食事の標準化によりマイクロバイオームの個人内変動が抑制される

食事の標準化によりマイクロバイオームの個人内変動が抑制される
Clara Delaroque,Gary D. Wu,Charlene Compher,Josephine Ni,Lindsey Albenberg,Qing Liu, show all
論文 2149047｜Received 2022年7月26日, Accepted 2022年11月14日, Published online: 2022年11月25日
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https://doi.org/10.1080/19490976.2022.2149047
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概要
ヒトの腸内細菌叢は、個人間で非常に不均一であり、また個人内でもかなりの日間変動を示す。我々は、食事がこのような個人間および個人内変動に寄与していると仮定した。そこで、食事の正常化が微生物叢の不均一性にどの程度影響を与えるかを調べた。我々は、最近報告された摂食管理研究の対照群を活用し、9人の健常者に10日間標準化された無添加食を摂取させた。食事の正常化は、個人間の差には影響を与えなかったが、糞便微生物叢組成の個人内日間変動の程度を減少させることができた。このような不均一性の減少は、個人特有の微生物叢メンバーの濃縮と枯渇を反映しており、微生物叢の炎症誘発性を反映する糞便中のLPSとフラジェリンの個人内変動が減少する傾向にも並行してみられた。しかし、一部の被験者のマイクロバイオータは研究期間中に有意な変化を示さなかった。これは、食事ストレスに対するマイクロバイオータの耐性に不均質性があるか、一部の被験者のベースラインの食事がおそらく本研究の標準食と類似していたことを示唆している。このことから、短期的な食事の不均一性は、日々の個人内の微生物叢組成のばらつきに寄与していることが示唆された。

キーワード：腸内細菌叢、食事、微生物叢の安定性
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はじめに
マウスの腸内細菌叢は、様々な食事成分によって急速に変化し、その結果、様々な炎症性疾患に対する感受性が変化することが、多くの文献で示されている1,2。一方、ヒトのマイクロバイオームが食事によってどの程度変化し、それに伴って疾患に対する感受性が変化するかは、あまり明らかではない。このような不明確な点の要因の1つは、個人間のマイクロバイオータ組成のベースラインの違いと、個人を異なる日に採取した場合の少ないながらもかなりの個人内分散の点で、ヒトのマイクロバイオータの高い異質性である3,4。食事成分がヒトの微生物叢にどのような影響を与えるかを調査することは、個人間および個人内の高い食事不均質性によって本質的に複雑になるため、調査対象の特定の食事成分とは無関係に微生物叢が変化し、最終的にその効果が不明瞭になる可能性もある5）。 -これらの理由から、一般的な食品添加物であるカルボキシメチルセルロース（CMC）に関する我々の最近の臨床研究、Functional Research on Emulsifiers in Humans (FRESH) 9 では、「各被験者が自分自身のコントロールとして」デザインを採用し、CMCを強化または含まない標準的無添加加工食品管理食（AF-PFF食）摂取前・間・後のそれぞれの被験者の微生物叢をモニタリングした。その結果、CMCは微生物叢を変化させるが、その影響の程度は非常に個人差が大きいという、マウスにおける我々の以前の結果10と一致するものであった。

本研究の目的は、FRESH試験の対照群を活用して、無添加食による食事の正常化がどの程度までマイクロバイオータの個体間および個体内のばらつきを減らすかを明らかにし、さらに、CMCによる摂動に対するマイクロバイオータの回復力が、ヒトのマイクロバイオータがAF-PFFなどの様々な食事操作に対して比較的抵抗力があるという一般的な傾向を反映しているかどうかを調べることであった。その結果、AF-PFFが腸内細菌叢に与える影響は非常に個人差が大きく、組成や機能における個人差の程度に変化はないことがわかった。それにもかかわらず、AF-PFFによる食事の標準化は個人内変動を減少させ、食事の不均一性が微生物叢の変動に寄与しているという考え方を支持するものであった。さらに、我々の結果は、食事の標準化を行うことで、特定の対象物質によって誘発される可能性のある微生物叢の変化を検出する感度が向上する可能性を示唆するものであった。

