視覚的アブストラクト RCT：プロバイオティクスと小児における抗生物質誘発性微生物異常

キーポイントQuestion小児における抗生物質誘発性腸内細菌叢異常に対する多種プロバイオティクスの効果は何か？
所見88名の小児を対象としたこの無作為臨床試験において、研究対象としたプロバイオティクス混合物は、抗生物質投与中および投与後の微生物叢組成に軽度かつ一過性の影響を及ぼした。補充された5属のうち3属は、プロバイオティクス補充中に相対存在量が高くなったが、その後1ヵ月後の追跡調査ではベースラインレベルに戻った。
研究対象としたプロバイオティクス製剤の使用は、腸内細菌叢の調節を介して抗生物質誘発性の副作用を予防する可能性があるが、マルチオミクス技術を組み合わせたさらなる研究が必要である。

要旨

重要性プロバイオティクスは、抗生物質に関連した下痢を予防するために、小児においてしばしば考慮される。しかし、抗生物質が誘発する微生物叢の変化に対するプロバイオティクスの根本的な機序的効果や影響はよくわかっていない。
目的抗生物質を投与されている小児の腸内細菌叢組成に対する多種類のプロバイオティクスの効果を調査すること。
デザイン、設定、参加者本研究は、2018年2月1日から2021年5月31日まで、入院および外来で広域スペクトルの抗生物質を投与されている小児350例を含む無作為化四重盲検プラセボ対照臨床試験の二次解析である。患者は介入期間の1ヵ月後まで追跡された。2022年9月1日～2023年2月28日に糞便サンプルとデータを解析した。参加資格は、生後3ヵ月から18歳までで、広スペクトル抗生物質の全身投与開始後24時間以内の患者であった。合計646人の適格な患者にアプローチし、350人が試験に参加した。
介入参加者は、抗生物質投与中および投与後7日間、毎日プラセボを投与する群、または5つの異なる属からなる8つの菌株からなる多種のプロバイオティクス製剤を投与する群に無作為に割り付けられた。
主なアウトカムと測定法以下の4つの時点で便サンプルを採取した：(1)組み入れ、(2)抗生物質使用の最終日、(3)試験介入の最終日、(4)介入後1ヵ月。微生物叢の解析は16SリボソームRNA遺伝子配列決定により行った。
結果計350名の小児が無作為に割り付けられ、微生物叢解析の対象となった88名から便サンプルが採取された（男児54名、女児34名；平均年齢［SD］47.09［55.64］ヵ月）。α多様性は最初の3回では群間で有意差はなかった。シャノン多様性（平均［SD］、3.56［0.75］ vs 3.09［1.00］；P= 0.02）および逆シンプソン多様性（平均［SD］、3.75［95％CI、1.66-5.82］ vs -1.31［95％CI、-3.17-0.53］；P= 1×10-4）指数は、介入1ヵ月後にプロバイオティクス群と比較してプラセボ群で高かった。β多様性はいずれの時期においても有意差はなかった。プロバイオティクスを補充した5属のうち3属は、プロバイオティクス補充中に相対存在量が増加したが、この差は1ヵ月後には消失した。
結論と関連性研究したプロバイオティクス混合物は、抗生物質治療中および治療後の微生物叢組成にわずかかつ一過性の影響を及ぼした。微生物叢を操作し、抗生物質に関連したディスバイオシスや抗生物質に関連した下痢などの副作用を予防する作用機序を理解するためには、さらなる研究が必要である。
臨床試験登録ClinicalTrials.gov Identifier： NCT03334604

