見出し画像

日本人における腸内細菌叢のタイピングについて

哉百名

微生物
学際電子出版協会（MDPI)
日本人における腸内細菌叢のタイピングについて


高木智久、井上涼、[...]、内藤雄士
追加記事情報
関連データ
補足資料
データの利用可能性に関する声明
アブストラクト
腸内細菌叢は宿主の健康と病気の両方に関与しており、細菌学的組成に基づいて層別化することができる。しかし、アジア人については、腸内細菌叢のクラスタリングデータは限られている。本研究では、健常者283名を含む日本人1803名の糞便微生物叢を16S rRNAシーケンスで解析し、2つのモデルを用いてクラスタリングした。また、様々な疾患と各コミュニティタイプとの関連も評価した。PAM（partitioning around medoids）とDirichlet multinominal mixturesモデルを用いて、それぞれ5つ、15つのコミュニティが特定された。PAMで特定されたタイプの中で特徴的に高い存在感を示した細菌は、Ruminococcaceae科（タイプA）、Bacteroides属、Blautia属、Faecalibacterium属（タイプB）、Bacteroides、Fusobacterium、Proteus（タイプC）、Bifidobacterium（タイプD）、Prevotella（タイプE）。日本人の被験者で最も注目されたのは、ビフィドバクテリウムが多く含まれるコミュニティであった。健康な被験者の母数が最も多いE型に基づくオッズ比では、他の型（特にA、C、D型）が炎症性腸疾患、機能性胃腸障害、生活習慣病など様々な疾患と高い関連性を持つことが明らかになりました。腸内細菌群集タイピングにより、日本人特有の腸内細菌型と考えられる菌が再現性よく同定され、欧米人とは一部異なることがわかった。
キーワード：腸内細菌群集、PAM（Partitioning around medoids）モデル、DMM（Dirichlet multinominal mixtures）モデル、Bifidobacterium、Enterotype

  1. はじめに
    近年、ヒトの腸内細菌叢に関する情報が蓄積され、その組成が宿主の健康や、炎症性腸疾患（IBD）、過敏性腸症候群（IBS）、アレルギーなどの各種疾患、さらには肥満や非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）などの生活習慣病と関連していることが明らかになっています [1,2,3,4] 。Arumugamらは、partitioning around medoids（PAM）を用いて、ヒトの腸内細菌叢が細菌学的組成に基づいて3つのクラスター（腸内タイプ）に分類できることを示しました［5］。伝統的な3つの腸型は、Bacteroides（腸型1）、Prevotella（腸型2）、Ruminococcus（腸型3）を多く含むことが特徴です。これらの腸型は、年齢、性別、文化的背景、地理に依存しないが、長期的な食生活に関連していることが示されている。例えば、Prevotellaは炭水化物の多い食事と強く関連しているのに対し、Bacteroidesの腸型は、西洋の食事によく見られるようなタンパク質や動物性脂肪の消費と関連しています[6]。
    また、便サンプルのコミュニティ型クラスタリングも提案されている[7,8]。これらの報告では、Dirichlet multinomial mixtures (DMM) モデリングアプローチを用いて、便を4つのクラスター型に層別化することを説明しています： Ruminococcaceae（R）、Prevotella（P）、Bacteroides 1（B1）、Bacteroides 2（B2）腸型です。R腸型は硬い便に多く、P腸型はゆるい便に関連します[9]。B1腸型は西洋食を採用している健康な集団に最も多い腸型ですが、B2腸型はBacteroidesの割合が高く、Faecalibacteriumの割合が低いという特徴があり、全身性の炎症レベルやIBDでより多く見られます［10, 11］ 。このことから、B2腸型は不健康なマイクロバイオームコンステレーションを示す可能性があることが示唆されます。欧米のコホートを用いたヒトの腸内細菌叢のクラスタリングは、様々な疾患との関連性を評価したり、治療介入による腸内細菌叢の変化を評価するのに有用であると思われます。しかし、腸内細菌叢のプロフィールや構造は、特定の地域の住民や民族の違いに基づいて異なることもよく知られています。西島ら[12]は、日本人集団の腸内細菌叢が他の集団と大きく異なることを確認しています。そこで、西島ら[12]が用いたデータセットで腸内細菌叢を層別化したところ、腸内細菌型の分布も他国と比較して日本人の集団に特徴があることが判明しました[13]。この違いは、食事だけでは説明できない。一方、アジア地域の学童の腸内細菌叢を解析したところ、PrevotellaやBifidobacterium/Bacteroidesの変異によって識別される2つの腸型類似クラスターが発見された[14]。したがって、腸内細菌叢の構造は、個人の居住国や地域、食習慣や生活習慣を強く反映しているといえる。しかし、日本人集団の組成微生物プロファイルに関する研究はほとんど行われていない。
    本研究では、日本人被験者の腸内細菌叢プロファイルを調査しました。我々の知る限り、本研究は、健康な人から様々な疾患を持つ人まで、多数の日本人被験者を対象とした腸内細菌叢プロファイルに関する最初の報告である。

  2. 材料と方法
    2.1. 研究対象者及びデータ収集
