抗生物質曝露による腸内細菌叢のアンバランスと腸内ロタウイルス複製のクロストーク

2023年1月23日 22:56

抗生物質曝露による腸内細菌叢のアンバランスと腸内ロタウイルス複製のクロストーク
著者リンク集オーバーレイパネルYuhuiLiaYehaoLiub
https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2022.e12718
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要旨
目的
ロタウイルス（RV）は、エンベロープを持たない二重鎖状RNAウイルスの一つであり、乳幼児の下痢症の原因となりうる。RVは主に糞口経路で感染することが広く知られている。しかし、無症状の成人が感染源となることもある。そこで、成人の腸管におけるRVの複製機構を解明することが必要である。

研究方法
健康なボランティアとRV無症状保菌者を集め、まず動物由来の食品摂取量と尿中の抗生物質濃度との関連性を調べた。次に、腸内細菌叢の構造の違いを比較し、その違いを説明する可能性が高い分類群を同定した。最後に、グラム陰性菌が産生するリポ多糖（LPS）がRVの複製に及ぼす影響をin vivoおよびin vitroで検討した。

結果
本研究では、参加者の10％がRVの無症状保菌者であることを明らかにした。動物由来食品の高摂取は、尿検体中の抗生物質濃度と正の相関があった。RVキャリアの腸内細菌叢は、抗生物質耐性のグラム陰性菌が多く、LPSが高いことが特徴的であった。ペニシリン投与による腸内細菌叢の崩壊は，in vivoでのRVの複製に有利であった。LPSはin vitroでRVの熱安定性を向上させた。

結論
抗生物質曝露による腸内細菌叢のアンバランスは、RVの複製に重要な役割を果たし、健康合併症のリスクをもたらすことが示唆された。

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キーワード
ロタウイルス腸内細菌叢抗生物質耐性遺伝子LPS

はじめに
RVは非エンベロープ型二重鎖RNAウイルスであり、RNA配列とウイルスタンパク質6（VP6）の抗原性の違いにより、AからIまでの9群に分類されている[1]。しかし、ヒトへの感染の90％以上を引き起こすのはA群のみである。RV感染は、世界中の乳幼児の下痢性疾患の主要な原因であり、重度の脱水症状、栄養失調、さらには死亡に至る可能性があります。RVの予防接種が導入されているにもかかわらず、RV感染により、主に低所得国において毎年20万人以上の死亡が発生しています[2]。

RVは、主に糞便-経口経路、人と人との密接な接触、フォマイト、汚染された水や食品を介して広がります[3]。感染後、5歳以下の小児のみが重篤な脱水性胃腸炎を示す一方、成人では無症状または軽度の症状を引き起こします[4]。RVは、感染を繰り返すと重症度は低下しますが、生涯を通じて再感染を起こすことが報告されています[2,5]。しかし、RVが成人の腸内でどのように生活しているかは、あまり明らかではありません。

ヒトの消化管には、宿主の健康に重要な役割を果たす多くの種類の微生物が生息しています[6]。腸内細菌叢が適切に機能するためには、微生物の多様性が重要です。その組成の不均衡は、糖尿病、代謝異常、感染症など、多くのヒトの病気と関連しています [7]。多くの研究が細菌-宿主間の相互作用に焦点を当てていますが、腸内細菌叢のアンバランスが腸管ウイルスに与える影響についてはまだ調査する必要があります。

抗生物質は、ヒトや動物の感染症治療だけでなく、養殖や農業における成長促進剤として広く使用されているため、抗生物質への曝露は最も一般的な状況です[8]。その結果、抗生物質は食物連鎖を通じてヒトの体内に蓄積され、腸内細菌叢の破壊といくつかの細菌分類における耐性遺伝子の誘導を引き起こします[9]。最近の知見では、腸内細菌叢のバランスが崩れると、ポリオウイルス、レオウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）などの腸管ウイルスの感染が促進されることが報告されています[10]。Kussらは、腸内細菌叢がレオウイルスやポリオウイルスの複製や病原性を促進することを明らかにした。感染プロセスにおいて、LPSはビリオンの安定性を高め、環境適合性を促進することで重要な役割を担っている[11]。

