2種類の病原性真菌に対するJuglans regiaのエンドファイト微生物群の反応パターン

哉百名

2024年4月12日 10:48

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Front. 微生物学、2024年4月11日
微生物共生
第15巻 - 2024年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2024.1378273
この論文は次の研究テーマの一部です。
植物マイクロバイオーム：相互作用、作用機序、応用、第3巻
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2種類の病原性真菌に対するJuglans regiaのエンドファイト微生物群の反応パターン

https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2024.1378273/full?utm_source=S-TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FCIMB_XXXXXXXX_auto-dlvrit

Ziye Wang,Ziye Wang1,2Lu Xu,Lu Xu2,3Xiaoyue Lu,Xiaoyue Lu2,3Ruidong Wang,Ruidong Wang2,3Jie Han,Jie Han2,3Aihua Yan、
厳愛華2,4*研究室
1中国林業科学院生態自然保護研究所国家林業草地管理局森林保護重点実験室、中国、北京
2中国、河北省保定市、河北農業大学林学院
3Hebei Province Key Laboratory of Forest Trees Germplasm Resources and Forest Protection, Baoding, China（河北省保定市、中国
4中国、河北省保定市、河北省都市森林衛生技術革新センター
宿主植物が病原菌によってストレスを受けた場合、内生微生物群集は再集合し、植物の免疫バランスに関与する。しかし、この集合体が病原体特異的なものであるかどうかや、複数の病原体が存在する場合に制御経路がどのように調整されるかは、依然として不明である。そこで、Colletotrichum gloeosporioides（Cg処理）とFusarium proliferatum（Fp処理）の感染がクルミの葉のエンドファイト微生物叢に及ぼす影響について、その集合、共存パターン、葉の内部環境の総合的な化学的機能を調べるために、種子胚組織培養技術を用いてクルミと病原性真菌の相互作用系を構築した。本研究では、CgおよびFp処理後のクルミの樹において、3群（対照群、Ck；Cg；Fp）間で内生微生物群集の集合に違いが見られた。相対的な存在量の変化にもかかわらず、2つの病原菌の感染中、門と属の支配的な群集は同等であった。エンドファイト菌類は、エンドファイト細菌よりも病原菌に敏感であった。両者ともバチルスやシュードモナスなどの有益菌の濃縮を促進し、群集のモジュール性を変化させ、エンドファイト群集の安定性と複雑性を低下させた。病原菌の感染は、主にポルフィリンとクロロフィルの代謝、プリン代謝、フェニルプロパン代謝、アミノ酸代謝に影響を与えた。しかし、感受性植物の違いによる二次代謝産物には有意な差は見られなかった。さらに、内在性拮抗菌のスクリーニングにより、シュードモナス・サイコロトレランスとバチルス・サブチリスが2つの病原性菌に対して抑制作用を持ち、葉と病原性菌の相互作用に関与していることを確認した。抗菌性物質は、1-メチルナフタレン、1,3-ブタジエン、2,3-ブタンジオール、トルエンアルデヒドであると考えられる。

1 はじめに
クルミの木としても知られるJuglans regiaは、木質穀物や油のため、中国では経済的・生態学的に大きな価値を持つ（Su et al.）しかし、この樹種は病原性真菌、特に葉斑病を引き起こすColletotrichum gloeosporioidesとFusarium proliferatum（Crousら、2004；Wangら、2022）による大きな問題に直面している。発病初期には、葉の縁に不規則な褐色の斑点が現れ、葉が縮れる。後期になると、病害は縁に沿って内側に進行し、葉全体に影響を及ぼし、葉は枯れる（Wang et al.）現在、植物病害を制御するための新たな研究アイデアとして、エンドファイトが提案されている。エンドファイトは、植物の病原性を引き起こすことなく、植物細胞や細胞間隙に定着する。それらはしばしば必須栄養素を供給し（Luら、2018）、成長を促進し（Chialvaら、2018；Dubeyら、2019）、ストレス耐性を増強する（Berendsenら、2012）。したがって、エンドファイトは、植物の防御メカニズムを理解し、持続可能な農業を推進するための重要な研究分野である。

病原菌は、相関するシグナル伝達経路を通じて微生物関連分子パターン（MAMPs）の植物免疫反応を引き起こし、宿主-マイクロバイオーム連合ネットワークをさらに制御する（Pieterse et al.）内生コミュニティには、植物の病害抵抗性を高める特定の機能性グループが含まれる一方で、増殖準備の整った潜在的な病原性要素として機能するグループもある（Cordovez et al.）異なる機能性微生物群間の競合的相互作用は、主に病原菌のコロニー形成や拡大に影響を与える（Berendsenら、2018；Liuら、2020）。病害植物中の生物活性代謝物は、メタボローム解析によって示されるように、アルカロイド、テルペノイド、ステロイド、キノン、フェノール、クマリン、配糖体、ベンゾピロンなど、様々な構造グループに分類されている（Zhang et al.）内生細菌と宿主植物は、これらの代謝産物を別々に、あるいは一緒に生産し、異なる代謝機能と相互作用を持つ可能性がある。これらのメカニズムを解明し、生物防除戦略に利用できる主要な微生物プレーヤーを特定することが、研究の焦点となるはずである（Spadaro and Droby, 2016）。植物内生微生物群集の相互作用の代謝産物は、植物の成長を促進するシグナル伝達のクロストークにおけるそのような相互作用の役割、ストレス調節におけるその役割を理解し、植物全体の生物的コール＆レスキュー戦略のための新たな洞察を提供するために、さらに系統的に研究されるべきである（Noeckerら、2019；Liら、2022）。