    2016年11月から2017年4月にかけて、当院外来から病状の異なる計1803名を抽出した。対象となるのは、14歳以上101歳未満の男女の被験者である。健常者283名を含む、登録された1803名の試験対象者の分布を表1にまとめた。健康な被験者は、健康状態が良好であるとみなされた。除外基準は以下の通りである：糞便サンプル採取前3ヶ月以内に抗生物質、コルチコステロイド、免疫抑制剤、酸抑制剤（プロトンポンプ阻害剤（PPI）またはヒスタミン型2受容体遮断剤（H2ブロッカー））の投与、または悪性疾患の基礎疾患の既往歴がある。さらに、代謝、呼吸器、心臓、腎臓、肝、血液、神経、精神機能が重篤な患者、例えば、下剤、抗うつ剤、オピオイド系麻薬鎮痛剤、抗コリン剤、プレバイオティクスやプロバイオティクスなど腸の運動に影響を与える薬を常用している患者は除外しました。妊娠中または授乳中の個人も除外した。研究者が評価した、腸管運動や腸内細菌叢に影響を与える可能性のある他の要因を持つ患者も除外された。
    表1
    登録された研究対象者の分布。
    高血圧（HT）は、収縮期血圧≧140mmHg、拡張期血圧≧90mmHg、または現在降圧剤を使用しているものと定義した。高脂血症（HL）は、血清低密度リポタンパク質コレステロール濃度≧140mg/dL、高密度リポタンパク質コレステロール濃度＜40mg/dL、トリグリセリド濃度≧150mg/dL、またはコレステロール低下剤の現在の使用と定義された。2型糖尿病（T2D）は、空腹時血糖値126mg/dL以上、ヘモグロビンA1c値6.5％以上、または現在糖尿病治療薬を使用していると定義された。肥満は、体格指数（BMI）≧30kg/m2と定義された。
    2.2. サンプル採取とDNA抽出
    糞便サンプルを採取し、腸内細菌組成分析を既報[15,16,17]に従い実施した。簡単に説明すると、米粒大の糞便サンプルを、糞便採取キット（テクノスルガラボ、静岡、日本）で入手できるチオシアン酸グアニジン溶液を用いて採取した。サンプルは激しく混合した後、DNA抽出まで最大7日間、室温で保存した。
    ゲノムDNAは、NucleoSpin微生物DNAキット（Macherey-Nagel, Düren, Germany）を用いて分離した。保存した糞便サンプルの約500μLを、100μLのElution Buffer BEを含むマイクロ遠心分離管に入れた。次に、この混合物をプロテイナーゼKを含むNucleoSpinビーズチューブに入れ、TissueLyzer LT小型ビーズミルで30Hzで12分間、機械的ビーズによるホモジナイズに供した。その後の抽出手順は、製造元の説明書に従って行った。抽出されたDNAサンプルは、Agencourt AMPure XPシステム（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）を用いて精製した。
    2.3. 16S rRNA遺伝子の塩基配列決定
    精製したDNAサンプルの配列ライブラリーを作成するために、2段階のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施した。1回目のPCRは、NGS用16S（V3-V4）メタゲノムライブラリー構築キット（タカラバイオ株式会社、草津市）を用いてDNAサンプルを増幅するために実施した。1回目のPCRのプライマーペアは、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域に対応する341Fフォワードプライマー（5'-TCGTCGGCAG CGTCAGATGT GTATAAGAGA CAGCCTACGG GNGGCWGCAG-3' ）と806Rリバースプライマー（5'-GTCTCGTGG CTCGGAGATG TGTATAAG ACAGGACTA CHVGGTWTC TAAT-3' ）が含まれていました。2回目のPCRは、Nextera XT index kit（Illumina, San Diego, CA, USA）を用いて、イルミナシーケンサー用のインデックス配列にバーコード配列を付加して行った。その後、調製したライブラリーを、MiSeq Reagent v3キットとMiSeqシステム（イルミナ社）を用いて、タカラバイオのバイオメディカルセンターで250ペアエンド塩基のシーケンサーを行った。
    2.4. マイクロバイオーム解析とコミュニティタイピング
    得られた配列データは、標準的なQIIME2（ver2020.8）ソフトウェアパイプラインを使用して処理された。DADA2プラグインを使用してノイズ除去を行い、アンプリコン配列バリアント（ASV）を生成した。各ASVの分類は、Greengenes (13_8) 99% operational taxonomic units (OTUs)で学習したscikit-learn naïve Bayes machine-learning classifierによって行われました。葉緑体およびミトコンドリアに割り当てられたシングルトンおよびASVは、この研究のために削除された。α-多様性指数、Chao1指数（ASVリッチネス推定）、Shannon指数（ASV均等性推定）はQIIME2を用いて算出した。細菌属レベルのβ多様性は、Bray-Curtisメトリックを用いてサンプル間の距離を計算し、主座標分析（PCoA）を用いて可視化した。