はじめに

抗生物質は、小児において最も頻繁に処方される薬剤の一つである1,2。現在、欧米諸国では、小児1人当たり0.5～1.6コースの抗生物質が処方されている3。抗生物質に曝露されると、腸内細菌叢における病原体の増加と同時に、常在微生物の多様性と存在量が減少する4,5。その結果、抗生物質による腸内細菌叢の異常は、特に幼児期において、肥満、喘息、クローン病、1型糖尿病などの長期的な健康転帰と関連している。
抗生物質の使用による有害事象を予防するための介入として最も十分に研究されているのは、プロバイオティクスである。プロバイオティクスとは、「適切な量を投与すると、宿主に健康上の利益をもたらす生きた微生物」と定義されている12。最近、我々は無作為化臨床試験（RCT）において、抗生物質に曝露された小児に多種類のプロバイオティクスを補充すると、下痢のリスクが有意に減少することを証明した13。しかし、抗生物質が誘発する微生物叢の異常を緩和する効果を含め、プロバイオティクスの根本的な保護メカニズムについては、小児ではまだ十分に研究されていない。

方法

このRCTの二次解析は、Consolidated Standards of Reporting Trials（CONSORT）報告ガイドラインに従った。本研究は、ワルシャワ医科大学（ポーランド、ワルシャワ）およびアムステルダム大学医療センター（オランダ、アムステルダム）の生命倫理委員会の承認を得た。0～11歳の小児についてはすべての保護者から、12～15歳の小児については小児と保護者から、16歳以上の小児については小児のみから、それぞれ書面によるインフォームド・コンセントを得た。

試験デザイン

オランダの3病院とポーランドの2病院において、4重盲検プラセボ対照RCTを実施した16。この試験の主な目的は、AADの発生率に対する多種類のプロバイオティクスの効果を評価することであり、これについては以前に結果が報告されている13。我々は、抗生物質を投与されている小児の消化管細菌叢組成に対する多種プロバイオティクスの効果を縦断的に記述するために、RCTの小児から糞便サンプルを入手した。試験プロトコルは補遺1に示す。

参加者

広範な抗生物質の経口投与または静脈内投与を開始している生後3ヵ月から18歳までのすべての小児および青年（以下、小児とする）を参加対象とした。小児の募集期間は2018年2月1日から2021年5月31日であった。抗生物質投与開始後24時間以内の小児を対象とした。小児は、小児または両親が2回以上の糞便サンプルを採取し、小児が試験プロトコルを遵守している場合にのみ、微生物叢解析の対象とした。小児は、試験製品の推奨用量の75％以上を摂取した場合、アドヒアレントとみなされた。除外基準については以前に記述されている13。

手順と介入

小児は、最初の抗生物質投与から24時間以内に開始し、抗生物質治療期間中およびその後の7日間、最大17日間、1日2回、多種混合プロバイオティクスまたはプラセボのいずれかを投与された。無作為化とマスキングの手順については、以前に記載されている。13多種混合プロバイオティクス（Ecologic AAD 612; Winclove Probiotics BV）には8つの菌株が含まれていた： Bifidobacterium bifidumW23、Bifidobacterium lactisW51、Lactobacillus acidophilusW37、L acidophilusW55、Lacticaseibacillus paracaseiW20、Lactiplantibacillus plantarumW62、 Lacticaseibacillus rhamnosusW71、Ligilactobacillus salivariusW24で、1袋あたり合計50億コロニー形成単位（CFU）（100億CFU/日）を摂取した。オランダの参加者は、10mLの滅菌容器（Stuhlgefäß；Greiner）に糞便サンプルを採取し、採取後直ちに凍結した。自宅で採取されたサンプルは、研究者の一人（T.H.D.）が自宅で受け取り、病院に搬送され、そこで-20℃で保存された。ポーランドの参加者は、市販のキット容器（OMNIgene-GUT；Omnitek社製）にDNA安定化緩衝液を入れて便サンプルを採取し、病院に送られ、サンプルは直ちに-80℃で保存された。糞便サンプルは4回採取された：(1)組み入れ後の初便、(2)抗生物質治療の最終日、(3)プラセボまたはプロバイオティクスサプリメントの最終日、(4)プラセボまたはプロバイオティクスサプリメント終了1ヵ月後。