内生微生物群集は、植物の成長と免疫恒常性において重要な役割を果たしている。それらは、植物が病原菌によってストレスを受けたときに再構成される。本研究では、種子胚組織培養技術を利用し、クルミ-病原菌の相互作用系を確立した。微生物群集とノンターゲットメタボロームアッセイを系統的に解析し、内生葉マイクロバイオームの種多様性の変化と、さまざまな病原性真菌ストレスに対するクルミの応答を明らかにした。広範な耐性を持つ機能的コアグループを調査し、2種類の病原性真菌が葉における内生微生物の凝集および共生パターンに及ぼす影響を分析した。本研究は、クルミの様々な病害を統合的に予防・防除するための微生物生態学的防除技術や製品を開発するための理論的基礎を提供するものである。

2 材料と方法
2.1 試料の処理と収集
クルミの種子は、臨城県にある河北柳陵会社のクルミ実証園基地で収穫された「LVLING」果実から選択した。クルミ種子胚植物組織培養苗は、高さ約15 cmの均一な生育のものを選択した。対照群（CK）として、無菌水を接種したものを用いた。処理群には病原性真菌（C. gloeosporioides [Cg]およびF. proliferatum [Fp]）の胞子懸濁液（濃度：1.8×107 units/mL）を接種した。0.5cm×0.5cmの滅菌ろ紙を用い、葉の表面を覆うように胞子懸濁液または滅菌水を吸い上げた。接種から7日後、無菌条件下で葉を別々に回収した。滅菌遠心チューブに入れ、液体窒素で瞬間凍結し、-80℃で保存した。サンプルはその後ドライアイスで梱包され、ハイスループット配列決定のために北京バイオマーカーテクノロジーズに輸送された。

2.2 マイクロバイオーム抽出とデータ解析
サンプルDNAはTGuide S96 Magnetic Universal DNA Kit（Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co.）内生細菌DNAは16S V3-V4領域のユニバーサルプライマー338F/806Rを用いて増幅し、内生真菌はITS1F/ITS2Rを用いて増幅した（Zheng et al.） PCR増幅反応プログラムのパラメーターは以下の通りであった：95℃で5分間の前変性；95℃で30秒間の変性、50℃で30秒間のアニーリング、72℃で40秒間の伸長を30サイクル；最後に72℃で7分間の伸長。PCR産物は1.8%(w/v)アガロースゲルで電気泳動し、完全性を確認した。

構築したライブラリーはIllumina NovaSeq6000 (Illumina)を用いて塩基配列を決定した。シーケンシングで得られた生配列（raw reads）をCutadaptソフトウェア（Cutadapt 1.9.1）を用いてスクリーニング、解析、廃棄し、プライマー配列のないクリーンリードを得た。各サンプルのクリーンリードをオーバーラップさせるため、USEARCH v10ソフトウェアを用いてダブルエンド配列のスプライシングを行った。キメラ配列を同定・除去した後、有効なリードを得た。

クリーンデータをOTUにクラスタリングし、各サンプルの分類系統に割り当てた。QIIME2 2020.6（Bolyen et al., 2019）ソフトウェアを用いて、異なる処理群における内生菌および真菌群集のアルファ多様性指標、Chao1およびShannonを算出し、スチューデントのt検定を用いて差の有意性を検証した。QIIMEソフトウェアを用いてβ多様性分析を行い、種の多様性の観点から異なるサンプルの類似性を比較した。サンプル間の距離をBray-Curtisを用いて計算し、サンプル間のベータ値を求めた。これらの値を非計量多次元尺度法（NMDS）チャートで可視化した（Looft et al.）統計解析の結果、試料中の微生物群集の主な分布特性が得られた（Schloss et al.）各試料における各生物種の存在量と変動に基づき、スピアマンの順位相関分析を行い、相関が0.1以上かつp値が0.05未満のデータをフィルタリングして相関ネットワークを構築し、相対存在量上位80属の相関ネットワークをGephi 0.10を用いて可視化した。