    サンプルのコミュニティタイプへの割り付けには、PAM（Partitioning around medoids）モデルとDMM（Dirichlet multinominal mixtures）モデルの2つの一般的なアプローチを使用した1。コミュニティタイプ分類には属レベルのデータを用い、50%以上のサンプルから検出された頻度の高い属のみが選択された。選択されなかった属や検出頻度の低い属は、「その他の属」としてまとめて分類された。同様に、分類されていない属はすべて "unclassified genera "としてグループ化された。最適な成分数（コミュニティ）は、PAMベースのクラスタリングモデルで最も高い平均シルエット幅を与え、DMMモデルベースのクラスタリングで負のログモデルへの最小ラプラス近似を与える数を選択することで特定した。評価する成分数の最大値は、いずれのクラスタリング手法でも20とした。コミュニティタイピングは、Rソフトウェア（ver.4.0.4）を用い、"cluster "や "DirichletMultinomial "など適切なパッケージで実施した。
    JMP Pro（SAS Institute, Tokyo, Japan）のサポートベクターマシン（SVM）を用いて、検出頻度の高い属に「その他の属」「未分類の属」を加えた構成から、PAMで特定された5つのコミュニティそれぞれを予測するモデルを構築した。予測モデルの検出力は、トレーニングデータの約65%（1200人）と予測データの約35%（603人）のホールドバックバリデーションで評価した。本研究では、線形カーネルと1に等しいコストパラメータが適用された。
    2.5. 統計解析
    成分間のα-多様性指標は、一元配置分散分析（ANOVA）とTukey HSD post hoc testを用いて統計的に比較した。成分間のβ-多様性の差は、順列分散分析（PERMANOVA）を用い、Tukey HSDポストホックテストを行うことで評価した。統計解析はRソフトウェアおよびvegan package for Rを用いて行った。グループ間の細菌系統および属の相対存在量の統計的差異（p < 0.05）は、STAMPソフトウェアでBenjamini-Hochberg相関を用いた一元配置分散分析により評価した。各コミュニティにおける疾患頻度に基づいて、腸内細菌叢の各疾患のオッズ比を算出した。各コミュニティにおける疾患のオッズ比の統計的差異（p < 0.05）は、JMP ProのWald検定を用いて計算した。
    2.6. 倫理に関する記述
    本研究はヘルシンキ宣言に記載された倫理規範に準拠し、研究プロトコルは京都府立医科大学倫理委員会（ERB-C-1770-2）により承認された。すべての参加者は、登録前に書面によるインフォームドコンセントを行った。本研究は、大学病院医療情報ネットワークセンター（UMIN000045216）に登録された。

  3. 結果
    3.1. 登録された試験参加者
    日本人1803名（男性983名、女性820名）、うち健常者283名を登録した（表1）。全参加者の平均年齢は64.2±15.0歳（14-101歳）であった。表1に示すように、参加者は、心血管疾患、肝疾患、機能性胃腸症、内分泌疾患、神経疾患、精神疾患、IBD、自己免疫疾患、悪性疾患、および高血圧、脂質異常症、高尿酸血症、T2D、肥満などの生活習慣病など、さまざまな疾患の状態を示していた。各疾患のより詳細な内訳は、補足表S1に示す。
    3.2. 日本人参加者の腸内細菌叢
    平均相対存在量に基づくと、本研究に参加した日本人被験者の腸内細菌叢は、主に4つのフィラで構成されていました： これは、先行研究[12,17]の報告と一致しています（図1a）。属レベルでは、Bacteroides、Bifidobacterium、Faecalibacterium、Blautia、Ruminoocccus（Ruminococcaceae科）、Roseburia、Prevotellaの7属が日本人で優勢であることが判明しました。これらの平均存在量の合計は、腸内細菌叢の約45％を占めた（図1b）。また、36属が被験者の50%以上で検出されました（図1c）。これらの頻繁に検出される属は、腸内細菌叢のコミュニティタイピングに使用されました。

  4. 図1
    本試験に登録された日本人被験者の微生物群集の分類学的組成。腸内細菌叢における4つの主要細菌門の平均存在量（a）、7つの優勢属（b）、および頻繁に検出される属（c）の累積棒グラフ....
    3.3. 本試験に登録された日本人参加者の腸内細菌叢のタイピング
    PAMクラスタリングに基づく最適なコミュニティ数は5（補足図S1a）であったが、DMMモデルクラスタリングに基づくそれは15（補足図S1b）であった。DMMモデルで定義された15個のコミュニティの特徴と、様々な疾患との関係について、以下に簡単に説明する。ただし、簡略化のため、PAMモデルによって同定された腸内細菌叢の5つのコミュニティと関連する疾患との関係については、主に本論文の以降の部分で説明することとする。
    5つのコミュニティは、PAMクラスタリングによって特定された順序に従って、タイプA〜Eに分類された。表2に示すように、E型コミュニティの健常者数は5つのクラスターの中で最も多く、A型とD型コミュニティの健常者数は他の3つのタイプに比べ著しく少なかった。α-多様性指数（Chao1指数、Shannon指数とも）は、A型が最も高く、次いでE型、C型であった（図2a、b）。タイプDの群集では、Chao1指数とShannon指数の両方が最も低かった。β多様性については、Bray-Curtis非類似度から、タイプAとタイプBの距離、タイプBとタイプEの距離、タイプCとタイプDの距離に有意差はなかった（図2c、d）。しかし、タイプAとタイプDを含む他のペア間の距離は、有意に異なっていた。
    図2
    PAMで特定された5つの群集の腸内細菌叢のα多様性とβ多様性。 α多様性はChao 1 index（ASV豊かさ推定）（a）およびShannon index（ASV均等性推定）（b）によって評価。α-ダイバーシティの統計的差異 ...