検体の取り扱い

各糞便サンプルの合計 250 μg をビーズビートを用いてホモジナイズし、市販のシステム（Maxwell 16; Promega Corporation）を用いて製造業者のプロトコールに従って DNA を抽出した。ポリメラーゼ連鎖反応を行い、バーコード化プライマー515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-）および806R（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-）を用いて細菌16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子のV4超可変領域を増幅した。ライブラリーあたり70のユニークにバーコード化されたサンプルをプールすることにより、6つのライブラリーが構築された。品質管理は、ネガティブコントロールと人工モックコミュニティをライブラリーに加えることで評価した。アンプリコン混合物は市販のプラットフォーム（HiSeq 2000; Illumina, Inc）を用いて塩基配列を決定した。データ処理にはセマンティックフレームワーク（NG-Tax [オープンソース]）を用い、リード長以外はデフォルト設定で100塩基対に設定した18。アンプリコン配列変異（ASV）の分類学的割り付けは、参照データベース（SILVA_138.1）を用いて行った19,20。

結果

当初の試験の主要アウトカムはAADの発生率であり、その結果は以前に発表されている13。抗生物質を投与されている小児の消化管細菌叢組成に対するプロバイオティクスの効果は、この試験の副次的アウトカムであり、そのデータは本研究で提示されている。その目的は、プラセボ群とプロバイオティクス群の微生物叢組成の経時的変化の差を分析することであった。続いて、すべての時点における2群間の横断的比較を別々に行った。

マイクロバイオームデータ解析

すべての解析は、Rソフトウェアのバージョン4.2.1（R Project for Statistical Computing）で、microbiome、phyloseq21、vegan22パッケージを用いて行った。リードカウントが陰性対照のものより低いサンプルはすべて、以降の解析から除外した。どの門にも属さない分類群はデータセットから除外した。16S rRNA遺伝子アンプリコンデータセットのサンプルあたりのリード数の中央値は175 933（範囲、2273-2 106 395）であった。合計で1471種のASVと180属が同定された。
個々のマイクロバイオームの多様性の幅を定量化するために、希少な分類群をフィルタリングする前の各サンプルについて、ASVレベルでアルファ多様性（シャノンおよび逆シンプソン）指数を算出した。微生物叢の経時的変化を分析するため、ASV分類群レベルでBray-Curtis距離を用いた主座標分析法を用いて、各研究群について個別にβ多様性を評価した。さらに、グループ間の微生物β多様性の違いを分析するため、各採取時間について別々に分析を行った。腸内細菌叢組成の分析はすべて、分類群の相対存在量に基づいて行った。

統計解析

2022年9月1日から2023年2月28日までのデータを解析した。記述統計を用いて、2群の参加者のベースライン特性を示した。2値データにはχ2検定を用いた。連続データについては、正規分布および非正規分布のデータに対して、それぞれ対応のない両側t検定およびMann-Whitney検定を用いた。すべての統計検定は2尾で、有意水準5%で行われた。最初に、多様性と存在量の経時的変化を比較し、次に4回に分けて横断比較を行った。
抗生物質に曝露された小児において、プロバイオティクスの補給の有無によるアルファ多様性の経時的変化を評価するために、年齢と国で調整した線形混合モデルを用いた（Rのlme4パッケージ、バージョン4.2.1）。反復測定を考慮するため、参加者の識別をランダム効果として用いた。モデル中の時間項の統計的有意性の評価は、構築したモデルと時間を削除したモデルを比較することで行った（χ2統計量を使用）。有意な結果が得られた場合は、Tukey検定を用いた（emmeans package in R, version 4.2.1）。すべてのP値は偽発見率法を用いて補正し、P< .05を統計的に有意とみなした。次に、参加者の識別をランダム効果として用いた線形混合モデルを用いて、時点とグループコーディングの間の交互作用効果を検定することにより、グループ間の組成変化軌跡の違いの統計的有意性を評価した。解析は年齢と国で調整した。パーミュテーショナル分散分析（PERMANOVA）を用いて、細菌組成が研究グループと時間に関連しているかどうか、また時間と研究グループの間に交互作用があるかどうかを検定した。次に、どの時間が互いに有意に異なるかを評価するために、線形混合効果モデルを用い、座標軸上の点間の距離を各グループ内の時間間で比較した。さらに、非類似度指数を計算することで、ベータ多様性の全体的な変化を調べた。これは、1回目と2回目、1回目と3回目、1回目と4回目に採集された同じ参加者のサンプル間のブレイ・カーティス距離を比較することによって行われた。次に、非類似度指数をグループ間で比較し、線形混合モデル効果を用いて、これらの変化がグループと時間変化の相互作用によって区別されるかどうかをチェックした。
研究グループ間の微生物叢組成の変化の違いを比較するために、各グループの時間1と時間2、3、4の間の倍数変化を、後の時間における分類群の相対存在量を前の時間における相対存在量で割って計算した。マイクロバイオームデータはゼロインフレーションを起こすため、フォールドチェンジ計算の前にゼロ置換法を適用した。すべてのゼロは、検出限界の65%に等しい定数値で置換された24。その後、倍数変化について2進対数が計算され、これらの値が各時間変化（時間1から2、1から3、1から4）内のグループ間で比較された。プロットは、ggplot2およびmicroVizパッケージ（R、バージョン4.2.1）を用いて作成した。