2.3 代謝物抽出とデータ解析
代謝物抽出は、50mgの葉試料に内部標準物質（1,000、2、濃度：2mg/L）を含む抽出液（メタノール：アセトニトリル：水＝2：2：1、内部標準物質濃度：2mg/L）を1,000μL加えた。溶液を30秒間撹拌した後、45Hzの粉砕機で10分間粉砕し、氷浴中で10分間超音波処理を行った。その後、サンプルを-20℃で1時間静置し、12000rpm、4℃で15分間遠心分離した。上清（500μL）を真空乾燥した。160μLの抽出液（アセトニトリル対水1：1）を再溶解し、30秒間遠心分離し、氷水に10分間浸し、最後に12000rpm、4℃で15分間遠心分離した。上清（120μL）をアッセイサンプルとしてピペッティングし、各サンプルから一定量の上清を確保した。各サンプルの上清をLC-MSに注入して分析した（Want et al.）

ピーク抽出とアライメントデータ（Progenesis QIソフトウェア）が処理され、質量数偏差（< 100 ppm）が制御され、正規化された（Wang et al.）代謝物は、定性的および定量的な目的のために、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) データベースで分類・検索した (Kanehisa and Goto, 2000; Yu et al., 2012)。各投与群について分散検定を行った（fold change [FC] > 1、t検定p値 < 0.01、OPLS-DAモデルVIP > 1）。差分代謝物のスクリーニングは、FC値、t検定p値、OPLS-DAモデルのVIP値を組み合わせて行った。スクリーニング基準は以下の通りである： FC＞1、p値＜0.05、VIP＞1（FC＞2：アップレギュレーション、FC＜1/2：ダウンレギュレーション、FC＝1：差のスクリーニングはFCを無視したのと同じ）。

2.4 内生菌の拮抗作用の測定
クルミの葉を水道水の流水ですすぎ，葉の表面の不純物を除去した：葉の表面を滅菌水で洗浄した後、真空吸引して表面に残った滅菌水を乾燥させ、75％アルコール（5～10秒）、0.1％塩化水銀溶液（5分）を用いて徐々に滅菌し、最後に葉の表面を再び滅菌水で5回洗浄した。クルミの葉を滅菌乳鉢でホモジネートに粉砕し、ホモジネートを滅菌水90 mLの入った三角フラスコに入れた。一定量の汲み取り希釈液を滅菌LB平板培地に均一に散布し、対照群、処理群それぞれ3反復を設定し、温度28℃の人工光培養器で倒立培養した。コロニーの増殖は随時確認し、単一コロニーはさらに精製培養に使用した（Zhengら、2021）。

発酵ブロス中の菌株の阻害能は、コートプレート法（Wang et al., 2011）および胞子発芽法（Fang, 1979）により分離した内生菌を用いて測定した。胞子発芽率、菌糸成長阻害率、発病率、発病指数、防除効果を数え、一元配置分散分析を用いて有意差を算出した。その後、分離した葉および生きた葉を用いて、菌株の細菌阻害能力をさらに測定した。7d活性病原性菌類を穿孔器を用いて円盤状（直径0.5cm）にし，構成した菌液を葉の表面に散布し，葉をよく保湿した後，9日後の各処理について，発病率と発病指数，および病原性菌類を防除する菌効力を算出した（Fang, 1979）。

拮抗効果を示した菌株は、プライマー27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′および1492R 5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′を用いて16S rDNA配列決定に供した。増幅産物の品質を検査し、配列検出を行って配列の類似性を比較した（GenBankプラットフォーム）。MEGA 7.0ソフトウェアの隣接距離法を用いて配列の系統を解析し、系統樹を作成した。

葉内での拮抗菌の発現を、リアルタイム蛍光定量法を用いて時期を変えて解析した。菌株の代謝物は液体質量分析（MS）分析を用いて決定した。データの処理にはExcel 2003、一元配置分散分析のためのSPSSバージョン26.0ソフトウェア、有意差（p < 0.05）を検定するためのダンカンの多重範囲検定（MRT）、グラフを作成するためのOrigin 2021ソフトウェアを使用した。

3 結果と分析
3.1 内生微生物群集の形成
3.1.1 内生微生物多様性分析
C. gloeosporioidesとF. proliferatumの感染後、グループ間の差はグループ内の差よりも大きく、感染により、内生菌類群集には有意な差が見られたが、内生細菌群集には有意な差は見られなかった（図1A,B）。Chao1およびShannon多様性指標から、病原性真菌感染後、内生菌の多様性がわずかに低下したことが示されたが、その差は統計的に有意ではなかった（p > 0.05）。Cg感染による内生菌の豊富さへの影響は少なかったが、Fp感染は内生菌の豊富さを有意に減少させた（図1C,D）。病原性細菌の感染により、内生菌類群集の存在量と多様性は減少したが、その差は有意ではなかった（p > 0.05）。内生菌類群集の存在量と多様性は、Cg感染後の方がFp感染後よりも高かった（図1E,F）。

図1
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図1. 内生微生物群集の多様性。(A,B)内生細菌および真菌のβ-多様性、(C-F)内生微生物群集のα-多様性、(C,E)内生細菌および真菌群集のChao1指数、(D,F)内生細菌および真菌群集のShannon指数。

