緩和することができる。

以上より、野生型S. Typhimuriumが引き起こす腸内炎症によって形成された腸内環境は、複雑な微生物叢の移入によって補完され、hilD変異体の選択を阻止する一方で、病原体の腸管内腔での頑健な増殖を可能にすると結論づけられた。

野生型S. Typhimurium感染マウスにおける長期的な微生物叢の擾乱
これまでのデータから、衛生的な条件下では、抗生物質で前処理したマウスの野生型S. Typhimuriumが誘発する腸疾患は、弱毒化hilD変異体を選択することが示唆される。この現象は、マウスにナイーブなドナーからの正常な微生物叢を補充しない限り起こる。一方、S.Tmによって誘発される腸疾患では、再生する微生物叢がhilD変異体の蓄積を防ぐことができるため、病原性の減弱にはつながらない。そこで次に、両方の感染条件下で微生物叢の組成がどのように変化したかを調べた。野生型S. TyphimuriumおよびS.Tm感染時の微生物叢の変化、サルモネラの腸内コロニー形成の動態、病原性が低下した変異体の選択との相関を明らかにするために、図1A-1Dに示すマウスから採取した糞便サンプルについて16Sコミュニティシークエンシングを行った。図1A-1Dに示した実験は、ストレプトマイシン前処理による最初の微生物叢の擾乱に依存していることに注意すべきである。これまでの研究で、ストレプトマイシンは微生物叢の組成を乱し、その多様性を一過性に減少させることが立証されていた[12,58-60]。しかし、抗生物質の投与だけではCRを1～3日間しか抑制できない。病原性が誘発する炎症が微生物叢の再成長を抑制しない限り、腸管内腔のサルモネラ負荷は、4日目のp.i.までに盲腸内容物1gあたり109を超えるCFUから約107CFUに減少する［12］。このことは、野生型S.Typhimurium感染や、TTSS-1およびTTSS-2の機能を欠損した弱毒性二重変異体（S.TmAvir；上記参照）への感染で確立されていたが、腸管障害を起こさなかった［12］。S.Tm*感染時に一過性に発生するhilD変異体優位のサルモネラ菌集団がなぜ排除されるのか、またなぜ野生型S.Typhimurium感染マウスからhilD変異体優位の病原体集団を排除する能力を腸内細菌叢が保持しているのかを説明する一助になるのではないかと考えた。

解析のために、0日目の糞便微生物叢組成を評価し、10日目の糞便微生物叢組成と比較した、 サルモネラ菌の負荷は感染マウスの両群で漸増し（≒109 CFU/g糞；図1B）、炎症マーカーであるリポカリン-2の濃度は上昇し、ほぼ同等（≒104 ng/g糞；図1C）であり、検出可能なSipC発現のないクローンはほとんどのマウスの糞便ではまだ少数派であった（図1D）。糞便中のサルモネラ負荷量と腸内炎症が両群間で強く異なっていたため、70日目のp.i.についても評価した（図1B、1C、S3）。さらに、70日目には、野生型S.Typhimuriumに感染したすべてのマウスの糞便で、SipCの発現が検出されないクローンが優勢であった（S.Tm*感染マウスでは見られなかった；図1D）。また、70日目のp.i.のデータは、Fig.3に示した微生物叢移植実験にこの時期のマウスが使用されたため、特に貴重であろう。

p.i.10日目のサンプル内多様性（シャノン指数で定量）は、野生型S. TyphimuriumマウスとS.Tm感染マウスの間で同程度であり、ナイーブCONXマウスよりも低かった（図6Aと図3Eの灰色記号を比較）。野生型S.Typhimurium感染マウスでは、サンプル内の多様性は低いままであったが、S.Tm感染マウスでは、70日目p.i.までにほぼ「乱れのない」レベルに戻った（図6AおよびS13；図3Eの灰色記号と比較）。S.Tm感染マウスでは、10日目から70日目にかけての微生物叢の複雑性の上昇は、糞便中のサルモネラ菌総数の減少（図1B）および検出可能なSipC発現を持たないクローンの減少（20日目から70日目の間；図1D）と時間的に相関していた。重要なことは、Bray-Curtis非類似度に基づく主座標分析（PCoA）によって示されるように、野生型S.Typhimurium感染マウスとS.Tm感染マウスでは、両時点で微生物叢組成が異なっていたことである（図6Bおよび6C）。なお、サルモネラ菌のリードをこの解析から除外しても、同じ結果が得られた。このように、S.Tm*は微生物叢の複雑性を一過性に減少させたが、70日間の感染期間中、衛生的に隔離したにもかかわらず回復した。対照的に、野生型S.Typhimuriumが微生物叢の複雑性に与える影響は明瞭であり、長期間持続した。

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図6. 野生型S.
Typhimuriumがストレプトマイシン前処理したCONXマウスの腸内細菌叢組成に及ぼす長期にわたる影響。図1B-1Dに示した実験において、10日目と70日目のp.i.にサンプリングした無撹乱のCONXマウスの糞便サンプルの微生物群集を解析するために16S配列決定を行った。(A）サンプル内の多様性をShannon Indexを用いて測定した（ピンクの丸：野生型S.Typhimurium感染、黒の丸：S.Tm感染）： 黒丸：S.Tm感染）。(B, C）サンプル間のBray-Curtis非類似度に基づく主座標分析（存在量の平方根変換後）。データ点は個々のマウスを表し、色のついた境界線は各サンプルグループ内のデータ点のグループ分けを定義する。(PERMANOVA R2 = 0.397、p = 0.0045（10日目p.i.）、R2 = 0.661、p = 0.0024（70日目p.i.）。最も豊富な4つの門を示し、残りの門は "その他 "として示した。(E)ファーミキューテス門に属する最も多い目の相対存在量。図3でドナーとなったCONXマウス（灰色の円）の糞便微生物叢をコントロールとして用いた。(F,G)Lachnospirales目とOscillospirales目に属する最も豊富な属の相対量。野生型S. Typhimurium感染マウスとS.Tm感染マウスの10日目および70p.i.における属数を比較した。(E-G）点線は検出限界。線は中央値を示す。両側Mann-Whitney U検定を用いて、野生型S. TyphimuriumとS.Tm感染サンプル（パネルA黒星、パネルE-Gピンク星）、またはS.Tm感染マウスと未処置CONXマウス（パネルE-G；黒星）を比較した（p≧0.05有意ではない（ns）、p＜0.05（）、p＜0.01（）、p＜0.001（）、p＜0.0001（**））。ソースデータはS1データファイルにある。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.g006

詳細 "
変異型が優勢な腸管腔内サルモネラ集団を置き換える原因となりうる分類群を同定するために、まず、より高い分類学的解像度で腸内細菌叢コミュニティを調査した。CONXの微生物相は、4つの主要な門から構成されていた： すなわち、ファーミキューテス属、バクテロイデーテス属、プロテオバクテリア属、およびアクチノバクテリア属である（図6D）。経時的な微生物叢組成の解析から、野生型S.Typhimuriumに感染したマウスとS.Tmに感染したマウスとでは、分類群の相対的存在量に顕著な違いがあることが明らかになった。S.Tm感染マウスおよび野生型S.Typhimurium感染マウスでは、10日目のp.i.においてプロテオバクテリア門のメンバーが顕著であり、プロテオバクテリアの16S配列の99％以上がこれらのマウスに感染させたサルモネラ菌株に起因するものであった（S7-S10表）。糞便中のサルモネラ負荷量の高さ（図1B）と同様に、プロテオバクテリアの配列は野生型S. Typhimurium感染マウスでは70日目まで顕著であったが、S.Tm*感染マウスでは急激に減少した（図6D；青棒；70日目p.i.）。

バクテロイデーテス門は両群とも10日目までに抑制された（図6DおよびS13E）。バクテロイデス門はこの門の主要な目であり、69%（CONXマウス未処置群の糞便から読み取った16S配列に基づく；中央値）の相対存在量から約0.1%まで減少し、両群とも70日目まで低いままであった（図6DおよびS13E）。このことから、S.Tm*感染マウスでも腸内細菌叢の組成は完全に初期状態に戻るわけではないことが示唆された。さらに、これらのデータから、バクテロイデス門は我々の実験では内腔のサルモネラ菌群を駆逐するのに必要でない可能性が高いことが示唆された。

アクチノバクテリア門は、無撹乱マウスでは低存在量であったが、野生型S.TyphimuriumおよびS.Tm*感染マウスでは、70日目のp.i.において、より多様な存在量で出現した（図6D）。この存在量のパターンは、高濃度のアクチノバクテリアの有無がhilD変異体の腸内コロニー形成にほとんど影響しないことを示唆しているのかもしれない。

バクテロイデーテス門とは対照的に、ファーミキューテス門のメンバーは、両グループのほとんどの動物で、生後10日目には全16S配列の10%から30%を占めていた（図6D）。70日目には、S.Tm感染マウスではファーミキューテス門が全16S配列の95%以上を占めるようになったが、野生型S.Typhimurium感染マウスでは約10%から30%にとどまった。より高い分類学的分解能では、感染マウスと非感染マウスとの間に、またS.Tm感染群と野生型S. Typhimurium感染群との間にも顕著な違いが見られた（図6E-6G）。S.Tmまたは野生型S.Typhimuriumに感染したマウスでは、(i)70p.i.日目においてS.Tmまたは野生型S.Typhimuriumのいずれかに感染したマウスで存在量が増加した目、(ii)10p.i.日目までは両群とも減少していたが、70p.i.日目には再び増加した目、 (ii)S.Tm感染マウス（野生型S.Typhimurium感染マウスではない）では、10日目のp.i.までに両群で減少したが、70日目のp.i.までに再増加した目；(iii)S.Tm感染マウスでは、10日目のp.i.までに減少したが、70日目までに、特にS.Tm感染マウスでは、乱れのない微生物叢よりも高い存在量まで開花した目（図6EおよびS13H）。後者の2つの反応パターンを示す分類群は、S.Tm感染マウス（70日目、図1Bと1D）や微生物叢移植後（図3B、3C、4Bと4C）に観察されたように、サルモネラ属を駆逐し、突然変異体の過剰増殖から選択される環境を作り出す重要な菌株を含んでいる可能性があるため、特に興味深いものであった。

Oscillospirales目およびLachnospirales目は、いずれの株でも感染10日目までに枯渇したが、S.Tm*-感染マウスでは感染70日目までに再生したが、S.Tm感染マウスでは再生しなかった（図6E）。そのメカニズムは不明なままである。一方では、回復期の腸管内環境（S.Tm感染マウスでは70日目p.i.）がOscillospiralesとLachnospiralesを選択するのかもしれない。従って、これらの菌株はその腸管内環境の指標菌株である可能性がある。あるいは、OscillospiralesとLachnospiralesが優勢であるということは、これらの分類群が腸管内腔でのサルモネラの増殖を抑制し、急性大腸炎が治癒したときに弱毒化したサルモネラ変異株を選択するという、より積極的な機能を持つことを示唆しているのかもしれない。原理的には、このような「積極的な」役割は、酪酸のような短鎖脂肪酸（SCFA）を介して発揮されるかもしれない。なぜなら、これらの微生物叢の代謝産物は、CRのないマウス（無菌マウスなど）よりも、CRの高いマウス（CONXマウスなど）の盲腸内腔の方がはるかに高濃度だからである。SCFAはHilD-regulonの発現を調節し[61-63]、OscillospiralesおよびLachnospiralesはそのような代謝産物を産生することが示された。それにもかかわらず、S.Tm感染マウスにおいても、微生物叢の構成はナイーブな状態には戻らず、バクテロイデス目のほとんどがファーミキューテス門の目（主にラクノスピラレス目；図6D、6EおよびS13E）に置き換わっていた。このことは、大腸炎後の微生物叢が、ナイーブな微生物叢とは異なる機能的特徴（腸病原体による病原性制御への異なる影響、SCFA産生の変化など）を持っている可能性を示唆している。

