微生物叢の運動性に対するワクチン接種が、食餌性乳化剤摂取の有害な影響からマウスを守る

2023年9月20日 11:34

研究論文
微生物叢の運動性に対するワクチン接種が、食餌性乳化剤摂取の有害な影響からマウスを守る

https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3002289

Melissa C. Kordahi, Clara Delaroque, Marie-Florence Bredèche, Andrew T. Gewirtz, Benoit Chassaing

要旨
カルボキシメチルセルロース（CMC）やポリソルベート80（P80）などの食用乳化剤は、腸内細菌叢の組成や遺伝子発現を変化させ、その結果、宿主の炎症性遺伝子発現を活性化し、腸内粘液層に侵入する能力を高めた細菌叢を形成する。このような微生物叢の変化は腸の炎症を促進し、脂肪率の増加など様々な表現型の結果をもたらしうる。細菌フラジェリンは、この分子が運動性を可能にし、それ自体が炎症性アゴニストであるという点で、乳化剤の影響の重要なメディエーターである。従って、我々は、フラジェリンを発現する微生物を排除するように適応粘膜免疫系を訓練すれば、乳化剤から身を守れるのではないかと考えた。この仮説を検討した結果、マウスにフラジェリンを免疫すると、CMCやP80の摂取に反応して発現するはずの粘膜抗フラジェリンIgAやIgAでコートされた微生物叢が増加することがわかった。しかし、フラジェリン免疫化によってこれらの反応をあらかじめ誘導しておくと、CMC/P80によって誘発されるLPSやフラジェリンを含む炎症誘発性アゴニストの微生物叢発現の増加を防ぐことができた。さらに、このような免疫化により、CMC/P80によって誘導される微生物叢の侵食、およびそれに関連する結腸短縮や脂肪率の増加などの有害な炎症誘発性の結果を防ぐことができた。したがって、フラジェリンを含む病原体表面成分に対する粘膜免疫応答を誘発することは、乳化剤やおそらく他の現代の微生物叢ストレス因子によって促進される一連の炎症性疾患と闘う手段となりうる。

引用 Kordahi MC, Delaroque C, Bredèche M-F, Gewirtz AT, Chassaing B (2023) 微生物の運動性に対するワクチン接種が、食餌性乳化剤摂取の有害な影響からマウスを保護する。PLoS Biol 21(9): e3002289.

学術編集者セバスチャン・E・ウィンター、UTサウスウェスタン：テキサス大学サウスウェスタン医療センター, アメリカ合衆国

受理された： 2023年3月6日受理：受理：2023年3月6日；受理：2023年8月7日；発行：2023年9月19日 2023年9月19日発行

データの利用可能性未処理のシーケンスデータは、European Nucleotide Archiveにアクセッション番号PRJEB64212で寄託されており、https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home。

資金提供本研究は、欧州連合（EU）のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムに基づく欧州研究会議（ERC）のスターティンググラント（助成金契約No. ERC-2018-StG- 804135からBCへ）、IdEx Université de Paris - ANR-18-IDEX-0001 からChaire d'ExcellenceからBCへ、Kenneth Rainin FoundationからBCへInnovator Awardを授与された、アベニール財団からの賞（AP-RM-21-032、BCに授与）、ANR助成金EMULBIONT（ANR-21-CE15-0042-01、BCに授与）およびDREAM（ANR-20-PAMR-0002、BCに授与）、INSERMの国家プログラム「Microbiote」からBCに授与。MKはFondation pour la Recherche Médicale (FRM)のポスドクフェローシップの支援を受けている。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と解析、発表の決定、原稿の作成には一切関与していない。

競合利益著者らは、競合する利害関係は存在しないと宣言している。

略語 ANOVA、分散分析；CMC、カルボキシメチルセルロース；FISH、蛍光in situハイブリダイゼーション；HE、ヘマトキシリン-エオシン；HEK、ヒト胚性腎臓；HPF、高倍率視野；HPLC、高速液体クロマトグラフィー；IBD、炎症性腸疾患；Ig、免疫グロブリン；IgA、免疫グロブリンA； IgG、免疫グロブリンG;Lcn2、リポカリン2;LGI、低悪性度炎症;LPS、リポ多糖;PCoA、主座標分析;NRS、正常ラット血清;P80、ポリソルベート80;qRT-PCR、定量的逆転写PCR;SC/FSC、側方散乱光/前方散乱;TLR、Toll様受容体;WT、野生型

はじめに
腸管は、腸内細菌叢と呼ばれる大規模で多様な微生物の集合体によってコロニー形成されている[1]。生理的条件下では、腸は腸表面を覆う多層粘液構造によって微生物叢から保護されており、その結果、腸内細菌の大部分は腸上皮内層から安全な距離に保たれている [2]。私たちや他の研究者たちは、特定の食用乳化剤が腸における低悪性度炎症（LGI）を促進する可能性があることを報告してきた。このようなLGIは、乳化剤が腸内細菌叢を変化させることに関連し、その結果生じる可能性がある。LGIは、メタボリックシンドロームを含む様々な慢性疾患の原因となり、炎症性腸疾患（IBD）を含む重篤な炎症の素因となる可能性がある [3-5]。例えば、我々は以前、一般的に使用されている2種類の乳化剤、すなわちカルボキシメチルセルロース（CMC）とポリソルベート80（P80）が、この疾患に遺伝的に罹患しやすいマウスに大腸炎を誘発し、また野生型（WT）マウスの代謝異常を促進するのに十分であることを報告した。このような変化は、微生物叢の組成と機能の変化、特に微生物叢の侵入の促進を特徴とする宿主-微生物叢の擾乱と関連しており、このことが観察された宿主の損害の中心であると仮定された。微生物叢の侵入は、少なくとも部分的には、選択された微生物叢のメンバーによって発現され、細菌の運動性を担う鞭毛付属器[6-8]が関与していることが以前に報告されている[6,7]。我々は以前、微生物叢侵食の重症度と乳化剤誘発性慢性腸炎の重症度との間に直接的な相関関係があることをマウスで観察し [3]、またヒトのコホートでは2型糖尿病の重症度との間に直接的な相関関係があることを観察した [9]。最小限の複雑な腸内細菌叢を保持するgnotobioticマウスモデルを用いて、微生物叢の侵食がない場合、食事性乳化剤は十分に耐容性があり、腸の健康に対する有害な結果とは関連しないことが観察された。これらの知見を総合すると、前臨床モデルにおいてもヒトにおいても、微生物叢の侵入は、少なくとも部分的には鞭毛の発現によって媒介される可能性が高く、その後の慢性的な腸の炎症と代謝異常の発症に中心的な役割を果たしていることが示唆される。

また、細菌べん毛の主成分である細菌べん毛のレベルは、通常、健康な腸では低く、IBDのような炎症を起こした微小環境では上昇することが観察されている [10-12]。フラジェリン受容体であるToll様受容体5（TLR5）を欠損したマウスでは、フラジェリン特異的免疫グロブリン（Igs）反応の消失が、腸管内の細菌叢の侵食と関連する形で、腸管内の鞭毛細菌の割合の増加と関連している [13] 。重要なことは、抗鞭毛虫Igsが、選択された細菌による鞭毛遺伝子の発現と運動性を直接ダウンレギュレート／シャットダウンすることを示した以前の研究から、腸管の抗鞭毛虫と微生物叢由来のフラジェリン発現との直接的な関係が示唆されたことである [14]。この概念とよく一致しており、腸管フラジェリン特異的IgA反応を誘導することで、鞭毛細菌のレベルが減少し、微生物叢の侵入が減少し、実験的に誘導された重度および低悪性度の炎症から完全に保護された [6]。興味深いことに、このような抗鞭毛虫適応免疫応答の有益な影響は、病気が始まる前にのみ重要であるように思われる。確立された慢性腸炎は、鞭毛虫に対する非保護的な免疫反応性と関連するという観察から、おそらく微生物叢が上皮内壁を突破することが原因であろう [15,16]。