3.1.2 内生微生物群集組成
エンドファイト微生物群集は、エンドファイト細菌（13％）とエンドファイト真菌（46％）の相対的存在量の増加を示したが、エンドファイト細菌（28％）とエンドファイト真菌（26％）の相対的存在量の減少も示した。このように、内生微生物群集は両病原菌の感染に同時に応答していた。さらに、両病原菌の感染に応答して、内生菌種レベルの相対存在量の変化が観察された（図2A,B）。

図2
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図2. 内生植物群集の種構成。(A,B)内生細菌群集と真菌群集それぞれの相対存在量変化の統計、(C,D)内生細菌群集の門・属レベルの種構成、(E,F)内生真菌群集の種構成。

内生微生物群の支配的な門は同じ属であったが、相対的な存在量は異なっていた。内生細菌群集の優占門は、プロテオバクテリア属、ファーミキューテス属、バクテロイデーテス属、および放線菌属であり、優占属のトップ5にはワイセラ属、シュードモナス属、スフィンゴモナス属、ステノトロフォモナス属、およびバチルス属が含まれた。バチルス属の相対現存量は、両方の病原菌に反応して増加した。また、Weissellaの相対現存量はCg感染によって増加し、Pseudomonasの相対現存量はFp感染によって増加した。バチルス属とシュードモナス属の相対現存量は、処理区間で有意差があった（図2C,D）。内生菌類群集の優占門は子のう菌門、担子菌門、モルティエレル菌門であった。病原性真菌の感染により、子のう菌類の相対的な存在量は増加し、ステノトロフォモナスの相対的な存在量は減少した。優勢属はAspergillus属、Filobasidium属、Pleurotus属であった。病原性真菌感染により、潜在的病原性真菌であるAspergillus属、Filobasidium属、Pleurotus属の相対現存量が減少した（図2E,F）。

3.1.3 内生微生物群集の共起ネットワーク
内生菌ネットワークでは、相対存在量の高い上位80属を選択して共起ネットワークマップを構築した。対照群（CK）には1,227のエッジ、79のノード3モジュールが存在し、負の相関が49.47%であった（補足表S1）。Weissellaは相対存在量が最も高い属と35の関連、18の負の関連を示した（補足表S2）。Cg処理群は369個のエッジ、76個のノード、5個のモジュール、32.79％の負の相関を示した（補足表S1）。WeissellaはCKよりも関連性が少ない。[Ruminococcus]_torques_groupは最も関連数が多い（補足表S3）。Fp処理グループは327個のエッジ、79個のノード、5個のモジュールを持ち、負の相関は10.4％であった（補足表S1）。WeissellaはCKよりも関連数が少ない。ブドウ球菌の関連数が最も多い（補足表S4）。2つの病原性真菌の感染後、内生菌ネットワークのモジュール性は変化し、ネットワークの相関は減少し、負の相関の割合が減少したため、コミュニティの安定性に影響を与えた（図3A-Cおよび補足図S1-S3）。

図3
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図3. 内生微生物群集連合ネットワーク図。パネル(A-C)は内生菌群集、パネル(A)はCK内生菌群集、パネル(B)はCg処理後の内生菌群集、パネル(C)はFp処理後の内生菌群集；パネル(D-F)は内生菌群集、パネル(D)はCK内生菌群集、パネル(E)はCg処理後の内生菌群集、パネル(F)はFp処理後の内生菌群集。図中の異なる色のノードは異なるモジュールを示し、点と点の間の線は2つのノード間の相関を示し、ピンクの線は正の相関、グレーの線は負の相関を示し、線の太さは相関のレベルを示す。

内生菌類関連ネットワークでは、相対存在量の高い上位80属を選択してマップを構築した。図3D-Fに示すように、対照群（CK）では845エッジ、5モジュール、29.11％の負の相関が得られた（補足表S1）。Filobasidiumは29属の関連属で相対存在量が最も高く（補足表S5）、Cg処理群のネットワークグラフでは78ノード、471エッジ、6モジュール、23.99％の負の相関が認められた（補足表S1）。Penicillium属の相対存在量が最も高く、25属が関連していた（補足表S6）。Fp処理群のネットワーク図には、78個のノード、370個のエッジ、6個のモジュールがあり、負の相関は5.14％であった（補足表S1）。Alternariaの関連数が最も多い（補足表S7）。その結果、2つの病原真菌の感染後、内生菌ネットワークのモジュール数が増加し、関連するエッジと負の相関の割合が減少した（図3D-Fおよび補足図S4-S6）。