本研究の目的は、RVキャリアと健常者の尿中抗生物質残留レベルの違いを比較し、RVキャリアにおける腸内細菌叢の構造を特徴付けることであった。最後に、腸内細菌叢が介在するRVの複製促進の可能なメカニズムを探った。

材料と方法
2.1. 倫理規定
本研究は、安徽医科大学倫理委員会により承認された。参加者全員がインフォームドコンセントの文書に署名した。全員が質問票を受け取り、サンプル採取を行った。

2.2. サンプルの収集と処理
2020年12月から2021年11月にかけて、RVに感染した30名の学部生（患者群とする）から糞便サンプルを採取した。患者群の基本的な特徴を表 S1 に記載した。便サンプル中のウイルス抗原は、ELISAキット（YS01379B、Yaji Company、上海、中国）により検出し、Kulis-Hornらによる既述の通り、特異的PCR反応により確認した[12]。同時に、対照として健康な学部生30名からも糞便サンプルを採取した（健康群と命名）。すべての糞便サンプルは、分析まで-20℃で保存した。

2.3. 尿サンプルの抗生物質分析
尿サンプルは午前中に採取し、ラボに運んだ後、-20 °Cで凍結した。本研究では、ヒト用抗生物質（HA）、動物用抗生物質（VA）、動物用として好ましい抗生物質（PVA）など、一般的に使用されている抗生物質を検出対象として選択した。尿検体中の抗生物質の処理および測定方法については、当社の論文[13]で紹介しました。

2.4. 食生活の調査
Zhaoらが報告した半定量的な食物摂取頻度調査票（FFQ）を用いて、摂取した食物の種類と尿中残留抗生物質の関連を検出した[14]。FFQの指示に従い、参加者全員の1日の食物摂取量を算出した。その後、動物由来食品と植物由来食品の比率を2つのグループで決定した。

2.5. PCRによる耐性遺伝子の同定
Escherichia coli（大腸菌）およびStaphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）に存在する耐性遺伝子を検出するため、Table S2に示す異なるプライマーを用いてPCR法を実施した。PCR増幅の鋳型には、糞便サンプルから抽出したTotal DNAを用いた。50μLのPCR混合液には、25μLのTakara Taq™ HS Perfect mix (R300S, Takara Company, Beijing, China), 0.6μM of each primer, 1μL of template DNA and 23μL of waterが含まれていた。PCRは以下の手順で行った。DNAの変性は94℃で30秒、その後94℃で10秒、55℃で10秒、72℃で20秒のサイクルを30回行った。アンプリコンは4S Green Plus（A616694, Sangon Company, Shanghai, China）で染色したアガロースゲルでの電気泳動により可視化した。

2.6. 16S rRNA遺伝子アンプリコンのDNA抽出と塩基配列の決定
QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (code no. 51604, QIAGEN Company, Hilden, Germany)を用いて糞便サンプルからDNAを抽出した。次に、341Fと806Rのプライマーを用いて、DNAを増幅した。最後に、PCR産物をShanghai Personalbio Technology Co., Ltd.に送り、16S rRNA遺伝子アンプリコンの塩基配列を決定し、データ解析を行った。

2.7. 糞便サンプル中のLPS測定
Bioendo Limulus Amebocyte Lysate kit (EC32545, Xiamen Bioendo Company, Xiamen, China) を用いて、製造元の指示に従いLPS量を測定した。簡単に言えば、糞便サンプル0.1gをLPSフリー水に溶解した。この混合物を1分間ボルテックスした後、10,000 rpmで5分間遠心分離して上清を得た。大腸菌O111:B4から分離したLPSを用いて検量線を作成した。検量線に基づき試料中のLPS濃度を測定した。

