塩分濃度を徐々に変化させながら海水へ移行したアトランティックサーモン（Salmo salar）の腸内細菌量と濃度は増加した
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雑誌 微生物の巻 11号 10.3390/microorganisms11010076
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塩分濃度を徐々に変化させながら海水へ移行したアトランティックサーモン（Salmo salar）の腸内細菌量と濃度は増加した
by María F. Morales-Rivera 1,2,Diego Valenzuela-Miranda 1,2,3ORCID,Gustavo Nuñez-Acuña 1,2,Bárbara P. Benavente 1,2,Cristian Gallardo-Escárate 1,2 and Valentina Valenzuela-Muñoz 1,2,3,※ORCID
1
コンセプシオン大学水産養殖学際研究センター（INCAR）、コンセプシオン、4030000、チリ
2
コンセプシオン大学海洋学部生物工学・水生ゲノム研究室（コンセプシオン4030000、チリ
3
コンセプシオン大学バイオテクノロジーセンター（コンセプシオン4030000、チリ
*
宛先は著者です。
微生物2023, 11(1), 76; https://doi.org/10.3390/microorganisms11010076
受理されました。2022年10月26日／改訂：2022年12月7日／受理：2022年12月20日／掲載：2022年12月27日
(この記事はトピック「水環境中の微生物」に属しています。）
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アブストラクト
宿主の生理的履歴と環境がマイクロバイオーム構造を決定する。その意味で、パースモルト変態後のサケの海水への移行に用いられる戦略は、アトランティックサーモンの腸内細菌叢に影響を与える可能性がある。そこで本研究では、3つの処理下で海水移行中のアトランティックサーモン腸内細菌叢の多様性と存在量、およびメタゲノム機能予測について探索することを目的とした。1群は緩やかな塩分変化（GSC）、もう1群は塩分ショック（SS）、3群は海水（SW）移行の前に機能性飼料（FD）を摂取させた。微生物プロファイルは、Nanoporeプラットフォームを用いたフル16S rRNA遺伝子配列決定によって評価されました。さらに、PICRUSt2を用いてメタゲノム機能予測を実施した。その結果、塩分濃度の変化がアトランティックサーモンの腸内細菌叢の豊富さ、多様性、分類学的組成に影響を与えることが示された。その結果、GSCとFDはアトランティックサーモンのスモルトの微生物叢の多様性を増加させることが明らかになり、海水移入時の腸内微生物叢と魚の健康との間に正の関係があることが示唆されました。この知見は、スモルト魚の生産におけるマイクロバイオームのサーベイランスに応用でき、アトランティックサーモンの海水移入のパフォーマンスを向上させることができる。
キーワード アトランティックサーモン；パースモルト化；海水移入；腸内細菌叢；ナノポアシーケンス
はじめに
過去数年にわたり、魚の健康と福祉はその微生物叢に大きく影響されるというコンセンサスが得られている[1]。海産魚の微生物相は、腸の発達、代謝、免疫反応において極めて重要な役割を果たすことがあります。マイクロバイオームがどのように変化するかを理解することは、宿主と微生物の相互作用や宿主の健康への影響を理解する上で重要です[2]。そのため、養殖生産における健康な生物と福祉を促進するために、海産魚の腸内細菌叢を形成する因子を理解することにさまざまな研究努力が注がれています[3]。
魚類微生物群集は、主にシーケンス技術に基づく分子的手法によって探索されてきました。ここでは、16S rRNA遺伝子のV1からV9までの超可変領域のシーケンスを用いて、海洋環境の微生物多様性を研究した[4,5,6,7]。魚類の微生物相を評価するために、どの領域を使用すべきかについてのコンセンサスは得られていません。したがって、微生物相の同定に16S rRNA遺伝子の異なる領域を使用する研究を見つけることが可能である[8,9,10]。しかし、超可変領域の塩基配列部分が分類学的多様性の推定に影響を与える可能性があることが知られている[11,12,13]。また、異なる16S rRNA領域だけでは、正確な豊かさの推定やより高度な分類学的分類には不十分であることが確認されている[14,15]。近年、Nanoporeテクノロジー（Oxford Nanopore Technologies, Oxford, UK）を用いた16S rRNA遺伝子の全塩基配列の決定が、種やより高い分類レベルの微生物相を特定する最良のツールとして示唆されている[16,17,18,19]。
微生物叢の構造は、宿主の生理歴、食事、生態学的要因、環境など、多様な要因によって変化する可能性がある[20,21,22]。環境要因については、塩分濃度の変化が魚類の腸内細菌叢の構造と多様性に影響を与えることが証明されている[23,24]。冬眠魚では、SWへの移行が魚の飲水量増加の引き金となる[2,25]。これらの適応は、腸内の浸透圧変化を安定化させ、腸内細菌叢を構成する細菌群に変化をもたらす [2,10,26,27].