3.2 植物微量代謝物スクリーニング
正イオンモデルでは、160 種類のアミノ酸、18 種類のインドール、12 種類のクマリン、127 種類のフラボノイド、14 種類の不飽和脂肪酸を含む、1,549 種類の代謝物および 115 種類の二次代謝物が濃縮された。これらの化合物のうち、5つのアミノ酸がダウンレギュレートされ、3つのフラボノイドがダウンレギュレートされ、4つがアップレギュレートされ、2つのインドールがアップレギュレートされ、1つの不飽和脂肪酸がアップレギュレートされた。植物ホルモンについては、エチレンの代謝物9種、サリチル酸の代謝物4種、アブシジン酸の代謝物1種が同定された。

図4A,Bに示すように、グループ間で合計134の差分代謝物が得られた。2つの病原性真菌に感染した後の差分代謝産物には同一のものが8つあり、ビリベルジン、トリプタミン、シピオン酸エストラジオールが有意に上昇した。

図4
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図4 （A,B）それぞれ正イオンパターンの微分代謝物Weinダイアグラム。グラフ中の数字は微分代謝物ツリー：青字は2つの処理後に同じダウンレギュレートされた代謝物、赤文字はアップレギュレートされた代謝物；（C,D）微分代謝物とコバリアント内生菌の相関のヒートマップ；（E,F）微分代謝物とコバリアント内生菌の相関のヒートマップ；（C,E）それぞれCg処理とFp処理。横座標は微分代謝物、縦座標は内生菌。グラフの赤枠は発現量または相対量の増加、青枠は減少を示す；（G,H）代謝産物ネットワークに差のある2つの内生拮抗菌の関連プロット。

3.3 マイクロバイオームとメタボロームの複合解析
病原性真菌感染に共働する内生微生物について、KEGGパスウェイにアノテーションされた代謝産物の差異との相関を調べた。有意に相関したデータ（CCP < 0.05）を用いてヒートマップを作成した。図4C,Dに示すように、両病原性菌の感染後、微分代謝産物は多数の共変異性内生菌と有意に相関した。共通の微分代謝産物であるビリベルジンは、CgおよびFp感染後、内生菌であるClostridium paeoniae、Paeniclostridium、Aedonella spp.およびIdeonellaと有意に負の相関を示した。トリプタミンはポルフィロモナス属と有意な負の相関を示した。グアノシン5′-二リン酸はCg感染後のラクトバチルス・デュボシエラ、イデオネラ、パエニクロストリジウムと高い有意な正の相関を示したが、アルテルナリア・オルタナータおよびアルテレリスロバクターとも有意な正の相関を示した。シトルリンはAltererythrobacterおよびIdeonellaと高い有意な正の相関を示したが、Fp感染後のDubosiellaおよびPaeniclostridiumとも有意な正の相関を示した。

図4E,Fに示すように、Cg処理群はFp処理群よりも共変種内生菌との相関が高かった。代謝産物であるビリベルジンは、Cg感染後の内生菌Clathrosphaerina、Nigrospora、Paracremonium、Westerdykellaと高い有意な正の相関を示したが、Fp感染群では相関を示さなかった。共通微分代謝物トリプタミンは、CgおよびFp感染後の内生菌Clathrosphaerina、Sarocladium、Simplicillium、Trichocladium、TrichodermaおよびTrichotheciumと有意に正の相関を示した。グアノシン5′-二リン酸は，CgおよびFp感染後の内生菌Clathrosphaerinaとそれぞれ有意な正の相関を示した。Fp感染後の内生菌との有意な相関は認められなかった。

3.3.1 内生微生物群：属および代謝産物との関連性の差異
バチルス属およびシュードモナス属の内生菌は、それぞれ17代謝産物および43代謝産物と関連していた。Bacillus属とPseudomonas属では、それぞれ4つと5つの代謝経路が濃縮され、1つの代謝物がアップレギュレートされ、3つの代謝物が同時にダウンレギュレートされた。D-ネオプテリンはアップレギュレートされ、主に3,4-メチレンジオキシアンフェタミンの葉酸生合成に関与している。3,4-メチレンジオキシアンフェタミンはフェニルプロパノイドの生合成に関与し、スルファピリジンやロキシスロマイシンなどの代謝産物とも関連している（図4G,H）。

3.4 内在性拮抗細菌のスクリーニングと阻害能の同定
拮抗菌の実験前スクリーニングにより、より優れた阻害効果を持つ菌株が2株得られた。分子生物学的手法により、Pseudomonas psychrotoleransとBacillus subtilisの2菌株を同定し（図5A,B）、単離・スクリーニングを行った。P. psychrotoleransはCgおよびFp胞子の発芽をそれぞれ50.06％および56.63％阻害した。P.psychrotoleransは、CgおよびFp胞子の発芽を41.54％および64.75％阻害することで、発酵ブロス中の菌糸成長を阻害し、菌糸成長阻害率はそれぞれ78.86％および65.79％であった（図6A）。枯草菌発酵ブロスはCgおよびFp胞子の発芽をそれぞれ58.59％および42.65％阻害し、菌糸成長阻害率はそれぞれ87.78％および67.22％であった（図6B）。分離葉の阻害能力は以下の通りであった： P.psychrotolerans防除後のCgおよびFp発生率はそれぞれ51.26および52.39％減少し、CgおよびFpの防除効果はそれぞれ76.58および73.12％であった。枯草菌の防除後、CgとFpの発生率は44.12％と35.71％減少し、CgとFpの防除効果は56.2％と40.00％に達した（図6C）。枯草菌は生葉の防除後にCgとFpの発生を20%と10%減少させ、防除効果はそれぞれ44.44%と23.08%であった。P. psychrotolerans は生葉の防除後に Cg と Fp の発生をそれぞれ 70%と 50%減少させ、防除効果はそれぞれ 70%と 61.54%であった（図 6D）。