2.8. 抗生物質投与とRV感染
安徽医科大学動物センターより C57BL/6 マウス（3 ヶ月齢）を購入した。1週間の適応飼育後、24匹のマウスを無作為に4群に分けた（1ケージ6匹）。(1)無処理群、(2)抗生物質投与群には抗生物質カクテル（アンピシリン（1g/L）、バンコマイシン（0.5g/L）、メトロニダゾール（1g/L）、ネオマイシン（1g/L）の4種類の抗生物質）を飲料水にてアドリビタブルに投与、 (3) RV感染群には1週間前に106 PFU/mL マウスRV strain EC 50μLを経口摂取し抗生物質カクテルを投与、(4) 抗生物質投与群は、1週間前に抗生物質カクテル（アンビシリン（3g/L）とバンコマイシンのみを投与し、(5)の抗生物質カクテルを投与。(4) LPS投与群は抗生物質カクテルを1週間投与後、LPSを1g/Lで飲料水にて3日間自由摂取させた後、106 PFU/mL Mouse RV strain EC 50μLを経口摂取させた。

2.9. 糞便サンプル中のRVの定量
Mag-MK Virus RNA Extraction Kit（B518767-0050, Sangon Company, Shanghai, China）を用いて、製造者の指示に従い、糞便サンプルから核酸を抽出した。RV量はRotavirus Real-time PCR Kit (AP4351-50T, Fusheng Company, Shanghai, China)により、製造者の指示に従って決定した。

2.10. 粒子安定性熱放出アッセイ（PaSTRy)
PaSTRyはRVの熱安定性を調査するために、他の場所で記載されているように実施された[15]。簡単に言うと、反応混合物は、1μgのRV、3×SYPRO red、5μM SYTO9および添加緩衝液（10mM HEPES、200mM NaCl）を最終容量50μLになるように含んでいた。サンプルは、Roche LightCycler 96リアルタイム装置で、0.5℃の段階的な勾配で25℃から95℃まで加熱し、蛍光を読み取ることができるようにした。

2.11. 統計解析
データ解析は、SPSS バージョン 22.0 を用いて行った。すべてのデータは、平均値±標準偏差（SD）として表した。統計的な有意性は、p < 0.05レベルで考慮された。他に指示された場合を除き、本研究では3つの生物学的複製を実施した。

結果
3.1. 動物由来食品の大量摂取により、尿中の残留抗生物質が多くなる
参加者全員が薬物投与を受けていないにもかかわらず、尿検体から合計33種類の抗生物質が検出された（表1）。そのうち、HAが3種類、VAが10種類、PVAが20種類検出された。興味深いことに、HAの濃度は両群間で差がなかった。しかし、VA5種とPVA13種の濃度は、健常者グループに比べ、患者グループで有意に高く、VA1種とPVA5種の濃度は、健常者グループのそれよりも有意に低かった。さらに、4つのVAと2つのPVAが患者グループでのみ検出された。

表1. 尿検体から検出された抗生物質

抗生物質の種類抗生物質名健常者群 (ng/mL) 患者群 (ng/mL) p値
HAs Levofloxacin 6.79 6.28 NS
クラリスロマイシン 0.96 0.91 NS
セファクロール 196.44 202.78 NS
VAs Enrofloxacin 2.99 2.62 NS
スルファクロロピリダジン 41.34 71.86 ※1
スルファモノメトキシンナトリウム水和物 4.65 7.50 * * スルファキノキサリン
スルファキノキサリン 1.13 2.99 * Sulphaquinoxaline 1.13 2.99 * Sulfamethazine 1.82 2.62 NS
スルファメタジン 1.82 1.97 NS
スルファクロジンナトリウム一水和物 13.49 61.64 ＊スルファクロジンナトリウム一水和物
N4-acetylsulfamonomethoxine 4.49 4.05 NS
セフキノーム硫酸塩 102.94 49.77 ＊セフチオフル
セフティオフール 0.00 1.99 ＊Cyadox
シアードックス 306.38 309.81 NS
PVA Lomefloxacin hydrochloride 4.03 8.16 * ロメフロキサシン塩酸塩
Ofloxacin 0.00 14.77 * * Pefloxacin mesilite
ペフロキサシンメシル酸塩二水和物 9.35 67.89 ＊シプロフロキサシン
シプロフロキサシン 14.78 15.82 NS
Norfloxacin 2.80 5.13 * トリメトプリム
トリメトプリム 5.00 4.47 NS
スルファメトキシジアジン 7.65 25.73 ＊スルファメトキサゾール8.0 25.73
スルファメトキサゾール 8.37 5.02 ＊スルファジアジン
スルファダイアジン 123.23 65.74 * * スルファダイアジン
エリスロマイシン 58.43 83.63 ※1
リンコマイシン塩酸塩 12.54 28.29 * * リンコマイシン塩酸塩
スペクチノマイシン塩酸塩 69.00 12.08 * * ドキシサイクリン塩酸塩
ドキシサイクリン塩酸塩 81.39 119.91 ＊オキシテトラサイクリン塩酸塩
オキシテトラサイクリン塩酸塩 2.00 3.80 * * オキシテトラサイクリン塩酸塩
テトラサイクリン塩酸塩 3.34 2.39 * * テトラサイクリン塩酸塩
クロルテトラサイクリン塩酸塩 155.25 232.62 ＊セフォタキシムナトリウム 32.00 3.80
セフォタキシムナトリウム 32.21 24.19 * * アモキシシリン三水和物
アモキシシリン三水和物 32.12 249.61 ＊ペニシリン-Gナトリウム塩 143.12 249.61
ペニシリンGナトリウム塩 143.06 441.53 * ペニシリンV
ペニシリンV 0.00 5.23 * * 注：NS：有意差なし
注）NS：有意ではない、*：p＜0.05、HA：ヒト用抗生物質、VA：動物用抗生物質、PVA：動物用抗生物質として好ましいもの。