これらの既往の観察に基づき、我々は、精製フラジェリン免疫化により粘膜フラジェリン特異的IgA反応を誘導することで、食事性乳化剤が誘発する有害な結果を防ぐことができるという仮説を立てた。その結果、乳化剤によって誘発される微生物叢の組成および局在の変化を完全に予防するには、フラジェリン免疫化で十分であることが観察された。さらに、このような免疫化は、乳化剤によって誘発される低グレードの腸炎症および代謝異常から効率的に保護した。したがって、フラジェリン免疫化による防御能は、宿主-微生物叢相互作用を乱すことが知られている現代の食餌ストレス要因に対抗するために利用できる方法で、微生物叢の侵入および下流の有害な結果を促進する上で、この付属細菌が果たす中心的役割を支持するものである。

研究結果
フラジェリン免疫化はIgA-微生物叢相互作用を安定化させる
乳化剤の慢性摂取は、腸の慢性炎症を促進し、宿主の健康に有害な影響を及ぼす可能性があることを、我々や他の研究者が以前に報告した [4,5]。フラジェリン免疫の有益な効果を検証するため、S1 Fig.に模式的に示したように、乳化剤曝露の7週間前から精製細菌フラジェリン（対照群ではPBS）を週1回免疫するレジメンに従って、マウス群を乳化剤CMCまたはP80に慢性的に曝露した。以前の研究[6]に従って、フラジェリン免疫化は糞便中抗フラジェリンIgAレベルを上昇させるのに十分であった（図1A-1CおよびS1データ、5週目）。一方、当然のことながら、非免疫化水処理マウスでは糞便中抗フラジェリンIgAレベルは安定していた（図1AおよびS1、S2、S6データファイル、17週目）。しかし、非免疫マウスでは、乳化剤を長期間摂取すると、フラジェリン特異的IgAレベルが上昇した（図1B、1C、S2、S1、S6データファイル、17週目）。このような観察結果は、細菌フラジェリンに対する免疫反応性が上昇しているIBD患者におけるこれまでの観察結果と一致しており、おそらく基礎免疫系への微生物叢の曝露が増加した結果であろう。同様に、食事性乳化剤によって誘発された慢性腸炎は、微生物叢の炎症誘発能の上昇や微生物叢の侵入と関連しており、最終的に細菌フラジェリンに対する免疫反応性の上昇につながっている（図1Bおよび1C、S1データ）。さらに、使用したフラジェリン免疫化レジメンは、このような糞便中の抗フラジェリン免疫反応性を防ぐのに十分であったことから、乳化剤曝露前に抗フラジェリン抗体反応を促進することで、乳化剤による抗フラジェリン抗体反応の誘導を防いでいることが示唆された（図1B、1CおよびS1データ）。乳化剤を摂取すると、非免疫マウスではIgA+糞便細菌数が有意に増加したが、フラジェリン免疫化によって、特にP80摂取群では、乳化剤によるこのような変化が部分的に抑制された（図1DおよびS1データ）。これらのことから、乳化剤による慢性腸炎とその下流への影響を予防するのに十分であるという仮説のもと、細菌抗原に対する腸粘膜のチャレンジ前免疫化が、微生物と免疫系の相互作用を安定化させることが示された。

拡大サムネイル
図1. フラジェリン免疫化はIgA-微生物叢相互作用を安定化させる。
(A-C）5週目および17週目の抗フラジェリンIgAの糞便中濃度。データは5週目の非免疫群を100％とした相対値で表した。(D-F）19週目に採取した糞便内容物を、IgA陽性およびIgA陰性の細菌集団について選別した。選別した細胞からDNAを抽出し、16S rRNAの塩基配列を決定した。(D）19週目の盲腸内容物中のIgAコート細菌の割合を示す棒グラフ。(E、F）19週目における、IgA指標を用いたユークリッド距離のPCoAで、ドットを処理別に色分けした（E、水＝青；CMC＝オレンジ；P80＝紫、F、水-FliC＝水色；CMC-FliC＝薄オレンジ；P80-FliC＝薄紫）。この図の基礎データはS1 Dataにある。N = 4-5. 棒グラフについては、t検定と一元配置分散分析を用いて統計解析を行った。折れ線グラフについては、二元配置分散分析または混合モデルを用いた。有意差は以下のように記録した： CMC vs. 水, *p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001. ANOVA、分散分析；CMC、カルボキシメチルセルロース；FliC、フラジェリン；IgA、免疫グロブリンA；PCoA、主座標分析；P80、ポリソルベート80。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.g001

詳細 "
次に、乳化剤によるIgAコート微生物集団の変調に対するフラジェリン免疫の影響を明らかにするために、以前に報告したように[6]、糞便中のIgA+およびIgA-細菌集団の選別と16S配列決定を行った。S3 Figに示したように（S7 Data）、このようなアプローチでは、試験したすべての実験群でIgA指標に大きな幅があり、乳化剤の摂取やフラジェリン免疫化による明らかな全体的影響は見られなかった。したがって、計算されたIgA指標（log (IgA+ abundance / IgA- abundance)）を用いたユークリッド距離の主座標分析（PCoA）により、CMCとP80の摂取はともに腸内細菌叢のIgAコーティングに有意な影響を与え、グループ間で明確なクラスタリングがあることが明らかになった（図1E）。S4 Fig（S8 Data）に示されるように、CMCとP80の摂取はともに、多数のClostridiales微生物叢メンバーのIgAコーティングに変化を引き起こした。このような乳化剤によるIgAコーティング微生物集団の変化は、フラジェリン免疫化によってほとんど阻止された。フラジェリン免疫化は、Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Bacteroidaceaeを含む腸内細菌叢の様々なメンバーからのIgAインデックスに影響を与えた（S5図およびS9データ）。このように、乳化剤の摂取がIgA-微生物叢相互作用に及ぼす影響は免疫マウスでは観察されず、フラジェリンを標的とするように免疫系を訓練することで、これらの化合物が微生物叢-免疫系の恒常性を不安定にするのを防いだことが示唆された。

フラジェリン免疫化は微生物叢の組成を変化させるが、乳化剤による微生物叢の変化を防ぐことはできない。
食餌性乳化剤が腸内細菌叢に及ぼす直接的な影響は、細菌の侵入、腸内炎症、およびその下流の結果を促進する上で中心的な役割を果たしている［3,4］。そこで次に、乳化剤による腸内細菌叢組成の変化をフラジェリン免疫によってどの程度防ぐことができるかを検討した。16S rRNA遺伝子の塩基配列決定とBray Curtis距離のPCoAを用いることで、この試験に組み入れたマウスは、投与開始前（1週目、図2A）のベースラインの微生物叢組成が均一であることが明らかになった。対照的に、CMCまたはP80に10週間暴露した結果（17週目、図2B）、処理に基づく微生物叢のクラスタリングが明らかになり、CMCとP80の両方が腸内細菌叢組成に著しい影響を与えることがわかった。このような観察は、乳化剤処理マウスと水処理マウスの間で有意な増加を示し、グループ間のBray Curtis距離計算によって確認された（図2DおよびS2データ）。次に、フラジェリン免疫化も微生物叢組成に明確な影響を与えるのに十分であることが観察され、免疫化マウスと非免疫化マウスの間で明瞭なクラスタリングが観察された（図2C）。このような微生物叢組成の調査から、乳化剤による微生物叢組成の変化を防ぐには、フラジェリン免疫だけでは不十分であることが最終的に明らかとなり、水投与マウスとP80投与マウスの間で、明瞭なクラスター形成（図2B）および有意なブレイカーチス距離の増加が観察された（図2DおよびS2データ）。これらの所見から、フラジェリン免疫化は腸内細菌叢組成に影響を与えるには十分であるが、乳化剤による細菌叢の変化を防ぐことはできないことが示唆される。