研究結果
微生物叢組成の個人差は、食事の標準化がもたらす潜在的な影響を凌駕する
微生物叢の個人間および個人内（すなわち時間的）変動が食事の標準化によってどの程度影響を受けるかを明らかにするため、最近報告された研究の対照群のサンプルを利用した。この研究では、被験者（N = 9）に、慎重に管理した条件下で、11日間、無添加加工食品（AF-PFF）制御食を与えた（図1A）。AF-PFFの実施中、実施前、実施後に採取した糞便を微生物叢評価に使用した。糞便1gmあたりの細菌の総量、すなわち糞便細菌密度は、AF-PFF食摂取の前半に非統計的に有意な増加が観察されたものの、有意な影響はなかった（図1b, c）。9人の参加者から収集した全サンプルのJaccard β多様性距離の主座標分析では、予想通り、また以前に報告されたように5,11、参加者間の微生物叢組成の高いレベルの変動が、ある参加者から収集した全サンプルが明確にクラスタリングされていることによって示されている（図1d）。対照的に、試験段階（AF-PFF食の前、途中、後）に基づいたプロットの色付けは、食事段階がマイクロバイオータ組成に及ぼす大きな影響を示すことができず、AF-PFFの影響は、ベースラインの個人間差の程度に比べてわずかであることが示された（図1e）。したがって、図1fに示すように、微生物叢組成の個人間変動は、参加者間で観察されたJaccard距離が家庭（介入前および介入後の両方）およびAF-PFF食の下で類似していたことから、均質なAF-PFF食消費によって減衰されることはないことが分かった。同様の観察は、Bray-Curtis距離を分析したときにもなされた（図1g）。したがって、AF-PFF食による食事の標準化は、微生物叢組成の個人間差異を減少させるのに十分でなかった。

図1. 個体間差は、細菌負荷と微生物叢組成に対する食事標準化の影響を支配している。(a) 9人の健康なボランティアに、4日目から14日目まで管理食を与えた。(b-c) 経時的な糞便細菌負荷の個人差を糞便1gあたりの細菌数で表した(b)、(c)のデータは介入前の個人差を正規化するため、0日目のサンプルを1に正規化している。濃い茶色の線は、平均値±SEMを表す。(d-e) 16S rRNA遺伝子配列決定によって評価された参加者の糞便微生物叢のJaccard距離行列の主座標分析(PCoA)。すべての時点が表現に含まれ、サンプルは参加者別（d）、または時点のカテゴリー別（管理食前、管理食中、管理食後）（e）に色分けされている。(f) 試験開始0日目、14日目、48日目、107日目の参加者間のJaccard距離。(g) 0日目、14日目、48日目、107日目の参加者間のブレイ・カーティス距離。平均値±SEMを表し、有意性はそれぞれDunnett posttestまたはSidak posttestで補正した反復測定ありまたはなしの一元配置分散分析を用いて評価した。(**p ≤ 0,01; n.s.は有意差なしを示す).

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AF-PFF食の標準化は、日々の個体内微生物叢組成のばらつきを低減した
次に、AF-PFF食が参加者内の微生物叢組成の日内変動に与える影響を解析した。微生物叢組成の個人内変動は、各参加者を独立して分析した際のJaccard距離の日間変化を測定することで評価した。このようなアプローチにより、家庭食とAF-PFF食の間で測定した場合でも、個人間の微生物叢組成の変動は、個人内の微生物叢組成の変動と比較して有意に大きいことが示された（図S1）。さらに重要なことは、このアプローチで微生物叢組成の日々の変化を可視化すると、各被験者の微生物叢は、介入前後の食事段階と比較して、AF-PFF食事段階においてより安定しているように見えたことである（図2a）。また、4日間隔で採取した同一被験者のサンプルを分離するJaccard距離は、試験中に徐々に減少し、0,459±0,018から始まり、AF-PFF期終了時には0,391±0,018となり、均質なAF-PFF食の摂取によって誘発される微生物叢の安定化がさらに強調されている（図2b）。さらに、このような個人間変動は、AF-PFFと食事後の段階の間で（0,493±0,017）、また、各参加者のAF-PFF治療後の段階における2つのサンプルを比較したとき（0,458±0,015、図2b）、有意に増加した。これらのデータから、家庭での食事が不均質な場合、AF-PFFの食事が均質な場合と比較して、微生物叢組成の日々の変動が大きいことが示唆された。