動物用抗生物質が広く利用されているため、肉、牛乳などの動物由来食品を介して様々な抗生物質が人体に沈着する可能性がある。そこで、尿検体中の抗生物質濃度と食品摂取量の差の関連性を調べるために、食品摂取量の差について分析を行った。Fig.1に示すように、患者群では動物由来食品の割合が高く（56.3%）、植物由来食品の割合が低い（43.7%）、健康群では植物由来食品の割合が高く（65.4%）、動物由来食品の割合が低い（34.6%）ことが示された。このことから、動物性食品の過剰摂取は、尿中の残留薬物の濃度を高くしている可能性が示唆された。

図1
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図1. 患者群と健常者の動物由来食品と植物由来食品の摂取割合の比較。*: P < 0.05.

3.2. 患者群では黄色ブドウ球菌よりも大腸菌で耐性遺伝子が多く検出される
大腸菌と黄色ブドウ球菌は、内因性細菌叢の一部であり、抗生物質に暴露されると容易に耐性遺伝子を誘導することができる。大腸菌と黄色ブドウ球菌は，抗生物質に暴露されると容易に耐性遺伝子が誘導されるため，通常，抗生物質耐性の指標とされている。我々は、VAやPVAに曝露された患者群が健常者群よりも多いことから、大腸菌と黄色ブドウ球菌に耐性遺伝子が誘導されるかどうかを検討した。そこで，大腸菌と黄色ブドウ球菌の耐性遺伝子をPCR法で増幅し，耐性遺伝子の有無を調べた．その結果、表2に示すように、クロラムフェニコールに対するcmlA遺伝子、テトラサイクリンに対するtetA遺伝子、β-ラクタムに対するTEM1遺伝子、キノロンに対する2遺伝子（qnr-Sとqnr-B）、多剤排出ポンプのコード遺伝子（mdtFとmdtB）など大腸菌に存在する耐性遺伝子が患者群の糞便からしか検出されないことが判明した。また，β-lactamのOXY遺伝子は両群で検出された。一方，S. aureusの耐性遺伝子は両群ともermB遺伝子1個のみ検出され，S. aureusの耐性遺伝子は両群ともermB遺伝子1個のみ検出された。これらの結果から，若年成人の腸内には大腸菌，黄色ブドウ球菌ともに広く分布しており，患者群では大腸菌の方が黄色ブドウ球菌よりも多くの耐性遺伝子を保有していることが示唆された．