正常なマウスの腸内細菌叢の中で、hilD変異体による長期的なコロニー形成を制限している可能性のある属を同定するために、Oscillospirales目とLachnospirales目を亜目レベルで調べた（図6Fと6G）。S.Tm感染から70日目（p.i.）に回復したマウスの腸内で最も豊富な分類群を、野生型S.Typhimuriumに70日間感染したマウスおよび無処置のマウスの腸内の分類群と比較した（図6Fおよび6G）。特に、S. Tm感染から回復したマウスでは、LachnospiralesのLachnospiraceae NK4A136、Roseburia、Lachnospiraceae UCG-006、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae UCG-001、A2、Marvinbryantia、OscillospiralesのColidextribacter、Intestinimonas、Anaerotruncus、Oscillibacterが有意に上昇していた（図6F、6G）。 Tm感染から回復したマウスでは、Oscillospiralesに属す 我々は、これらの分類群からなる特定のメンバーまたはコンソーシアムが、hilD変異体に対して選択的な腸管内腔環境を作り出している可能性があると仮定した（図6Fおよび6G）。この仮説を検証するため、初期には枯渇していたが、S.Tmで70日目p.i.までに再生した分類群に注目した。そのため、Lachnospirales、Oscillospirales、Erysipelotrichalesから培養可能な株を選んだ。

最初の実験では、ストレプトマイシンで前処理したCONXマウスを感染させ、0日目、1日目、3日目に指定した微生物株を接種した（S15AおよびS15B図）。ストレプトマイシンは約24～36時間以内に腸から洗い流され、S. Typhimurium腸内感染は1～2日目の間に腸管内細菌群集に顕著な影響を及ぼし［48,49］、2日目以降に回復し始めるため、この微生物叢接種のタイミングは妥当であると思われた。しかし、個々の菌株を導入しても、（顕著な微生物叢発酵産物の例として）マウスの飲料水にプロピオン酸または酪酸を補充しても、S.Tm*hilDの選択は阻止されなかった（S15B図）。

第2の実験は無菌マウスで行った。これらの動物にはhilD変異体に対して選択的な微生物叢が存在しないか、あるいはhilD変異体が優勢なサルモネラ菌群を腸管内腔から追い出す微生物叢が存在しないからである（図4Bおよび4C参照）。したがって、適切な微生物叢菌株を加えることで、これらの微生物叢が介在する機能を回復できる可能性がある。この目的のために、図4（40日目のp.i.）から競合感染させた無菌C57BL/6マウス（S.TmとS.Tm hilDの100：1混合）を採取した。 緑色の記号）、Actualibacter muris KB18、Clostridium clostridioforme YL32、Flavonifractor plautii YL31、Blautia coccoides YL58、Faecalibaculum rodentium DSM 103405からなる微生物叢株カクテルを40、45、50日目のp.i.でこれらのマウスに接種した（S16A図）。しかし、微生物叢の接種はS.Tm* hilDの優勢には影響しなかった（S16B図）。この理由はまだ不明である。図6とS13の16Sデータは、適切な腸管内環境を構築できる菌株を同定するには不十分であったのかもしれないと推測される。あるいは、このような環境条件は、特定の微生物叢菌株の組み合わせ（我々が微生物叢の組み合わせに加えることができなかった菌株も含む）を必要とする創発的な性質なのかもしれない。また、Oscillospirales属、Lachnospirales属、またはErysipelotrichales属が、hilD変異体に対する選択、あるいは変異体優位のサルモネラ個体群の置き換えに積極的な役割を果たしていない可能性も否定できない。むしろ、それらは回復期のマウスの腸管内環境に生息する指標株なのかもしれない。これらの疑問は今後の研究課題である。

まとめると、我々のデータは、S.Tm*感染マウス（図1Bおよび1D）および野生型S.Typhimurium感染動物への微生物叢移植後（図4Bおよび4C）において、回復後の完全な群集の出現的特性がhilD変異株の拡散を抑制する原因となっている可能性を示唆した。

中間レベルのCRを付与する微生物叢はhilD変異体の選択を阻止する傾向がある。
上記のデータから、腸内細菌叢はhilD変異体を選択しないような腸管内腔環境を整えるのに重要であることが示唆された。野生型S. Typhimuriumによる（S.TmhilDと比較して）優れた腸管内腔コロニー形成は、軽度の食餌を介した微生物叢の摂動後（図2およびS6）、および摂動していない複合微生物叢（すなわちCONXまたはCONE）と比較して低レベルのCRを付与する微生物叢を保有するマウスにおいて特に明らかであった。これらの最初の実験では、マウスを野生型S.TyphimuriumまたはS.TmhilD単独で感染させた。しかし、中間のCRを与える微生物叢の存在下で、野生型の病原性がhilD変異体と競合して選択されるか否かは不明であった。そこで、中間のCRを持つモデルマウスを用いて、2つの競合感染実験を行った。

最初の実験では、CRを一過性に緩和するために高脂肪食にシフトしたCONXマウスで、野生型S. TyphimuriumとS.TmhilDを競合させた（図7A）。複雑な微生物叢を適度に乱すことで、腸内環境が病原性に有利な状態になる可能性が、すでに我々のデータで示されていたからである（S6J図）。この目的のために、CONXマウスを高脂肪食に24時間移行させた後、野生型S. TyphimuriumとS.TmhilDの100:1混合菌に感染させ、40日間にわたりサルモネラ菌の腸管内増殖と糞便中のリポカリン-2濃度を解析した。糞便中の総サルモネラ負荷量の中央値は、実験を通して≈106 CFU/gのままであった。これは、CONXマウスのようにCRの強いマウスでは予想される値よりも高いが（S6K Fig）、ストレプトマイシン前処理をしたCONXマウスよりは有意に低かった（Fig 7B、Fig 4Aから再掲）。これらの高脂肪食シフトCONXマウスでは、hilD変異体に対する平均的な選択は極めて軽度であったか、あるいは存在しなかった（図7C）。実際、一部のマウスではhilDを持つ野生型S. Typhimurium株への選択が観察された。この野生型S. Typhimurium株への選択は、腸管内腔の病原体負荷が最も低い（糞便1gあたり103-107 CFU）動物で最も顕著にみられた。これをより詳細に評価するために、10日目の糞便中のサルモネラ総量が106 CFU/gを超えるマウスと106 CFU/g未満のマウスのサブグループに分けて、感染データを再分析した（図7およびS17A-S17D）。前者のサブグループでは、S.TmhilDが強く選択された（p.i.30～40日目までにC.I.≈106）。一方、後者のサブグループでは、S.TmhilDは選択されなかった（C.I.≒1、p.i.1～40日目；S17C図、灰色丸）。この2つの異なるサブグループへの分裂は、（ストレプトマイシン前処置と比較して）高脂肪食シフトがCRに及ぼす影響が比較的穏やかであるため、腸内コロニー形成および腸症の程度に動物間のばらつきが大きい（これは上記（S6EおよびS6J図）および以前の研究[25]でも観察された）ことに根ざした、高い動物間ばらつきに関連している可能性がある。糞便中のサルモネラ菌の濃度が106 CFU/g未満の動物では、微生物叢はごくわずかしか撹乱されなかったと考えられる。すなわち、CRを部分的に緩和するには十分だが、腸管内腔の環境を整え、それによってS.TmhilDの選択を促進する微生物叢の能力を完全に緩和するには少なすぎた。驚くべきことに、このサブグループマウスでは、3日目から40日目までの糞便中リポカリン-2濃度≈102 ng/gによって示される有意なレベルの腸炎症にもかかわらず、S.TmhilDの選択は阻止された（図7およびS17D、グレーの記号）。これは図5のデータと一致しており、選択的な腸管内環境の条件付けに重要な微生物叢の一部が、そのサブグループマウスでは無傷のままであり、このことが炎症腸内でもhilD変異体の選択を防ぐことができることを示唆している。

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図7. 高脂肪食シフト後、hilD変異体の選択はストレプトマイシン前処理マウスに比べて減少した。
(A）実験スキーム。(B-D)CONXは、感染前日に通常の植物性飼料から高脂肪飼料に切り替えられ（そして通常の飼料に戻され）、野生型S.TyphimuriumとS.TmhilDの100:1混合飼料を投与された（オレンジ色のシンボル；5×107 CFU、経口投与；n = 17マウス 2回の独立実験）。対照として、ストレプトマイシン前処置マウスと同等のデータを示す（黒シンボル；図4Aから再プロット）。(B）選択プレーティングにより糞便中に検出されたサルモネラ総数。点線は検出限界を示す。色付きの線は中央値を結ぶ。(C)野生型S.TyphimuriumとS.TmhilDの選択的抗生物質を用いたマッコンキープレートを用いて測定した正規化C.I.。点線はC.I.が1であることを示す。 (D) 便中リポカリン-2のELISAを用いて2群間の腸内炎症を比較した。示されたデータは、両群の比較を含む2つの独立した実験から得られた。統計解析には両側Mann-Whitney U検定を用いた（p≧0.05有意ではない（ns）、p＜0.05（）、p＜0.01（）、p＜0.001（）、p＜0.0001（***））。ソースデータはS1データファイルにある。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.g007

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2番目の実験では、低複雑性微生物叢（LCMと呼ばれる）に関連するgnotobiotic C57BL/6マウスにおけるhilD欠損サルモネラ株とhilD欠損サルモネラ株の競合感染を解析した。LCMマウスは、8株からなる微生物叢コンソーシアムを保有し、中間レベルのCRを付与する。このモデルマウスに経口胃感染させると、野生型 S. Typhimurium は3～4日で増殖し、2～4日で顕著な腸症を引き起こす[4,46,47]。40日間にわたる病原性の淘汰（あるいは淘汰に対する）を評価するために、我々はssaV変異を持つ同系統の株ペアを使用した。LCMマウスにS.TmとS.TmhilDを100:1で混合して感染させたのは、感染初期に病原性株S.Tmが腸管内腔の炎症環境を整えるためであり、天然のサルモネラ集団で自然発生するhilD変異体の存在量が低いことに近似させるためである（S18図）。LCMマウスでは、最初の10日間にS.TmhilDが選択され、C.I.は100から≈102に上昇した（S18D図）。この期間は、≈102 ng/gの糞便リポカリン-2濃度によって示されるように、軽度の腸炎症と関連していた（S18E図）。重要なことに、S.Tm*hilDのC.I.は実験10日目から40日目にかけて10,000倍以上低下し（S18D図）、リポカリン-2濃度は、通常、障害のないマウスで観察される正常レベルに戻った。同時に、hilD欠損株の腸管内腔密度は非常に高いままであった（≒109 CFU/g糞；S18C図）。このように、LCMマウスの腸管内環境は、少なくとも実験の10日目から40日目にかけては、強毒株を強く選択した。

これらのデータを総合すると、腸内細菌叢は感染した腸内の環境を整えるために重要であり、中間のレベルのCRを与える微生物叢は野生型S. Typhimuriumの病原性を選択する傾向があるという仮説が支持される。

考察
我々は、腸内病原体の病原性進化における微生物叢の役割を解明するために、マウスを用いた野生型S. Typhimurium感染症の研究を行った。宿主内進化、微生物叢の移入、およびCRレベルの異なるマウスを用いた感染アッセイにより、腸内細菌叢が腸管内腔の環境を整える上で重要な役割を担っており、病原性の低下した変異体の選択に重要な影響を及ぼすことが明らかになった。腸内細菌叢が回復不能なほど消失または破壊された場合（図1、3、4、6、S16）、病原性を減弱させたhilD変異体が、特に炎症腸内において、親株である野生型に取って代わる。これにより病原性は低下する。回復期に微生物叢が回復すれば（図1、3、4、S18）、あるいは移植によって微生物叢が補充されれば（図3-5）、この現象は防がれる。全体として、hilD依存性病原性発現のコスト、腸内細菌叢を攪乱する役割、野生型S. Typhimuriumの宿主内進化を決定するhilD変異体に対する選択を阻止する微生物叢の役割の間のトレードオフが明らかになった。我々は、この腸内環境が、この腸内病原性細菌の進化と病原性の維持を選択した自然な生息環境を表しているのではないかと考えている。注目すべきことに、ほとんどの天然のサルモネラ分離株は、機能的なHilD-regulonを保持している[41,64]。従って、HilD-regulonの保持を選択したマウス感染モデルを用いることで、実験的アプローチを最適化し、病原体の自然生息環境に類似した条件を特定できる可能性がある。これらの条件は、病原体の脆弱性を発見するための実験場となりうる。病原性に有利な腸内環境をマイクロバイオータがどのように形成しているかを解明することは、病原性を促進することなくマイクロバイオームを回復させ、CRを回復させる治療法や予防法につながるかもしれない（S1本文の補足的考察B）。