結果

当初のRCTに組み入れられた350人の小児のうち、88人（プロバイオティクス群44人、プラセボ群44人；男児54人、女児34人；平均［SD］年齢、47.09［55.64］ヵ月）が、2018年2月1日から2021年5月31日の間に、十分な読み取り数の便サンプルを少なくとも2検体採取することに関する試験プロトコルを遵守していた（図1）。合計19検体はリード数が少なかったため、解析から除外せざるを得なかった。参加者の特徴は2群間で同等であった（表）。本試験に組み入れられた参加者と、当初の試験に組み入れられた後に脱落した参加者の特徴は、補足資料2のeTable 1に記載されている。人種と民族のデータは収集されなかった。各群の限られた数の小児（プラセボ群13人［29.5％］、プロバイオティクス群7人［15.9％］）に下痢がみられ、プラセボ群10人（22.7％）、プロバイオティクス群6人（13.6％）にAADがみられた。

プラセボ群とプロバイオティクス群の微生物多様性の違い

両群とも、最初の2回の採取におけるα多様性指標の変化に差は認められなかった。プラセボ群では、シャノン多様性指数（平均［SD］、3.56［0.75］ vs 3.09［1.00］；P＝0.02）および逆シンプソン指数（平均［SD］、3.75［95％CI、1.66～5.82］ vs -1.31［95％CI、-3.17～0.53］；P＜0.001）において、2回目と比較して4回目に高い値が認められた（図2）。このような経時的な変化はプロバイオティクス群では認められなかった。回帰分析によると、シャノン指数（β係数、時間1では-0.22［95％CI、-0.56～0.12］；-0.39［95％CI、-0.74～-0.04］；-0.09［95％CI、-0.44～0. 26］、時間3では-0.14［95％CI、-0.23～0.51］、時間4では-0.14［95％CI、-0.23～0.51］、交互作用についてはP＝0.05）、逆シンプソン指数（β係数、時間1では-2.57［95％CI、-5.94～0. 81］；時間1では-3.55［95％CI、-6.99～-0.09］；時間3では0.28［95％CI、-3.17～3.75］；時間4では3.72［95％CI、0.10～7.34］；交互作用についてはP＜0.001）。プラセボ群とプロバイオティクス群の横断比較では、最初の3回ではシャノン多様性指数と逆シンプソン指数に差はなかった。シャノン多様性指数は、プラセボ群ではプロバイオティクス群と比較して4時間目に高かった（平均［SD］、3.56［0.75］対3.25［0.83］；P= 0.048）（図2A）、逆シンプソン指数も同様であった（17.92［10.08］対12.52［9.00］；P= 0.03）（図2B）。
β多様性解析では、時間がプラセボ群におけるマイクロバイオーム全体の構成と関連していることが示された（R2= 1.76%;P= 0.004）（図3A）。多次元空間において、時間4のサンプルは、時間3（β係数、0.13［95％CI、0.07～0.19］；P= 0.02）、2（β係数、0.03［95％CI、-0.03～0.08］；P< 0.001）、および1（β係数、-0.02［95％CI、-0.07～0.04］；P= 0.001）のサンプルと、第1軸上で有意に離れていた（図3B）。プロバイオティクス群における各時刻のサンプルの分散は等しくなかった（時刻2と時刻4のセントロイドまでの距離の平均差、-0.05［95％CI、-0.09～-0.01；P= 0.008］；時刻3と時刻4の間、-0.04［95％CI、-0.08～0.00；P= 0.05］、分散の均一性検定）；したがって、この群では全体的なマイクロバイオーム組成の時間との関連性は評価できなかった。しかし、PERMANOVA解析の結果、群間および時間間の交互作用効果は認められず（F = 0.56;P= 0.97）、経時的なβ多様性の変化に群間で有意差がないことが示された。
非類似度指標からも、時間4における微生物叢組成は、両群とも時間1における微生物叢組成と比較して非類似であることが示された。時間2および3における組成も同様に時間1とは非類似であった（図3C）。β多様性の横断的解析では、4回ともプラセボ群とプロバイオティクス群の間に差は見られなかった（補足2の図1）。