図5
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図 5. 抗菌薬耐性の系統樹：パネル（A）はPseudomonas psychrotolerans、パネル（B）は枯草菌。

図6
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図6 (A)実験室での抗菌力測定；(B)内生菌発酵液の抗菌力測定（(A,B)座標軸の左軸は胞子発芽率、右軸は菌糸成長阻害率）。(C) In vitro抗菌力；(D) 生体静菌力測定（(C,B)座標軸の左軸は発病指数、右軸はコントロール効果）。パネル(E)は病原性菌感染後のB. subtilisの発現、パネル(F)は病原性菌感染後のP. psychrotoleransの発現。異なる期間での量の決定（(E,F) 座標の縦軸は発現、横軸は処理の異なる時間）。

3.5 病原菌感染に対するエンドファイト拮抗菌の発現
プライマーdnaN-F（5'-GCACTTGCCGCAGATT GA-3′）およびdnaN-R（5'-AATGCAAGACGGTGGCTATC-3′）を用いたB. subtilis。プライマー16 s9-F（5'-CTGGCCTTGACAT GCTGAGA-3′）および16 s9-R（5'-ACCGGCAGTCTCCTTAGAGT-3′）を用いたP. psychrotolerans。B. subtilisの発現は、CgおよびFp病原体の感染120時間後に最も高くなり、その後発現が減少した（図6E）。P. psychrotoleransの発現は、Cg病原体の感染24時間後と72時間後に2つのピークに達した。Fpの発現は感染168時間後に最も高くなった（図6F）。

3.6 2つの拮抗細菌の代謝物分析
脂質、ベンゼノイド、フェニルプロパノイド、ポリケチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド代謝物を含む多くの代謝物が、2つの拮抗性内生菌で濃縮された。さらに、1-メチルナフタレン、1,3-ブタジエン、2,3-ブタンジオール、トルエンアルデヒドなどの代謝物が病原菌感染時に濃縮された（図7A-D）。

図7
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図7. 2つの拮抗菌の代謝物濃縮統計。パネル(A,B)は枯草菌陽性イオンモードと枯草菌陰性イオンモード、パネル(C,D)はシュードモナス・サイクロトレランス陽性イオンモードとシュードモナス・サイクロトレランス陰性イオンモード。

4 考察
葉は植物の生態学的に重要な部分であり、葉の内部における内生微生物の分布と微生物群集の活動は、植物の健康と成長に大きく影響する。内生微生物群集の多様性、集合性、共生ネットワークは、異なる病原性真菌に感染した場合の典型的な反応パターンを共有している。この応答パターンは、植物内の環境代謝産物の変化によって引き起こされる可能性があり、また植物の病害抵抗性にも影響する。クルミの葉に2種類の病原性真菌が侵入すると、内生菌のネットワークの複雑性が増加したことから、内生菌群集の多様性は内生細菌よりも病原性真菌感染に敏感であることが示された。健康な植物でも病気にかかった植物でも、バクテリアのアソシエーションの割合は高かった。対照的に、細菌ネットワークとその中心的分類群に対する負の会合の割合は、真菌ネットワークよりも植物の方が高かった。生態学的競争は、協力的な会合の安定性を阻害することで、マイクロバイオームの安定性を向上させる可能性が示唆された（Coyte et al.）

微生物種の協力的・競争的性質とネットワークのモジュール性は、コミュニティの安定性に影響を与える可能性がある（Zhang et al.）我々の結果は、2つの病原性真菌が植物に侵入したことを示唆している。宿主植物は微生物の競合から利益を得て、外部ストレスに対する抵抗性を高めている可能性がある（Wagg et al.）菌類群集は細菌群集よりも病原性真菌の影響を受けていたが、これはおそらく罹病植物のネットワークにおける真菌の会合が健全なネットワークよりも強い正の相関を示したためであろう。本研究により、内生菌類群集は細菌群集よりも病原菌に対して敏感であり、そのことはネットワークの安定性が低いことからも明らかである。これまでの研究で、土壌細菌ネットワークは乾燥ストレス下で真菌ネットワークよりも安定性が低いことが示されている（De Vries et al.）我々のサンプルは同じ環境で培養された無菌の組織原性苗であったため、葉のエンドファイト微生物叢に対する外部要因の影響を除外することができ、したがって結果の信頼性を説明することができる。