炎症は、感染した腸内の環境を整える重要なパラメータである [4] 。炎症は病原体集団に2つの相互に関連した影響を及ぼす。1つは、野生型S. TyphimuriumよりもhilD変異体が選択されることである。腸内炎症がなければ、抗生物質で前処理したマウスの腸管内腔で、hilD変異株と同種の野生株は同等に増殖する（S11図）。もうひとつは、腸内炎症が微生物叢を崩壊させることで、病原体がより高い密度で長期間増殖することである。これは野生型S. Typhimuriumにも当てはまり、最初に[12]で発見され（ただしhilD変異体には気づかなかった）、今回の研究でも確認された。我々の新しいデータは、これがS.TmhilDにも当てはまることを示している（図1および4）。野生型S.Typhimurium感染の最初の数日間に腸疾患によって引き起こされる）復帰を超えた微生物叢の崩壊は、hilD変異体が優勢な病原体集団が（図1のように）長期間にわたって腸内に生息できる理由を説明している。微生物叢の破壊とhilD変異体への淘汰の両方が、炎症を起こした腸の腸管内腔の環境によって媒介され、微生物叢がhilD変異体への淘汰を止めるように炎症を起こした腸を調整することができるためである（図5）。

抗生物質で前処理されたマウスにおける野生型S. Typhimurium感染は、腸内感染における微生物叢の崩壊の極端なケースであり、病原体の宿主内進化にとって重要な2つの現象を明らかにするのに役立った： このような極端な条件下では、野生型病原体の腸症の重症度が高いため（図1、2、S5、S6）、病原性が減弱する方向に近視眼的に進化する可能性があり、減弱変異体が選択され、数週間から数ヵ月にわたって糞便中に大量に排出されることが示された（図1B、1D、1E、3B、3C）。このことは、S.Tm*感染マウスや本研究の実験的対照群における、腸内細菌叢の再生が病原性の低下への進化を止めたという、我々の以前の観察結果とは著しく異なっている[29]。第二に、ここで示したように、野生型病原体によって引き起こされた極端な条件下では、微生物叢を介したCRの病原性主導型緩和と、サルモネラの病原性維持に選択的な腸管内環境条件付けにおける微生物叢の重要な役割との間のトレードオフが明らかになる可能性がある。以前の研究 [12] と同様に、ストレプトマイシン前処置マウスにおいて野生型S. Typhimuriumによって誘発される顕著な腸症は、複雑な腸内細菌叢を有するマウスの長期的な腸内コロニー形成の前提条件である。従って、宿主の生存率が変わらない限り、病原性が高いほど感染力が高まり、野生型病原体による病原性の進化または維持が選択されるはずである。しかし、今回発表された新しいデータは、野生型S. Typhimuriumによる微生物叢の顕著な破壊（「beyond return」；図6とS13）が、弱毒化変異体の選択につながることを示している（図1、4、S5、S6、S8、S12）。これらのデータを総合すると、病原性が引き金となる微生物叢の抑制と、微生物叢の病原性選択効果との間にトレードオフがあることがわかる。言い換えれば、サルモネラ菌群における病原性の維持を考える場合、「より多くの炎症」が必ずしも「より良い」とは限らないということである。微生物叢が病原性の選択を促進し、病原体における病原性喪失のための近視眼的進化を偶然にも防止する上で重要な役割を果たすことは、野生型S. Typhimuriumを40日または70日間感染させた後の微生物叢移植実験（図3および4）、および感染4日目にマウスを同居させた移植実験（図5）によって最もよく示されている。腸内細菌叢が病原性の維持に果たす役割については、中間レベルのCRを持つマウスにおけるhilD変異体の腸内コロニー形成不全からも、さらなる裏付けが得られている（図2およびS6）。食物が介在する一過性のCR障害、中間レベルのCRを付与する微生物叢、そして顕著な腸疾患と微生物叢の移行が組み合わさった宿主では、病原体は病原性誘発性炎症を悪用して微生物叢を（部分的に）抑制し、病原性を減弱させた変異体を選択することなく、サルモネラの増殖を促進することができる。これによって伝播が促進され、野生型病原体のフィットネスが向上するという仮説を立てた [65]。一方、宿主集団内での伝播の際には、サルモネラの病原性の選択にさらなる要因が作用する。例えば、宿主間の伝播ボトルネックにより、次の宿主に腸炎を引き起こすことのできる病原性S.Tm細胞が選択される [52,66]。宿主内進化実験から得られた結果は、この概念にもう1つの層を導入するものであると我々は考えている。すなわち、乱れのない、あるいは再成長する微生物叢は、弱毒化した変異体に対して選択的であり、その結果、糞便中に排出され、新たな宿主に感染しうる野生型病原体細胞の総数が増加する。このプロセスは、最終的に自然界における病原性S.Tm集団の疫学的適合性を高めることになる [67]。したがって、微生物叢によって促進される病原性の宿主内選択は、集団内での病原性の進化に寄与する可能性がある。しかし、病原体が宿主集団全体に広がる可能性（進化的なタイムスケールでのフィットネス）を定量的に評価するためには、さらにデータを得る必要がある。

hilD変異体の淘汰を防ぐ上で腸内細菌叢が重要な役割を果たしていることは、無菌マウスから得られた新しいデータによってさらに裏付けられた。抗生物質で前処理したCONXマウスやCONEマウスを使った我々の以前の研究とは対照的に、S.TmhilDは無菌マウスではhilD欠損株（つまりS.Tm）よりも選択された（図4、緑色のシンボル）。さらに、変異型が優勢なサルモネラ集団は、何週間にもわたって高密度に維持され、排出された。我々のデータから、ストレプトマイシン前処理のCONXマウスとのこの顕著な違いは、S.Tmが複雑な腸内細菌叢を復帰以上に破壊しないことにあり（図6およびS13）、これは野生型S.Typhimuriumと比較してS.Tmによって惹起される腸症の程度が低いことに起因することが示唆された（S2図）。このようなS.Tmの病原性の低下は、以前の研究でもよく報告されている[20,23]。これらの観察結果は、病原性が引き金となる微生物叢の抑制と、微生物叢の病原性選択効果とのトレードオフをさらに裏付けるものである。複雑な微生物叢（および抗生物質治療や食事シフトなどによる一過性の緩和）に直面すると、中等度腸症は減弱変異体の一過性の出現を伴うこともある。しかし、微生物叢の主要メンバーが病気を生き延びたため、これらの変異体は後に再生する微生物叢によって置き換えられる（図1、4、6のS.Tmデータを参照）。

抗生物質前処理マウスモデルと、HilD-regulon変異体を選択するその傾向から、他に何がわかるだろうか？これまでの一連の研究から、このモデルは炎症を引き起こすメカニズムを解明し[68-71]、本格的な炎症下でのサルモネラの増殖について研究し[12,31,32]、HilD-regulonの発現がなぜ微生物叢の激しい擾乱時に大きなコストとなるのかを評価する[29,38,52]ための、極端ではあるが非常に有益なモデルであることが示されている。これらのコストは、抗生物質と野生型S. Typhimurium感染の複合作用によって宿主の微生物叢が破壊された時や、衛生的隔離によって微生物叢の移動が禁止された時に、HilD-regulon欠損変異体がサルモネラ集団で優勢になる理由を説明する（図1および4）。変異のスペクトルは、天然のSalmonella Enterica分離株のゲノム配列で観察されたものと驚くほど類似している[41]。このことは、抗生物質で前処理されたマウスモデルが、HilD-regulon変異体を選択する環境を特徴とする、（小規模で特徴づけが不十分ではあるが）明確な自然ニッチを代表するものであることを示唆している。大部分の宿主では、微生物叢は強いCR（コロニー形成を阻止し、病原性を低下させる方向に進化する）か、あるいは中間レベルのCRを付与し、無傷のHilD-regulonを選択する[41]。抗生物質と野生型S. Typhimurium感染による顕著な微生物叢の破壊の後でも、微生物叢の移行は、hilD変異体に対する選択（図5）、あるいは変異体優位の病原体集団による腸内コロニー形成を終結させることができる（図3および4）。このような微生物叢の移動は、ほとんどの自然感染で起こるはずである。このことは、Joshua Cherry [41]によって観察された、病原性の低下した変異体を選択する自然ニッチの性質についての疑問を提起する。これまでのところ、このニッチは特定されていない。我々のデータは、成熟した複雑な微生物叢が極端に破壊され（例えば、食物、抗生物質、および／または大規模な炎症によって）、厳格な衛生対策によって微生物叢の移行へのアクセスが制限されるというまれな事例が、これらの事例の一部を説明する可能性があることを示唆している。乳児のマウス感染モデル [72] （野生型S. Typhimuriumよりも鞭毛虫変異体が選択されることが知られている） [73] から得られた証拠は、乳児の腸内細菌叢が提供する不完全なCRが病原性を低下させた変異体を選択する可能性も示している。しかし、これらのニッチとの関連性を立証したり、サルモネラの病原性低下を選択する、より関連性の高いニッチを同定したりするには、さらなる研究が必要である。

腸疾患は腸内細菌叢にどのような影響を及ぼすのか？興味深いことに、腸症の程度が微生物叢の変化を決定するようである（図6およびS13）。S.Tm*と比較して、野生型S.Typhimuriumによって誘発される顕著な腸症は、腸管内腔への好中球の動員、上皮障害の悪化、腸管内腔の代謝産物レベルの変化、および腸管微小環境の空間的構成の変化を伴う（S2およびS14図）。これまでの研究で、ストレプトマイシン前処置マウスにおいて野生型S. Typhimuriumによって誘発される腸症は、腸内細菌叢の再成長を妨げるだけでなく、p.i.1〜2日目に特に強い殺菌効果を示すことが立証されている[48,49]。[48,49]、感染2日目には炎症に適応した病原体の腸管内負荷量を10～10,000分の1に減少させるのに十分なほど強力であり、その前に宿主能力（盲腸内容物または糞便中の≈109 CFU/g）まで再生することができる。これらの観察から、野生型S. Typhimurium感染マウスでは、1～2日目が、微生物叢が復帰を越えて破壊されるのに最も重要であることが示唆される。我々は、IFN-γレベルの上昇によって示される組織破壊的炎症が、陰窩、パイエル板、粘液関連群集のような腸粘膜の微生物叢保存ニッチを破壊するかもしれないという仮説を立てた[74]。我々の実験は、糞便中の微生物叢組成の縦断的サンプリングに限られており、空間的構成の微妙な違いを評価するものではなかった。サンプリング手法の違いにより、組織関連細菌が過小評価される可能性が示唆された [75]。これらのニッチにおける関連する微生物叢のメンバーや、それらの長期的な抑制や再増殖を促進する根本的な分子機構をさらに解析することで、特定の微生物叢菌株の特定の機能についての理解が深まり、例えば感染症に関連する素因を軽減したり、IBDのような自己炎症性後遺症を緩和したりするための生物治療薬として興味を引く可能性がある（S1本文の補足的考察Cを参照）。さらに、腸内細菌によるコロニー形成を逆転させるために腸内環境を整える（プロバイオティクスとして使用する）、異なる微生物叢メンバーの特異的な競合効果を強調することもできる。しかし、サルモネラ菌の病原性を偶然選択するような微生物叢のメンバーを避けるように注意しなければならない。

宿主との関係や環境的背景に依存して、微生物共生体が相互主義から寄生や病原性へ、あるいはその逆へと進化することが、複数の研究で報告されている（総説は[7,9]）。真菌病原体C. albicansに関する以前の研究では、菌糸の病原性が損なわれた変異体の選択において、微生物叢が重要な役割を果たすことが立証されていた [10,11,76-78]。ここで我々は、野生型腸内病原細菌の病原性維持における微生物叢の役割を実証した。C.albicansのデータとは対照的に、我々の研究は、野生型S.Typhimuriumの病原性が微生物叢と二重の関係にあり、その結果、病原性が介在する微生物叢の破壊とサルモネラの病原性維持における微生物叢の役割とがトレードオフの関係にあることを立証した。C. rodentium、V. cholerae、C. difficileのような他の多くの腸内病原菌は、S. Typhimuriumと同様に、病原性を介した宿主の搾取を感染拡大の戦略として用いていることから、微生物叢がこのような細菌病原菌の病原性維持に同様の役割を果たしている可能性が示唆される[12-16]。これは実験的な枠組みを提供すると同時に、微生物叢が複数の腸内病原体における病原性の進化動態にどのような影響を及ぼすのか、その役割とメカニズムを理解するための大きな研究分野を開くものである。

材料と方法
倫理規定
すべてのマウス実験は法的要件に従って行われ、担当当局（Tierversuchskommission, Kantonales Veterinäramt Zürich, ライセンス承認番号： ZH158/2019、ZH108/2022、ZH109/2022）。サンプルサイズはあらかじめ決めておらず、マウスは治療群にランダムに割り付けられた。共同飼育実験では、メスマウスを主に使用した。その他の実験では、雌雄ともに8～12週齢のマウスを用いた。