    表2
    PAMで特定された各タイプにおける健常者の数と割合。
    A型の分類学的特徴を属レベルでみると、Coprococcus、Gemminger、Roseburiaの存在量が最も多かった（図3a、補足表S2）。また、A型ではRuminococcus（Ruminococcaceae）がC型に次いで2番目に多く、未分類の属が最も多く存在することがわかった。さらに評価したところ、ルミノコックス科に属する未分類の属の存在量は、5種類のうちA型が最も多く、平均4.6%であった（補足図S2）。BacteroidesはBタイプで最も多く、BlautiaとFaecalibacteriumも最も多く含まれていた。その他の属では、C型はMegamonusが最も多く、平均4.9%であった。また、タイプCではフソバクテリウムとプロテウスが最も多く含まれていた。D型では、ビフィドバクテリウム、ラクトバチルス、ストレプトコッカスが他の4型に比べて有意に多く、主要な乳酸菌の生息数が最も多いことがわかった。Eタイプでは、プレボテラが最も多いという明確な特徴があった。各タイプの腸内細菌叢の特徴的な構成要素を表3にまとめた。無作為に抽出した1200人の被験者のデータをトレーニングデータとして生成したSVMベースのモデルは、残りの603人の被験者の予測データを用いて、PAMで特定されたコミュニティを高精度に分類することが示された。検証用データセットの誤分類率は約7.8%（47/603人）であった。また、各タイプの受信者動作特性（ROC）曲線の曲線下面積（AUC）値は0.98以上であった（図4）。
    図3
    PAMで特定された5種類の微生物群集の属レベルでの分類学的組成。検出頻度の高い属の存在量の累積棒グラフ（a）、検出頻度の高い属の存在量の平均値のヒートマップ（b）。...
    図4
    PAMで特定された各タイプにおける各種疾病のオッズ比。PAMで特定された各タイプにおける各種疾患のオッズ比を、各疾患を持つ個体数に基づいて算出した。統計的に有意な差（p < ...
    表3
    PAMで特定された各タイプの腸内細菌叢に特徴的に多く含まれる分類学的特徴のまとめ。
    3.4. 腸内細菌叢のコミュニティタイプと疾患状態との関連性
    続いて、E型のプロファイルをもとに、各病態のオッズ比を算出した（図5）。E型が選ばれた理由は、5つのタイプの中で最も健康な人の母数が多く、35.8%であったためである（表2）。B型は26.6%と2番目に健康な人が多く、IBDを除く各種疾患の奇数比率に大きな差は見られなかった。一方、健常者が少ないタイプA、タイプC、タイプDは、様々な疾患との関連が示された。タイプAでは、特に循環器系疾患、神経系疾患、生活習慣病で高いオッズ比を示し、タイプDでは、IBD、機能性胃腸症で高いオッズ比を示しました。また、C型ではIBDで比較的高いオッズ比を示したが、D型に比べると低い。各疾患のより詳細なオッズ比の結果は、補足図S3に示す。
    図5
    サポートベクターマシンモデルによるROC曲線とAUC値。SVM分類モデルを用いて各腸内細菌叢コミュニティタイプを予測する能力を評価するROC曲線の評価。各曲線は、...に対する感度と特異度を表す。
    3.5. DMMベースのクラスタリングによって特定された腸内細菌叢コミュニティ
    PAMで特定されたコミュニティと同様に、DMMモデルに基づくクラスタリングで特定された15のコミュニティのそれぞれを、タイプ1～15として順次ラベル付けした。健常者の人口が最も多いコミュニティタイプはタイプ10で、健常者は42.2%であった（補足表S3）。タイプ10の特徴的な細菌分類では、Prevotella属が最も多く含まれており、これはPAMで特定されたコミュニティのタイプEと一致する（補足図S4a,b）。タイプ10のプロファイルをもとに各種疾患のオッズ比を計算すると、タイプ5、11、12、14、15は、疾患のオッズ比が20以上と顕著に高いことがわかった（補足図S5）。例えば、タイプ5、11、12は、心血管疾患のオッズ比が高く、一方、タイプ14、15ではIBDのオッズ比が顕著に高くなりました。また、12型では悪性疾患（治療中、治療後とも）、高血圧など他の疾患のオッズ比が他の型と比較して高い値を示しました。これら疾患との関連性が比較的高い5つのタイプのうち、タイプ5はタイプ10を含む他のタイプに比べてα多様性（Chao1指数、Shannon指数とも）が高かった（補足図S6a、b）。また、タイプ11と12のChao1指数とShannon指数の両方によるα多様性もタイプ10より高かったが、タイプ14と15のα多様性はタイプ10より低かった（補足図S6a,b）。β多様性については、Bray-Curtis非類似度から、タイプ10とタイプ14または15の距離は有意な差があったが、タイプ10とタイプ5、11、12の距離は有意な差はなかった（補足図S6c、d）。他のタイプに比べて相対量が多い特徴的な細菌属は、タイプ5のOscillospira、タイプ11のRuminocceae科のRuminococcus、タイプ12のStreptococcus、タイプ14のBifidobacterium、タイプ15のVeillonellaだった（補足図S4a、b）。

  5. 考察
    本研究では、1803名の日本人被験者（健常者15.7％、各種疾患保有者85.3％を含む）を登録し、糞便サンプルを用いて腸内細菌叢を解析しました。特徴的なのは、腸内細菌叢の組成に変化が見られることがすでに報告されている炎症性腸疾患や機能性胃腸症の参加者（13.1％）である。さらに、高血圧、脂質異常症、高尿酸血症、T2D、肥満などの生活習慣病を少なくとも1つ有する参加者（63.0%）を登録した。