これまでの宿主植物と病原性真菌の相関関係によると、病原性真菌の感染が特定の微生物の増殖と成長を促進することが示唆されている（Seneviratne et al.、2007）。さらに、生物ストレスによって増加するように誘導された微生物は通常有益であり、これらは植物の宿主病害抵抗性を高めることができる（McSpadden Gardener and Weller, 2001; Neal et al.）本研究では、罹病植物に、ワイセリア属、バチルス属、シュードモナス属、ペリプロコッカス属などの潜在的に有益な細菌が濃縮されていた。これらの有益な細菌は、植物マイクロバイオームのコア分類群（すなわち、すべてのサンプルに存在し、相対存在量が高い）としても同定された。これまでの研究で、Weissella属とPseudomonas属が宿主のパフォーマンス、特に植物の病原菌抑制において重要な役割を果たすことが示されている（Kimら、2018；Bao、2019）。バチルス属とシュードモナス属は、有益な細菌であることが適度に証明されている（Moulton and Montie, 1979; Garrity and Ordal, 1995; Sampedro et al., 2015）。Mortierella属のいくつかの種は抗生物質を産生し、ある種の分離株は様々な植物病原菌の潜在的な拮抗菌であり、現在では高麗人参栽培におけるフザリウム病防除の重要な指標として用いられている（Wang et al.、2021）。我々の結果は、宿主植物は病原性細菌の存在下で、いくつかのコア分類群の存在量を選択的に制御できることを示している。さらに、Weissella spp.やStenotrophomonas spp.などのいくつかの細菌分類群は罹病植物で濃縮され、共起ネットワークにあった病原体の優占分類群として同定された。Bacillus属とPseudomonas属は、2つの病原性菌による感染後に有意な差を示した。現在、これらの有益細菌の相対存在量が上昇することで、抗菌化合物や個体群感知消光分子などの資源や空間をめぐる病原性真菌との競合が促進され、その結果、病原性細菌の増殖・繁殖や病原性の拡散が抑制される（Frey-Klettら、2011；Raaijmakers and Mazzola、2012；Tycら、2017）。

メタボローム解析に基づくと、病原性真菌感染によって葉内の代謝産物の発現が変化することがわかった。内生共生体は、植物の二次代謝内生環境を変化させる抗生物質様化合物または揮発性物質を産生し、両方の病原性真菌に対する直接的および間接的な植物防御を促進する可能性がある。これまでの研究で、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、バチルス属の多くの細菌が、植物の異なる生態学的ニッチ（葉間や根間など）にコロニーを形成し、宿主のパフォーマンス、特に植物病原性抑制において重要な役割を果たすことが示されている（Shwetaら、2010；Xiongら、2017；Weiら、2019）。本研究では、Bacillus属とPseudomonas属が病原性細菌感染後に対照と有意な差を示した。両属ともフラボノイドおよびイソフラボノイド微分代謝物と有意に正の相関があった。フラボノイドおよびイソフラボノイドは、植物において多くの生理機能を発揮し、植物-病原体相互作用におけるシグナル伝達分子の一種であり、植物が生物学的ストレスにさらされた場合には、ファイトケミカルとして保護的な役割を果たす（Dakora et al.、1996）。さらに、フラボノイドとイソフラボノイドの代謝物は、病原性真菌感染後に有意にアップレギュレートされた。後者の代謝産物は、クルミの木と2つの病原性真菌との相互関係に関与している可能性があり、クルミの病原性真菌に対して保護的または防御的な役割を果たしている可能性がある。

クルミの病原菌に対して優れた効果を示す2つのエンドファイト株をスクリーニングした：枯草菌と耐寒性Pseudomonas spp.の両菌株の発現は、病原性真菌を接種した後の植物でアップレギュレートされ、これは我々のマイクロバイオーム研究の結果と一致した。枯草菌は多くの脂質代謝産物、ベンゼン類、プリンヌクレオシド代謝産物に富み、病原性真菌感染により発現が増加した。この結果は、主成分をリポペプチドとしてスクリーニングした先行研究とは対照的である（Huang et al.）しかし、この矛盾は、拮抗代謝産物を豊富に含むリポペプチドに類似した真菌抑制成分が存在しないことを意味するものではないため、さらなる研究が必要である。枯草菌はタンパク質、多くの糖類、デンプンを使ってトリプトファンを異化し、インドールを形成することができる。また、宿主に関与するプリンヌクレオチド合成経路にも関与することができる。P. psychrotoleransは、リパーゼ生産（Huang et al., 2010）や廃水処理（Li et al., 2018）に頻繁に使用され、脂質やベンゼンの代謝産物に富んでいる。1,2-ジミリストイルグリセロール-3-ホスファチジル-N, N-ジメチルエタノール、フェニルプロパノールアミンなどの代謝物の発現が有意に上昇した。これらの脂質およびベンゼン代謝産物が、P. psychrotoleransの2つの病原性真菌に対する作用に関与している可能性が推測されるが、具体的な作用機序についてはさらなる研究が必要である。