細菌株と増殖条件
すべての実験において、Salmonella Typhimurium SL1344（SB300、SmR）または指示された変異型を使用した（表1に要約）。P22 HT105/1 int-201 ファージ導入 [79]を用いて、所望の遺伝子コンストラクトを適切なバックグラウンド株に導入した。必要に応じて、pCP20にコードされた熱誘導性FLPリコンビナーゼを用いて、抗生物質耐性カセットを除去した[80]。インビボでのマウス感染のために、細菌を、適切な抗生物質（50μg/mlストレプトマイシン（AppliChem）；15μg/mlクロラムフェニコール（AppliChem）；50μg/mlカナマイシン（AppliChem）；100μg/mlアンピシリン（AppliChem））を含むリゾゲニーブロス（LB）培地で37℃で12時間増殖させ、抗生物質を含まない1：20LBで4時間サブカルチャーした。細胞を洗浄し、冷PBS（BioConcept）に再懸濁した。

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表1. 本研究で使用した株。
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感染実験
感染実験は、S.Tm経口感染モデルマウスのストレプトマイシン前処理に由来するプロトコールに従った[19]。実験は8～12週齢の雄または雌マウスで行った。研究全体を通して、CRの異なるマウスモデルを使用した。無菌（GF）マウスは CR を持たない [83]。LCM[46]マウスおよびOligo-MM12[57]マウスは、それぞれ8種および12種の代表的な微生物叢によって安定的にコロニー形成された元GFマウスである。これらは中間的なCRを与える。特定病原体フリー129/SvEvマウス（CONX）およびC57BL/6（CONE）は、抗生物質で前処理しない限り、完全なCR [4]を特徴とし、129/SvEvマウスは機能的なNramp1対立遺伝子（Slc11a1としても知られる）を持つため、4日以上のS.Tm感染に使用された。これはNramp1対立遺伝子（Slc11a1とも呼ばれる）が機能しているためで、全身性のS.Tm病に対する抵抗性があり、長期間の感染が可能である[44,84]。すべての感染実験において、接種菌は以下のように調製した。ストレプトマイシンを添加したLBで一晩培養したS.Tmを、抗生物質無添加のLBで4時間（1:20希釈）継代培養した。亜培養株をPBSで洗浄し、マウスに約5×107 CFUのS.Tmを経口投与した。糞便は、1mlのPBSを含むあらかじめ秤量したチューブに回収し、TissueLyser（Qiagen社製）を用いてスチールボールを用いて25Hzで2分間ホモジナイズした。マウスは図の説明で示した時点で安楽死させた。臓器は無菌的に採取し、クロスコンタミネーションを最小限に抑えるため、臓器採取の合間に解剖器具をエタノールで消毒した。腸間膜リンパ節（mLN）、脾臓、肝臓、胆のう、腎臓、肺、脳、心臓、および胃については、臓器ごとに報告する。約100μlの血液を安楽死直後に心臓から吸引し、2%BSAおよび1mM EDTAを含むPBS中に回収した。すべての臓器をPBS中で、スチールボールを用いて30 Hzで3分間ホモジナイズした。

ストレプトマイシン前処置マウスにおける単独感染
マウスに20mgのストレプトマイシンを経口投与し、24時間後に約5×107 CFU S.Tmを経口投与した。

競合感染
マウスに20 mgのストレプトマイシンを経口投与し、24時間後に染色体に異なる抗生物質耐性マーカーを付与した競合株の混合接種株（総接種株数約5 ×107 CFU S.Tm）を経口投与により感染させた。競合株は個々に増殖・継代培養し、PBS で洗浄した後、結合させた。競合指数は2株間の比率として算出し、接種株中の比率で正規化した（選択プレーティングにより確認）。

洋食に切り替えたマウスへの単独感染
マウスを維持食(Kliba Nafag, 3537; オートクレーブ滅菌; 体重あたり: 4.5%脂肪, 18.5%タンパク質, 35.7%炭水化物, 0%繊維)から洋食(BioServ, S3282; 60%kcal脂肪; 放射線照射) [25] に切り替えた。 5%脂肪、18.5%蛋白質、約50%炭水化物、4.5%繊維）、24時間後にマウスを維持食に戻し、経口経口投与により約5×107 CFU S.Tmを接種した。ケージ内の残留飼料への摂食と微生物叢の持ち越しを制限するため、飼料切り替えの間にケージを交換した。

糞便感染実験
S.Tmを投与したマウスの糞便懸濁液は、使用するまで-80℃で20%グリセロール/LBに保存した（S6図）。細胞を遠心分離し、PBSで2回洗浄した後、24時間前に20mgのストレプトマイシンで前処理したマウスに合計約5×107 CFUを導入した。

糞便感染実験
S.Tmを投与したマウスの糞便ペレットを3日目のp.i.に回収し、1mlのPBSに懸濁した（S5図）。この懸濁液から100μlを次のマウスに経口投与した。

共同飼育実験
同居させるS.Tmに感染させた雌マウスを、同居させる時点で新鮮な個別のケージ（1例では2匹1ケージ）に分けた。マウスは無作為に同居群に割り付けられた（または元のケージに残された）。同居ドナーとなる雌マウスをケージに加えた（1ケージにつき1匹）。ケージに加えたマウスは、未処置のCONXマウス（ケージに加える前に摂動なし）またはS.TmSPI-2に40日間感染させたマウスのいずれかであった。

微生物群の経口摂取実験
無菌マウスまたはストレプトマイシン前処置CONXマウスに、代表的な微生物菌株のカクテル（凍結グリセロールストック；[85,86]）を経口胃から経口投与した。Oligo-M12株は、嫌気性Akkermansia培地（AAM；18.5g/l brain heart infusion (BHI)、5g/l yeast extract、15g/l trypticase soy broth、2.5g/l K2HPO4、1mg/l haemin、0.5g/l glucose、0.4g/l Na2CO3、0.5g/l cysteine hydrochloride、5mg/l menadione、3% complement-inactivated fetal calf serum）で嫌気的に増殖させた。培養の正常増殖は、OD測定と16S PCRで確認した。DSMZ（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH）の菌株は、活性培養（DSMZの培養条件に従ってそれぞれの培地で培養）として注文し、グリセロールストックを嫌気的に調製した。

免疫蛍光
マウスの頭蓋組織切片を4％パラホルムアルデヒドで固定し、20％スクロースを含むPBSで飽和させ、最適切断温度コンパウンド（OCT; Sakura USA）でスナップ凍結した。サンプルはさらに分析するまで-80℃で保存した。染色するサンプルは10μmの断面に切り出し、スライドグラス（Superfrost++, Thermo Scientific）にマウントした。染色するために、スライドガラス上の凍結切片を風乾し、PBSで再水和し、PBS中の0.5％TritonX-100溶液を用いて透過処理した。一次抗体および二次抗体で染色する前に、切片を10%正常ヤギ血清（NGS）/PBSでブロックした。異なるサンプルの染色には、以下の抗体と希釈液を使用した： 1:200 EpCam/CD326 (clone G8.8、Biolegend)、1:200 α-S.Tm LPS (O-antigen group B factor 4-5、Difco)、1:200 α-Ki67 (ab15580, Abcam Biochemicals)、または1:200 α-Ly6B.2 (clone 7/4、BioRad)を、それぞれの二次抗体、すなわち、α-ウサギ-アレキサンドリア抗体と組み合わせて、異なるサンプルの染色に使用した、 α-ウサギ-AlexaFluor488（Abcam Biochemicals）、α-ラット-Cy3（Jackson）、蛍光プローブ、すなわちCruzFluor488標識ファロイジン（Santa Cruz Biotechnology）、AlexaFluor647標識ファロイジン（Molecular Probes）、および/またはDAPI（Sigma Aldrich）と組み合わせた。染色した切片は、Mowiol（VWR International AG）を用いてガラススリップで覆い、室温（RT）で一晩暗所に置いた。共焦点顕微鏡イメージングには、10～100倍の対物レンズを備えたZeiss Axiovert 200 m顕微鏡、または10～100倍の対物レンズを備えたスピニングディスク共焦点レーシングユニット（Visitron）を用いた。手作業による定量は、同じマウスの2つの異なる切片（1切片あたり3～5領域）を用いて、指示されたパラメーターに従って盲検で行った。63×視野あたりの好中球数は、上皮の半分が上皮に近い内腔を含み、移行したばかりの好中球を含む上皮上でカウントした。

qRT-PCR
頭蓋組織切片は、PBSで十分に洗浄した後、RNAlater溶液（Thermo Fisher Scientific）でスナップ凍結し、下流の分析まで-80℃で保存した。全RNAはRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて抽出し、RT2 HT First Strand cDNA Kit（Qiagen）を用いてcDNAに変換した。qPCRはFastStart Universal SYBR Green Master試薬（Roche）を用いて行い、Ct値はQuantStudio 7 Flex FStepOne Plus Cyclerで記録した。使用したプライマーは、Cxcl9, il1a, Ccl2, Adgre1 (F4/80)用のバリデーション済みのプライマーアッセイとしてQiagenから入手したものか、NCBIプライマーデザインツールを用いてデザインしたものである（表2参照）。mRNA発現レベルは相対遺伝子発現（2-ΔΔCt）としてプロットし、比較は図のキャプションに明記した。

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表2. リアルタイムqRT-PCRに使用したプライマー配列。
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リポカリン-2 ELISA
リポカリン-2 ELISA（R & D Systems社製）は、製造元の指示に従って糞便を用いて実施した。糞便ペレットをPBSに懸濁し、1:20、1:400、または原液で希釈し、GraphPad Prism version 7の4-Parametric Logistic Regressionを用いたカーブフィッティングにより濃度を決定した。

コロニープロテインブロット
SipC（TTSS-1発現のプロキシとして）のコロニータンパク質ブロットを用いて、糞便中でSipCを発現できるクローンの割合を定量した。詳しいプロトコールは[50]を参照。希釈した糞便懸濁液からMacConkey寒天培地上のコロニーをニトロセルロース膜にレプリカ移し、抗生物質無添加のLB寒天培地に表向きに置き、37℃で一晩培養した。元のマッコンキープレートも再インキュベートした後、4℃で保存した。コロニーを溶解し、細胞物質をメンブレンにハイブリダイズさせるために、バッファーに浸した一連のWhatmanフィルターペーパーを使用した。浸したWhatmanフィルターペーパーを入れたペトリ皿に、以下の条件でメンブレンを置いた： 10%SDSで10分、変性液（0.5M NaOH、1.5M NaCl）で10分、中和液（1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl（pH7.4））で5分×2回、2×SSC（3M NaCl、0.3M クエン酸ナトリウム（pH7））で15分。TBS洗浄（10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl (pH 7.4)）を行い、折り畳んだワットマン紙でメンブレン表面を穏やかにこすり、余分な細胞残屑を除去した。3%BSAを含むTBSを用い、膜を1時間RTでブロックした。Virotech Diagnostics GmbHから提供された抗SipCウサギ抗体（参照番号：VT110712）の1:4,000希釈液を含むブロッキング溶液5ml（メンブレンあたり）を用いて、湿潤チャンバー内で4℃、ロッキングプラットフォーム上で一晩インキュベートし、メンブレンを染色した。TBS-T（20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.2% Triton X-100 (pH 7.5)）で1回、TBSで2回洗浄し、非特異的結合を除去した。次に、膜を二次抗体（HRP結合ヤギ抗ウサギIgGの1:2500希釈；シグマ；カタログ番号A0545-1ML；5mlブロッキング溶液）と共に、ロッキングプラットフォーム上でRT、2～4時間インキュベートした。TBSでさらに洗浄（3×）した後、メンブレン1枚につき5mlの基質を加えた：4-クロロ-1-ナフトール（シグマ社製）30mg錠をメタノール10mlに溶解し、TBS50ml中でH2O2（0.06% w/v）と混合したもの。所望の強度が観察されたら、反応をdH2Oで停止した。

検出可能なSipC特異的シグナルのないクローンは、コロニーブロットアッセイデータを元のマッコンキー寒天培地プレート上のコロニーパターンと比較することにより同定した。目的の単離株を元のマッコンキープレートに合わせ、それらのプレートから摘出し、ストレプトマイシンを含むLBに接種した。分離株はその後、全ゲノム細菌配列決定が行われるまで、-80℃で20％グリセロール/LBに保存された。