図2. 食事の標準化により、個人のマイクロバイオータ組成の日々の変化の程度が減少する。9人の健康なボランティアに、4日目から14日目まで管理された食事が与えられた。(a) 16S rRNA遺伝子配列決定で評価した参加者の糞便微生物叢のJaccard距離行列のPCoA第1軸。暗褐色の線は平均値±SEMを表す。(b）個人内のJaccard距離-0日目（家庭食）と4日目（無添加食）の間、無添加食内で離れた4日間すべての間（対応するバーの下に矢印で示す）、14日目（無添加食中）と48日目の間（家庭食）、48日目と107日目の間（家庭食と家庭食の間）。矢印の横の括弧内の数字は、解析したタイムポイント間の日数を示す。各点は1人の参加者を表す。(c-d) 代表的な2人の参加者のJaccard距離行列のPCoA。各点は1つのタイムポイントを表し、各色は研究の1つの段階を表す。平均値±SEMを表し、有意性は反復測定ありまたはなしの一元配置分散分析を用いて決定し、それぞれDunnettまたはSidak posttestで多重比較の補正をした。(*p ≤ 0,05; ***p ≤ 0,001; n.s.は有意差なしを示す).

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このような考え方は、代表的な参加者のJaccard座標をプロットしても明らかであり、AF-PFF食期（青い点）の日々の変化の程度は、食前（緑の点）または食後（ピンクの点）で観察したものよりも小さかった（図2c-d）。これらの観察結果は、AF-PFF食の毎日の摂取が、微生物叢組成の日々の個体内変動を減少させたことを示している。

AF-PFF食は、微生物叢の組成と機能を個人ごとに調節することを可能にした。
AF-PFFによる食餌の標準化がどのように個体内のβ多様性を安定化させたかをより理解するために、次に、個々の微生物叢の分類を系統レベルで解析した。その結果、AF-PFFの食事は、非常に個人差のある方法で微生物叢の分類群に影響を与えることが観察された（図3a, b）。例えば、15009、15017、15020、15029の参加者は、AF-PFF食摂取により、プロテオバクテリア門に属するRF32目の著しい増加を示したが（図3）、これは標準化食を中止した後も維持されなかった。他の例としては、参加者15012人または15017人のBifidobacteriales目、参加者15009人、15012人、15029人のVerrucomicrobiales目がある（図3b）。このような微生物叢メンバーの個体差は、標的メタボロミクスで評価した糞便代謝物プロファイルの顕著な変化とは関連していなかった（図3c）。

図3. 食事の標準化は、特定の参加者の様々な微生物叢のメンバーを変化させる。9人の健康なボランティアは、4日目から14日目までの間、制御された食事にさらされた。(a-b) 分類順の微生物叢組成を相対的存在量で表す。0日目から14日目までの、ClostridialesとBacteroidales目はパネルaに、その他の目はパネルbに示されている。矢印は、結果セクションで説明した微生物相の順番を示す。(c) 便中代謝産物の相対量を0日目から数日間にわたって示した。

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参加者全員について、個々の微生物叢メンバーを経時的に追跡すると、AF-PFF食に対する非常に個別的な反応が浮き彫りになった（図S2）。一部の参加者は、特定の微生物叢メンバーについて著しい増加または減少を示し、他の参加者は全く影響を受けないままだった（図S2）。同様に、AF-PFF食の摂取によって影響を受ける代謝物のほとんどは参加者固有のものであり、アラニン、チロシン、分岐鎖アミノ酸などの特定の代謝物の増加は、AF-PFF食期間中にほぼすべての参加者で観察された（図S3）。また、メタボロームデータをBray Curtis距離の主成分分析で計算すると、参加者ごとにある程度のクラスタリングが見られたが（図S4A）、食事の均質化の影響はこれらの差を正規化するには十分ではなく（図S4A、C）、個人内変動にも影響を与えなかった（図S4B、D）。