    本研究では、これらの日本人の腸内細菌叢が腸型に層別化することが示されました。PAMベースのクラスタリングを用いて、腸内細菌の構造に基づいて5つの可能なコンステレーションが同定された。重要なことは、SVMベースの予測モデルにより、これらのクラスタリングの再現性が高いということである。コミュニティタイピングには属レベルのデータを使用し、頻繁に検出される属（サンプルの50％以上で検出される属）のみを選択した。図3および表3に示すように、日本人被験者の腸内細菌叢の分類学的特徴は、ビフィドバクテリウム属に富む腸型（タイプD）の存在に基づいて特徴づけられました。また、PAMで特定された4つのコミュニティは、欧米諸国からこれまでに報告されたコミュニティと類似していた[5,7]。Vandeputureら[7]が報告した腸型のうち、健康な集団に最も多い腸型であるB1腸型は、E型に次いで健康な人が多く含まれる本研究のPAMベースのB型に相当する。一方、B2型腸型は、バクテロイデスの割合が高く、フェーカリバクテリウムの割合が低いという特徴を持つ、PAMに基づくC型群に類似していた。E型は健常者が最も多く、Prevotella属が豊富に含まれていることが特徴で、既報のP型腸管型と類似している可能性が示唆された。最後に、A型はRuminococcaceaeに属する未分類の属が豊富に含まれており、R enterotypeに類似していることが示唆された。
    西島ら[12]は、日本人集団の腸内細菌叢構造が他の集団と大きく異なることを示し、その違いの少なくとも一つはビフィドバクテリウム属が豊富であることであった。Parkら[18]も、健康な日本人1596人の腸内細菌叢の特徴として、ビフィドバクテリウムが豊富に存在することを述べています。このように、日本人の腸内細菌叢の構造において、ビフィドバクテリウムの高存在は、様々な疾患の有無に関係なく、重要な属を代表するものとして注目されているようです。
    ビフィドバクテリウムのいくつかの菌株は、その有益な効果からプロバイオティック微生物とみなされ、機能性食品（主に乳製品、食品サプリメントや医薬品など）に生物活性成分として含まれていることはよく知られている[19]。ビフィズス菌の摂取によるヒトの健康への有益な効果は、主にIBDやIBSなどの腸内疾患やアレルギー疾患などの免疫疾患の予防や治療と関連しています。最近の研究では、ビフィドバクテリウム・ビフィダムG9-1（BBG9-1）の投与が、便の硬さの変化により、日本人の便秘患者のQOLを改善することが明らかにされました［20］。
    しかし、様々な疾患の状態と腸内細菌叢のタイプとの関連性に関する解析では、ビフィドバクテリウム属に富むクラスターが、必ずしも様々な疾患の低リスクであることを示すものではないことが示されました。今回の研究では、ビフィズス菌が多く存在するクラスターであるタイプDは、心血管疾患、肝疾患、IBDや機能性消化管障害、精神疾患、高血圧、脂質異常症、高尿酸血症、糖尿病などの生活習慣病など、様々な疾患ステータスと高いオッズ比を示していました。ビフィズス菌の健康状態における機能的役割については、心不全 [21]、高脂血症、T2D [15,22,23] の患者に多く存在することが証明されており、やや議論の余地があります。ともあれ、ビフィズス菌を介した健康上の利点は、ビフィズス菌、腸内細菌叢の他のメンバー、およびヒト宿主の間の複雑かつ動的な相互作用の結果として生じると考えられている。したがって、今回の知見は、ビフィズス菌そのものが有害な作用を及ぼすのではなく、ビフィズス菌が豊富に存在するような腸内環境が有害である可能性を示唆しています。
    また、D型群集では、ビフィドバクテリウムを含む乳酸産生菌が他の菌種に比べて多く、より多くの乳酸が産生されることが予想される。大腸で生成された乳酸は、通常、乳酸利用菌によって酪酸やプロピオン酸といった宿主に有益な短鎖脂肪酸（SCFA）に代謝される。しかし、乳酸利用菌の数が少ない群集の場合、乳酸は蓄積され、さまざまな有害な作用を及ぼす可能性があります[24]。例えば、乳酸はpKaが低いため、腸内pHを低下させ、微生物相の変化や大腸のアシドーシスにつながる可能性があります。また、乳酸は硫酸還元性腸内細菌の増殖基質となるため [25] 、有毒な濃度の硫化水素の生成を促進する可能性がある。実際、乳酸は重症の大腸炎患者の大腸に蓄積されることが示されている[26,27,28]。α多様性が最も低いタイプDは、乳酸利用菌が少ない可能性がある。したがって、様々な疾患に対するオッズ比が高いことは、このタイプの腸内細菌叢に乳酸が蓄積している可能性を支持する。
    本研究では、PAMだけでなく、DMMモデルを用いて腸内細菌叢の分類を試みました。DMMモデルに基づく解析では、被験者の数が増えれば、より多くのコミュニティが同定されることが期待されます。この予想通り、今回の研究ではDMMモデルを用いて15個のクラスターを確認しましたが、これはPAMに基づくクラスタリングで確認されたコミュニティよりも3倍多い数となっています。DMMモデルのタイプ10は、PAMベースのクラスタリングのタイプEと同様に、Prevotellaに富むクラスタであった。一方、タイプ12は、溶連菌が多いクラスターとしてユニークであると考えられ、全体的に疾患オッズ比が高かった。さらに、14型と15型ではStreptococcusが多い傾向にあり、Streptococcusは高いホモ乳酸発酵と高い乳酸産生を示すことがよく知られているため、これらの型の疾患リスクを上げるために重要である可能性があります。今回の研究にはいくつかの限界があります。ヒトの腸型を評価した過去の研究よりも多くの被験者を登録することができたが、サンプルサイズはまだ不十分である可能性がある。特に、加齢に伴う腸内細菌叢の変化を考慮した年齢調整分析を行うことができなかった。また、食習慣は特定の腸内細菌型の出現に最も重要な要因の一つと考えられているが、食習慣に関する調査を考慮することができなかった。そのため、各腸内細菌叢に関連する食事要因については議論することができない。さらに、各種疾患と各腸内細菌叢コミュニティとの関連性については、現在および過去の疾患状態に基づいて評価するのみであった。そのため、本研究の結果を用いて様々な疾患のリスク・発症を予測することは困難である。ヒトの腸内細菌叢をエンテロタイプのような個別のクラスターに層別化することは、特定の疾患に関連する微生物マーカーを評価する上で魅力的な方法であるが、現実はより複雑である。例えば、腸内細菌群集と疾患との関係を適切に議論するためには、腸内細菌の代謝能力を考慮することが重要である。しかし、残念ながら、各腸内細菌叢のSCFAなどの代謝物のプロファイルは現在のところ不明である。したがって、今後の研究で、微生物代謝物と腸内細菌叢のコミュニティタイプとの関連性を解析する必要がある。