このアッセイは、sipC発現に必要な遺伝子（hilDを含む）に遺伝的欠損を持つクローンを同定するのに適していることに留意すべきである。しかしながら、シグナル対ノイズ比が非常に小さい場合があるため、偽陰性（false-negative）、つまり、原理的にはプレート上でSipCを発現できるが、所定のアッセイで十分なシグナルが得られないクローンがわずかに存在する可能性がある。野生型S. Typhimuriumの全クローンのうち、SipCを発現せず、hilD遺伝子が機能している18%のクローンのサブグループに、このようなケースがあるかもしれない（図1E参照）。結論として、コロニーブロットアッセイは病原性が低下した変異体の宿主内進化をモニターするのに有用である。しかし、フィットネス効果を確認するためには、同系株を用いた競合感染アッセイを行う必要がある。

全ゲノム配列決定
20%グリセロール/LBで-80℃に保存したクローンを、ストレプトマイシンを添加したLBで再成長させた。ゲノムDNAはQIAamp DNA Mini Kit（Qiagen）を用いて抽出した。Functional Genomics Centre ZurichまたはNovogene（Cambridge）がIllumina MiSeqシークエンシングを行い、ゲノム全体で少なくとも50×カバレッジの150 bpペアエンドリードを作成した。解析はCLC Genomics Workbenchバージョン11、12、20を用いて行った。ペアエンドリードはSL1344染色体リファレンス（NCBIアクセッションFQ312003.1）にマッピングした。基本的なバリアント検出は、リードの最低70%で発生するバリアントを検出し、アミノ酸変化を検出するために行った。S1-S6表には、祖先株（SL1344およびSL1344ssaV）には存在しなかったコード配列の非同義変異の要約が記載されている。S6表は、祖先株で検出された変異を含む。

16S rRNA配列決定を用いた腸内細菌叢コミュニティ解析
マウスから糞便ペレットを採取し、直ちに-20℃で保存した。AllPrep DNA/RNA Mini Kit（Qiaqen社製）を用い、ホモジナイズと菌膜破壊のためのプロトコルを修正した上で、糞便ペレットからゲノムDNAを抽出した。TissueLyser（Qiagen）を用いて、約600mlのRLTバッファーと2個の3mm金属ビーズを用い、25Hzで3分間ビーズビートを行った。短時間の遠心後、細菌を含む上清を0.9 mgの0.1 mmジルコニアビーズ（OPS Diagnostics社製）を含むチューブに移し、ホモジナイズした（30 Hz、3分間で2回、各ホモジナイズの間に5分間のインキュベーション）。その後、全速力で3分間遠心し、細胞残渣をペレット化した後、サンプルをDNA結合カラムに移した。上清をDNA結合カラムにロードし、100μlの溶出バッファー（EB）でDNAを溶出した。例外的に、4 サンプル（S.Tm; 160 日目; マウス 1-4）については、技術的な理由により、PBS に懸濁した糞便サンプルから DNA を抽出した。

ゲノムDNAの濃度はQubit測定により決定し、5 ngのDNAを入力として、[87]の2段階PCR法を用いて配列決定ライブラリーを作成した。遺伝子座特異的変性プライマー515f（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）および806r（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）を用いて、16S rRNA遺伝子のV4領域を増幅した。最初のPCRは、Q5 High-Fidelity DNA polymerase（BioConcept, New England BioLabs）を用い、以下の条件で行った： 98℃で30秒の初期変性、98℃で10秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、72℃で30秒の伸長。最初の変性後のステップを15回繰り返した後、最後の伸長ステップを72℃で2分間行い、その後温度を4℃に一定に保った。最初のPCRステップの後、0.8×反応容量のCleanNGS磁気ビーズ（LABGENE SCIENTIFIC SA）を用いてPCR産物を精製し、13μlのEBで溶出した。清浄化されたPCR産物は、最初のPCR工程と同じ条件で2回目のPCR工程の入力として使用されたが、15サイクルの代わりに20サイクルが実行された。このステップの間に、多重化を可能にするために、各サンプルにユニークなデュアルインデックスバーコードが付加された。最終PCR産物（約450 bp）の量と質はフラグメントアナライザー（Advanced Analytical）を用いて評価した。最終ライブラリーは、標的断片を表すフラグメントアナライザーのピークの濃度に応じて等モルにプールされた。最終ライブラリーは、Genome Engineering and Measurement Lab（GEML、チューリッヒ）のMiSeqプラットフォームでペアエンドリードシーケンスを用いて配列決定した。アンプリコンの長さは300bpであった。246サンプル（中央値＝64,486）から得られた合計34,412,752シーケンスリードが、dada2 [88]を用いたASV推論の入力となった。プライマー配列はcutadapt [87]を用いて除去し、両方のプライマーを含み、少なくとも75塩基の挿入配列のみを下流の解析に使用した。次に、dada2パッケージのfilterAndTrim関数（maxEE = 2, truncQ = 3, trimRight = (40, 40)）を使用して、リードを品質フィルターした。learnErrors関数とdada関数を使用して、pool = pseudoをパラメータとしてサンプル推論を計算した。mergePairs関数を用いてリードをマージし、removeBimeraDenovo関数（method = pooled）を用いてバイメラを除去した。残ったASVは、IDTAXA分類器[89]とSilva v138データベース[90]を組み合わせて分類学的アノテーションを行った。最終的な表（陰性対照と陽性対照を除いたもの）には、1,081個のASVが含まれていました。個々のライブラリーサイズは18,634～140,867で、中央値は45,669でした。すべてのサンプルを18,634リードの均等な深さに希釈しました。異なる条件下で差次的に濃縮されたASVをS7-S10表に示す。

統計解析
マウス実験では、GraphPad Prism 8 for Windowsを用いてノンパラメトリック統計検定を行った。16Sアンプリコンシーケンスの解析はRバージョン4.1.0で行った[91]。主なα多様性指標として多様性のシャノン指数を計算し、2標本ウィルコクソン順位和検定でサンプル群間の多様性の差を統計的に検定した。存在量の平方根変換後のBray-Curtis非類似度に基づくパーミュテーショナルMANOVAは、異なるマウス群の微生物群集間の差異を推論するために使用した。個々のASVの濃縮度は、DESeq2パッケージ（バージョン1.28.1）を用いて、apeglm法 [92]を用いてlog2倍変化を縮めた差分存在量検定を用いて推論した。

サポート情報
S1データ。 7B-7D、S2A-S2C、S2E、S3A、S3C、S3D、S4A-S4C、S5A、S5C、S6B-S6K、S7A、S7B、S7D、S8A、S9A、S9B、S11B、S11C、S12B-S12D、S13A-S13H、S14A、S14B、S15B、S16B、S17A-S17D、S18B-S18E。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s001

(XLSX)

S1テキスト。補足的な議論A、B、Cは、原稿本文で議論された論点を拡張し、関連するトピックに関する視点をより包括的にまとめたものである。

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S1 図：HilDレギュロン発現のシグナル、利益、コスト。

(A）HilDレギュロン（中央）は複雑な構造を持ち（詳細は[34,35]を参照）、様々な環境シグナルに対する応答を計算する。これらのシグナルの多くは、微生物叢や宿主に由来するか、あるいは宿主によって制御されている。これらのシグナルは、S. Typhimuriumの病原性因子の発現を制御するための環境的な手がかりを提供し、感染サイクルの中でそれぞれの病原性因子が必要とされる瞬間にのみ関連コストが発生するように、成長と生存を保証する生理学的適応を行う。HilD制御因子は、そのコストのかかる発現を腸管内腔に限定し、粘膜浸潤後には発現を停止する［36］。さらに、HilDレギュロンは、病原体集団のサブセットのみがhilDを発現する（双安定発現）ようにすることで、病原性発現のこれらのコストを腸管内腔のS. Typhimurium細胞のサブ集団に制限している［28,29］。従って、微生物叢が著しく破壊された宿主では、HilD制御系の主な機能は、TTSS-1、鞭毛、および／またはSii-接着剤依存性の粘膜侵入による腸炎症の引き金に関連するコストを最小化することにあるようである。この宿主反応は、腸管内腔における病原体のブルームを促進し、それによって感染を促進する。これらのコストの正確な分子的性質については、まだ解明されていない。抗生物質で前処理されたマウスでは、これらのコストは、生体外で観察される成長速度の低下 [37]、組織侵入後に遭遇する自然宿主防御による死 [28,93]、SCFAを介した成長制限に対する感受性の変化 [62,94]、あるいはエネルギーレベルの低下と外膜破壊に対するレギュロン発現細胞の感受性の増加 [95]を伴う。HilDレギュロン [96]によって制御される遺伝子や表現型の数が非常に多いことが、その発現コストの原因を解明する上での障害となってきた。ここで紹介する我々の研究は、腸内環境を整えることによって腸内細菌叢が重要な役割を果たしていることを示唆しており、それによってHilDレギュロンの出力の相対的なコストとベネフィットに影響を与えている。このことは、中間のCRを持つマウスが、無傷のHilD-regulonを保持するS. Typhimuriumクローンを選択する傾向がある理由を説明する。(B）本研究で使用した主要サルモネラ菌株のHilD-regulon発現表現型。インタクトなHilDレギュロンを有する菌株由来のコロニーは、プレート上でコロニーとして増殖する際、低レベルの病原性因子を発現することに注意すべきである。したがって、これらのコロニーはTTSS-1トランスロコンとエフェクタータンパク質SipCを分泌するため、コロニータンパク質ブロットアッセイでウエスタンブロット陽性シグナルを示す[29,50]。

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S2 図：ストレプトマイシン前処理したS.Tm-またはS.Tm*-感染CONEまたはCONXマウスにおける腸内炎症の解析と比較。

ストレプトマイシン前処理のC57BL/6（CONE）に、野生型S.Typhimurium（ピンク；n = 15、n = 9はp.i.1日目に安楽死させ、n = 6はp.i.4日目に安楽死させた；5回の独立実験）またはS. Tm*（ピンク；n＝16、n＝9を1日目p.i.で安楽死させ、n＝7を4日目p.i.で安楽死させた；5回の独立した実験）またはS.TmAvir（紫；n＝13、n＝7を1日目p.i.で安楽死させ、n＝6を4日目p.i.で安楽死させた、 n=6、p.i.4日目に安楽死、4回の独立実験）、総CFUは5×107であった。注目すべきは、すべての接種液が、炎症のタイプのレポーターとして、S.TmAvir（tsr-対tsr+）の2.5×106 CFU（1:20）を含んでいたことである[97]。(A)S.Tm（n=15匹解析）、S.Tm*（n=16匹解析）、S.TmAvir（n=9匹解析）の糞便集団は、1日目または4日目のp.i.に選択的プレーティングにより決定した。 C）p.i.4日目におけるS.Tm（n＝6匹解析）対S.Tm*（n＝6匹解析）の脾臓数（D）p.i.1日目または4日目にS.TmまたはS.Tmに感染させたマウスのヘマトキシリン・エオジン（HE）染色した糞便組織切片の代表画像。S.E.＝粘膜下浮腫。黒矢印は粘膜上部の崩壊を示す。スケールバー＝100μm。(E）パネルDの切片の病理組織学的スコアリング（S.Tmは1日目n=6、4日目p.i.はn=6；S.Tmは1日目n=6、4日目p.i.はn=5）。(F）野生型S.Typhimurium（S.Tm:S.TmhilD、1,000:1比）またはS.Tm*（S.Tm*:S.TmhilD、1,000:1比）に4日間感染させたストレプトマイシン前処置129/SvEv（CONX）マウスのHE染色盲腸組織切片（異なる3匹のマウスから）の代表的画像；Lu.＝内腔。S.E.=粘膜下浮腫。黒矢印は上部粘膜の崩壊を示す。スケールバー＝100μm。点線は検出限界を示す。線は中央値を示す。S.TmとS.Tmの比較には両側Mann-Whitney U検定を用いた（p > 0.05 not significant (ns), p < 0.05 (), p < 0.01 (), p < 0.001 (), p < 0.0001 (*)）。ソースデータはS1データファイルにある。解釈 このモデルで予想されたように、S.TmとS.Tmの両方が4日間、これらのマウスを収容力までコロニー形成し、S.TmはS.Tmよりも高い全身臓器負荷を達成した。一方、S.Tm感染マウスは、4日目のp.i.において、陰窩の過形成、杯細胞を含む粘液の回復、上皮細胞の排出の減少により、粘膜炎症からの上皮回復の徴候を示した。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s004