このように、AF-PFF食の摂食期間が腸内環境に及ぼす機能的影響は、この比較的短い期間では限定的であり、非常に個人差のある影響が観察された。これらの観察から、腸内細菌叢の組成および代謝物の生産は、食餌調節および食品添加物の除去に対して比較的高いレベルの回復力を持つことが示唆される。

AF-PFF食の摂取が参加者の微生物相に及ぼす影響をさらに調べるため、次にアルファ多様性、すなわち種の豊かさのシャノン指数とイーブネス指数を調べた。このことは、AF-PFF食は、少なくともこのような短期間の暴露期間中や平均値で見た場合、この微生物叢の特徴に有意な影響を与えるには十分ではないことを示唆している（図4）。正規化されていないパネルAおよびCに示されているように、参加者のアルファ多様性指数は、我々の試験の各フェーズ間でかなり安定していたが、一部の参加者に微妙な効果が観察され、糞便微生物叢の豊かさが時間の経過とともに比較的強く回復することが示唆された（図4）。次に、多くの微生物叢メンバーによって発現され、微生物叢の炎症誘発性の代理人であることが以前に報告されている炎症誘発性分子リポポリサッカライド（LPS）とフラジェリンの糞便レベルに対する制御された均一な食事の影響について調べた12。したがって、平均して、糞便フラジェリンとLPSはAF-PFFによって有意な影響を受けなかったが、AF-PFF初期に上昇する傾向を示し、糞便細菌密度に関する観察と類似していた。さらに、AF-PFF期間中に糞便中のLPSおよびフラジェリンの個体内日間変動が減少する傾向が観察されたが、統計的有意差には至らなかった（p = .11 and 0.15, 図S5）が、それでもこの期間に観察された微生物叢組成の個体内変動減少に一致する。

図4. 食事の標準化は、個人のマイクロバイオータα多様性の変化を誘発しなかった。9人の健康なボランティアに、4日目から14日目までの間、制御された食事が与えられた。(a-b) 16S rRNA遺伝子配列決定後に評価した研究期間中の偶奇性α多様性マトリックス (a), (b) のデータは、介入前の個人間変動を正規化するため、0日目のサンプルを1として正規化したもの。(c-d) 16S rRNA遺伝子配列決定後に評価した研究期間中のシャノンアルファ多様性マトリックス (c)、(d)のデータは、介入前の個体間変動を正規化するために、0日目のサンプルを1に正規化した。濃い茶色の線は平均値±SEMを表し、有意性はDunnett posttestを用いた反復測定による一元配置分散分析を用いて評価した。

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図5. 食事標準化後の微生物叢の炎症性潜在能力の変動は、参加者に大きく依存する。9人の健康なボランティアに、4日目から14日目まで管理食を与えた。(a-b) HEK-TLR5レポーター細胞を用いて測定した試験期間中の糞便中の生物活性フラジェリンレベル。データは糞便1gあたりのmgで表され、(b)のデータは介入前の個人間変動を正規化するため、0日目のサンプルを1として正規化されている。(c-d）HEK-TLR4レポーター細胞を用いて測定した試験期間中の生理活性リポ多糖の糞便レベル、データは糞便1g当たりのmgで表した（c）、（d）のデータは、介入前の個人差を正規化するために0日目の試料を1に正規化した。濃い茶色の線は平均値±SEMを表し、有意性はDunnett posttestを用いた反復測定による一元配置分散分析を用いて評価した。

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AF-PFF食に対する宿主応答の不均質性
最後に、腸の炎症の宿主マーカーである糞便リポカリン-2に対するAF-PFF食の影響を調べた13。縦断的に採取した糞便サンプルのこのパラメータの定量化は、AF-PFF段階において、一部の参加者が糞便リポカリン-2レベルの比較的安定した減少を保有していたものの、AF-PFF下での食事の標準化が炎症性緊張に影響を与えるほどではなかったことを示している (Figure 6. a, b),。各参加者のリポカリン-2、フラジェリンおよびLPSのレベルを見ると、AF-PFFに対する反応も非常に不均一であった（Fig. S6）。したがって、AF-PFFは、それ自体では、炎症に関連する微生物叢または宿主パラメータに有意な影響を与えない。

図6. 制御された均一な食事に対する宿主反応は不均一であり、個人差がある。9人の健康なボランティアに、4日目から14日目までの間、制御された食事を与えた。(a-b）0日目からそれ以降の炎症マーカーであるリポカリン-2の糞便レベル。（a）は糞便1gあたりのngで表され、（b）のデータは介入前の個人間変動を正規化するために0日目のサンプルを1として正規化されている。濃い茶色の線は、平均値±SEMを表す。AF-PFF食後（14日目）の糞便中の生物活性フラジェリンレベルとAF-PFF食後（14日目）の糞便中のリポカリン-2レベルとをプロットした。有意性は、反復測定による一元配置分散分析（Dunnett posttest）を用いて評価した。(*p ≤ 0,05).