チリでは、アトランティックサーモン（Salmo salar）が養殖場におけるサケ科魚類の優先種であり、生産量の72％を占めている[28]。パー・スモルト転換、すなわちスモルト化の際、アトランティックサーモンは、魚がFWからSWに変化するための分子的・生理的変化を必要とする[25、29]。自然条件下では、サケ科魚類は、スモルト化の際に川から海まで塩分濃度勾配を通過する [30]。しかし、生産的なシステムでは、スモルトがFWからSWに直接移動することが多く、サケの微生物相と健康における塩分濃度の直接的な変化の影響を考慮することはない。SWの移動の1週間後と4週間後にFWの段階と比較した場合、SWの皮膚微生物相の多様性と豊かさが大きいことが報告されている[8]。Wangら[10]は、アトランティックサーモンの腸内細菌叢について、FWの魚とSW移行2週間後の魚の間で高い差があることを報告している。彼らの結果のうち、FWに関連するLactobacillus属とPhotobacterium属、SWで22週間後にLactobacillus属とMycoplasma属が高い頻度で観察された。さらに、再循環型養殖システム[31]では、SW後1週間で腸内微生物の豊富さが減少することが観察されている[9]。さらに、アトランティックサーモンのSW移行時の微生物群集の変化は、魚の免疫系を誘導して感染症の発生を許容することが報告されている[31]。そのため、スモルト化時のサケ類のパフォーマンスと健康を高めるための機能性飼料が開発されている[32]。
以前、我々は、緩やかな塩分変化にさらされたアトランティックサーモンの腸と塩分ショックの間のトランスクリプトームの変化を報告した[33]。この研究では、塩分濃度の緩やかな変化にさらされたサケの腸内組織では、塩分濃度ショックにさらされた魚と比較して、多くの転写産物が異なって発現していることが報告されています。さらに、Gen Ontology（GO）エンリッチメント解析により、代謝プロセス、イオン膜貫通輸送、免疫反応に関連する遺伝子が多く存在することが示されました。このように、スモルト化戦略の違いによるアトランティックサーモンの腸内細菌叢の変化を示唆することが可能である。そこで、本研究では、16S rRNA遺伝子ナノポアシーケンスにより、アトランティックサーモンのスモルトの腸内細菌叢の豊富さと存在量を属・種レベルで探索することを目的とした。我々は、異なる塩分条件と飼料中の機能性成分の使用が、パースモルトの移送中にマイクロバイオームコミュニティを変調させる可能性があると仮定した。これらの知見を総合すると、スモルト生産の新規戦略をサポートし、サケ養殖における動物の健康と福祉を向上させることができます。材料と方法
2.1. 実験デザイン
この研究のためのアトランティックサーモンの腸内サンプルは、私たちのグループにとって以前に報告されたアッセイから採取された[33]。簡単に説明すると、淡水（FW）スモルト（60±6.2g）を商業農場（Hendrix Genetics Aquaculture, Villarrica, Chile）から入手し、Universidad de Concepción, Dichato, ChileのMarine Biology Stationに運んだ。魚は紫外線処理されたシングルパスフロースルータンクシステム（500L、30匹/タンク）で、12：12時間の明暗サイクル、溶存酸素レベル8.5mg/L、pH=8.0で維持し、カーギルの普通食を毎日与えた。1ヶ月の馴化後、FW（対照群）試料を採取した。その後、魚を3連の実験群に分けた。最初のグループのサケは、3連の水槽あたり30匹のスモルトで、FWの塩分濃度をSWに上げることによって、漸進的な塩分濃度変化（GSC）にさらされました。勾配は3塩分点に設定し、1ヶ月間、1週間に10PSUずつ変化させた。各塩分点での1週間の馴化後、腸内試料を採取した。一方、1水槽あたり30匹のスモルトを3連にした別のグループは、GSCグループと同じ日に塩分ショック（SS）とFWから32PSUへの移動に晒された。これら2つのグループには、Cargillの通常飼料を与えた。3連の水槽あたり30匹のスモルトからなる第3グループは、SuperSmolt Feed Only, Stim社（未承諾試験）の機能性飼料（FD）を1ヶ月間与え、他のグループと同時に32PSUに移した。32PSUでの馴化1週間後に各群の魚の腸内サンプルを採取した。さらに、VEHICE社（チリ）が実施した免疫組織化学分析により、SW移送までのサケの状態を評価した。また、ATPase-αとATPase-βのRT-qPCR発現解析は、比較ΔΔCt相対発現解析で求めた。プライマーおよびqPCR条件は、私たちのグループに関して以前に説明したものと同様であった[33]。動物処置は、コンセプシオン大学の倫理委員会が承認したガイドラインの下で実施された。実験デザインは、動物実験に関する3R（Three Rs）ガイドラインを考慮した。
2.2. DNAの抽出とFull-16S rRNAの増幅