表2. 検出された抗生物質耐性遺伝子の一覧。

空細胞 OXY MdtB MdtF TEM-1 cml-A qnr-B qnr-S tet-A
健康グループ P N N N N N N N N
患者グループ P P P P P P P P
抗生物質標的 β-ラクタムエフラスポンプエフラスポンプ β-ラクタムクロラムフェニコールキノロンキノロンテトラサイクリン
注：P：糞便サンプルから検出された遺伝子、N：糞便サンプルから検出されなかった遺伝子。

3.3. 患者群の腸内細菌叢の多様性は、健常者群より低い
健常者グループと患者グループの腸内細菌叢組成の違いを比較するために、すべてのサンプルについてIlluminaハイスループットシーケンスを実施した。41,109から45,279のQualified Readsが得られ、raefaction曲線はピークに達した（data not shown）。これらの結果は、腸内細菌叢を解析するのに十分なシーケンスの深さであることを示しています。

健常者と患者群では腸内細菌叢の構成が全く異なることが、サンプル内多様性（α-diversity）およびサンプル間多様性（β-diversity）の測定に反映されていることがわかった。患者群では、健常者群に比べ、Shannon indexが著しく低かった（図2a）。患者群ではα-多様性が低下していることから、健常者群に比べて採用された菌種が少なかったと考えられる。Fig. 2bに示すように、非制約的主座標分析（PCoA）により、患者群と健常群の腸内細菌叢は、第1座標軸に沿って分離した2つの異なるクラスターを形成していることが明らかになった。

図2
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図2. 16S rRNAのデータによる患者群と健常者群との腸内細菌叢の多様性の違い。(a) 患者群と健常者群のShannon diversity indexの比較、(b) UniFrac距離による主座標分析（PCoA）により、患者群の腸内細菌叢は1軸目で健常者群から分離していることが示された。

3.4. 腸内細菌叢の構造と豊富な菌種は両群で異なっていた
腸内細菌叢の構成は、両群間で検出可能かつ有意な差があった。門レベル（Fig. 3a）では、患者群ではBacteroidetes（68.8%）とProteobacteria（16.4%）が多く、健常群ではFirmicutes（49.6%）が多く、Bacteroidetes（47.2%）は少ないという特徴であった。属レベルでは（図3b）、患者群ではBacteroides（52.4%）、Sutterella（14.2%）、Parabacteroides（4.5%）の比率が高く、健常群ではProabacteroides（20.8%）やDialister（13.0%）、Alistipes（4.2%）の比率が高いことが特徴的であった。

図3
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図3. 患者群と健常者群における門（a）および属（b）レベルの細菌分類群の相対存在量。

その後、LEfSe解析を行い、両群の違いを最もよく説明する分類群を発見した。Fig. 4に示すように、LEfSe解析の結果、優勢な細菌は、異なる分類レベルで変化を示していることがわかった。患者群ではDialister, Sutterella, Enterobacteriaceae, Enterobacteriales, Escherichia_Shigellaが濃縮され、そのほとんどがBacteroidetesに属しているのに対し、健康群ではLactobacillaceae, Lactobacillales, Ruminococcaceae, Clostridia, Alloprevotellaに濃縮されていることが確認された。

図4
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図4. 線形判別分析効果量（LEfSe）分析に基づくLDAスコアによって同定された、患者群と健常者群の間で最も差のある富栄養化分類群。赤い棒は患者群で濃縮された分類群、緑の棒は健常者群で濃縮された分類群を示す。

3.5. 患者群の糞便中のLPS濃度は健常群のそれよりも高い
LPS産生菌の多いBacteroidetesとProteobacteriaが患者群に多く含まれていることがわかった。そこで、LPS産生量に差があるかどうかを調べた。Fig.5に示すように、患者群のLPS濃度は健常群に比べ33.3％と著しく高いことが分かりました。

図5
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図5. 患者グループと健常者グループの糞便中のLPS濃度の比較。*: P < 0.05.