  6. 結論
    結論として、我々はPAMベースおよびDMMモデルベースのクラスタリングを用いて、日本人の腸内細菌叢のタイピングを実証することに成功した。欧米人向けに提案された腸内細菌型とは異なり、日本人の腸内細菌はPAMベースのクラスタリングにより5つのコミュニティタイプにかなりの再現性で層別された。日本人の腸内細菌叢は、特にビフィドバクテリウム属の存在によって特徴づけられていた。また、様々な疾患と腸内細菌叢のコミュニティタイプ分けとの関連性を評価することも試みました。しかし、詳細な微生物の特性と個人の健康状態を完全に相関させるためには、さらなる調査が必要である。近い将来、年齢、性別、民族性、栄養習慣、服薬などによって駆動される正確な腸型が、個人の健康状態とうまく相関させるとともに、診断マーカーとして使用されるようになることが期待されます。
    謝辞
    本研究は、株式会社プレメディカとの共同研究として行われました。
    補足資料
    以下は、オンライン（https://www.mdpi.com/article/10.3390/microorganisms10030664/s1）で公開されています。補足表S1：本研究の登録被験者の詳細な分布、補足表S2：PAMで特定された各タイプにおける細菌属の多さ、補足表S3．DMMモデルで特定された15種類の各タイプにおける健常者の数と割合、補足図S1：partitioning around medoids（PAM）とDirichlet multinominal mixtures（DMM）モデルのモデルフィッティング、補足図S2：PAMで特定した5種類のコミュニティタイプにおけるRuminococcaceaeに関する細菌群の多さ、補足図S3．より詳細な疾患背景に基づく、PAMで特定された各コミュニティタイプにおける各種疾患のオッズ比、補足図S4： DMMモデルで特定された15種類のコミュニティタイプにおける微生物コミュニティの属レベルでの分類学的組成、補足図S5：DMMモデルで特定された15種類のコミュニティタイプそれぞれにおける各種疾患のオッズ比、補足図S6：Dirichlet multinominal mixtures (DMM) モデル解析に基づいて層別された15のコミュニティタイプの腸内細菌群のα多様性と主要座標解析（PCoA）プロットです。
    追加データファイルはこちら(2.4M, zip)
    著者からの寄稿
    T.T.（高木智久）、R.I.、Y.N.が実験の構想を、T.T.（高木智久）、R.I.、A.O.、H.S.、K.M、K.Uが腸内細菌叢データのメタゲノム解析、K. O、 T.T.（冨永智）、Y.M.、T.S.が登録被験者の調査および背景情報の収集を行い、T.T.（高木智久）、R.I、Y.N、Y.Iが原稿編集に携わりました。すべての著者は、結果について議論し、原稿にコメントした。すべての著者は、掲載された原稿を読み、同意した。
    資金提供
    本研究は、日本学術振興会の科学研究費補助金（助成番号20K08292）、農林水産省の産学官共同研究「知の融合領域」（FKII）内藤裕司（番号28020006）の支援を受けています。
    インスティテューショナル・レビュー・ボード声明
    本研究は、ヘルシンキ宣言に記載された倫理規範に準拠し、研究プロトコルは京都府立医科大学倫理委員会（ERB-C-1770-2）により承認されました。すべての参加者は、登録前に書面によるインフォームドコンセントを行った。本研究は、大学病院医療情報ネットワークセンター（UMIN000045216）に登録されました。
    インフォームドコンセントの声明
    すべての参加者は、登録前に書面によるインフォームドコンセントを行った。
    データの利用可能性に関する声明
    本研究では、複数の独立した研究による配列データを使用した。データはNCBIデータベースのSequence Read Archive（SRA）に寄託され、アクセッション番号はPRJNA766337、PRJNA804422、PRJNA809418、およびPRJNA809527。後者2つは2022年5月1日現在で利用可能です。
    利益相反について
    高木智久は、富士フイルムメディカル株式会社から共同研究費を、持田製薬株式会社から講演料を受領しています。高木智久は富士フイルムメディカル株式会社から共同研究費を得ています。内藤裕司は、EAファーマ株式会社から奨学金を受け、太陽化学株式会社から共同研究費を得ています。内藤裕司は、EAファーマ株式会社から奨学金、太陽化学株式会社から共同研究費、マイランEPD株式会社、武田薬品工業株式会社から講演料を受けている。(株)エヌ・ティ・ティ・ドコモ マイランEPD株式会社、武田薬品工業株式会社、持田製薬株式会社から講演料を受領しました。Ltd.、武田薬品工業株式会社、持田製薬株式会社から講演料を受領した。Ltd.、EA Pharma. Ltd.、武田薬品工業株式会社、持田製薬株式会社、EA Pharma. 大塚製薬株式会社 大塚製薬株式会社 (注)1．Ltd.、EAファーマ株式会社、大塚製薬株式会社、宮里山製薬株式会社 伊藤義人 伊藤義人は、日医工株式会社からの寄付金で運営されている診療科に所属している。本研究は、これらの資金により一部支援されたものである。資金提供会社および外部組織は、本研究の設計に参加せず、競合する利害関係も有していない。これらの企業は、最終版の原稿を承認した。
    脚注
    出版社からのコメント：MDPIは、出版された地図や機関所属の管轄権主張に関して中立を保っています。
    記事情報
    マイクロオーガナイザーズ 2022 Mar; 10(3)： 664.