プラセボ群とプロバイオティクス群間の分類学的組成の変化の違い

第1時点と比較して、第2時点ではプラセボ群ではEubacterium属の存在量が減少した（平均減少率0.03％[95％CI、-0.10％～0.04％]）が、プロバイオティクス群では変化は認められなかった（0[95％CI、0-0]；群間のlog fold変化の比較ではP＝0.05）。その他の属の変化については、時間2において時間1と比較して試験群間に有意差は認められなかった。第3時点では、第1時点と比較して4属の相対量の変化においてプラセボ群とプロバイオティクス群の間に有意差があった。Ligilactobacillus属の増加は、プラセボ群（0 [95% CI, 0-0];P= 0.02）と比較して、プロバイオティクス群（0.16% [95% CI, -0.05% to 0.37%]）で有意に大きかった。さらに、Desulfovibrio種の変化（プラセボ群-0.02％［95％CI、-0.05％～0.01％］に対してプロバイオティクス群-0.01％［95％CI、-0.01％～0.03％］、P= 0.049）、Barnesiella種の変化（プラセボ群0.18％［95％CI、-0.20％～0.56％］に対してプロバイオティクス群-0. 22% [95% CI, -0.65% to 0.22%] in the probiotic group;P= 0.02)、Marvinbryantiaspecies (0.01% [95% CI, -0.0004% to 0.02%] in the placebo group vs -0.03% [95% CI, -0.08% to 0.01%] in the probiotic group;P= 0.03)は群間で有意差があった。4時間目では、プラセボ群とプロバイオティクス群間の相対存在量の変化は、Monoglobus種（プラセボ群0.18％[95％CI、0.06％～0.29％]対プロバイオティクス群0.01％[95％CI、-0.05％～0.07％]、P= 0.005）、Lachnospiraceae UCG-003種（0. 09％［95％信頼区間、-0.02％～0.19％］（プラセボ群）、-0.01％［95％信頼区間、-0.02％～0.01％］（プロバイオティクス群）、Slackia種（0.02％［95％信頼区間、-0.01％～0.04％］（プラセボ群）、-0.01％［95％信頼区間、-0.03％～0.01％］（プロバイオティクス群）、P= 0.049）。これらのP値と増減は、図4に示すように、プラセボ群とプロバイオティクス群のlog fold changeの差の比較である。