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考察
14 この複雑な微生物群集の役割には、腸管免疫系の成熟促進や腸内病原体に対する防御が含まれる。さらに、微生物叢の組成および/または機能の変化は、炎症性腸疾患やメタボリックシンドロームなど、炎症を伴う多くの疾患の促進に関与しています1、2、15、16。疾患と関連した微生物叢の変化に加えて、健常者における微生物叢のばらつきにも大きな幅があります。微生物叢の異常の理解に多くの努力が払われているが、健康な個体内で微生物叢の安定性が維持されるメカニズムや、疾患時にどのように変化するのかについては、まだ十分に解明されていないのが現状である。マウスを用いた研究により、腸内細菌叢の組成の形成には多くの遺伝的および環境的要因が関与していることが示唆されているが、中でも食事が重要な役割を果たしているようで、おそらく摂取した食物がこの複雑な生態系の平衡に日々影響を与えていることを反映していると思われる。一方、食事がヒトの微生物叢の組成の安定性をどの程度変化させるのか、また、それに伴って疾患に対する反応がどの程度擾乱されるのかについては、あまり明らかではない。

本研究では、最近行われたFRESH研究9の対照群を利用して、無添加・無加工食品による食事の標準化が、個人間および／または個人内の微生物叢の変動にどの程度影響するかを調査しようとしたものである。その結果、健康成人がAF-PFF食で食事を標準化しても、マイクロバイオータ組成の個人間差は減少しなかったが、個人内の日々の変動は減少し、食事の不均質性がマイクロバイオータ組成の変動に寄与しているという考えが支持されることが確認された。このような個人内の微生物叢の変動の減少は比較的早く（7日間）生じたが、AF-PFF食の中止直後の数日間は試料が採取されなかったため、その経時的安定性はまだ検討されていない。さらに、AF-PFFが被験者間のばらつきを減らすことができないことから、少なくとも本研究の短期間においては、そのようなばらつきは食品添加物だけの結果ではないことが主張され、微生物叢組成における比較的高い被験者間の差異に関する以前の観察と一致する7,17。しかし、長期的な食習慣が幅広い分類学的差異と関連するという以前の観察7と、添加物の除去が特定の個人における健康関連微生物叢メンバー（ビフィズス菌およびVerrucomicrobiales目）の著しい増加を引き起こすのに十分であるという我々の観察から、同様のAF-PFFが長期にわたる個人間格差を低減するかどうかを調べることが必要であることが示唆された。食事の標準化効果に加えて、AF-PFF期間中に参加者が入院することで、サンプルの取り扱いと保存が改善され、特定の微生物叢メンバーの相対的存在量に影響を与える可能性がある。このことは、実験的に誘発された変動を人為的に減少させる可能性があり、したがって、AF-PFF食事療法中に観察された個人内変動の減少に一役買っている可能性がある。