魚の腸内消化物を除去した後、腸組織を十分にミンチにしてから、1 mLの溶解バッファー（10 mM Tris-HCl, 400 mM NaCl, 100 mM EDTA, 0.4% SDS, and 5 μL of 20 mg/mL Protease K, pH 8.0） と混合し、その後十分にボルテックスを行い37℃にて2時間インキュベートした。サンプルは、1.4 mmのセラミック球を用いた振動ミル（MM200、Retsch）で24 Hzで5分間ホモジナイズし、フェノール：クロロホルム：イソアミル法を行った。DNAの完全性は、抽出後、1％アガロースゲル電気泳動で評価した。DNA濃度は、Nanodrop分光光度計で測定した。実験グループごとに5個体を最終濃度100ng/μLでプールした。プライマー27 F 5′-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ および1492 R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ を用いてフル16S rRNA遺伝子を増幅した［34］．増幅には、15μLのTaq DNAポリメラーゼLongAmp（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）を用い、以下の条件下で行った。95℃、1分、95℃、56℃、30秒、65℃、1分を25サイクル行い、最終伸長は65℃、5分とした。PCR結果の評価には、1.2%のアガロースゲルでの電気泳動が用いられた。
2.3. ナノポアライブラリーの合成と塩基配列の決定
Nanoporeについては、5個体のプールのフル16S rRNA PCR産物を用いて、各実験グループごとに3連でライブラリーを実施した。PCR産物は、Agencourt AMPure XPビーズ（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）を用いて、1：2のサンプル：ビーズの割合で精製した。サンプルを磁気スタンドに入れ、70％エタノール（新鮮なものを用意）で洗浄した。ビーズを分子生物学グレードの水で再懸濁した。精製したアンプリコンは、Qubit 4蛍光計（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）で定量し、16S Barcoding Kit（SQK-RAB204, Oxford Nanopore Technologies）を用いて、1D配列決定戦略の製造者の指示に従って、ライブラリー合成のテンプレートとして使用しました。簡単に言うと、精製した16Sアンプリコンをバーコードと混合し、LongAmp Taq Polymerase（New England Biolabs）を用いて、最終反応量を50uLとして、前段で述べたようにPCRを実施した。PCR産物をHulaMixer（Thermo Scientific）中で室温で5分間インキュベートし、Agencourt AMPure XPビーズで洗浄した。精製産物を10uLの溶出バッファー（10mM Tris-HCl pH8.0 with 50mM NaCl）で溶出した。ライブラリーの最終濃度はQubit 4 fluorometer（Thermo Scientific）を用いて測定し、ライブラリーはHigh Sensitivity D5000 ScreenTape（Agilent, Santa Clara, CA, USA）を用いて、メーカーの指示に従い、TapeStation Bioanalyzer 2100（Agilent）で検査した。Oxford Nanopore Technologiesの方法論に従って、ライブラリーをマルチプレックスモードでプールし、フローセルMK1 Spot-ON FLO-MIN107-R9にシークエンシングしました。内部コントロールとして、微生物モックコミュニティ（Zymo Biomics Microbial Community Standard）のDNAを抽出し、同じ記載手順でシーケンスし、観察された分類群の存在量を予想される存在量と比較した。シーケンス効率は、ソフトウェアMinKNOW 2.0（Oxford Nanopore Technologies）を用いてモニタリングした。
2.4. バイオインフォマティクス解析
生成されたfast5ファイルはGuppy（version 3.2.2, Oxford Nanopore Technologies, Oxford, UK）を用いてベースコールし、Qスコア≧7の配列のみを保持するフィルタステップを適用した（quality filter）。脱多重化、プライマー、バーコードのトリミングはPorechop V0.2.4で行った[35]。BLASTNは、NanoCLUSTパイプライン[36]でクリーニングされた配列16S NCBI分類学データベースをアライメントした。これには、配列サイズ1400-1800 bpとQ-score≥9によるフィルタリングが含まれる。α多様性の推定にはSimpsonの1-DとShannon indexを、均等性の推定にはPielouのindexを使用した。微生物群集構造は、分類群相対量データに基づくBray-Curtis非類似度を用いて解析し、多変量教師なしデータ探索として主座標分析（PCoA）を実施した。すべての指標とPCoAは、Rの「Vegan」パッケージ[37]を用いて算出した。腸内細菌叢のバリエーションは、R統計ソフトウェアで系統、目、属の相対的存在度をプロットすることで探索した[38]。PICRUSt2ソフトウェアを用いて、16S rRNAの全配列から得られたV3-V4領域を用いて、メタゲノム機能を予測した[39]。これらの領域は、CLCプログラムのV3-V4用ユニバーサルプライマー[26]と我々のシーケンスデータとのアライメントによって同定された。経路レベルは、MetaCycデータベース[40]を用いて構築した。相対存在量プロットはRを使用して作成した。パスウェイ貢献度の有意差の検定にはSTAMP 2.1.3プログラムを使用した[41]。Benjamini-Hochbergの偽発見率で補正したカイ二乗検定が適用された。グラフ作成には、割合の違いを判断するために、相対存在度が0.5以上のデータを使用した。結果