プラセボ群とプロバイオティクス群間の分類学的組成の断面差

門レベルでの微生物叢の分類学的組成について、Verrucomicrobiotaはプラセボ群ではプロバイオティクス群と比較して第4時点で相対存在量が高かった（平均［SD］、0.23［0.06］ vs 0.01［0.02］；P= 0.04）（補足2の図2）。属のレベルでは、4つの時期にまたがる18の異なる分類群の存在量において、2群間で有意差が認められた（補足2の図3）。時刻1では、5属の存在量が2群間で有意差があった。補充されたプロバイオティクス製剤に存在する属については、プラセボ群と比較して、プロバイオティクス群では、時間2（平均［SD］、0［0.01］対0.002［0.01］；P= 0.008）および時間3（平均［SD］、0［0］対0.001［0.003］；P= 0.006）において、リギラクトバチルスに高い存在度が認められた。また、時間3において、Lactiplantibacillus属（平均［SD］、0［0］ vs 0.001［0.003］；P= 0.006）およびLactobacillus属（平均［SD］、0［0.002］ vs 0.004［0.01］；P= 0.004）でより高い存在度が認められた。ビフィズス菌については、4回のいずれの時点でも2群間に差は認められなかった。試験材料の摂取停止から1ヵ月後に相当する時点4では、補充された属に有意差は認められなかった。プラセボ群とプロバイオティクス群で観察されたすべての属の概要は、調整P値とともに補足3の表2から表4に示されている。

考察

このRCTの二次解析では、小児における抗生物質関連微生物叢異常に対するプロバイオティクス補充効果を検討した。α多様性は介入期間中2群間で差はなかったが、介入中止1ヵ月後のシャノン多様性および逆シンプソン指数はプラセボ群で高かった。研究対象としたプロバイオティクスは、微生物叢に対して軽微かつ一過性の影響を及ぼし、その中には5属中3属の補充期間中の存在量の増加が含まれた。
プロバイオティクスは抗生物質が誘発する腸内細菌叢の異常を緩和し、結果としてAADのような抗生物質関連の副作用を減少させるという仮説がある。しかし、そのメカニズムに関するエビデンスは、特に小児においては限られている14,15。本研究では、いずれの群においても抗生物質が多様性指標に及ぼす大きな影響は観察されなかったが、これは予想されていたことや小児を対象とした先行研究とは対照的であった4,25。その結果、最初の抗生物質投与は、ベースライン検体で測定された微生物叢組成にすでに影響を与えていた可能性がある。したがって、抗生物質治療を開始する前のベースライン時のα多様性は、実際にはベースラインサンプルで測定されたものよりも高かったと推測される。もしそうだとすれば、抗生物質治療中（時間2）、アルファ多様性はまず減少するだろう。その後、プラセボ群ではアルファ多様性が増加するか、時間4でベースラインに戻るが、プロバイオティクス群ではそうならない。2018年の研究26では、プロバイオティクスの補充は自然回復と比較して再構成が遅く、アルファ多様性は5ヵ月まで低下すると結論しているが、この研究は参加者数が非常に限られていた。最近のメタアナリシス28でも、抗生物質治療中のプロバイオティクス補充は多様性指標に影響しないと結論している。しかし、有害な細菌で満たされた多様性の高いマイクロバイオームは、健康な細菌で構成された多様性の低いマイクロバイオームと比較して、健康的でない可能性がある。どの分類群が善玉菌なのか悪玉菌なのかは、現在も議論が続いている。したがって、マイクロバイオームが多様であればあるほど健康的であるとは限らず、多様性に全体的な正味の変化がないからといって、意味のある変化がないとは限らない。
抗生物質に暴露された成人（n＝136）を対象とした別のプラセボ対照試験では、介入群にL paracaseiCNCM I-1518とL rhamnosusCNCM I-3690を14日間の抗生物質投与を含む28日間補充した27。しかし、この研究者らは、抗生物質投与中止後28日以内に抗生物質誘発性異常の程度が減少し、早期に回復することを見出している27。
抗生物質治療中の腸内細菌叢に対するプロバイオティクスの補充効果に関する他のいくつかの研究14,28では、多様性指標、微生物叢組成、回復時間に関して相反する結果が示されている。しかし、これらの先行研究では、成人や新生児を含む異なる研究集団、プロバイオティクスや抗生物質の種類、投与量、投与期間、異なる時期に採取され異なる方法で分析された便サンプルなどが含まれていた。
リギラクトバチルス属、ラクチプランチバチルス属、およびラクトバチルス属は、プロバイオティクスを投与された小児でより多く検出された。補充されたプロバイオティクス株のコロニー形成に加えて、プロバイオティクスの投与はマイクロバイオーム群集の分類学的組成と機能に幅広い変化をもたらす可能性がある。抗生物質は腸管上皮の機能低下とリーキーガットを引き起こし、下痢のリスクを増加させる25。抗生物質による上皮の機能低下を防ぎ、腸管バリアの完全性を刺激する可能性がある14。SCFAは大腸からの水分吸収を促進するため、SCFAが減少すると下痢を引き起こす14。プロバイオティクスのサプリメントを摂取している小児では、コプロコッカス属の存在量が高いことも観察された（補足2の図3）。Coprococcus属および炭水化物を主な炭素源として代謝する様々な乳酸菌は、炭水化物のSCFAへの消化において重要な役割を果たすため、これらの分類群の生息数が増加するとSCFA濃度が上昇する可能性がある。成人および動物モデルにおいて、さまざまな乳酸菌を補充するとSCFA濃度が上昇することが判明している。本研究では、下痢のある小児の数が限られていたため（プラセボ群13名、プロバイオティクス群7名）、AADにおけるプロバイオティクスの役割をさらに検討するために、下痢のある小児とない小児のサブグループ解析を行うことができなかった。
プロバイオティクスを投与された抗生物質曝露児の代謝物レベルを測定した研究は不足している。エビデンスが限られていることから、プロバイオティクスの正確な作用機序を解明するためには、微生物叢の機能に焦点を当てた今後のメカニズム研究が必要である。これによって、プロバイオティクス療法の最適な種類、組み合わせ、投与量、期間が明らかになるかもしれない。これらの研究は、プロバイオティクスへの曝露による長期的な健康転帰にも焦点を当てるべきである。