3.6. ペニシリンへの曝露はRVの複製を促進する
我々は、尿中に抗生物質が多く残留している被験者の腸内にのみRVが存在することに注目した。そこで、抗生物質曝露による腸内細菌叢の乱れと腸内におけるRVの複製との因果関係を検討するため、ペニシリンを投与した成体マウスにRVを1週間経口投与し、RV感染中もペニシリンの投与を継続した。成体マウスにRVを感染させても激しい下痢は見られないが、それでも感染モデルとして使用することは可能である。成体マウスにRVを経口接種した後、マウスの糞便中のRVをqPCRにより定量した。図6に示すように、ペニシリン投与マウスでは接種2日目からRV量が増加し始めたが、無処置マウスでは4日目まで遅れて増加した。RV量は、ペニシリン投与マウスでは接種後6日目にピークに達し、安定的に推移したが、無処置マウスでは8日目に低いピークに達し、減少に転じた。これらの結果は、ペニシリン曝露がRVの複製を促進することを示唆するものであった。

Fig.6
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図6. 無処理マウスとペニシリン処理マウスにおける、試験した各時点でのRVの複製。糞便を採取し、qPCRによりウイルスを定量化した。*: P < 0.05.

3.7. バランスの悪い腸内細菌叢が産生するLPSは、in vivoでRVの複製を促進する
我々は、患者集団がBacteroidetes/Firmicutesの比率が高く、LPSが高レベルであることを見出した。我々は、これらの変化は抗生物質への曝露によって引き起こされると仮定した。この仮説を確かめるために、マウスにペニシリンを投与し、その腸内細菌叢を解析した。その結果、ヒトの結果と同様に、ペニシリン曝露による腸内細菌叢の崩壊が観察され、バクテロイデーテス/ファーミキューテスの比率が高いことが特徴的であった。一方、ペニシリン投与マウスでは、LPSが高濃度で存在することも確認された（データ未掲載）。

ペニシリン投与マウスは腸内細菌量がまだ多いことから、腸内細菌叢の欠如がRVのコロニー形成を阻害するかどうかを評価するために、抗生物質カクテルを用いて腸内細菌叢を枯渇させた。抗生物質カクテル投与後のマウスの糞便には培養可能な細菌は認められなかった（データは示さず）。抗生物質カクテル投与マウスおよびコントロールマウスに、ろ過したRVを経口接種した。図7に示すように、抗生物質カクテル投与により、接種3日後のRV量は2倍に減少し、腸内細菌叢の欠如がマウス腸内でのRVの複製を抑制していることが確認された。興味深いことに、抗生物質カクテル処理したマウスの飲料水にLPSを添加するとRV量は一部回復したことから、LPSがRVの複製に重要な役割を担っていることが示唆された。

図7
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図7. 無処置でRVのみを接種したマウスとRV＋抗生物質カクテルを接種したマウスにおけるRVの複製。糞便を採取し、qPCRによりウイルスを定量した。

3.8. LPSはビリオンの熱安定性を高める
LPSはポリオウイルスやレオウイルスなどいくつかの腸管ウイルスの熱安定性を高めるという知見がある[10,11]．そこで、LPSがRVに同様の効果を与えるかどうかを検証するために、Particle Stability Thermal Release assay (PaSTRy)を実施した。図8に示すように、PBS処理したRVの蛍光強度は44℃でピークに達した。しかし、LPS処理したRVの蛍光強度のピークは48℃まで上昇し、LPS処理がRVの構造を安定化させたことが示唆された。興味深いことに、1 mg/mL の代わりに 0.1 mg/mL の LPS で RV をインキュベートした場合、蛍光強度のピークはコントロールと同程度であり、LPS による熱安定化には用量依存性があることが判明した。これらの結果から、LPSに曝露することでRVの熱安定性が向上することが示唆された。

図8
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図8. LPSがRVサーモスの安定性をLPS濃度依存的に促進することを示すPaSTRy実験の定量化。*: P < 0.05.