重要なのは、FRESH試験で被験者内変動が減少したという観察結果が、食事が微生物叢に影響を与えるという考え方を一般に支持していることである。Sonnenbergら18も同様の結果を示している。7日間の均質な食事により、微生物叢組成の個人内変動、種の豊富さと多様性の変化、および糞便代謝物の個人内変動が同様に減少し、我々のAF-PFF食アプローチで得られた観察結果と一致している。これらの結果は、組成と期間の異なる2つの均質な食事で一致しており、食事の均質化が日々の微生物叢の変動を抑制する能力を持つことを強調するものである。Sonnenbergの研究参加者による均質な食事の摂取は、均質な食事の段階において、わずかではあるが有意な対人変動の減少を誘発し、AF-PFFの間に観察された変動レベルと相反していた。我々は、AF-PFFが微生物叢組成の被験者間差異を減少させないという我々の観察が、以前に行われた対照摂食試験での観察と一致していることに注目したい7。これらの矛盾する結果は、食事の均質化が個人間差異に及ぼす影響が小さいことを解読するためには、より多くの参加者が必要であることを示唆しているかもしれない。もう一つの可能性は、食品添加物が腸内細菌叢の構成に影響を及ぼす可能性があることを考えると、この過去の研究では食品添加物の摂取の均質化が観察された個人間変動の減少の大部分を牽引しており、一方、AF-PFF食では、すべての参加者が同様の食事駆動型ストレス要因にさらされないようにして個人間変動を保存しているということである。

これらの知見は、食事の標準化が、ある化合物／添加物の腸内細菌叢の組成と機能を調節する能力に関する調査の力を最終的に最適化することができるという考えを支持するものである。実際、まだ検証されていないが、腸内細菌叢組成に対する未定義の食事要因の影響による日々の変動は、研究対象の食事要因の効果を覆い隠す可能性がある。

研究方法
研究デザイン
本補遺で使用したデータは、ペンシルバニア大学のCenter for Human Phenomic Science（CHPS）で実施された無作為化対照摂食試験から得られたもので、試験番号として https://ClinicalTrials.gov で登録されている。NCT03440229.9 試験の最初の 3 日間は外来患者として、その後 11 日間は入院患者として実施された。CHPS病棟に入院した参加者は、研究スタッフの付き添いがない限り病棟を離れることができませんでした。この研究には9人の健康なボランティアが参加し、14日間、無添加の標準化された食事が提供されました。研究の詳細については、Chassaing et al.9に記載されている。

食事
すべての食事は、CHPSメタボリックキッチン内で乳化剤を使用せずに調理された。すべての参加者は、同じ西洋式食事（唯一の違いは分量）に従った。試験食のカロリーの主要栄養素の割合は、炭水化物55％、脂肪30％、タンパク質15％であった。19-21 食事療法は2つのメニューで構成され、交互に摂取された。水、ブラックコーヒー、プレーンティーは希望に応じて提供された。参加者は、提供された食事以外に追加で食事をとることができたが、追加で食事をとるためには、前回の食事がすべて消費されている必要があった。

検体採取
便サンプルは、外来食開始前、入院中、退院後1ヵ月および3ヵ月に、保存料や安定剤なしで採取された。その日の最初の便は分注し、-80℃で凍結した。入院中の他の便はすべて重量を測定した後、廃棄した。入院4日目と14日目に、各参加者はS状結腸鏡検査を受け、肛門縁から約15cmの領域（これはほぼ直腸S状結節に相当する）から生検を受けた。S状結腸鏡検査に先立ち、腸の前処置は行わなかった。生検試料は非変性共焦点顕微鏡検査用にCarnoy溶液に入れられた。

イルミナ技術を用いた16S rRNA遺伝子配列決定による微生物叢の解析
16S rRNA遺伝子の増幅と配列決定は、Earth Microbiome ProjectのプロトコルにMOBIO PowerSoil DNA Isolation KitのDNA抽出手順を修正したIllumina MiSeqテクノロジーを利用した http://www.earthmicrobiome.org/emp-standard-protocols.2,3 QiagenのPowerFecal-HTキットを用いて冷凍糞からバルクDNAを機械的破壊（ビーズビーティング）により抽出した。16S rRNA 遺伝子、領域 V4 は、複合フォワードプライマーと、Golay 誤差補正スキームを用いて設計したユニークな 12 塩基バーコードを含むリバースプライマーを用いて、それぞれのサンプルから PCR 増幅し、PCR 産物にタグ付けした3。フォワードプライマー 515 F 5'- AATGATACGGCACCGAGATCACGCTACGCXXXXXXXXXTATGTAATTGTGTGYCAGCMGCCGCGTAA-3'を使用した。斜体の配列は5'Illuminaアダプター、12×配列はGolayバーコード、太線の配列はプライマーパッド、斜体と太線の配列はプライマーリンカー、下線の配列は保存細菌プライマー515 Fである。使用したリバースプライマー806 Rは、5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAGCCAGCCGACTACNVGGTWTCTAAT-3'：斜体の配列は、Illuminaアダプターの3'逆相補配列、太線の配列は、プライマーパッド、斜体の太線の配列は、プライマーリンカー、下線の配列は、保存された細菌のプライマー806 Rである。PCR反応はHot Master PCR mix (Quantabio, Beverly, MA, USA), 0.2 μM of each primer, 10-100 ng templateからなり、反応条件はBioradサーモサイクラーで95℃で3分、その後95℃で45秒、50℃で60秒、72℃で90秒を30サイクル繰り返した。PCR産物はQuant-iT PicoGreen dsDNA assayを用いて定量した。精製産物から等モル比でマスターDNAプールを生成し、その後Ampure magnetic purification beads (Agencourt, Brea, CA, USA) を用いて精製した。プールした産物をQuant-iT PicoGreen dsDNA assayを用いて定量し、Cornell University, Ithaca, NYでIllumina MiSeq sequencer (paired-end reads, 2 × 250 bp) を用いて塩基配列を決定した。