長所と限界

本研究の長所は、無作為化プラセボ対照試験デザインであり、プロバイオティクス曝露群と対照群を比較することができたこと、比較的多くのサンプルを標準的に収集できたことである。さらに、本研究は、抗生物質に暴露された小児における多種類のプロバイオティクスの縦断的効果に焦点を当てた、我々の知る限り初めての研究の一つである。
この研究にはいくつかの限界もある。下痢をした小児の数が限られていたため、下痢をした小児（非応答者）と下痢をしなかった小児（反応者）の微生物叢の違いを調べることができなかった。さらに、先に報告したように、ベースラインサンプルは、ほとんどの症例で最初の抗生物質投与後に採取されたため、抗生物質の影響を受けた可能性がある。最初の糞便サンプルの採取まで抗生物質の投与を延期することは不可能であり、倫理的にも問題があった。抗生物質が処方された感染症が腸内細菌叢の組成に影響を及ぼした可能性があり、特に消化管感染症があった症例ではそうであった。さらに、AAD発症率に焦点を当てた最初の試験でリクルートされたすべての小児が本研究のこの部分に含まれたわけではなかった。このため、微生物叢をアウトカムとして研究する力が失われた。とはいえ、抗生物質を投与されている小児における微生物叢に対するプロバイオティクスの効果を調査した最大規模の研究であることに変わりはない。脱落者が多かったことから交絡が生じた可能性があり、本研究はRCTであるが、交絡の残存を完全に否定することはできない。本試験では、ほとんどの参加者がオランダの施設から募集されたのに対し、当初の試験ではほとんどの参加者がポーランドで募集された。抗生物質治療の適応と期間、および国のガイドラインの違いにより、当初の試験に組み入れられた参加者と脱落した参加者に差が生じた。本研究に組み入れられた小児の年齢層は幅広く、異なる適応症に対して異なる種類の抗生物質が処方されたため、結果に影響を与えた可能性がある。食事など、本研究では測定されなかった微生物叢に影響を与える他の変数が、結果に偏りを与えた可能性がある。微生物叢の組成を調べるために16S rRNA遺伝子配列決定のみを行ったが、将来的には採取した検体についてメタボロミクス解析を行い、組成だけでなく微生物の機能についての洞察を可能にする予定である。