3.1. アトランティックサーモンの実験性能
GSC、SS、FDの各条件を適用したアトランティックサーモンの免疫組織化学分析において、クロライド細胞の移動が確認され、この条件がSW移行に適していることが示された（図S2）。さらに、ATPase-αおよびATPase-βサブユニットのRT-qPCR検査により、この状況が検証された（図S3）。実験群では、死亡率は観察されなかった。
3.2. フル16Sシーケンスデータレポート
Nanoporeシーケンスにより、Guppyでフィルタリングされた5,867,910リードが生成され、二次メタゲノム解析のために処理されました。脱多重化、トリミング、品質、サイズフィルター後、46.18%のリードがNanoCLUSTによって分類された。模擬コミュニティを含む合計96,160リードが分類学的に分類され、1条件あたり平均13,308リードが分類されました。分類されていない細菌はすべて研究から除外され、分類された分類群のみが多様性と分類学の研究に含まれた（表S1およびS2）。
3.3. 腸内細菌群集の構造
希釈曲線を見ると、すべてのサンプルがプラトーに達しており、分類学的分類に十分な配列数であったことがわかる。ただし、10PSU-GSCと20PSU-GSCのグループのみ10,000リード以上であった（図S4）。全グループの魚類腸内細菌叢のBray-Curtis非類似度は、0.67-0.65の値を示した。勾配を含むFWからSWへの移動は、高い非類似度（0.68-0.91）を示している。最も高い非類似度は、最初の塩分濃度の変化（10PSU-GSC：0.91）で観察される。FWから32PSUへの変化のみに着目すると、32PSU-GSC（0.67）が最も小さな非類似度を示し、32PSU-SSと32PSU-FDは同様の非類似度（0.88-0.85）を示していることが確認された。一般に、最も低い非類似度は、GSCグループ（10PSU-GSC、20PSU-GSC）と32PSU-SSおよび32PSU-FDグループとの間であった（表S3）。Bray-Curtis非類似度を用いた主座標分析（PCoA）では、4つのクラスタが示された。一つは、10PSU-GSCと20PSU-GSCをグループ化したものである（図1A）。第二のクラスターは、32PSU-SSと32PSU-FDの魚試料をグループ化したものである。第3のクラスターはFWサンプルをグループ化し、第4のクラスターは32PSU-GSCを独立して分布させたものである。シンプソン指数（1-D）およびシャノン指数（図1B,C）によると、最も細菌多様性が高いのはグループ10PSU-GSCの個体で、最も分布が少ないグループはFWであった。Pielouの指数によると、最も均一性が低いグループは20PSU-GSCの腸内魚であった（図1D）。SWで1週間後に得られたサンプルに関連し、Simpsonの指数とShannonの指数では、32PSU-FDの魚で高い細菌多様性を示した（図1B、C）。一方、Pielouの指数は、グループ32PSU-SSでより均一性を示した（図1D）。
微生物 11 00076 g001 550Figure 1. アトランティックサーモンの腸内細菌叢の塩分濃度処理間における多様性指数。FW：淡水前処理群、GSC：10PSU、20PSU、32PSU群での漸次塩分濃度変化、32PSU-SS 32PSU群での塩分ショック、32PSU-FD：32PSU群での塩分ショック機能食を事前に給与。(A) Bray-Curtis非類似度により算出したマイクロバイオームのβ多様性のPCoAプロット、(B) The Simpson's 1-D、(C) Shannon diversity index、 (D) Pielou's evenness.
3.4. 大西洋サケのSW輸送中の腸内細菌叢の組成
すべての実験群で腸内細菌叢に10門が確認され（図2A）、89％がProteobacteria門に確認された。さらに、Bacteroidetes、Firmicutes、Actinobacteriaの各系統が微生物叢のサンプルに非常に多く含まれていました。FWの腸内サンプルは、Armatimonadetesが存在する唯一のサンプルであった。一方、10PSU-GSCグループの腸内細菌叢には、Acidobacteria、Fusobacteria、Verrucomicobiaが存在し（図2A）、20PSU-GSCグループの腸内細菌叢ではCyanobacteria門が区別されていた。さらに、32PSU-SSグループの腸内細菌叢には、ProteobacteriaとBacterioidetesという系統の細菌のみが確認された。最後に、32PSU-FD群の微生物叢には、Thermotogae門の存在が顕著であった（図2A）。
微生物 11 00076 g002 550Figure 2. 腸内アトランティックサーモン微生物相組成の相対的存在量。FW：淡水前処理群、GSC：10PSU、20PSU、32PSUで徐々に塩分濃度変化群、32PSU-SS 32PSUで塩分ショック群、32PSU-FD：32PSUで塩分ショック群 機能食で事前に摂餌。(A)門レベルの微生物叢の存在量；(B)処理間の属レベルの最も豊富な上位25分類群。