4.考察
これまでの知見から、RVは主に糞口経路で感染すると考えられている[2]。しかし、我々の調査では、若年成人の10％が無症状のRVに感染していることがわかった。おそらく、無症状あるいは軽症の成人が広く分布しているのであろう。RVの感染経路としては、食物連鎖よりもヒトからヒトへの伝播の方がより重要となってきている。その結果、RV保菌者は動物由来の食品を多く摂取しており、尿中のVAs、PVAsの負荷が高いことが判明した。その結果、豊富なグラム陰性菌と高濃度のLPSを特徴とする腸内細菌叢の崩壊を招いた。我々は、ペニシリン曝露による腸内細菌叢のアンバランスが、in vivoでRVの複製を促進することを証明した。

4.1. 食事組成と尿中残留抗生物質との関係
抗生物質がヒトの尿中に残留していることは広く報告されている[17]。また、残留抗生物質が人体に及ぼす影響についても深く議論されている[18]。動物由来の抗生物質が食品から継続的に摂取されることは避けられないため、腸内細菌叢と腸管ウイルスの相互作用に及ぼす影響など、さらなる有害性を検討する必要がある。まず，薬物投与歴のないRVキャリアの尿から高濃度の動物用抗生物質が検出された。動物用抗生物質が広く使用されていることから、次に健常者群と患者群の食品摂取量の差を検討した。その結果、RV保菌者は動物由来の食品を多く摂取していることが分かった。動物由来食品の摂取量と抗生物質負荷の関連性については、いくつかの研究で報告されている[19,20]。今回の結果は、動物由来食品の過剰摂取が腸内細菌叢と腸内ウイルスの相互作用に関与している可能性を示す証拠である。

4.2. RV保菌者の腸内細菌叢のディスバイオシス
バランスのとれた腸内細菌叢は、宿主の栄養、代謝、病原体抵抗性に寄与している。しかし、食事や薬物など多くの要因が腸内細菌叢のディスバイオーシスを引き起こす可能性がある[9,21]。Xiongらは、RV感染児は腸内細菌叢の多様性が低いのに対し、健常対照児は腸内細菌叢の多様性が高いと報告しています[22]。さらに、RV感染児では腸内細菌叢の多様性が低下していることも判明している[23]。我々の研究でも、患者群では腸内細菌叢の構造が変化し、多様性が低下していることが確認された。α多様性の低下は、腸内細菌叢のバランスが崩れ、一部の優勢な分類群が損なわれる一方で、一部の希少な分類群が促進されていることを意味する[24]。この知見はLEfSe分析によってさらに説明され、いくつかの希少種が患者群で豊富になったことを示す。これらの知見は、多様性の低い腸内細菌叢が、年齢に関係なく、RV保菌者のバイオマーカーであることを示唆している。

健常者と患者群との腸内細菌叢の構造を比較したところ、患者群では変化が見られた。バクテロイデス類とパラバクテロイデス類の割合が増加し、ファーミキューテス類とユーリーアーキオタ類の割合が減少していることが確認された。興味深いことに、乳児や新生児マウスのRVによる下痢を対象としたいくつかの研究では、Bacteroidesの存在量の減少が観察されており[22,25]、今回の所見とは矛盾している。5歳児の腸内細菌叢はまだ成人に達していないため[26]、おそらく成人と異なる方法でRVの複製に影響を及ぼしているのであろう。我々の発見は、成人のRVキャリアおよび成人モデルマウスに基づいており、彼らの腸内細菌叢は低用量の抗生物質への曝露を受けている。このような違いが矛盾を生んでいるのだと推測している。LEfSe解析の結果、Parabacteroides属、Lactobacillus属、Alloprevotrlla属などいくつかのプロバイオティクスが患者群では全く検出されないことが分かった。これまでの研究で、プロバイオティクスは、感染症の除去、腸内細菌叢の回復、乳酸および短鎖脂肪酸の生産など、人間の健康に保護的な効果をもたらすことが実証されている[27,28]。プロバイオティクスは他の属よりも脆弱であることが証明されているため、患者グループにおけるこれらのプロバイオティクスの減少は、抗生物質への曝露の結果かもしれません[29]。一方、患者群ではEscherichua_shigellaが顕著に増加していることがわかった。腸内のEscherichua_shigellaの高濃度と多くの疾患との間に密接な関連性があることを発見した研究がある。ある研究では，非アルコール性脂肪性肝疾患患者においてEscherichua_shigella属の増加が認められ，その増加は疾患の重症度と関連していることが報告されました[30]．また、別の研究では、心臓弁置換術患者において、この属が多く存在すると、ワルファリン抗凝固療法に対する反応が損なわれることが観察された[31]。我々の結果は、グラム陰性菌が多く、プロバイオティクスが少ないという特徴を持つ腸内細菌叢の崩壊が、腸内でのRVの複製に重要な役割を果たすことを示唆している。