拡大サムネイル
図2. フラジェリン免疫化は微生物叢組成を変化させるが、乳化剤による変化を防ぐことはできない。
週目と17週目に採取した糞便から細菌DNAを抽出し、16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定した。(A-C）1週目（A）および17週目（BおよびC）の16S rRNA遺伝子配列決定により評価した微生物叢のBray Curtis距離マトリックスのPcoA。各ドットは個々の動物を表し、実験グループごとに色分けされている（AおよびB：青、水；オレンジ、CMC；紫、P80；水色、水-FliC；薄いオレンジ、CMC-FliC；薄い紫、P80-FliC。C：青、PBS対照群；赤、フラジェリン免疫群）。(D）17週目におけるマウスを実験群間で分離したBray Curtis距離。この図の基礎データはS2データにある。データは平均値±SEMで表した。統計分析は一元配置分散分析を用いて行い、有意差は以下のように記録した： **p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001。ANOVA、分散分析；CMC、カルボキシメチルセルロース；FliC、フラジェリン；PCoA、主座標分析；P80、ポリソルベート80。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.g002

詳細 "
フラジェリン免疫化は乳化剤誘発微生物叢の炎症潜在性と侵入を抑制する
微生物叢の組成の他に、腸の健康に下流で有害な結果をもたらす可能性のある微生物叢の変化を深く調べるには、機能的評価が正当化されるようである。例えば、CMCやP80によって誘導されたものを含む微生物叢の変化は、フラジェリンやリポ多糖（LPS）などの炎症性微生物叢由来分子のレベルを増加させる可能性がある［3,4,17］。そこで次に、TLR5およびTLR4レポーター細胞を用いて、これらの炎症性分子の糞便中生理活性レベルを定量化した。このアプローチにより、乳化剤を摂取したマウスではフラジェリンとLPSレベルが有意に上昇していることが明らかになった（図3A、3B、S3データ）。図3Aおよび3B（S3データ）に示されるように、細菌フラジェリンに対して免疫化された動物は、乳化剤によって誘導された微生物叢の炎症潜在性の増加から完全に保護された。

拡大サムネイル
図3. フラジェリン免疫化は、乳化剤によって誘導される微生物叢の炎症性潜在性と侵入を抑制する。
(A-C）TLR5およびTLR4レポーター細胞を用いて17週目に測定した炎症性微生物叢由来分子フラジェリン（A）およびLPS（B）の糞便生理活性レベル。(C)19週目に採取した大腸をFISHと対にした免疫染色を行い、微生物叢の局在を共焦点顕微鏡で解析した。D）5生物学的複製から得られた代表写真。MUC2（緑）；アクチン（紫）；細菌（赤）；DNA（青）。スケールバーは50μm。この図の基礎データはS3 Dataにある。N = 4-5. 統計解析は一元配置分散分析を用いて行い、有意差は以下のように記録した： *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。ANOVA、分散分析；CMC、カルボキシメチルセルロース；FISH、蛍光in situハイブリダイゼーション；FliC、フラジェリン；HPF、高倍率視野；IEC、腸管上皮細胞；LPS、リポ多糖；P80、ポリソルベート80。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.g003

詳細 "
食餌性乳化剤の摂取によるもう一つの中心的な有害影響は、微生物叢の侵入を誘導する能力であり、通常は無菌である粘液層の内側に微生物叢がコロニーを形成していることが観察され、これは上皮-細菌間距離を測定することによって定量化することができる[9]。このような微生物叢の侵入は、乳化剤によって誘発される慢性的な低グレードの腸の炎症と代謝異常において中心的な役割を果たしているという仮説が立てられている［3］。微生物叢の侵入現象において鞭毛盲腸が果たす役割[7,8]に基づき、我々はカルノイ固定結腸標本の共焦点イメージングによって微生物叢の侵入を調べた。その結果、CMCおよびP80の摂取により、微生物叢の侵食が顕著に観察され、細菌／上皮の平均距離は、水投与マウスの16.50μmから、CMCマウスおよびP80マウスではそれぞれ8.70μmおよび6.20μmに減少した（図3Cおよび3D、S3データ）。フラジェリン免疫化によって、乳化剤によって誘導された微生物叢の侵入は完全に防御され、細菌／上皮距離は、水、CMC、P80処理群でそれぞれ17.90μm、16.00μm、19.90μmであった（図3C、3D、S3データ）。フラジェリンに対する免疫応答が慢性腸炎を防御するという仮説がさらに支持された。

フラジェリン免疫化は乳化剤誘発の低グレード腸炎を予防する
食餌性乳化剤の摂取が宿主にもたらす有害な結果の中心は、慢性腸炎症の促進である [3,4]。以前および本明細書で示したように、食餌性乳化剤の摂取は慢性的な低悪性度腸炎を誘発し、水投与の対照群と比較して、乳化剤投与マウスでは大腸の短縮、脾臓重量の増加、炎症マーカーであるリポカリン-2の糞便中濃度[18]によって明らかになった（図4A-4CおよびS4データ）。大腸切片、ヘマトキシリン-エオシン（HE）染色、および病理組織学的スコアリングにより、乳化剤投与マウスでは慢性的な低グレードの腸炎症が発症していることが確認され、そのスコアは水投与マウスの2.20±2.28から、CMC-およびP80-投与群ではそれぞれ7.00±2.12および6.60±2.19となった（図4Dおよび4E、S4データ）。一方、フラジェリンで免疫したマウスでは、乳化剤によって誘発された慢性腸炎のこれらの指標は見られなかった（図4およびS4データ）。実際、病理組織学的スコアは完全に正常化され、水、CMC、P80投与群ではそれぞれ2.40±1.67、1.40±1.67、3.20±1.79であった（図4D、4EおよびS4データ）。

拡大サムネイル
図4. フラジェリン免疫化は乳化剤誘発の低悪性度腸炎を予防する。
(A)結腸長、(B)脾臓重量、(C)安楽死時（19週目）の糞便中Lcn2濃度、(D)HE染色結腸切片の病理組織学的スコア、(E)代表的HE染色結腸切片。スケールバー、100μm。この図の基礎データはS4データにある。データは平均値±SEMで表した。N = 4-5. 統計解析は一元配置分散分析を用いて行い、有意差は以下のように記録した： **p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001。ANOVA、分散分析；CMC、カルボキシメチルセルロース；FliC、フラジェリン；HE、ヘマトキシリン-エオシン；Lcn2、リポカリン-2；P80、ポリソルベート80。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.g004

詳細 "
フラジェリン免疫化は乳化剤による代謝異常を抑制する
我々は以前、多くのモデルにおいて、慢性的な腸炎症が代謝異常の原因となることを報告した[3,17]。そこで次に、乳化剤の摂取が宿主の代謝に及ぼす影響と、フラジェリン免疫化による予防効果を調べた。図5（S5データ）で報告されているように、CMCまたはP80を摂取すると、水で処理した対照群と比較して、体重増加が大きくなることが観察された（図5AおよびS5データ）。このような体重増加には、乳化剤を摂取したマウスでは対照マウスと比較して脂肪沈着および一晩空腹時血糖値の有意な上昇が伴っていたことから（図5Cおよび5D、S5データ）、食餌性乳化剤の慢性的摂取が宿主の代謝を損なうのに十分であることがさらに示された。精製フラジェリンを免疫すると、乳化剤によって誘発された様々な代謝の変化が完全に消失し、脂肪沈着と一晩空腹時血糖値は水処理した対照群と比較して完全に正常化した（図5C、5DおよびS5データ）。全体的な体重増加に関しては、フラジェリン免疫化はCMC誘発の体重増加を防ぐのに十分であった。これらのデータを総合すると、フラジェリン免疫化によって、食餌性乳化剤に慢性的に暴露されたマウスで観察された慢性的な腸の炎症が予防され、それに関連した代謝の結果も改善されることが示された。