16S rRNA遺伝子配列解析
16S rRNA配列は、QIIME2 - バージョン201922を使用して解析した。 イルミナアンプリコン配列データを検出および修正するために、QIIME2デフォルトパラメータでDada2法23を用いて配列を脱多重化および品質フィルタリングし、Qiime 2配列バリアント（SV）のテーブルを作成した。次に、align-to-tree-mafft-fasttreeコマンドを用いて系統多様性解析のための木を作成し、core-metrics-phylogeneticコマンドを用いてαおよびβ多様性解析を計算した。微生物叢組成の個人差を正規化するため、1日目のデータは同定されたすべてのSVを1として正規化し、他の日のデータは各患者について、1日目のデータとの相対値として表現されるようにした。サンプル間のばらつき（β多様性）を評価するために、Jaccardメトリックの主座標分析（PCoA）が可視化された。分類学分析のために、Greengenes参照データベース13_8とのペアワイズ同一性が99%の閾値を持つSVに分類学を割り当てた。24 食事の標準化によって有意に影響を受けるASVは、MaAsLin2 Rパッケージ、Rソフトウェアバージョン4.1.2を使って同定された。未処理のシーケンスデータは、European Nucleotide Archiveにアクセッション番号PRJEB55423で寄託されている。

16S rRNA qPCRによる細菌密度の定量化
抽出したDNAを滅菌DNAフリー水で1/10に希釈し、16S V4特異的プライマー515 F 5'-GTGYCAGCMGCCGCGTAA-3' および806 R 5'-GGACTACNVGGTWTCTAAT- 3' を用いて定量PCRにより増幅した。 3'、またはAIEC LF82 PTM特異的プライマー PTM-F 5'- CCATTCATGCAGCAGCTTT -3' と PTM-R 5'- ATCGGACAACATTAGCGTGT -3' を用いて、 QuantiFast SYBR® Green PCR Kit (Qiagen) を用いて、 LightCycler 480 (Roche) で実施した。PCR産物の増幅は2%アガロースゲルでの電気泳動で確認し、データはDNA抽出に用いた糞便重量で正規化した相対値で表した。

糞便中フラジェリンおよびリポポリサッカライド負荷の定量化
糞便中の生物活性フラジェリンおよびリポ多糖（LPS）のレベルは、ヒト胚性腎臓（HEK）-Blue-mTLR5およびHEK-BluemTLR4細胞（Inivogen、カリフォルニア州サンディエゴ、米国）をそれぞれ用いて、先に述べた25ように定量化された。糞便をPBSに再懸濁し、最終濃度を100 mg/mLとし、細菌の破砕を避けるためにビーズを加えずにMini-Beadbeater-24を用いて10秒間ホモジナイズした。その後、サンプルを8000 gで2分間遠心分離し、得られた上清を連続的に希釈して哺乳類細胞上に塗布した。HEK-Blue-mTLR5細胞およびHEK-Blue-mTLR4細胞を用いた標準曲線決定には、精製大腸菌フラジェリンおよびLPS（Sigma-Aldrich社）をそれぞれ使用した。24時間刺激後、細胞培養上清をQUANTI-Blue培地（Invivogen）にアプライし、30分後に620nmでアルカリホスファターゼ活性を測定した。