    オンライン公開 2022 Mar 20. doi: 10.3390/microorganisms10030664
    pmcid: pmc8954045
    PMID：35336239
    高木智久1,2,*† 井上亮3,† 大島晃4 坂爪裕4 小川健太4 富永朋4 三原洋一4 菅谷武志1 水島勝5 内山和彦1 伊藤義人1 内藤裕二5
    Hong Seong-Tshool、アカデミックエディター
    1京都府立医科大学大学院医学研究科分子消化器病態学分野（日本）; pj.ca.m-upk.otok@ayagus-t (T.S.); pj.ca.m-upk.otok@ihcu-k (K.U.); pj.ca.m-upk.otok@hotiy (Y.I.)
    2京都府立医科大学大学院医学研究科医療イノベーション・トランスレーショナル医科学専攻（〒602-8566 京都府京都市下京区錦小路通四条下ル）。
    3摂南大学動物科学研究室（〒573-0101 大阪府大阪市中央区）; pj.ca.nanustes@euoni.oyr
    4株式会社プレメディカ研究開発部, 東京都, 105-0011; pj.oc.m-kn@amihso.arika (A.O.); pj.oc.acidemerp@emuzakas.ihsorih (H.S.); pj.oc.acidemerp@awago.atnek (K.O.); pj.oc.acidemerp@aganimot.omot (T.T.); pj.oc.acidemerp@arahim.y (Y.M.)
    5京都府立医科大学大学院医学研究科人間免疫栄養科学専攻（602-8566）; pj.ca.m-upk.otok@amisuzim (K.M.); pj.ca.m-upk.otok@otiany (Y.N.)
    *Correspondence: pj.ca.m-upk.otok@omotakat; Tel： +81-75-251-5519
    †These authors contributed equally to this work.
    Received 2022 Feb 27; Accepted 2022 Mar 18.
    Copyright © 2022 by the authors.
    Licensee MDPI, Basel, Switzerland. この記事は、クリエイティブ・コモンズ表示（CC BY）ライセンス（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）の条件下で配布されたオープンアクセス記事です。
    Microorganismsの記事は、Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI)の提供でここに提供されます。
    参考文献

  7. Marchesi J.R., Adams D.H., Fava F., Hermes G.D., Hirschfield G.M., Hold G., Quraishi M.N., Kinross J., Smidt H., Tuohy K.M., et al. The gut microbiota and host health： 新たな臨床フロンティア。Gut. 2016;65:330-339. doi: 10.1136/gutjnl-2015-309990. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  8. Lynch S.V., Pedersen O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. N. Engl. J. Med. 2016;375:2369-2379. doi: 10.1056/NEJMra1600266. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  9. Li W., Fu L., Niu B., Wu S., Wooley J. メタゲノム配列解析のための超高速クラスタリング・アルゴリズム. Brief. Bioinform. 2012;13:656-668. doi: 10.1093/bib/bbs035. [PMCフリーペーパー] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  10. Adenote A., Dumic I., Madrid C., Barusya C., Nordstrom C.W., Rueda Prada L. NAFLD and Infection, a Nuanced Relationship. Can. J. Gastroenterol. Hepatol. 2021;2021:5556354. doi: 10.1155/2021/5556354. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  11. Arumugam M., Raes J., Pelletier E., Le Paslier D., Yamada T., Mende D.R., Fernandes G.R., Tap J., Bruls T., Batto J.M., et al. ヒト腸内細菌群の腸型(Enterotype of the human gut microbiome. ). Nature. 2011;473:174-180。[PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  12. Wu G.D., Chen J., Hoffmann C., Bittinger K., Chen Y.Y., Keilbaugh S.A., Bewtra M., Knights D., Walters W.A., Knight R., et al. 長期食事パターンと腸内細菌腸型タイプの関連性。Science. 2011;334:105-108. doi: 10.1126/science.1208344. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  13. Vandeputte D., Kathagen G., D'Hoe K., Vieira-Silva S., Valles-Colomer M., Sabino J., Wang J., Tito R.Y., De Commer L., Darzi Y., et al. 定量的マイクロバイオームプロファイリングにより、腸内コミュニティの変動と微生物負荷が関連付けられた。Nature. 2017;551:507-511. doi: 10.1038/nature24460. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  14. ホームズ I.、ハリス K.、クインス C. ディリクレ多項式混合物： 微生物メタゲノミクスのための生成モデル。PLoS ONE. 2012;7:e30126. doi: 10.1371/journal.pone.0030126. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  15. Vandeputte D., Falony G., Vieira-Silva S., Tito R.Y., Joossens M., Raes J. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rate. Gut. 2016;65:57-62. doi: 10.1136/gutjnl-2015-309618. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  16. Vieira-Silva S., Sabino J., Valles-Colomer M., Falony G., Kathagen G., Caenepeel C., Cleynen I., van der Merwe S., Vermeire S., Raes J. Quantitative microbiome profiling disentangles inflammation- and bile duct obstruction-association microbiota alterations across PSC/IBD diagnoses. Nat. Microbiol. 