拡大サムネイル
図5. フラジェリン免疫化は乳化剤誘発の代謝異常を抑制した。
(A, B) ビヒクル（PBS, A）または精製フラジェリン（B）で免疫したマウスの経時的体重増加。(C）精巣上体脂肪パッド重量と（D）19週目に測定した15時間空腹時血糖値。この図の基礎データはS5データにある。データは平均値±SEMで表した。N = 4-5. 棒グラフについては、一元配置分散分析を用いて統計解析を行い、有意差は以下のように記録した： ns：有意でない、**p < 0.01、***p < 0.0001。ANOVA、分散分析；CMC、カルボキシメチルセルロース；FliC、フラジェリン；P80、ポリソルベート80。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.g005

詳細 "
考察
微生物叢の形成異常は、腸の炎症、ひいては炎症を伴う多くの慢性疾患を引き起こす中心的な役割を担っていると考えられている [1]。微生物叢異常症の特徴として、鞭毛をもつ細菌が濃縮された菌種組成の変化が挙げられる。この変化は、例えば、運動性の病原性大腸菌株を含むγ-プロテオバクテリアの増加 [19,20] に起因することもあるが、他のクラスの細菌、特にファーミキューテス菌が運動性関連遺伝子の発現をアップレギュレートすることに起因することもある [14] 。高レベルのフラジェリンを発現するこれらの疾患関連微生物群はまた、通常無菌である内側の粘液層に侵入する能力が増大していることも特徴であり、これは微生物の侵入と呼ばれる特徴である。このような侵入微生物叢は、腸の炎症を促進する上で重要な役割を果たすと考えられており、例えば、以前、マウスモデルにおいて、微生物叢の侵入と腸の炎症の重症度との間に正の相関関係が観察されたほか、ヒトにおいても代謝異常の重症度との間に正の相関関係が観察されている [3,21]。微生物叢の形成不全や侵入を引き起こす根本的な要因は多岐にわたると考えられるが、環境的（すなわち非遺伝的）決定因子が大きな役割を果たすことを支持する証拠も数多くある。例えば、我々や他の研究者は、食餌性乳化剤の摂取が微生物叢の組成の変化と浸潤を引き起こし、遺伝的感受性の高いマウスでは大腸炎を、WTマウスではLGIとメタボリックシンドロームを引き起こすことを以前に明らかにしている[3,4]。

本研究では、フラジェリン免疫によって、通常、食餌性乳化剤の摂取によって誘発される多くの有害な結果を十分に予防できることを報告する。一方、このような免疫では、乳化剤によって誘発される微生物叢の組成変化を完全に予防することはできないようである。したがって、免疫によって誘導される微生物叢の調節に関して重要であると考えられるのは、微生物叢の組成的側面よりもむしろ、微生物叢の局在や炎症誘発性などの機能的側面に関連するものである。さらに、Clasenらの最近の研究では、あるフラジェリンがTLR5受容体を活性化する能力には高い不均一性があることが報告されており、ある微生物叢では、フラジェリンを発現する微生物叢メンバーの割合が比較的高くても、TLR5活性化の可能性は弱いことが示唆されている［22］。したがって、免疫プロトコールが微生物叢の構成、より具体的には鞭毛細菌集団に及ぼす影響を正確に特定するには、追跡調査が必要である。今後の研究としては、例えば、レーザーキャプチャー・マイクロダイセクションを用いた腸管内粘液層の採取を行い、粘液に関連する微生物叢に焦点を当て、その後ショットガン・メタゲノミクスを行い、鞭毛細菌群を同定する予定である。今回の研究では、免疫マウスにおけるフラジェリン生理活性レベルの低下とともに、糞便中の生理活性LPSレベルの低下も観察された。

腸管には、様々な抗菌ペプチドの分泌など、内側の粘液層を無菌状態に保つための様々な自然・適応免疫機構が備わっているが、我々のグループは以前に、適応免疫、特にフラジェリン特異的IgAの粘膜産生が、運動性細菌を抑制する上で重要な役割を果たしていることを示した[6]。私たちは、免疫によって抗フラジェリン抗体を誘導することが、大腸炎や食事誘発性肥満から身を守るための効率的な戦略であることを実際に観察した[6]。細菌鞭毛に対する抗体は非常に種特異的であるが、多くの抗鞭毛虫抗体は高度に保存された鞭毛虫エピトープを認識することができる。例えば、サルモネラ由来の鞭毛虫をマウスに接種すると、クロストリジウム鞭毛虫のような他の鞭毛虫とかなりの交差反応性を示す抗体が産生される[23]。さらに、様々な微生物叢に由来するフラジェリンがTLR5受容体に結合し、また、Firmicute Roseburia hominis由来の組換えフラジェリンペプチドに対して上昇させた抗体によって認識されることを以前に報告した[14]。しかし、サルモネラ菌由来のフラジェリン抗体の、様々な微生物叢のメンバー、例えばバクテロイデーテス（Bacteroidetes）種に対する交差反応性については、さらなる研究が必要である。したがって、たとえ乳化剤の摂取によって上皮に侵入する微生物叢のメンバーがまだ特定されていないとしても、また様々な宿主で異なる可能性が高いという事実があるとしても、我々は、強固な抗フラジェリン反応を誘発することで、乳化剤への慢性的な暴露による有害な影響からある程度保護されるのではないかと考えている。

具体的には、乳化剤への暴露によって糞便中のフラジェリン濃度が上昇する一方で、精製フラジェリンによる免疫化によってそのような影響が完全に阻止されることが観察された。さらに重要なことは、CMCとP80の両方が、微生物叢の局在、糞便中IgA反応、腸の炎症性緊張、および代謝に及ぼす影響が、免疫化マウスではすべて阻止されたことである。したがって、フラジェリン免疫化は、乳化剤の摂取による有害な結果を防ぐ効率的な方法であると考えられる。このような観察結果の説明として考えられるのは、フラジェリン免疫の主な作用機序が、乳化剤摂取時に通常産生される抗フラジェリンIgA反応を安定化させ、微生物叢が大腸内粘液層に侵入して炎症性遺伝子を活性化するのを阻止することである。さらに、本明細書で行ったIgA-Seqアプローチは、フラジェリン免疫化が、乳化剤によって誘発されるIgAで被覆された微生物叢組成の変化を防ぐのに十分であることを明確に示唆しているが、このことが、全体的な微生物叢組成の調節によって起こっているのか、あるいは様々な微生物叢メンバーによるフラジェリン発現の標的化調節によって起こっているのかは、まだわかっていない。