上位25属の微生物相の相対的な存在量は、10PSU-GSCグループを除くすべての分析サンプルでEscherichia-Shigella属（Enterobacterales）が優勢であることが示された。このグループでは、種族分布はより均質であった（図2B）。特に、FW、10PSU、20PSUサンプルの腸内細菌叢は、32PSUの腸内細菌叢よりも多くの細菌属の多様性を示していた。興味深いことに、32 PSUのすべてのグループのサンプルの微生物叢は、ビブリオ属の存在を示し、32 PSU-SSグループで最も豊富であった（図2B）。
最後に、すべての実験グループにおいて、核となる微生物相が観察されました。このコアは、フラボバクテリア目、エンテロバクター目、モラクセラ目、シュードモナデス目で構成されていた（図3A）。属別に分析すると、腸内コア微生物群ではEscherichia-Shigella属が最も多く、次いでAcinetobacter属とPseudomonas属が多かった（図3B）。
微生物 11 00076 g003 550図3. 全実験群におけるアトランティックサーモン腸内コア微生物叢の正規化相対存在量のヒートマップ。FW：淡水前処理群、GSC：10PSU、20PSU、32PSUで徐々に塩分濃度変化群、32PSU-SS 32PSUで塩分ショック群、32PSU-FD：32PSUで塩分ショック群 機能食で事前に飼育。(A）目レベルのコアマイクロバイオタ、（B）属レベルのコアマイクロバイオタ構成。
3.5. 大西洋サケの腸内細菌叢で同定された細菌種
NanoCLUSTで生成された70種のクラスターは、Yarzaら[14]が定義した同一性98.7％の閾値を超え、全クラスターの17.7％に相当するのみであった。Acinetobacter johnsoniiは、すべての実験グループの腸内細菌叢で確認された唯一の種である（表S4）。また、Pseudomonas migulaeやShigella flexneriなど、FWに存在し、塩分濃度の緩やかな変化にさらされた魚の腸内細菌叢で維持されていた種が観察された。さらに、32PSU-GSCの腸内細菌叢には、Aliivibrio wodanis, Methylobacterium brachiatum, Microbacterium mangrove, Micrococcus luteus, Sphingobium yanoikuyaeといった種が含まれていた。
NanoCLUST解析により、46の病原性細菌のクラスターが分類された。しかし、平均的な同一性と相対量がそれぞれ98.7%と0.2を超えるのは5つだけである（表S4）。すべてのデータセットで同定されたこれらの病原性グループのクラスターは、Acinetobacter johnsonii、Aliivibrio wodanis、Flavobacterium succinicans、およびProvidencia rettgeriという種でした。興味深いことに、Acinetobacter johnsonii種は、すべての実験魚群の腸内細菌叢に存在した（表S4）。
3.6. 海水移植後の腸内細菌叢
また、海水中に1週間放置した後の魚群間の微生物叢の存在量と豊富さを評価した。各実験魚群の腸内細菌叢では、Proteobacteria門が最も豊富であった。さらに、この門は、属レベルで最も高い濃度を示した。特に、Vibrio属、Pseudomonas属、Escherichia-Shigella属、Acinetobacter属は、すべてのグループの32PSUの微生物叢に存在した（図4）。32PSU-GSC群の腸内細菌叢では、ファーミキューテス門、特にBacillales属とLactobacillales属がより豊富であることが確認された。また、32PSU-SS群では、ビブリオ属の存在率が最も高く、45%に達した。32PSU-FDグループは、バクテロイデーテス門の属がより多く、豊富であることがわかった。また、このグループは32PSUの他のグループと比較して、Ralstonia属やPelomonas属を中心とするプロテオバクテリア門の高いリッチネスを示しました（図4）。最後に、32PSU-FD群は、微生物相にThermotogae属が存在する唯一のグループである。
微生物 11 00076 g004 550Figure 4. 海水グループにおける腸内アトランティックサーモン微生物群の属レベルでの相対的存在量。32PSU-GSC：32PSU群での緩やかな塩分変化、32PSU-SS 32PSU群での塩分ショック、32PSU-FD：32PSU群での塩分ショック 機能性飼料を事前に給与。
3.7. 腸内アトランティックサーモン微生物叢の機能解析