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S3 図. 野生型S. TyphimuriumまたはS. S. Typhimuriumを感染させたCONXマウスの全身臓器における腸の炎症とサルモネラ病原体負荷の追加解析。

TyphimuriumまたはS.Tm*（図1A-1Dの動物）に感染させたCONXマウスの全身臓器における腸炎とサルモネラ病原体負荷量の追加解析。(A)野生型S.Typhimurium（ピンク；n = 7匹で解析）またはS.Tm*（黒；n = 7匹で解析）に70日間感染させたマウスの盲腸組織における炎症性遺伝子発現のRTqPCR解析。結果は、S.Tmに感染させたマウスの平均値に対する倍率でプロットした。核（青；DAPI）、好中球（赤；Ly6B.2）およびアクチン（白；ファロイジン）を染色した。Lu.＝内腔。白矢印は好中球を示す。スケールバー＝50μm。HPF；高視野。(C）糞便切片における好中球の定量。各データポイントはマウス1匹につき5視野（FOV）の平均値である（各群n = 7匹）。線は中央値を示す。(D) 70日目に安楽死させたマウス（両群ともn = 7）の野生型S.Typhimurium（n = 7）またはS.Tm（n = 7）によるサルモネラ臓器負荷量。mLN = 腸間膜リンパ節。血液は CFU per ml で報告。線は中央値を示す。野生型S.Typhimurium感染群とS.Tm感染群とのデータ比較には、両側Mann-Whitney U検定を用いた（p≧0.05有意ではない（ns）、p＜0.05（）、p＜0.01（）、p＜0.001（*））。これらのデータは、自然免疫と適応免疫が、70日目のp.i.までに両菌株による感染をほぼ同等に制御していることを示している。

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S4 図1Dのコロニータンパク質ブロットデータのさらなる解析。

(A）SipCが検出されたコロニーが得られたサルモネラ糞便集団の分画。(B）SipCが検出されなかったコロニーを生じたサルモネラ菌集団の総数の推定値。(C）SipCが検出されたコロニーが得られたサルモネラ菌集団の総数の推定値。(A-C）黒い点線は保守的検出限界を示す。色のついた線は中央値を示す。透明なピンクの点（p.i.20日以上）は、SipCが検出されなかったクローンが95％を超えるマウスが大多数であるため、それぞれのサルモネラ菌集団の絶対サイズの計算があまり信頼できないことを示している。野生型S.TyphimuriumとS.Tm感染群の比較には両側Mann-Whitney U検定を用いた（p ≥ 0.05 not significant (ns), p < 0.01 (), p < 0.001 (), p < 0.0001 (*)）。解釈 最初の20日間、S.Tm感染マウスは野生型S.Typhimurium感染マウスよりもSipCを発現できる病原体細胞を糞便中に排出した（S4C Fig; 9.5 × 108 CFU/g糞便/日 vs 6.5 × 108 CFU/g糞便/日、20日間の平均）。野生型S.Typhimuriumに感染して20日後、SipCを発現するクローンは糞便中にほとんど検出されなかったため、20～70日目の間にSipCを発現する能力を維持したまま糞便中に排出された病原体の総量を合理的に推定することができなかった。対照的に、S.Tm感染マウスは、70日目までSipCを発現する能力を維持したまま（104 CFU/g糞便以上）、低いながらも確実に検出可能な量のクローンを排出した（S4C図）。このように、S.Tm感染マウスの糞便中には、野生型S.Typhimurium感染マウスと比較して、SipCを発現できるクローンの量が多く（約1.5倍以上）、SipCを発現できないクローンの量が少なかった（約104倍以下）。出典データはS1データファイルにある。野生型S. Typhimuriumに感染したマウスでは、ほとんどの糞便サンプルでSipCが検出されなかったクローンが95％以上含まれていたからである。プレートあたりのコロニー数が限られているため、SipCが検出されるコロニーを生み出す細胞の絶対数は、我々のアッセイでは測定できなかった。集団サイズのより正確な分析は、選択的プレーティングによる検出を行う、本研究の後半で行われるC.I.実験で得られるであろう（例えば、図4）。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s006

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S5 図：野生型S. Typhimuriumに感染して70日後に採取された糞便病原体集団の病原性の低下（マウス由来）。

Typhimurium（図1B-1Dのマウス）。(A）実験スキーム。図1A-1Dのマウス（野生型S. Typhimurium感染70日後のCONX）の糞便懸濁液を、ストレプトマイシン前処理したCONXマウス（n = 6マウス；灰色；PBS中の1ml糞便懸濁液100μlを、経口投与）に移した。これにより、感染後の病原性を評価する手段が得られた。同居による感染とは対照的に、糞便懸濁液の経口投与は、より正確な感染のタイミングと投与量を可能にした。感染動態を野生型S. Typhimuriumによる最初の感染と比較したのが図1A-1Dで、1-3日目のp.i.である（n = 19マウス；ピンク色）。(B）糞便中のサルモネラ菌数を選択的プレーティングにより定量した。(C）ELISAで測定した糞便中のリポカリン-2濃度。点線は検出限界を示す。点線は検出限界を示す。各時点における2群の比較には両側Mann-Whitney U検定を用いた（p≧0.05有意ではない（ns）、p＜0.05（）、p＜0.001（**））。ソースデータはS1データファイルにある。実験グループは、オリジナルの野生型S. Typhimurium株に感染したマウス（p.i.1～2日目）よりもかなり遅れて（p.i.3～4日目）腸炎を発症したことに注目すべきである。これは、進化したサルモネラ菌群によってTTSS-1による腸炎が消失したことと一致する。我々は、この進化した集団が腸炎を誘発する能力が残っているのは、TTSS-2が介在する腸組織での病原体の増殖に起因しており、この病原体はストレプトマイシン前処置マウスにおいて遅延型の腸炎を誘発することができる（これは「代替経路」と呼ばれている；[22]）。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s007

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S6 図 野生型S.

TyphimuriumおよびS.TmhilDの感染動態（図2に関連する証拠を拡大）。(A）実験スキーム。無菌マウスはCRを付与せず、経口胃管経路で感染させることができ（この場合、いかなる前処理も必要としない）、野生型S.Typhimuriumは感染後12時間以内に保菌能力（109～1010 CFU/g糞便）まで開花し、顕著な腸症を引き起こす[4,44]。LCMマウスは8つの菌株からなる微生物叢を保有しており、中間のCRレベルを有している。経口胃感染では、野生型 S. Typhimurium は増殖に 3～4 日を要し、顕著な腸症を引き起こすまでに 2～4 日を要する [4,46,47]。OligoMM12マウスは、12種類の代表的な微生物株からなる明確な微生物叢を保有している[57]。オリゴMM12マウスは、中間レベルのCRを持つ。胃から感染した野生型S. Typhimuriumは、3-4日で増殖し、顕著な腸症を引き起こす [4,25,57]。CONEマウスの複雑なSPF微生物叢は強力なCRをもたらし、野生型S. Typhimuriumおよび弱毒化サルモネラ菌変異体の腸管内腔での増殖をほとんどの動物で阻止する。したがって、経胃感染後、ほとんどのCONEマウスでは糞便中のサルモネラ負荷量は低いままであり（典型的には糞便あたり106 CFU未満）、感染後5日以内に腸症は発症しない（CONXマウスと同様）。比較のため、感染前日に通常の植物性飼料から高脂肪飼料に変更したCONXマウス（図2）のデータも再プロットした。高脂肪食に24時間暴露することで、CONEマウスのCRの程度が低下するため、野生型S. Typhimuriumは腸管内腔内容物≈108 CFU/gの密度まで増殖し、ほとんどの動物で3～4日目までに腸症を誘発する[4,25]。(B-K)野生型S. Typhimurium（5×107CFU、経口投与；灰色丸；n=6（GF）、n=4（LCM）、n=6（Oligo-MM12）；n=10（CONE）；n=13（transient diet shift））または同系統のhilD変異体（S. TmhilD；5×107CFU、経口摂取；赤丸；GFではn＝7、LCMではn＝5、Oligo-MM12ではn＝6；CONEではn＝10；一過性食餌シフトではn＝12）。モデルはCRの低いものから高いもの（左から右）の順に表されている。(B-F）サルモネラ誘発性腸症の指標として糞便中リポカリン-2をELISAで測定した。(G-K)糞便サルモネラ負荷量を選択的プレーティングにより測定した。点線は検出限界を示す。色線は中央値を結ぶ。各時点における野生型S. TyphimuriumとS.TmhilD感染群の比較には両側Mann-Whitney U検定を用いた（p≧0.05有意ではない（ns）、p＜0.05（）、p＜0.01（）、p＜0.001（）、p＜0.0001（***））。ソースデータはS1データファイルにある。解釈 CRが強いマウス（CONEマウスなど）では、野生型病原体も変異型病原体も腸管内腔で増殖することができず、腸症を誘発することもできない。このことは、糞便中の病原体量が少なく、リポカリン-2濃度が102 ng/g糞便以下であることからもわかる。CRが中間レベルのマウスでは、野生型S.TyphimuriumはS.TmhilDよりも2〜4日以内に腸管内腔で高密度まで増殖し（糞便中の病原体量が108 CFU/gを超えることで示される）、より顕著な腸症を引き起こす。このことから、S.TmhilDは、中間レベルのCRと関連して、腸管内腔環境における病原性が低下していることが裏付けられた。無菌マウスでは、野生型S.TyphimuriumとS.TmhilDはともに、腸管内腔の密度が高くなるまで増殖することができる（糞便中の病原体量が≈1010 CFU/gで測定）。これは、炎症を介した微生物叢抑制の必要性を失わせるCRの欠如によって説明される。それにもかかわらず、野生型S.TyphimuriumはS.TmhilDよりも顕著な腸症を引き起こし、これは糞便中のリポカリン-2濃度の減少によって示された。これらのデータから、S.TmhilDはアイソジェニック野生株と比較して病原性が低下していることが確認された。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s008

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S7 図3A-3Dに示した微生物叢移植実験終了時のマウスの臓器内病原体負荷と盲腸組織炎症の定量分析。

マウスは野生型S. Typhimuriumに感染させ（Fig 3に記載）、70日目p.i.からCONXドナーマウスと同居させた（赤丸に灰色塗りつぶし；各群n = 6匹）か、させなかった（赤丸に塗りつぶし；各群n = 6匹）。(A）160日目の臓器負荷（各群n = 6匹）。mLN = 腸間膜リンパ節。B）160日目の炎症性遺伝子発現解析（各群6匹）。結果は、CONXドナーマウスと同居させたマウスの平均値に対する、同居させなかったマウスの糞便組織からの誘導の倍数としてプロットした。 C）p.i.160日目の両群のマウスの糞便組織切片の代表的な免疫蛍光画像。核（青；DAPI）、好中球（赤；Ly6B.2）、およびアクチン（白；ファロイジン）が染色されている。Lu.=内腔。白矢印は好中球の糞便上皮への動員を示す。スケールバー＝50μm。(D）パネルCに示すように、糞便組織切片における好中球の定量化（各群n＝6マウス）。(A-D）S.TmとS.Tm＋CONXの比較には両側Mann-Whitney U検定を用いた（p≧0.05有意ではない（ns）、p＜0.05（*）、p＜0.01（**））。ソースデータはS1データファイルにある。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s009

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S8 図：野生型S.

Typhimurium感染マウスから分離したクローンの再シークエンシング。図2A-2Eのマウスから単離したクローンのゲノム再シークエンシングを行った。非同義変異の完全な概要はS3 Tableにまとめた。検出可能なSipC発現のない遺伝子変異クローンは、野生型S. Typhimuriumに160日間感染させた対照マウスから、同居させずに回収した。mutS変異株でのみ変異した遺伝子はこのグラフから除外した。非同義変異のみを示す。hilD変異は全分析クローンの87%で検出され、p.i.50-70日目に分離されたクローンと比較すると、hilD変異の頻度はさらに高かった（さらに変異が蓄積していた）（S2表）。ソースデータはS1データファイルにある。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s010

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図9 図3のマウスにおける微生物叢組成の追加解析。

(A）サンプル間のBray-Curtis非類似度に基づく主座標分析（存在量の平方根変換後）。PERMANOVA R2 = 0.284、p = 0.017（120日目）、R2 = 0.4034、p = 0.009（160日目）。(B)コントロールマウスまたは同居マウスのp.i.120日目とp.i.160日目の糞便サンプルの16Sコミュニティシークエンシング解析（各群n = 6糞便微生物叢を解析）。ソースデータはS1データファイルにある。棒グラフは優勢なフィラの相対的存在量を示す。最も存在量の多い4つの門を示し、それ以外の門は "その他 "として示した。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s011

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S10 図4のマウスの盲腸組織病理。

(A）S.Tm*:S.Tm*hilDに40日間感染させたマウス、またはS.Tm:S.TmhilDに80日間感染させたマウス、あるいはS.Tm:S.TmhilDに40日間感染させ、さらに40日間回復したマウスと同居させたマウスのヘマトキシリン・エオジン（HE）染色による盲腸組織切片の代表的な画像 Lu. S.E.=粘膜下浮腫。黒矢印は粘膜下浮腫を示す。スケールバー＝100μm。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s012

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S11図. hilD変異体は野生型S.