乳化剤を摂取したマウスの大腸で行った定量的逆転写PCR（qRT-PCR）ベースの解析では、特定のサイトカインがわずかに変化しただけであり、低グレードの慢性腸炎のみが誘導されていることが示唆された。食餌性乳化剤の摂取により、消化管内で影響を受ける腸管免疫細胞集団はわずかであると考えられる。従って、今後の研究では、乳化剤によって誘発される腸管免疫ランドスケープの変化を詳細に特徴づけるために、シングルセルRNA-seq解析を行う予定である。さらに、フラジェリンの腹腔内投与は、腹膜におけるTLR5および／またはNLRC4を介した自然免疫系の活性化を通じて炎症反応を引き起こすが、おそらく全身的な炎症反応も引き起こし、これが乳化剤投与後に観察される有害な表現型の予防に関与している可能性がある。注目すべきは、成熟したB細胞を持たないために抗体を産生できないμMTマウスでは、フラジェリン免疫法はもはや腸内細菌叢の有益な調節をもたらさないということを以前に報告したことである。したがって、フラジェリン免疫による細菌叢への影響のかなりの部分は、抗フラジェリン抗体によって媒介されると論じている[6]。乳化剤で処理したマウスの保護に関しても同様の観察が成り立つと予想されるが、このような側面はさらなる調査に値するだろう。さらに、正確なメカニズムはともかく、腸管粘膜を標的とした免疫化、例えば組換えフラジェリンの標的投与が、今後展開されるはずである。

結論として、ここで示されたデータは、抗菌薬による免疫化が、微生物叢の侵食を防ぐ効率的な方法であることを示唆している。注目すべきは、精製フラジェリンを繰り返し注射するという本明細書で用いたレジメンは、臨床の場では適用できないということである。しかしながら、ヒトには基礎レベルの抗フラジェリン抗体が存在することから、ヒトは外因的に投与されたフラジェリンに対して記憶型の反応を示す可能性があり、このことが組換えフラジェリンによる標的粘膜免疫の有効性を高めると推測される［24,25］。さらに、フラジェリン免疫化は、その後に投与される食餌性乳化剤に対する防御に十分であることが観察されたため、確立した慢性低悪性度腸炎症におけるこのような免疫化レジメンの治療可能性についてはまだ調査していない。しかしながら、本論文の結果から、非免疫化マウスにおいて乳化剤の摂取に反応して糞便中のフラジェリンが増加することは、抗フラジェリンIgAの増加とも関連していることが示唆される（図S2およびS6データ）。同様に、クローン病患者は高濃度の抗フラジェリンIgAを保有しているが、これは予防には十分ではない。

上記の様々な指摘は、腸内細菌叢相互作用の変化を伴う現代の慢性疾患に対するワクチン接種に微生物叢由来の抗原を利用するためには、広範な前臨床試験が必要であることを強調している。とはいえ、われわれの結果は、このアプローチが慢性炎症性疾患を予防する可能性が高いことを示唆している。フラジェリン特異的粘膜抗体の誘発によって、運動性細菌が抑制され、微生物叢の侵食が防止され、ヒトにおける炎症性微生物叢が一般的に減少するのであれば、このアプローチは、IBDやメタボリックシンドロームを含む広範な炎症性疾患を予防するための革新的な予防的／治療的手段となる可能性がある。

材料と方法
倫理規定
マウスはジョージア州立大学（米国ジョージア州アトランタ）にて、機関承認のプロトコル（Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) # A18006）に従って飼育された。ジョージア州立大学の公衆衛生局（PHS）Policy for Humane Care and Use of Laboratory Animalsに基づく動物福祉保証番号はD16-00527（A3914-01）である。

材料
CMCナトリウム（平均MW～250,000）とP80はSigma社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。

マウスとフラジェリン免疫
単量体フラジェリンは、Salmonella Typhimurium (SL3201, fljB-)から分離した鞭毛から高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製し、純度は既述のように検証した[27,28]。C57BL/6 雄性マウス WT は、米国ジョージア州アトランタのジョージア州立大学で、機関承認のプロトコール (IACUC # A14033 および A18006) に従って飼育された。マウスには、Salmonella Typhimurium由来フラジェリン（10μg；前述）を腹腔内注射により毎週計7回免疫し、対照マウスにはビヒクル（PBS）を投与した。マウスは同腹比で群飼した。CO2吸入によりマウスを殺し、結腸長、結腸重量、脾臓重量、脂肪重量を測定した。血清、糞便、臓器および盲腸から腸内容物を採取し、下流の分析を行った。

乳化剤処理
CMCまたはP80を飲料水（1.0%）で希釈したものをマウスに投与した（盲検化せず）。水処理（対照）群には同じ水（逆浸透膜処理したアトランタ市水）を使用し、これらの溶液はすべて1週間ごとに交換した。体重は毎週測定し、初期体重（0日目）を100％としたときの％で表した。糞便は毎週新鮮なものを採取し、下流で分析した。

一晩空腹時血糖測定
血糖値はNova Max Plus Glucose Meterを用いて測定し、単位はmg/dLとした。

糞便リポカリン-2定量
前述のように[18]、凍結した糞便サンプルを100 mg/mlの0.1% Tween 20を含むPBSで再構成し、20分間ボルテックスした。その後、ホモジネートを12,000 rpm、4℃で10分間遠心した。透明な上清を回収し、分析まで-20℃で保存した。Lcn2レベルは、DuoSet Murine Lcn2 ELISAキット（R&D Systems、DY1857）を用いて上清中で測定した。

糞便中のフラジェリンおよびリポ多糖（LPS）負荷量の定量
フラジェリンおよびリポ多糖の定量は、それぞれヒト胚性腎臓（HEK）-blue-mTLR5細胞およびHEK-blue-mTLR4細胞（それぞれInvivogen, hkb-mtlr5およびhkb-mtlr4）を用いて以前に記載した[3,4]。糞便を最終濃度100 mg/mLになるようにPBSに懸濁し、Mini-Beadbeater-24を用いて10秒間ホモジナイズした。その後、サンプルを8,000×gで2分間遠心し、得られた上清を連続希釈し、哺乳動物細胞に適用した。精製した大腸菌フラジェリンおよびLPS（Sigma, L2887）を、それぞれHEK-BluemTLR5細胞およびHEK-Blue-mTLR4細胞を用いた標準曲線測定に用いた。

免疫グロブリン定量用糞便サンプルの調製
マウスからの糞便サンプル採取は、最終フラジェリン投与後3ヶ月まで行った。ELISA用サンプルの調製は、以前に記載されている[29]。簡単に述べると、100mgの糞便ペレットを、1×PBSと0.1M EDTA(pH7.4)の3:1混合物1mlあたり0.05mgの大豆トリプシンインヒビターからなる3mLの収集培地中でホモジナイズした。1,800rpmで10分間遠心した後、上清を14,000rpmで15分間、4℃で再度遠心し、最終上清を回収し、20%グリセロールと2mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（Sigma, P-7626）とともに、分析まで-20℃で保存した。

糞便中の抗フラジェリンIgA/IgG
抗フラジェリン特異的IgAおよびIgGの定量は、以前に記載されている[24-26]。簡単に説明すると、96ウェルマイクロタイタープレート（Costar, Corning, New York）に、実験室で作製したSalmonella Typhimurium由来の100 ng/ウェルを9.6 pHの重炭酸緩衝液中、4℃で一晩コートした。その後、マウスの糞便サンプルを1:4希釈で37℃で1時間処理した。インキュベーションおよび洗浄後、ウェルを西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG（GE Healthcare Life Sciences、NA931V）または西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgA（Southern Biotech、1040-05）とインキュベートした。Igの定量は、3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジンの添加により行い、450nmと540nmの読み取り値の差により光学密度を算出した。