2019;4:1826-1831. doi: 10.1038/s41564-019-0483-9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  17. Vieira-Silva S., Falony G., Belda E., Nielsen T., Aron-Wisnewsky J., Chakaroun R., Forslund S.K., Assmann K., Valles-Colomer M., Nguyen T.T.D., et al. Statin therapy is associated with lower prevalence of gut microbiota dysbiosis. Nature. 2020;581:310-315. doi: 10.1038/s41586-020-2269-x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  18. 西島聡、須田和彦、大島和彦、Kim S.W.、廣瀬由美子、森田浩之、服部正明 健常日本人の腸内細菌叢とその微生物的・機能的独自性. DNA Res. 2016;23:125-133. doi: 10.1093/dnares/dsw002. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  19. 細田晋一郎、西島晋一郎、福永貴之、服部正明、浜田雅功：潜在ディリクレ配分によるヒト腸内細菌叢の微生物集合構造の解明．Microbiome. 2020;8:95. doi: 10.1186/s40168-020-00864-3. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  20. 中山淳一、渡辺紘一、姜淳一、松田紘一、チャオ・S・H、ハリオノP、ラ・オングカムO、サルヲコM・A、スジャヤI・N、ザオL、他 アジアの学童期の腸内細菌群集における多様性. Sci. Rep. 2015;5:8397. doi: 10.1038/srep08397. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  21. 高木俊介、内藤恭子、柏木聡、内山恭子、水島啓介、鎌田和彦、石川哲也、井上理恵子、奥田和彦、辻本祐一、他 腸内細菌叢の変化は日本人における高血圧、高脂血、2型糖尿病と関連する. Nutrients. 2020;12:2996. doi: 10.3390/nu12102996. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  22. プロトンポンプ阻害薬の長期服用が腸内細菌叢に及ぼす影響．年齢・性別一致の症例対照研究。J. Clin. Biochem. Nutr. 2018;62:100-105. doi: 10.3164/jcbn.17-78. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  23. 健康な日本人における年齢、性別、便の硬さに関連した腸内細菌叢の違い．J. Gastroenterol. 2019;54:53-63. doi: 10.1007/s00535-018-1488-5. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  24. Park J., Kato K., Murakami H., Hosomi K., Tanisawa K., Nakagata T., Ohno H., Konishi K., Kawashima H., Chen Y.A., et al. Comprehensive analysis of gut microbiota of a healthy population and covariates affecting micro variation in two large Japanese cohorts. BMC Microbiol. 2021;21:151. doi: 10.1186/s12866-021-02215-0. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  25. Hidalgo-Cantabrana C., Delgado S., Ruiz L., Ruas-Madiedo P., Sánchez B., Margolles A. Bifidobacteria and Their Health-Promoting Effects. Microbiol. Spectr. 2017;5:1-19. doi: 10.1128/microbiolspec.BAD-0010-2016. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  26. 冬木明彦、日暮隆史、毛受敏介、芦刈健一郎、吉原俊一郎、三澤直樹、岩城正樹、小林稔侍、大久保博、米田稔、他 慢性便秘患者のQOL改善に対するBifidobacterium bifidum G9-1の有効性．前向き介入研究. Biosci. Microbiota Food Health. 2021;40:105-114. doi: 10.12938/bmfh.2020-073. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  27. 心不全患者における腸内細菌叢と血漿微生物関連代謝産物．Circ. J. 2018;83:182-192. doi: 10.1253/circj.CJ-18-0468. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  28. 蔗糖の摂取は2型糖尿病患者における腸内細菌異常に影響を与える．J. Diabetes Investig. 2020;11:1623-1634. doi: 10.1111/jdi.13293. [PMC無料記事】【PubMed】【CrossRef】【Google Scholar】。

  29. 近藤恭子、橋本恭子、濱口雅史、安藤聡、加地明彦、酒井亮、井上亮、柏木聡、水島健太郎、内山和彦、他 2型糖尿病と関連する腸内細菌クラスターの特異な習慣性食品摂取量. Nutrients. 2021;13:3816. doi: 10.3390/nu13113816. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  30. Wang S.P., Rubio L.A., Duncan S.H., Donachie G.E., Holtrop G., Lo G., Farquharson F.M., Wagner J., Parkhill J., Louis P., et al. Pivotal Roles for pH, Lactate, and Lactate-Utilizing Bacteria in the Stability of a Human Colonic Microbial Ecosystem. MSystems. 2020;5:e00645-20. doi: 10.1128/mSystems.00645-20. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  31. Marquet P., Duncan S.H., Chassard C., Bernalier-Donadille A., Flint H.J. 乳酸はヒト大腸の硫化水素形成を促進する可能性を持つ。FEMS Microbiol. Doi: 10.1111/j.1574-6968.2009.01750.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  32. ヴェルニアP.、カプリリR.、ラテラG.、バルベッティF.、マリオッカF.M.、チッタディーニM. 便中乳酸と潰瘍性大腸炎。胃腸病学。1988;95:1564-1568. doi: 10.1016/S0016-5085(88)80078-7. [PubMed】【CrossRef】【Google Scholar】。

  33. Hove H., Nordgaard-Andersen I., Mortensen P.B. 100人の胃腸患者における糞便中DL-乳酸濃度. Scand. J. Gastroenterol. 1994;29:255-259. doi: 10.3109/00365529409090473. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  34. Chen L., Li R., Wang Z., Zhang Z., Wang J., Qiao Y., Huang Y., Liu W. Lactate-utilizing bacteria ameliorates DSS-induced colitis in mice. Life Sci. 2022;288:120179. doi: 10.1016/j.lfs.2021.120179. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？