PICRUSt2ソフトウェア[39]を用いて、アトランティックサーモン腸内細菌叢の338の機能パスウェイを同定した。そのうち48個がレベル2であり、大半が生合成に関連するものであった（図5A、表S5）。異なるSW処理を比較するために、塩分条件間でエフェクトサイズ＞0.5、p＜0.05のパスウェイをSTAMPで求めた（図5B-D）。最も豊富なパスウェイは、ビタミン、アミノ酸、ヌクレオシドおよびヌクレオチド、脂肪酸、脂質の生合成に関連していた（図5A）。FWグループでより豊富な5つのパスウェイは、レベル2の記述で二次代謝物分解、クエン酸サイクル（TCAサイクル）、C1化合物の利用と同化、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの生合成に注釈された。32PSU-GSCグループでより多く存在する上位5経路のうち、TCAサイクルはレベル2の記述として特定された。また、32 PSU-SS グループでは、Secondary Metabolic Degradation と TCA cycle がレベル2の記述で多く、32 PSU-FD グループで多く見つかったレベル2の記述は Secondary Metabolite Degradation, Nucleoside and Nucleotide Biosynthesis, and TCA cycle でした（表 S5）。
微生物 11 00076 g005 550図5. 代謝経路の相対存在比率（レベル2）。FW：淡水前処理群、GSC：10PSU、20PSU、32PSUで徐々に塩分濃度変化群、32PSU-SS 32PSUで塩分ショック群、32PSU-FD：32PSUで塩分ショック群 機能食で事前に飼育。(A) 淡水と海水処理の違いによる代謝経路の存在量；(B-D) 32PSUのサンプル間で存在量が異なるレベル2の代謝経路をSTAMP解析で求めた。PICRUSt2はフィルターサイズ0.5で代謝パスウェイを推論している。
また、FWとSWのサンプル間で比較したところ、同様のパスウェイが確認された。特に、SWと比較して、FWメタゲノムでは、TCAサイクル、脂肪酸と脂質の生合成、ヌクレオシドとヌクレオチドの生合成、アミノ酸の生合成の存在量が高いことが示された。機能解析の結果、32 PSUのサンプル間でメタゲノミクスのポテンシャルに大きな差があることがわかった。例えば、32 PSU-GSCと32 PSU-SSの間では、芳香族化合物分解とTCAサイクルが32 PSU-GSC群で有意に高い値を示した（図5B）。32 PSU-GSCと32 PSU-FDの比較解析から、12のパスウェイに存在量の差が見られ、アミノ酸生合成、脂肪酸と脂質の生合成、アミノ酸分解などのパスウェイが32 PSU-FDグループで高い存在量を示したことが強調された（図5C）。考察
魚の微生物相はサケのパフォーマンスに関連した役割を果たし、特に食事、魚の生理学、および環境の影響を受けることがある。スモルト化の際、アトランティックサーモンは、淡水（FW）から海水への環境変化にさらされる[42]。したがって、彼らの微生物相の多様性は変更され、海水魚の性能に影響を与える可能性がある。ここでは、16S rRNAのフルシーケンスを用いて、異なる戦略の下でのSWトランスファー中のアトランティックサーモン腸内細菌叢の変化を評価した。また、塩分濃度の緩やかな変化（GSC）による海水魚への移行が、業界で行われているような塩分濃度ショック（SS）にさらされた魚と比較して、微生物相の存在量と多様性に違いを示すかどうかを検討した。
FWとSWのアトランティックサーモンのコア腸内細菌叢には、合計19のOTUが報告されている[20]。これらのOTUのうち、著者らはLactobacillus、Lactococus、Streptococcus、Escherichia/Shigella、Pseudomonas、およびMycoplasmaの存在を報告した。さらに、Dehlerら[26]は、水槽および湖沼環境条件下でのFWにおけるアトランティックサーモンのプレスモールのコア微生物相にEscherichia/Shigellaを報告しています。さらに、Lorgen-Ritchieら[9]は、FW/SWのアトランティックサーモン腸のコア微生物叢にPseudomonas sp.が存在することを記述している。興味深いことに、本研究では、Pseudomonas、Escherichia/Shigella、Acinetobacterからなる微生物コアを同定しました。アトランティックサーモンの腸内細菌叢にアシネトバクター菌が存在することは、これまで報告されていない。しかし、FWアトランティックサーモンでは、皮膚微生物叢にアシネトバクターが高濃度に存在することが報告されている[8]。腸内コア微生物叢に見られる低い多様性は、研究が環境微生物叢を減少させることができる実験室条件下で実施されたためであることが示唆される。
以前、海中ケージ内のアトランティックサーモンの腸内細菌叢がFWの腸内細菌叢と比較して高い種の豊かさを持つことが報告されています[10]。さらに、RASシステムにおけるアトランティックサーモンのFW腸内細菌叢では、SWへのサケ腸内細菌叢の移植と比較して、細菌多様性が増加することが報告されている[9]。本研究では、細菌多様性解析の結果、10PSU-GSC群のサケ腸内細菌叢が、評価した腸内試料の中で最も高い細菌多様性を示すことが示されました。このことから、サケのFWから10PSU-GSCへの段階的な適応は、プレスモールの腸内細菌叢の多様性に有利であることが示唆されました。興味深いことに、海水中1週間後に評価した腸内試料のうち、GCSに曝露したアトランティックサーモンの微生物群およびFDを与えたグループは、塩分ショックによりSWに移行したグループよりも細菌多様性が高いことが示された。また、塩分濃度の緩やかな変化によりSWに移行したアトランティックサーモンのトランスクリプトーム解析では、塩分ショックにさらされたサケと比較して免疫関連遺伝子の発現量が増加していることが報告されている[33]。したがって、GSCに暴露された魚の微生物相の多様性の増加は、健康な魚と関連づけることができることを示唆することが可能である。一般に、腸内細菌叢の多様性の低さは、ディスバイオシスのマーカーであり、ヒトにおける様々な疾患と関連している[43]。さて、魚類では、病気っぽいティラピア（眼球外反、皮膚出血、皮膚病変、壊死）は、健康な魚に比べて多様性指数が低いことが判明している[44]。