IgAコート菌の単離
IgAコート細菌は、以前に記載されたように分離し、配列決定した[30,31]。簡単に説明すると、凍結した糞便内容物サンプルをPBS中で最終濃度20 mg/mLになるまで十分にホモジナイズした。糞便懸濁液を50g、4℃で15分間遠心分離し、40μmの滅菌ナイロンメッシュでろ過した。濾過した懸濁液約50μLを1mLのPBSに懸濁し、8,000×g、4℃で5分間遠心した。得られた細菌ペレットを100μlのブロッキングバッファー（20％濾過正常ラット血清（NRS）を含む染色バッファー）に懸濁し、4℃で20分間インキュベートした後、100 1mLの染色バッファー（1％（w/v）NRSを含むPBS、濾過）で洗浄した。その後、PE標識抗マウスラットIgA（1:12.5; eBioscience, 12-4204-82）を含む100μlの染色バッファーで、光を避けて室温で25分間染色した。染色バッファーで3回洗浄した後、ペレットを1mLの染色バッファーに再懸濁した。データ取得はBiorad S3ソーターで行った。サンプルは、イベント用に選択される前に、適切な側方散乱光/前方散乱（SSC-A/FSC-A）ゲートでゲートされた。各サンプルについて、IgA-、IgA+、および全集団から50万イベントを滅菌チューブに集めた。各フラクションは、後述するように、DNA抽出および細菌の16 S rRNA遺伝子の配列決定に先立ち、-20℃で保存した。IgA指数は以下の式に従って計算した：log (IgA + taxon abundance / IgA-taxon abundance) [32]。

細菌 DNA 抽出
QIAmp Fast Stool DNA kit（Qiagen Laboratories）を用い、化学破砕（Lyzing buffer）を行い、糞便および細胞選別サンプルからDNAを抽出した。

16S rRNA遺伝子配列決定による微生物叢解析
16S rRNA遺伝子の増幅と配列決定は、Earth Microbiome Project (www.earthmicrobiome.org/emp-standardprotocols)のプロトコルに若干の修正を加え、Illumina MISeqテクノロジーを用いて行った。16S rRNA遺伝子、領域V4は、各サンプルからのPCR産物にタグ付けするために使用されるGolayエラー修正スキームで設計された、固有の12塩基バーコードを含む複合フォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、各サンプルからPCR増幅した。斜体配列は5′イルミナアダプター、12X配列はゴレイバーコード、太字配列はプライマーパッド、斜体太字配列はプライマーリンカー、下線配列は保存された細菌プライマー515Fである。使用した806Rプライマーは、5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTCAGCCAGCCGGACTACNVGGGTWTCTAA T-3′：斜体の配列はイルミナアダプターの3′逆相補配列であり、太字の配列はプライマーパッドであり、斜体の太字の配列はプライマーリンカーであり、下線の配列は保存された細菌プライマー806Rである。PCR反応は5PRIME HotMasterMix（Quantabio, Beverly, Massachusetts, USA）0.2μMの各プライマー、10～100ngの鋳型からなり、反応条件は以下のように設定した： Bio-Radサーモサイクラーを用い、95℃で3分、95℃で45秒、50℃で60秒、72℃で90秒のサイクルを30回行った。PCR産物をゲル電気泳動で可視化し、Ampure磁気精製ビーズ（Agencourt, Brea, California, USA）で精製した。産物をQuanti-iT PicoGreen dsDNA assay）を用いて定量し、精製産物から等モル比でマスターDNAプールを作製した。このプール産物もQuanti-iT PicoGreen dsDNAアッセイで定量し、続いてIllumina MiSeqシーケンサーで塩基配列を決定した（ペアエンドリード、2×250 bp）。

16S rRNA遺伝子配列解析
QIIME2-version 2019を用いて16s rRNA配列を解析した。これらの配列は、QIIME2のデフォルトパラメーターでDada2法を用いて、イルミナアンプリコン配列データを検出・補正するために、デマルチプレックスおよびクオリティフィルターを行い、Qiime2アーチファクトのテーブルを生成した。次に、系統多様性解析のためにalign-to-tree-mafft-fasttreeコマンドを用いてツリーを作成し、core-metrics-phylogeneticコマンドを用いてアルファ多様性解析とベータ多様性解析を行った。PCoAプロットを用いて実験グループ間のばらつき（ベータ多様性）を評価した。未処理のシーケンスデータは、European Nucleotide Archiveにアクセッション番号PRJEB64212で寄託されており、https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home で一般公開されている。

ヘマトキシリン・エオジン染色と病理組織学的解析
安楽死後、大腸（近位結腸、盲腸から最初の2cm）をメタノール-カルノイ固定液（60％メタノール、30％クロロホルム、10％氷酢酸）に入れた。その後、組織をメタノール2×30分、エタノール2×15分、エタノール/キシレン（1:1）15分、キシレン2×15分で洗浄し、縦方向にパラフィンに包埋した。組織は5μmの厚さで切り出し、標準的なプロトコルを用いてHE染色した。HE染色したスライドは、粘膜、粘膜下層、筋層/漿膜の上皮障害と炎症浸潤の程度に基づき、既述のように4つのスコアが付けられた[18]。結腸ごとに4つのスコアを加算した結果、マウス1匹あたりの総スコア範囲は0から36となった。代表的な画像を選択した。

ムチンの免疫染色とFISHによる細菌の局在化
ムチンの免疫染色と蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を組み合わせ、腸粘膜表面での細菌の局在を解析した[3,17]。簡単に説明すると、大腸組織（近位結腸、盲腸から2cm目、糞便を含まない）をメタノール-カルノイ固定液（60％メタノール、30％クロロホルム、10％氷酢酸）中に室温で最低3時間置いた。その後、組織をメタノール2×30分、エタノール2×15分、エタノール/キシレン（1:1）15分、キシレン2×15分で洗浄し、パラフィンに垂直に包埋した。その後、5μm切片を作成し、60℃で10分間予熱した後、キシレン60℃で10分間、キシレン10分間、99.5％エタノール10分間で脱脂した。ハイブリダイゼーションバッファー（20mM Tris-HCl（pH7.4）、0.9M NaCl、0.1% SDS、20%ホルムアミド）中で最終濃度10μg/mLに希釈したEUB338プローブ（5′-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′、Alexa 647を用いた5′標識）を用いて、50℃で一晩ハイブリダイゼーションステップを行った。洗浄バッファー（20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、0.9 M NaCl）で10分間洗浄後、PBS中3×10分間ホルムアミドで洗浄し、PAPペン（Sigma-Aldrich、Z377821）を用いて切片の周囲に印をつけ、ブロック液（PBS中5％ウシ胎児血清）を加えて4℃で30分間処理した。Mucin-2一次抗体（ウサギ H-300; Santa Cruz Biotechnology, sc-15334）をブロック液で1:1,500に希釈し、4℃で一晩塗布した。PBSで3×10分洗浄後、1:1,500に希釈した抗ウサギAlexa 488二次抗体、Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate (Sigma-Aldrich, P1951)を1μg/mL、Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, 94403)を10μg/mL含むブロック液を切片に2時間塗布した。PBSで3×10分間洗浄した後、Prolong anti-fade mounting media（ThermoLife Technologies、P10144）を用いてスライドをマウントした。観察はZeiss LSM 700共焦点顕微鏡とZen 2011 version 7.1で行った。このソフトウェアは、バクテリアと上皮細胞単層との距離を測定するために使用した。簡単に説明すると、各動物について、2つの高倍率視野（HPF）を任意に選択し、以下の包含基準を設定した： (1)染色された細菌が存在すること、(2)明瞭で区切られた粘膜層が存在すること、(3)無傷の粘液層が存在すること。各HPFについて、最も近い5つの細菌と上皮との距離を決定した。したがって、図中の点で示された各細菌-上皮距離は、実際には10個の細菌-上皮距離の平均距離である。