いくつかの研究では、特定の微生物相互作用において、特定の微生物揮発性有機化合物（mVOCs）の産生が誘導または阻害されると主張している（Garbevaら、2014；Tycら、2015；Piechullaら、2017；Kristinら、2020）。さらに、mVOCは病原性細菌を抑制し、直接的な阻害によって植物の全身抵抗性を誘導することができる（Huangら、2012年）。実際、シュードモナスとバチルス属の多くの種が植物病原菌の生物防除剤として使用されており、抗菌活性を有する揮発性有機化合物を産生することが報告されている（Tahir et al.）本研究で用いた内生性拮抗細菌株は、いずれも1-メチルナフタレンとピペリジニウムに富んでいた。シュードモナス・フルオレッセンスによるベンゾチアゾールや1-メチルナフタレンなどの揮発性物質の生産は、トマトの病原菌であるラルストニア・ソラナセアルム（Ralstonia solanacearum）に対する抑制効果を有することが報告されている（Raza et al. 本研究では、枯草菌の代謝物に1,3-ブタジエンとトルエンアルデヒドも見出した。ベンズアルデヒドと1,3-ブタジエンは枯草菌が産生するmVOCであり、藍藻の原因菌である枯草菌に対して強い阻害活性を有する（Tahir et al.） mVOCは、運動性や病原性に関連するいくつかの遺伝子の転写発現レベルを変化させ、植物の全身抵抗性を誘導し、その結果、萎凋病の発生率を低下させることが報告されている（Santoyo, 2021）。1-メチルナフタレン、1,3-ブタジエンおよびトルエン・アルデヒドは、本研究でスクリーニングした枯草菌および耐寒性シュードモナス属の抑制因子であると考えられる。しかし、中好気性菌株のmVOCが病原性真菌に対する拮抗菌の抑制効果をどのように調節しているのかについては、さらなる試験と探求が必要である。

5 結論
今回の結果から、葉斑病菌感染に応答するクルミの葉のマイクロバイオームに関する新規かつ関連性の高い知見が得られた。Colletotrichum gloeosporioides（Cg処理）とFusarium prolatoratum（Fp処理）は、同等の発現と種特異性の両方で葉に感染し、植物内生細菌と真菌の優占門と属は類似していたが、相対的な存在量のみが異なっていた。また、病原性真菌の感染は、クルミのエンドファイト細菌および真菌コミュニティの多様性、ネットワークの複雑性、安定性に影響を与え、有益な細菌の濃縮を促進した。本研究により、病原性真菌の侵入にエンドファイト微生物叢が反応するメカニズムの理解が深まるとともに、病原性真菌侵入後の葉のメタボロームも解析された。結論として、本研究の結果は、クルミの葉における微生物群集の形成、共代謝、および病原性真菌の相互作用パターンを正確かつ包括的に記述するための基礎を築き、クルミの葉の病気に対するマイクロバイオームおよびメタボローム制御の理論的基礎を提供する。

データの利用可能性に関する声明
本研究で発表されたデータセットは、NCBIデータベースのアクセッション番号PRJNA909431およびPRJNA904015に掲載されている。

著者貢献
ZW：執筆-原案、執筆-校閲・編集。LX：執筆-校閲・編集。XL：執筆-校閲・編集。RW: 執筆-校閲・編集。JH: 執筆-校閲・編集。AY: 執筆-校閲・編集。

資金援助
著者は、本論文の研究、執筆、および/または発表のために財政的支援を受けたことを表明する。本研究は、中国国家重点研究開発計画（2023YFD1401302）、河北省高等教育機関科学技術研究プロジェクト（ZD2022061）、河北省現代農業産業技術システムプロジェクト（HBCT2024190208）、河北省重点研究開発計画プロジェクト（19226515D）から資金援助を受けた。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2024.1378273/full#supplementary-material。

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キーワード：内生微生物ゲノム、病原性真菌、メタボローム、内在性拮抗菌、発現様式

引用 Wang Z, Xu L, Lu X, Wang R, Han J and Yan A (2024) The endophytic microbiome response patterns of Juglans regia to two pathogenic fungi. Front. Microbiol. doi: 10.3389/fmicb.2024.1378273.

Received：受理：2024年1月29日; 受理：2024年3月20日；
発行：2024年4月11日

編集者

グスタボ・サントヨ、ミチョアカナ・デ・サン・ニコラス・デ・イダルゴ大学、メキシコ
査読者

ビノード・クマール・マフト、ランキ大学、インド
デバシス・ミトラ、グラフィック・エラ大学、インド
Copyright © 2024 Wang, Xu, Lu, Wang, Han and Yan. これはクリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*文責 Aihua Yan, yanjia208323@126.com

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