アトランティックサーモンの腸内細菌叢に提示されるフィラのうち、これまでの研究では、ProteobacteriaとFirmicutesのフィラが淡水で優勢であることが報告されている[9,10,21]。さらに、海水中では、Proteobacteria門の優位性が高いことが報告されている[9]。さらに、SWで20週間飼育したアトランティックサーモンの腸内では、ファーミキューテスの存在感が増していることが観察されている[10]。さらに、Proteobacteria門は、海水中で8ヶ月後に存在量が減少することが示されている[10]。本研究では、すべての評価対象腸内試料において、Proteobacteria門が最も豊富であった。また、10PSUと20PSUに暴露された魚の腸内では、ファーミキューテス門とバクテロイデーテス門がより豊富であった。さらに、Firmicutes門は、FWとSWの間で同定されたアトランティックサーモンの腸内コア微生物叢に記載されている[26]。ここで、GSC群の腸内細菌叢は、FWからすべての塩分濃度ポイントまでFirmicutesを示した。また、FD群の腸内細菌叢は、Firmicutes門を呈した。このことから、FDとGSCはファーミキューテス門の定着を促すことが示唆された。さらに、昆虫食、ガラクトマンナンオリゴ糖、プレバイオティクスなどのサケ養殖における機能性成分の使用は、Firmicutesの存在量を増加させる[3,10]。注目すべきは、塩分ショックにさらされた魚の腸内細菌叢には、ファーミキューテス門が存在しないことである。同様に、野生のサケでは、ファーミキューテス門は、パール、スモルト、回帰成魚といったFWに関連するステージで観察される[45]。塩分濃度の緩やかな変化と機能的な食性により、ファーミキューテス門が存在することができる。
ビブリオ属は、32PSUで1週間経過したアトランティックサーモンの腸内細菌叢で、主に塩分ショックにさらされた魚で確認された。この属の種は、海洋生態系に多く存在する[46,47]。例えば、エビ、軟体動物、アワビなどの腸内にはビブリオ属の種が報告されている[47]。さらに、ビブリオ属は魚類の病原性に関連している[48]。さらに、SW移入4週間後、アトランティックサーモンのスモルトの腸内細菌叢にビブリオ属が存在することが報告されている[9]。さらに、対照水槽と湖沼環境におけるアトランティックサーモンの腸内細菌叢の比較研究では、コア微生物叢にAliivibrioが存在することが示されている[20]。
特に、Lactobacillus属は、アトランティックサーモンの腸内細菌叢においてより多く存在することが報告されている[9、10、26]。さらに、FWおよびSWのアトランティックサーモンの腸内コア微生物叢には、Lactobacillusの存在が報告されている[26]。また、RASシステムにおいて、アトランティックサーモンのFWの腸内コア微生物叢の中にLactobacillus属が確認された[9]。本研究では、分析した腸内細菌叢にLactobacillus属は存在しないことが確認された。しかし、32 PSU-GSCの腸内細菌叢からは、Lactobacillales目に属するStreptococcus thermophilusが確認された。私たちは、本研究でLactobacillus属が検出されなかったのは、使用したDNA抽出方法の結果であると仮定している[49]。また、16Sライブラリー作成に使用したTaq Polymeraseが、この属の検出に不利である可能性もある[50]と思われる。
ナノポアシーケンスによる完全な16S rRNAシーケンスの利点は、微生物叢のメタゲノムが推測できることである。本研究では、16SからV3-V4領域を用いて、機能解析を実施した。しかし、本研究のアトランティックサーモン腸内細菌叢は、他の研究と比較していくつかの相違点が見られた。例えば、サケのFW微生物叢では、糖質代謝、TCAサイクル、脂質生合成、脂肪酸生合成、酸化的リン酸化に関連する機能の割合が高いことが報告されている[26]。しかし、SWでは、魚類微生物相は、Carbohydrate Metabolism、Amino Sugar and Nucleotide Sugar Metabolism、Glycolysis/Gluconeesisなどのパスウェイに高い濃縮度を示した。さらに、Lorgen-Ritchieらによって、FWとSWにおけるアトランティックサーモンの腸内細菌叢の代謝過程の違いが報告された[9]。本研究では、SW群の腸内細菌叢は、糖質分解、細胞構造、二次代謝物分解に関連する経路の相対存在量が高いことが示された。特に、FW群とSW群のメタゲノム解析では、TCAサイクル、脂肪酸と脂質の生合成、ヌクレオシドとヌクレオチドの生合成、アミノ酸の生合成が高い頻度で見られた。一般に、腸内魚類のメタゲノム機能研究では、Amino Acid Biosynthesisが際立っている[51]。さらに、バリン、ロイシン、イソロイシンは魚類にとって必須代謝物である[52]。32PSU-FDの魚類腸内細菌叢は、アミノ酸生合成の濃度が最も高いことを示した。また、32PSU-SSの魚類腸内細菌叢は、我々の予想に反して、2位であった。しかし、必須アミノ酸分解経路に着目すると、GSCよりもFDおよびSS処理でより有利になる。芳香族化合物分解は、処理間で最も大きな差がある経路である。芳香族アミノ酸、植物成分、薬剤、添加物、着色料、汚染物質などは、腸内における芳香族化合物の発生源の一部である[53]。したがって、FDとGSCは、芳香族化合物を炭素源として利用し、魚の腸内に存在するバクテリアから毒素を除去する上で、SSより有利であると考えられる。