データの表示と統計解析
データは平均値±SEMで表し、統計解析はGraphPad Prismソフトウェア（V.8.2.0）を用いて行った。有意性は一元配置分散分析（ANOVA）を用いて決定し、その後ボンフェローニ・ポストホック検定を行い、有意差は以下のように記した： *p ≤ 0.05 **p ≤ 0.01 ***p ≤ 0.001 ****p ≤ 0.0001。主座標プロットによるクラスタリング解析では、カテゴリーを比較し、PERMANOVAによりクラスタリングの統計的有意性を決定した。

参考情報
S1 図：使用した実験デザインの模式図。

ビヒクル（滅菌PBS、実線と棒グラフ）または精製FliC（ハッチング線と棒グラフ）を週1回免疫する、またはしない。CMC、カルボキシメチルセルロース；FliC、フラジェリン；P80、ポリソルベート80。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.s001

(TIF)

S2 図：食餌性乳化剤の摂取は腸内抗フラジェリンIgA反応を調節する。

(A、B）17週目の抗フラジェリンIgAの糞便レベル。データは5週目の非免疫群（100％と定義）と比較した相対値で表した。この図の基礎データはS6データにある。統計解析は一元配置分散分析（ANOVA）を用いて行い、有意差は以下のように記録した：ns：有意差なし、*p < 0.05、***p < 0.001、***p < 0.0001。ANOVA、分散分析；CMC、カルボキシメチルセルロース；FliC、フラジェリン；IgA、免疫グロブリンA；P80、ポリソルベート80。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.s002

(TIF)

S3 図：相対的存在量によるIgAインデックスの分布。

頭蓋内容物をIgA陽性およびIgA陰性の細菌集団について選別した。選別した細胞からDNAを抽出し、16S rRNAの塩基配列を決定した。各ドットは同定されたASVを表し、相対的存在量とIgAインデックスに基づいてプロットした。(A）水処理；（B）水処理とフラジェリン免疫；（C）CMC処理；（D）CMC処理とフラジェリン免疫；（E）P80処理；（F）P80処理とフラジェリン免疫。この図の基礎データはS7 Dataにある。ASV、amplicon sequence variant; CMC、carboxymethylcellulose; FliC、flagellin; IgA、immunoglobulin A; P80、polysorbate 80。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.s003

(TIF）

S4 図：乳化剤を摂取した非免疫化マウスと水を摂取した非免疫化マウスで、IgA指数が有意に変化した微生物叢メンバー。

19週目に、IgA陽性およびIgA陰性の細菌集団についてネコカル内容物を選別した。選別した細胞からDNAを抽出し、16S rRNAの塩基配列を決定した。免疫群と非免疫群の間でIgA indexが有意に変化したASVを同定し、ヒートマップとしてプロットした。(A）CMC処理；（B）P80処理。この図の基礎データはS8 Dataにある。ASV、amplicon sequence variant; CMC、carboxymethylcellulose; IgA、immunoglobulin A; P80、polysorbate 80。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.s004

(TIF）

S5 図：乳化剤を摂取した免疫マウスと非免疫マウスの間でIgA指数が有意に変化した微生物叢メンバー。

19週目に採取した尾骶骨内容物を、IgA陽性およびIgA陰性の細菌集団について選別した。選別した細胞からDNAを抽出し、16S rRNAの塩基配列を決定した。免疫群と非免疫群の間でIgA indexが有意に変化したASVを同定し、ヒートマップとしてプロットした。(A）CMC処理；（B）P80処理。この図の基礎データはS9 Dataにある。ASV、amplicon sequence variant; CMC、carboxymethylcellulose; IgA、immunoglobulin A; P80、polysorbate 80。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.s005

(TIF)

S1データ。パネル1A、1B、1C、1Dの作成に使用したデータ。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.s006

(XLSX)

S2データ。パネル2Dの作成に使用したデータ。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.s007

(XLSX)

S3データ。パネル3A、3B、3Cの作成に使用したデータ。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.s008

(XLSX)

S4データ。パネル4A、4B、4C、4Dの作成に使用したデータ。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.s009

(XLSX)

S5データ。パネル5A、5B、5C、5Dの作成に使用したデータ。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.s010

(XLSX)

S6データ。パネルS2AおよびS2Bの作成に使用したデータ。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.s011

(XLSX)

S7 データ。パネルS3A、S3B、S3C、S3D、S3E、S2Fの作成に使用したデータ。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.s012

(XLSX)

S8データ。パネルS4AおよびS4Bの作成に使用したデータ。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.s013

(XLSX)

S9 データ。パネルS5AおよびS5Bの作成に使用したデータ。

doi:10.1371/journal.pbio.3002289.s014

(XLSX)