Typhimuriumによって引き起こされる炎症によって選択される。ストレプトマイシンで前処理した、病原体を含まない複雑な微生物叢を持つC57BL/6マウス（本研究ではCONEマウスと呼ぶ）に、以下のサルモネラ菌の混合株（5×107 CFU、経口投与）を感染させた： (1) S.TmAvir:S.TmAvirhilD: S.TmAvir（1:1:10.000、1群あたりn = 4匹）（Avirulent conditioned）；(2) S.Tm:S.TmhilD: S.TmAvir（1:1:10.000、1群あたりn = 3匹）（Avirulent conditioned）；(3) S. TmAvir:S.TmAvirhilD:S.Tm(1:1:10.000;n=3匹/群)(野生型条件付け); (4)S.Tm:S.TmhilD:S.Tm(1:1:10.000;n=3匹/群)(野生型条件付け)を4日間行った。(A）実験スキーム。(B)競合指数(C.I.)。同系のhilD欠損株対hilD欠損株対の比率で算出。点線はC.I.が1であることを示す。 (C) リポカリン-2 ELISAを糞便で行い、異なるグループ間で腸の炎症レベルを比較した。点線は検出限界を示す。カラーコードは腸内炎症の程度を示す（[Lcn2]>200-1,000 ng/g糞便；軽度の腸内炎症、[Lcn2]=1,000-1,000.000 ng/g糞便；顕著な腸内炎症）。ソースデータはS1データファイルにある。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s013

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S12 図. ストレプトマイシン前処理したCONEと未処理のOligoMM12の連続感染実験。

未処理のOligoMM12。(A）実験スキーム。ストレプトマイシン前処理したCONEマウス（CRが強く破壊された；n＝5匹；2回の独立実験；ピンクの記号）とOligo-MM12マウス（CRが中間；n＝5匹；2回の独立実験；青の記号）に、同じ野生型S. Typhimurium株（5×107 CFU、経口投与）を感染させた。糞便ペレットは3日ごとに回収し、再懸濁した後、回収日に次のグループのマウス（感染マウスペレット1個につき2匹）に経口投与で感染させるために使用した。最後（4回目）の感染マウスは4日間感染させた（各群n = 10）。(B）選択的抗生物質を添加したMacConkeyプレートを用いて測定した糞便サルモネラ負荷量。(C）ELISAで測定した糞便中のリポカリン-2濃度。(D）コロニープロテインブロットアッセイで測定した、検出可能なSipCを含まないクローンの割合。各時点におけるCONE＋ストレプトマイシンとOligo-MM12の比較には、両側Mann-Whitney U検定を用いた（p≧0.05有意ではない（ns）、p＜0.05（）、p＜0.01（）、p＜0.001（）、p＜0.0001（***））。ソースデータはS1データファイルにある。解釈 これまでの研究と同様に、野生型S. Typhimuriumは両群のマウスで腸症（リポカリン-2 ELISA法で測定）を惹起した。しかし、ストレプトマイシン前処置のCONEマウスでは、Oligo-MM12マウスに比べ、感染後4日間で中等度の大腸炎を発症し、より速い動態を示し、より顕著であった[85]。我々は、3日ごとに（4回にわたって）ナイーブマウスに糞便懸濁液を感染させたので、Oligo-MM12が顕著な大腸炎（4日目のp.i.に起こると予想される）に進行しないことを保証した。このデザインには2つの重要な利点があった： それは、全く同じ野生型S. Typhimurium株を用いながら、実験の全過程にわたって、より顕著な大腸炎と、より顕著でない大腸炎を達成できたことである。そして、ストレプトマイシンで前処理したC57BL/6マウスに高レベルの腸内コロニーを形成させた後、5〜6日目以降に起こる、生命を脅かすほどの全身的な病原体の拡散を避けることができた。最初の感染から3日目には、両群ともSipC発現が検出可能な100％クローンからなるS.Tm集団を排出した。一方、4回目の感染終了時には、抗生物質前投与のCONEマウスではすべての動物でSipC発現のないクローンが検出されたが、Oligo-MM12マウスの糞便からはそのようなクローンは検出されなかった（中央値＝20％対SipC発現のないクローン0％）。この実験により、腸の炎症がS. Typhimuriumの病原性を低下させた変異体の選択と相関していることが証明された。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s014

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S13 図1B-1Dのマウスにおける微生物叢の多様性と群集組成の追加解析（図6に関連）。

図1B-1Dのマウスから採取した10日目と70日目の糞便サンプルの16Sコミュニティシーケンス解析。(A-C）サンプル間のBray-Curtis非類似度に基づく主座標分析（存在量の平方根変換後）。データ点は個々のマウスを表し、各サンプルグループ内のデータ点のグループ分けは色のついた境界線で定義されている。PERMANOVA R2 = 0.067、p = 0.589（p.i.0日目）、R2 = 0.397、p = 0.0045（p.i.10日目）、R2 = 0.660、p = 0.002（p.i.70日目）。(ピンク丸：野生型S. Typhimurium S.Tm、黒丸：S.Tm*）。(E-G)10日目と70p.i.で比較した相対的な次数の多さ。正常なCONX微生物叢の基準点として、穿刺していないCONXマウスの糞便微生物叢を用いた。(E）バクテロイデーテス門のバクテロイデー亜目。(F) Proteobacteria門のEnterobacterales。(G）放線菌門のCoriobacterales。(H) Erysipelotrichales目に属する最も豊富な属の相対的存在量。野生型S.Typhimuriumに感染したマウスとS.Tmに感染したマウスとで、70p.i.における属数を比較した。正常なCONX微生物叢（灰色丸印）の基準点として、穿刺していないCONXマウスの糞便微生物叢を用いた。点線は検出限界。線は中央値を示す。両側Mann-Whitney U検定を用いて、野生型S. TyphimuriumとS.Tm感染、またはS.Tm感染と未処置CONXを比較した（p≧0.05有意ではない（ns）、p＜0.05（）、p＜0.01（）、p＜0.001（）、p＜0.0001（*））。ソースデータはS1データファイルにある。解釈： 大腸炎後の腸内では、両実験群とも腸の炎症レベルに依存してTuricibacter属が顕著に優勢であることが観察され、これらの細菌が炎症腸に優れた適応を示すことが示唆された。また、Faecalibaculum属はS.Tm感染マウスの大腸炎後腸でのみ濃縮されていた。これは、これらの細菌は炎症が治まった腸内環境でのみ再生すると解釈できる。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s015

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S14 図：無処置CONXマウス、OligoMM12マウス、無菌マウス、およびS.Tm感染CONXマウスの盲腸内容物におけるSCFAおよびその他の腸管内代謝産物の解析。

盲腸はサルモネラや微生物叢が最も増殖する場所であるため、この解析では盲腸に焦点を当てた。未処理のCONXマウス（n = 5匹）、OligoMM12マウス（n = 5匹）、および無菌マウス（n = 5匹）の盲腸内容物を採取した。ストレプトマイシン前処理のCONXマウス（n = 8匹）に、野生型S. TyphimuriumとS.TmhilDの106:1混合物を感染させ、40日目のp.i.に盲腸内容物を採取した。遠心分離によって細菌を除去し、盲腸内腔の液体内容物にアクセス可能な代謝物を定量するために上清を回収した。代謝物濃度は、SCFAである酢酸、プロピオン酸、酪酸については内部標準物質を基準として、その他の代謝物である乳酸、リンゴ酸、ピルビン酸、2-オキソグルタル酸、コハク酸、フマル酸については13C標識コハク酸を基準として、質量分析により測定した。(A）酢酸、プロピオン酸、酪酸の濃度。点線は定量限界（LOQ）を示し、点線上の値はLOQ以下。(B) 標識コハク酸を基準としてlog2変換した面積比で測定した乳酸、リンゴ酸、ピルビン酸、2-オキソグルタル酸、コハク酸、フマル酸の相対存在量。X軸の値は検出限界以下。両側Mann-Whitney U検定を用いて、未処置のCONXマウスと野生型S. Typhimurium投与40日目のCONXマウスを比較した（p≧0.05有意ではない（ns）、p＜0.05（）、p＜0.01（）、p＜0.001（）、p＜0.0001（***））。ソースデータはS1データファイルにある。解釈 SCFA濃度の低下から、野生型S. Typhimurium感染は、40日目のp.i.データが示すように、CONX微生物叢の正常な生理をかなり強く、長期間にわたって破壊することが確認された。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s016

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S15 図：S.TmhilDに対する選択に対する影響を評価するための候補微生物叢株および微生物叢代謝物の試験。

(A）実験スキーム。(B）ストレプトマイシン前処理のCONXマウス（n = 35）を0日目にS.Tmと同種のhilD変異体（S.Tm:S.Tm*hilD；103:1比）の混合物に感染させ、4日間病原体の腸内コロニー形成を解析した。第1群は衛生的に隔離されたままであった（コントロール；黒丸；n＝14）。第2群と第3群も衛生的隔離下におき、25mM Na-プロピオン酸塩または50mM Na-酪酸塩を添加した飲料水を与えた。残りの群には、0、1、3日目のp.i.に標記菌株の一晩培養のグリセロールストックを接種した（約5×105～5×107CFU、経口投与；n＝3（DSM17677を除く、n＝4））。着色は試験した微生物株を示す。正規化されたC.I.は、選択プレーティングによって決定された、同種のhilD欠損株対hilD欠損株対の比としてプロットされている。ソースデータはS1データファイルにある。解釈 これらの結果は、hilD変異体の増加に対する選択は、多様な微生物叢メンバーまたは関連代謝産物の複合作用の結果であることを示唆している。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s017

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S16 図. hilD変異体の選択における、定義された微生物叢菌株の混合効果を調べる競合感染実験。

(A）実験スキーム。無菌マウスは図4に示した実験の終了時点から採取した。この時点で、これらの無菌マウスはS.TmとS.Tm hilDの100:1混合物（5×107 CFU、経口投与；n = 5）に40日間感染していた。感染後40日目、45日目、50日目に、OligoMM12マウスの菌株、またはDSMコレクション（カクテルA：KB18-YL32-YL31-YL58-DSM 103405；確立されたプロトコルを使用[57]）からのo/n培養のグリセロールストックをマウスに接種した。これらの微生物株は、S.Tmに感染して70日目までに再生し、したがって腸管腔から変異体優位の病原体集団を追い出すのに寄与すると考えられる微生物株メンバーを表すように選択された。(B）選択的抗生物質を添加したマッコンキープレートを用いて測定したS.Tm hilD対S.Tmの競合指数（C.I.）。C.I.は接種株に対して正規化した。点線はC.I.が1であることを示す。0～40日目のデータは図4からプロットし直した。ソースデータはS1 Data fileにある。解釈 微生物叢混合物を接種しても、S.Tm hilDに対する選択には検出可能な効果はなかった（20～40日目と40～55日目のデータを比較）。この理由はまだ不明である。これは、腸内環境の調整に重要である可能性のある菌株特異的形質に関する情報を提供しない16S配列情報に依存して菌株を選択したため、正しい競合微生物叢菌株を同定できなかったことに関連しているのではないかと推測している。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s018

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S17 図：一過性高脂肪食シフト実験（図7）の糞便サンプルの追加解析。