患者群の尿検体からはVAsとPVAsが高濃度で検出されたことから、腸内細菌で耐性遺伝子が誘導されるかどうかに関心がある。大腸菌と黄色ブドウ球菌は常在菌であり、それぞれグラム陰性菌とグラム陽性菌における代表的な抗生物質耐性菌であることから、対象菌種として選択した[32,33]。本研究では、VAs と PVAs の暴露に対して、両者で異なる反応を示した。大腸菌はより多くの耐性遺伝子を示したが、黄色ブドウ球菌は患者群では示さなかった。このことは、腸内細菌がグラム陰性菌に偏り、耐性遺伝子が多く出現していることを示唆している。

成体マウスは、RV感染における腸内細菌叢の役割を調べるために用いることができる。抗生物質カクテルで腸内細菌叢を除去すると、RV量が有意に減少することが確認された。この結果は、腸内細菌叢の存在がRVの複製に必須であることを示唆している。これは、微生物相の除去がRVの感染を遅らせ、感染力を低下させるという知見と一致する[34]。しかし、腸内細菌叢がRVの複製を促進する機構は依然として不明である。

4.3. LPSのRVの安定性への影響
LPSがポリオウイルスやレオウイルスなどの腸管ウイルスの安定性を促進するメカニズムについては、いくつかの研究で報告されています[11,35]。これらはすべてRNAウイルスであることから、RVの安定性も同様にLPSによって促進されると推察された。本研究では、患者群およびペニシリン投与マウスの糞便中にLPSレベルの増加を観察した。LPSによって促進されるRVの熱安定性はin vitroで検証された。この結果は、これまでの報告と一致している。これらのデータは、抗生物質への曝露がLPSの増加をもたらし、それがRVの複製を促進することを実証した。

5.結論
本研究では、VAs および PVAs 暴露による腸内細菌叢の構造の顕著な違いを明らかにした。腸内細菌叢はRVの感染に重要な役割を果たす。また、LPS が RV の熱安定性を高めることにより、RV の複製を促進することを確認した。本研究は、成人ヒトの腸内で腸管ウイルスが複製されるメカニズムについて有用なデータを提供する。

しかし、まだいくつかの限界がある。まず、主な制限はサンプルサイズが小さいことである。この制限を解決するためには、より大規模なコホートが必要である。第二に、食品および飲料水中の抗生物質の濃度を測定していない。尿中の抗生物質濃度に寄与する主な食品は調査していない。第三に、耐性遺伝子検出の対象は大腸菌と黄色ブドウ球菌のみとした。メタゲノム解析により、薬剤耐性に関与するマイクロバイオームメンバーが明らかになると思われる。第四に、LPSがRVの熱安定性に及ぼす影響のみを検証した。LPSがRVに与える影響について、より多くの研究が必要である。

宣言
著者貢献声明
Yuhui Li: 実験の実施、データの解析と解釈、試薬と材料の提供、論文の執筆。

Yifan Wu, Jie Wu, Lingling Yu: 実験実施、データの解析と解釈、試薬、材料、解析ツール、データの提供。

Xin Li、Ke Xie、Mingyi Zhang。Xin Li, Ke Xie, Mingyi Zhang: 試薬、材料、分析ツール、データを提供した。

Lingling Ren: データの解析と解釈、論文の執筆。

Yanli Ji, Yehao Liu: 実験の実施、実験の構想・設計、論文の執筆。

資金提供
Yehao Liu博士は、Natural Science Foundation of Anhui Province[1908085MH287]の支援を受けている。

Lingling Yuは、National undergraduate Program for Innovative Talents [202110366045]の支援を受けた。

Yanli Jiは、Natural Science Foundation of Anhui Province [2208085MH263]の支援を受けた。

データの入手方法
論文に含まれるデータ／付録資料／論文に引用されたデータ。

利害関係者の宣言
著者らは、競合する利害関係を宣言しない。

追加情報
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引用元: (0)
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