謝辞
参考文献
1.Cho I, Blaser MJ. ヒトマイクロバイオーム：健康と病気の接点で。Nat Rev Genet. 2012 Mar 13;13(4):260-270. doi: 10.1038/nrg3182.
2.Hansson GC. 腸内感染と炎症における粘液層の役割。Curr Opin Microbiol. 2012 Feb;15(1):57-62. doi: 10.1016/j.mib.2011.11.002. pmid:22177113.
3.Chassaing B, Koren O, Goodrich JK, Poole AC, Srinivasan S, Ley RE, et al. 食餌性乳化剤は、大腸炎とメタボリックシンドロームを促進するマウスの腸内細菌叢に影響を与える。Nature. 2015 Mar 5;519(7541):92-96. doi: 10.1038/nature14232.
4.Chassaing B, Van de Wiele T, De Bodt J, Marzorati M, Gewirtz AT. 食餌性乳化剤は、生体外でヒトの微生物叢組成と遺伝子発現を直接変化させ、腸内炎症を増強する。Gut. 2017 Aug;66(8):1414-1427. doi: 10.1136/gutjnl-2016-313099. pmid:28325746
5.Roberts CL, Rushworth SL, Richman E, Rhodes JM. 仮説：クローン病の罹患率上昇の説明としての乳化剤の消費量の増加。J Crohns Colitis. 2013 May;7(4):338-341. doi: 10.1016/j.crohns.2013.01.004. pmid:23360575.
6.Tran HQ, Ley RE, Gewirtz AT, Chassaing B. フラジェリン誘導性適応免疫は、鞭毛虫性微生物叢を抑制し、慢性炎症性疾患に対するワクチンを接種する。Nat Commun. 2019 Dec;10(1):5650. doi: 10.1038/s41467-019-13538-y. pmid:31827095
7.Sevrin G, Massier S, Chassaing B, Agus A, Delmas J, Denizot J, et al. 付着性侵入性大腸菌の腸内環境への適応：鞭毛の発現と細菌コロニー形成能への影響。Gut Microbes. 2020 May 3;11(3):364-380. doi: 10.1080/19490976.2017.1421886. pmid:29494278.
8.Viennois E, Bretin A, Dubé PE, Maue AC, Dauriat CJG, Barnich N, et al. Dietary Emulsifiers Directly Impact Adherent-Invasive E. coli Gene Expression to Drive Chronic Intestinal Inflammation. Cell Rep. 2020 Oct 6;33(1):108229.
9.Chassaing B, Gewirtz AT. レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによる内面粘液関連細菌の同定。Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2018 Sep 17;7(1):157-160. doi: 10.1016/j.jcmgh.2018.09.009. pmid:30510996.
10.McCole DF, Barrett KE. 大腸炎における上皮輸送と腸管バリア機能。Curr Opin Gastroenterol. 2003 Nov;19(6):578-582. doi: 10.1097/00001574-200311000-00011.
11.Sanders DSA. クローン病の初期病変の発症における粘膜の完全性とバリア機能。J Clin Pathol. 2005 Jun 1;58(6):568-572. doi: 10.1136/jcp.2004.021840.
12.Verberkmoes NC, Russell AL, Shah M, Godzik A, Rosenquist M, Halfvarson J, et al. Shotgun metaproteomics of the human distal gut microbiota. ISME J. 2009 Feb;3(2):179-189. doi: 10.1038/ismej.2008.108.
13.Vijay-Kumar M, Aitken JD, Carvalho FA, Cullender TC, Mwangi S, Srinivasan S, et al. Toll様受容体5欠損マウスにおけるメタボリックシンドロームと腸内細菌叢の変化。Science. 2010 Apr 9;328(5975):228-231. doi: 10.1126/science.1179721.
14.Cullender TC, Chassaing B, Janzon A, Kumar K, Muller CE, Werner JJ, et al. 自然免疫と適応免疫は相互作用して、腸内の微生物鞭毛運動を抑制する。Cell Host Microbe. 2013年11月13日;14(5):571-581. doi: 10.1016/j.chom.2013.10.009.
15.Alexander KL, Zhao Q, Reif M, Rosenberg AF, Mannon PJ, Duck LW, et al. Human Microbiota Flagellins Drive Adaptive Immune Responses in Crohn's Disease. Gastroenterology. 2021 Aug;161(2):522-535.e6. doi: 10.1053/j.gastro.2021.03.064.
16.Alexander KL、Targan SR、Elson CO. 自然免疫と適応免疫の微生物叢活性化と制御。2014 Jul;260(1):206-220. doi: 10.1111/imr.12180. pmid:24942691.
17.Chassaing B, Ley RE, Gewirtz AT. 腸管上皮細胞toll様受容体5は腸内細菌叢を制御し、マウスにおける低悪性度炎症とメタボリックシンドロームを予防する。Gastroenterology. 2014 Dec;147(6):1363-1377.e17. doi: 10.1053/j.gastro.2014.08.033. pmid:25172014.
18.Chassaing B, Srinivasan G, Delgado MA, Young AN, Gewirtz AT, Vijay-Kumar M. Fecal Lipocalin 2, a Sensitive and Broadly Dynamic Non-Invasive Biomarker for Intestinal Inflammation. PloS ONE. 2012 Sep 5;7(9):e44328.
19.Carvalho FA, Koren O, Goodrich JK, Johansson MEV, Nalbantoglu I, Aitken JD, et al. Proteobacteriaを一過性に管理できないことが、TLR5欠損マウスにおける慢性腸炎を促進する。Cell Host Microbe. 2012 Aug 16;12(2):139-152. doi: 10.1016/j.chom.2012.07.004.
20.Shin NR, Whon TW, Bae JW. Proteobacteria: microbial signature of dysbiosis in gut microbiota. Trends Biotechnol. 2015 Sep;33(9):496-503. doi: 10.1016/j.tibtech.2015.06.011. pmid:26210164.
21.Chassaing B, Raja SM, Lewis JD, Srinivasan S, Gewirtz AT. Colonic Microbiota Encroachment Correlates With Dysglycemia in Humans. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2017 Sep;4(2):205-221. doi: 10.1016/j.jcmgh.2017.04.001. pmid:28649593.
22.Clasen SJ, Bell MEW, Borbón A, Lee DH, Henseler ZM, de la Cuesta-Zuluaga J, et al. Toll様受容体5によるヒト腸内常在菌由来フラジェリンのサイレント認識。Sci Immunol. 2023 Jan 6;8(79):eabq7001.
23.Sanders CJ, Yu Y, Moore DA, Williams IR, Gewirtz AT. フラジェリンに対する体液性免疫応答には、T細胞と自然免疫の活性化が必要である。J Immunol Baltim Md 1950. 2006 Sep 1;177(5):2810-2818. doi: 10.4049/jimmunol.177.5.2810.
24.Ziegler TR, Luo M, Estívariz CF, Moore DA, Sitaraman SV, Hao L, et al. ヒト短腸症候群における検出可能な血清フラジェリンおよびリポ多糖、ならびに発現上昇した抗フラジェリンおよびリポ多糖免疫グロブリン。Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2008 Feb;294(2):R402-R410. doi: 10.1152/ajpregu.00650.2007.
25.Fedirko V, Tran HQ, Gewirtz AT, Stepien M, Trichopoulou A, Aleksandrova K, et al. 細菌産物リポ多糖およびフラジェリンへの曝露と肝細胞がん：ネステッドケースコントロール研究。BMC Med. 2017 Apr 4;15:72. doi: 10.1186/s12916-017-0830-8. pmid:28372583
26.Sitaraman SV, Klapproth JM, Moore DA, Landers C, Targan S, Williams IR, et al. クローン病におけるフラジェリン特異的免疫グロブリンの上昇。Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2005 Feb;288(2):G403-G406. doi: 10.1152/ajpgi.00357.2004.
27.Vijay-Kumar M、Sanders CJ、Taylor RT、Kumar A、Aitken JD、Sitaraman SV、et al. TLR5の欠失は、マウスの自然大腸炎を引き起こす。J Clin Invest. 2007 Dec;117(12):3909-3921. doi: 10.1172/JCI33084.
28.Vijay-Kumar M, Aitken JD, Sanders CJ, Frias A, Sloane VM, Xu J, et al. フラジェリン処理は化学物質、細菌、ウイルス、放射線から身を守る。J Immunol Baltim Md 1950. 2008 Jun 15;180(12):8280-8285. doi: 10.4049/jimmunol.180.12.8280.
29.Cong Y, Brandwein SL, McCabe RP, Lazenby A, Birkenmeier EH, Sundberg JP, et al. 自然発症大腸炎C3H/HeJBirマウスにおける腸内細菌抗原に反応するCD4+ T細胞：Tヘルパー細胞1型反応の増加と疾患移行能力。J Exp Med. 1998年3月16日;187(6):855-864. doi: 10.1084/jem.187.6.855.
30.Palm NW, de Zoete MR, Cullen TW, Barry NA, Stefanowski J, Hao L, et al. Immunoglobulin A coating identifies colitogenic bacteria in inflammatory bowel disease. Cell. 2014 Aug 28;158(5):1000-1010. doi: 10.1016/j.cell.2014.08.006. pmid:25171403.
31.Kau AL, Planer JD, Liu J, Rao S, Yatsunenko T, Trehan I, et al. 食餌依存性腸症を産生する栄養不良マラウィの小児からのIgA標的細菌分類群の機能的特徴付け。Sci Transl Med. 2015 Feb 25;7(276):276ra24. doi: 10.1126/scitranslmed.aaa4877.
32.Sterlin D, Fadlallah J, Adams O, Fieschi C, Parizot C, Dorgham K, et al. ヒトIgAは多様な常在細菌と結合する。J Exp Med. 2020年3月2日;217(3):e20181635. doi: 10.1084/jem.20181635.
33.Johansson MEV, Hansson GC. 組織切片における粘液の保存、固定組織におけるムチンの免疫染色、およびFISHによる細菌の局在。In： McGuckin MA, Thornton DJ, editors. Mucins： Methods and Protocols [Internet]. Totowa, NJ: Humana Press; 2012 [cited 2023 Feb 6]. p. 229-235 (Methods in Molecular Biology). doi: 10.1007/978-1-61779-513-8_13.
図を見る (5)
読者コメントを見る
著者について
指標を見る
メディア掲載
記事をダウンロード(pdf)
引用のダウンロード
この記事をメールで送る
PLOSジャーナル
PLOSブログ
トップに戻る
トップに戻る
PLOS
PLOSについて
フルサイト
フィードバック
連絡先
プライバシーポリシー
利用規約
メディアお問い合わせ
PLOSは非営利の501(c)(3)法人（#C2354500）で、米国カリフォルニア州サンフランシスコを拠点としています。

この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？