結論

このRCTの二次解析では、研究対象としたプロバイオティクスは、プラセボと比較して微生物叢に軽度かつ一過性の影響を及ぼし、これには、サプリメント摂取中にサプリメントを摂取した5属中3属の存在量が増加したことが含まれるが、その後1ヵ月追跡時にはベースラインレベルに戻ったことが含まれる。アルファ多様性とベータ多様性はプロバイオティクスの補充期間中に差はなかったが、シャノン多様性と逆シンプソン指数はともに1ヵ月後の追跡調査時にプラセボ群で増加していた。したがって、プロバイオティクスが抗生物質によって誘発された微生物叢の組成異常に対して有益な効果をもたらすかどうかについては、依然として議論の余地がある。分類学的組成に対する一過性の効果や多様性に対する効果が、AADを含む抗生物質誘発の副作用からの保護にメカニズム的な役割を持つかどうかを評価するためには、十分なベースライン・サンプルと均質な研究集団を用い、微生物叢の機能と微生物叢と臨床転帰との関連にも焦点を当てた今後の研究が必要である。
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論文情報

掲載受理 2024年4月22日
発行日：2024年7月5日 doi:10.1001/jamanetworkopen.2024.18129
オープンアクセス： 本論文はCC-BYライセンスの下で配布されているオープンアクセス論文です。© 2024 Dierikx TH et al.JAMA Network Open.
コレスポンディング・オーサー Thomas H. Dierikx, MD, PhD, Maastricht University Medical Center, P. Debyelaan 25, 6229 HX, Maastricht, the Netherlands(thomas.dierikx@mumc.nl).
著者貢献： Dierikx博士とde Meij博士は本試験の全データにアクセスし、データの完全性とデータ解析の正確性に責任を負う。
コンセプトとデザイン Łukasik、Besseling-van der Vaart、Szajewska、de Meij。
データの取得、解析、解釈： Dierikx、Malinowska、Łukasik、Belzer、de Meij。
原稿作成： Dierikx、Malinowska、Belzer、de Meij。
重要な知的内容について原稿を批判的に検討した： Łukasik、Besseling-van der Vaart、Belzer、Szajewska。
統計解析： Dierikx、Malinowska、de Meij。
事務的、技術的、物質的支援： Besseling-van der Vaart、Belzer、de Meij。
監督： Belzer、de Meij。
利益相反の開示： Dierikx博士は、本試験実施中にWinclove Probiotics BVから助成金を受けていたことを報告した。Dr Łukasikは、本試験実施中にWinclove Probiotics BVから助成金および非金銭的支援を受けたことを報告した。Szajewska博士は、研究実施中にWinclove Probiotics BVから非金銭的支援を受け、提出された研究以外ではBioGaia、Biocodex、Danone SA、Dicofarm、Nestlé SA、Novo Nordisk Inc、Nutriciaから個人的な報酬を受けていると報告した。de Meij博士は、本試験実施中にWinclove Probiotics BVから助成金を受けていることを報告した。その他の情報開示は報告されていない。
グループ情報： AAD（Antibiotic-Associated Diarrhea：抗生物質関連下痢症）における多種プロバイオティクス研究グループのメンバー一覧は補遺4に掲載されている。
データ共有声明： 補足5を参照のこと。

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