便サンプルのメタボローム解析
NMR のための便サンプルの調製は、以前に説明したように行った1,26H NMR スペクトルは、Bruker Avance NEO 600 MHz spectrometer に inverse cryogenic probe (Bruker Biospin, Germany) を装備して 298 K で取得し、 NOESYPR1D という典型的な 1D NMRスペクトルがサンプルごとに取得された。代謝物は、発表された結果27 に基づいて割り当てられ、一連の 2D NMR スペクトルで確認された。すべての 1H NMR スペクトルは，Chenomx（Chenomx Inc，カナダ）を用いて位相とベースラインを調整した．1H NMR スペクトルの化学シフトは 3-trimethylsilyl [2,2,3,3-d4] propionate sodium (TSP) を基準にδ0.00とした。代謝物の相対的な含有量は、スペクトル積分の総和に対して正規化することで算出した。便中の代謝物の定量は、Chenomxを用いてTSPに対するNMRピーク面積で算出した。

ELISAによる糞便中リポカリン-2（Lcn-2）の定量化
便中Lcn-2のELISAによる定量は、凍結便を0.1% Tween 20を含むPBSで終濃度100 mg/mLに調整し、20分間ボルテックスして均一な便中懸濁液を得た後、14 000 g、4℃で10分間遠心分離した13。透明な上清を回収し、分析まで-20℃で保存した。Lcn-2レベルは、発色ペルオキシダーゼ基質テトラメチルベンジジンを用いたDuoset Human Lcn-2 ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) を用いて上清中に推定し、光学密度（OD）は450 nm（Versamaxマイクロプレートリーダー）を読み取った。

統計解析
有意性は、反復測定ありまたはなしの一元配置分散分析を用いて決定し、それぞれ Dunnett または Sidak 後検定で多重比較の補正を行った。正規性とホモソデシティーの仮定に従わないデータの有意性は、それぞれDunnの検定で多重比較を補正したKruskal-WallisとDunnettの検定で多重比較を補正したBrown-ForsytheとWelch ANOVAを用いて検定された。差はP≦0.05で有意と記した。

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謝辞
FRESH研究の実施にご協力いただいたLillian Chau、Brittaney Bonhomme、Lisa Nesselに感謝いたします。

利益相反
ルイス博士は、Eli Lilly and Company, Samsung Bioepis, UCB, Bristol-Myers Squibb, Nestle Health Science, Merck, Celgene, Janssen Pharmaceuticals, Bridge Biotherapeutics, Entasis Therapeutics, AbbVie, Pfizer, Gilead, Arena Pharmaceuticals, Protagonist Therapeutics, Amgen, Scipher Medicineに対してコンサルティングや諮問委員を務めている。また、Nestle Health Science、武田薬品工業、Janssen Pharmaceuticals、AbbVieから研究資金を獲得しています。Chassaing博士は、Nestlé、Procter and Nobles、Qiagenから謝礼とコンサルティング料を受け取っています。その他の著者は、Agence Nationale de la Recherche</#funding-source; HORIZON EUROPE European Research Council</#funding-source; IdEx Université de Paris.と、競合するものはないことを明らかにしている。

補足資料
本論文の補足データは、https://doi.org/10.1080/19490976.2022.2149047 からオンラインでアクセス可能です。

追加情報
資金提供
B.C.は、欧州連合のHorizon 2020研究・革新プログラムの下、欧州研究会議（ERC）からのスターティンググラント（助成金契約番号：No. ERC-2018-StG- 804135 INVADERS）、- ANR-18-IDEX-0001 からの Chaire d'Excellence、Kenneth Rainin Foundation からの Innovator Award、ANR grant EMULBIONT ANR-21-CE15-0042-01, Fondation de l'Avenir (AP-RM-21-032) および INSERM の国家プログラム "Microbiote" から資金を提供されています。この研究は、NIHの助成金DK115180, 5UL1TR001878, P30-DK050306, DK099071, DK083890およびペンシルバニア大学Penn栄養科学・医学センターからも支援を受けている。
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