図7B-7Dに示した実験のデータを、10日目のp.i.における糞便中の病原体負荷量に基づいてマウスを2つのサブグループに分けて再分析した。高排泄群（黒記号）は107 CFU/g以上の糞便を、低排泄群（灰色記号）は107 CFU/g未満の糞便を10日目のp.i.において有していた。点線は検出限界。黒線は中央値を結ぶ。(B）プレーティングにより測定したmLNおよび脾臓中の病原体負荷量。(C）野生型S.TyphimuriumとS.TmhilDについて、選択プレーティングにより測定した、正規化競合指数（C.I.）の高低を示す。点線はC.I.が1であることを示す。 (D) 便中リポカリン-2のELISAを用いて2群間の腸内炎症を比較した。統計解析には両側Mann-Whitney U検定を用いた（p≧0.05有意ではない（ns）、p＜0.05（）、p＜0.01（）、p＜0.001（）、p＜0.0001（***））。ソースデータはS1データファイルにある。解釈 このモデルは、腸内炎症の誘発と病原性の低下との間のトレードオフをうまく要約している。炎症が高いほど病原体細胞の排出数が増加する（すなわち高排出菌）が、これは病原性を失うという問題を伴う（hilD変異体蓄積の増加）。したがって、S.Tmの腸内コロニー形成には、高すぎても低すぎても最適ではないのである。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s019

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S18 図：LCMマウスにおけるS.TmおよびS.TmhilDの競合感染。

(A）実験スキーム。(B-E）LCMマウスにS.Tmと同種のhilD変異体S.Tm hilD（5×107CFU、経口投与、n＝7匹）を100：1で40日間感染させた。(B）選択的抗生物質を添加したMacConkeyプレートを用いて測定した総糞便サルモネラ負荷量。(C）糞便中のS.TmおよびS.Tm hilD負荷量（選択的抗生物質を添加したMacConkeyプレートを用いて測定）。(D）選択的抗生物質を添加したマッコンキープレートを用いて測定したS.Tm* hilD対S.Tm*の競合指数（C.I.）。C.I.は接種株に対して正規化した。点線はC.I.が1であることを示す。 (E) 糞便で行ったリポカリン-2ELISA。各時点につき最小n = 3糞便ペレットを分析した。点線は検出限界を示す。線は分析日の中央値を結ぶ。ソースデータはS1データファイルにある。解釈 LCMマウスでは、感染後10日間にhilD欠損株への選択が観察された。これは、炎症を起こした腸管内環境がhilD変異株を選択したためと考えられる。また、炎症によってLCMの微生物叢が乱れ、この10日間はhilD変異株を選択する条件を確立できなかったと考えられる。腸の炎症は、リポカリン-e ELISAのデータが示すように、20-40日目には明らかに消失した。この期間の実験では、hilD欠損株の選択的優位性が逆転した。これはLCM微生物叢の再確立によるものであり、hilD欠損株よりもhilD欠損株の方が10,000倍も選択された（10日目のC.I.=102；対して30日目のC.I.=10-2）のはこのためであると我々は仮定している。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s020

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S1表。野生型S. Typhimuriumに感染させたマウスから分離した進化クローンで検出された変異の概要。

Typhimuriumに感染させたマウスから分離された進化型クローンで検出された変異の概要。すべてのクローン（n=16；SipCが検出された12クローン、SipCが検出されなかった4クローン；図1A-1Dのマウスから採取）について、我々のコロニープロテインブロットアッセイ[29,50]から得られたSipC表現型（TTSS-1発現の代用として）を記号と列の色分けで示した； + と青のカラーコードはSipCシグナルがポジティブに検出されたことを示し、+/-と黄色のカラーコードは中間のSipC発現を示し（この研究では、これらのSipC発現クローンをSipC発現クローンとみなした）、-と赤のカラーコードは検出可能なSipC発現がないことを示す。表は祖先株には存在しない非同義変異を示す（S6表）。SL1344参照染色体（NCBIアクセッションFQ312003.1）における位置を対立遺伝子変化とともに示す。空白の場合、ゲノムのその領域は変異を含まない。その遺伝子に1つ以上の変異が観察された場合は、単にその遺伝子に存在する変異体の数を示す。パーセンテージは、特定の変異を示す分離株の割合を示す。mutS変異を持つクローン（mutator株）のみに起こる変異は、"Mutator-specific mutations "とラベル付けした別のサブ表に記載した。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s021

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S2表。野生型S. Typhimuriumに感染させたマウスから分離した進化クローンで検出された変異のまとめ。

Typhimuriumに感染させたマウスから分離された進化型クローンで検出された変異のまとめである。全てのクローン（n=22；SipCが検出された11クローン、SipCが検出されなかった11クローン；図1A-1Dのマウスから採取）について、我々のコロニープロテインブロットアッセイ[29,50]から得られたSipC表現型（TTSS-1発現の代理として）を記号と列の色分けで示した； + と青のカラーコードはSipCシグナルがポジティブに検出されたことを示し、+/-と黄色のカラーコードは中間のSipC発現を示し（この研究では、これらのSipC発現クローンをSipC発現クローンとみなした）、-と赤のカラーコードは検出可能なSipC発現がないことを示す。表は祖先株には存在しない非同義変異を示す（S6表）。SL1344参照染色体（NCBIアクセッションFQ312003.1）における位置を対立遺伝子変化とともに示す。空白の場合、ゲノムのその領域は変異を含まない。その遺伝子に1つ以上の変異が観察された場合は、単にその遺伝子に存在する変異体の数を示す。パーセンテージは、特定の変異を示す分離株の割合を示す。mutS変異を持つクローン（mutator株）のみに起こる変異は、"Mutator-specific mutations "とラベル付けした別のサブ表に記載した。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s022

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S3表。野生型S. Typhimuriumに感染させたマウスから分離した進化クローンで検出された変異のまとめ。

Typhimuriumに感染させたマウスから分離された進化型クローンで検出された変異のまとめである。全てのクローン（n=20；SipCが検出された5クローン、SipCが検出されなかった15クローン；図3B-3Dのマウスから採取）について、我々のコロニープロテインブロットアッセイ[29,50]から得られたSipC表現型（TTSS-1発現の代用として）を記号と列の色分けで示した； + と青のカラーコードはSipCシグナルがポジティブに検出されたことを示し、+/-と黄色のカラーコードは中間のSipC発現を示し（この研究では、これらのSipC発現クローンをSipC発現クローンとみなした）、-と赤のカラーコードは検出可能なSipC発現がないことを示す。表は祖先株には存在しない非同義変異を示す（S6表）。SL1344参照染色体（NCBIアクセッションFQ312003.1）における位置を対立遺伝子変化とともに示す。空白の場合、ゲノムのその領域は変異を含まない。その遺伝子に1つ以上の変異が観察された場合は、単にその遺伝子に存在する変異体の数を示す。パーセンテージは、特定の変異を示す分離株の割合を示す。mutS変異を持つクローン（mutator株）のみに起こる変異は、"Mutator-specific mutations "とラベル付けした別のサブ表に記載した。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s023

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S4 表。p.i.10-12日目にS.Tm*に感染したマウスから単離した進化クローンで検出された変異のまとめ。

すべてのクローン（n=21；SipCが検出された14クローン、SipCの発現が検出されなかった7クローン；図1A-1Dのマウスから採取）について、我々のコロニープロテインブロットアッセイ[29,50]から得られたSipC表現型（TTSS-1発現の代理として）を記号と列の色分けで示した； + と青のカラーコードはSipCシグナルがポジティブに検出されたことを示し、+/-と黄色のカラーコードは中間のSipC発現を示し（この研究では、これらのSipC発現クローンをSipC発現クローンとみなした）、-と赤のカラーコードは検出可能なSipC発現がないことを示す。表は祖先株には存在しない非同義変異を示す（S6表）。SL1344参照染色体（NCBIアクセッションFQ312003.1）における位置を対立遺伝子変化とともに示す。空白の場合、ゲノムのその領域は変異を含まない。パーセンテージは、特定の変異を示す分離株の割合を示す。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s024

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S5 表。47-70日目のp.i.でS.Tm*に感染したマウスから分離した進化したクローンで検出された変異のまとめ。

すべてのクローン（n=12；SipCが検出された7クローン、SipCが検出されなかった5クローン；図1A-1Dのマウスから採取）について、我々のコロニープロテインブロットアッセイ[29,50]から得られたSipC表現型（TTSS-1発現の代用として）を記号と列の色分けで示した； + と青のカラーコードはSipCシグナルがポジティブに検出されたことを示し、+/-と黄色のカラーコードは中間のSipC発現を示し（この研究では、これらのSipC発現クローンをSipC発現クローンとみなした）、-と赤のカラーコードは検出可能なSipC発現がないことを示す。表は祖先株には存在しない非同義変異を示す（S6表）。SL1344参照染色体（NCBIアクセッションFQ312003.1）における位置を対立遺伝子変化とともに示す。空白の場合、ゲノムのその領域は変異を含まない。パーセンテージは、特定の変異を示す分離株の割合を示す。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s025

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S6 表。祖先の野生型S.

Typhimurium株またはS.Tm株における変異の概要。本研究でマウス感染に用いたSB300（SL1344 WT; S.Tm）およびM2730（SL1344 ΔssaV; S.Tm）の非同義変異を野生型S. Typhimurium SL1344参照ゲノムNCBIアクセッションFQ312003.1と比較した。TTSS-1発現の代用として）コロニープロテインブロットアッセイにおけるSipC表現型を示す；＋と青のカラーコードは、コロニープロテインブロットアッセイにおいてSipCが検出されたことを示す。S.Tm*（実験室株コレクションではM2730と呼ばれている）を作製するために、我々はP22導入後に耐性カセット（例えばssaV）を除去する方法を用いた。この欠失は、S6表では「Δ」記号で示されている。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s026

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S7表。120日目と160日目に濃縮されたASV。

野生型S. Typhimurium感染コントロールマウス（同居なし）の糞便中で、CONXマウスと同居させたマウスと比較した。ASVはp.i.120日目と160日目のマウスのサンプルで同定された（n = 各6匹、野生型S. Typhimuriumを衛生的に隔離したマウスとCONXマウスと同居させたマウス；図3より）。サンプル内の多様性、β多様性、目または門の多様性の指標を図3EおよびS9に示す。Wald検定によって決定された有意に濃縮されたASVは、log2倍変化（S.TmとS.Tm + CONX）によってランク付けされている。p<0.05のpadjusted cut-offと>1のlog2 fold change cut-offで、S.Tmで有意に豊富なASVが示されている（表中では青で示されている）。BaseMeanは、全サンプルをサイズファクターで正規化した平均リードカウントを表す。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s027

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S8 表 野生型S. Typhimurium感染者の糞便中に濃縮されたASV。

Typhimuriumに感染したコントロールマウス（同居なし）またはCONXと同居したマウス（160 p.i.日）の糞便中のASVは、0 p.i.日のCONXマウスと比較して、160 p.i.日のマウスのサンプルで同定された（それぞれn = 6マウス；図3より）。Wald検定により有意に濃縮されたASVをlog2倍変化（S.Tm + CONX over CONX）で順位付けした。p<0.05のpadjusted cut-offと>1のlog2 fold change cut-offで、同居マウスで有意に豊富なASVが示されている（表中では青で示されている）。BaseMeanは、全サンプルをサイズファクターで正規化した平均リードカウントを表す。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s028

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S9 表 野生型S. Typhimuriumに感染したマウスの糞便中に濃縮されたASV。

Typhimuriumに感染させたマウスと、S.Tmに感染させたマウスの0日目、10日目、70日目の糞便中のASVを比較した。サンプル内の多様性、β多様性、目や門や科の多様性の指標を図6CとS13に示す。Wald検定によって決定された有意に濃縮されたASVは、log2倍変化（S.Tm over S.Tm）でランク付けされている。p<0.05のpadjusted cut-offと>1のlog2 fold change cut-offで、S.Tmにおいて有意に豊富なASVが示されている（表中では青で示されている）。BaseMeanは、全サンプルをサイズファクターで正規化した平均リードカウントを表す。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s029

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S10 表 70日目にS.Tm*に感染したマウスの糞便中に濃縮されたASV。

(図1B-1Dより）と、図3よりp.i.0日目のCONXマウスとの比較。p.i.70日目のマウス（n = 6匹、図1B-1D）と0日目のマウス（n = 6匹、図3のドナーマウス）のサンプルでASVが同定された。Wald検定によって決定された有意に濃縮されたASVは、log2倍変化（CONXに対するS.Tm*）でランク付けされている。S.Typhimurium*感染マウスで有意に豊富なASVを、p<0.05のpadjusted cut-offと>1のlog2 fold change cut-offで示した（表中では青で示した）。BaseMeanは、全サンプルをサイズファクターで正規化した平均リードカウントを表す。

doi:10.1371/journal.pbio.3002253.s030

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謝辞
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