飼料中の機能性成分に関する研究中に蓄積された知見に関して、必須脂肪酸、ヌクレオチド、酵母細胞壁、プレバイオティクスなどの機能性成分が、腸内の魚類微生物叢の調節に関連するという強い証拠がある［10, 54］。例えば、機能性成分を摂取したアトランティックサーモンでは、海水中で44週間飼育した後、通常の餌を与えたサケと比較して、プロテオバクテリアとマイコプラズマの高い存在度が観察されている[10]。さらに、機能性成分を摂取したシーバス（Dicentrarchus Labrax）の微生物相の多様性に高い差があることが報告されている[54]。さらに、FIを摂取したシーバスは、Vibrionalesなどの潜在的な病原性細菌を減少させることが報告されています[54]。注目すべきは、本研究で得られた結果で、FDを給餌した魚は、他の実験グループよりも高い細菌属の豊かさを示したことである。さらに、32PSUでFDを給餌したアトランティックサーモンは、他の実験グループと比較してビブリオ属の存在度が低いことが示されました。このように、機能性成分は魚の免疫系を改善する以外に、魚の微生物叢の存在量や豊かさにも影響を与えることがわかりました。
今回の結果は、スモルトの状態を判断するためのサケの微生物相研究の可能性を示すものである。また、塩分濃度を徐々に変化させることで、サケの微生物叢の存在量が増加し、健康状態が改善されることが実証された。海水への漸進的な曝露によるアトランティックサーモンの移入の実施は、移入の成功率を高める可能性がある。現在、サケ産業は、海水への病原体への曝露を減らす戦略として、海水への移行の前にRAS条件下で魚を飼育する時間を長くしている[55]。したがって、業界はRASシステムで塩分濃度を徐々に変化させ、海水でのサケの成績を向上させることができる。結論
多様性指数の違いは、FWからSWへの移行時におけるアトランティックサーモンの腸内細菌叢の変動を示している。塩分濃度の緩やかな変化にさらされたアトランティックサーモンの腸内細菌叢では、豊かさ指数と多様性指数がより顕著であった。プロテオバクテリアはすべての群で優勢であったが、すべての条件下で下位分類群にばらつきがあった。Escherichia/ShigellaはSW微生物叢の一部として高濃度で見出された。分類学的な違いはあるものの、分析した代謝経路のうち、有意な違いを示した割合は低く、その多くは生合成に関連するものであった。最後に、本研究は、スモルト化時に緩やかな塩分変化にさらされたアトランティックサーモンの腸内細菌叢を評価した初めての研究であり、このSWへの移行方法が魚の微生物叢の多様性を高め、その結果、健康状態を改善することを示すものであった。
補足資料
以下のサポート情報は、https://www.mdpi.com/article/10.3390/microorganisms11010076/s1；図S1：実験デザイン；図S2：鰓フィラメント上皮における塩化物細胞の局在；図S3．ATPase-αおよびATPase-βサブユニットのRT-qPCR解析；図S4: 希釈曲線；図S5：模擬コミュニティ組成；表S1：配列データレポート；表S2：完全なNanoCLUST分類クラスター；表S3：Vegan Packageを用いたR上で計算した腸サンプルのBray-Curtis類似性；表S4．NanoCLUST クラスタの平均的な同一性パーセントを種レベルで示した。表S5：PICRUSt2により推定された淡水（FW）と異なる海水処理の完全代謝MetaCycパスウェイの存在量。
著者貢献
概念化、M.F.M.-R., D.V.-M., G.N.-A., and V.V.-M.; Data curation, M.F.M.-R.; Formal analysis, M.F.M.-R.; Funding acquisition, D.V.-M., C.G.-E., and V.V.-M.; Methods, M.F.M.-R. M.、C.G.-E.、V.V.-M.、調査、M.F.M.-R.、B.P.B.、V.V.-M.、方法論、M.F.M.-R.、D.V.-M.、G.N．B.P.B.、C.G.-E.、V.V.-M.、プロジェクト管理、V.V.-M.、リソース、C.G.-E.、スーパービジョン、C.G.-E. およびV.V.-M.、視覚化、M.F.M.-R。 原案執筆、M.F.M.-R.、V.V.-M.、査読・編集、D.V.-M., G.N.-A., C.G.-E., および V.V.-M. すべての著者は、本原稿の出版版を読み、同意した。
資金提供
本研究は、ANID-ChileのPostdoctoral grant FONDECYT (3190320), grants FONDAP (15110027), FONDECYT (1210852), FONDECYT (11220307), Postdoctoral grant FONDECYT (3200600) から資金提供を受けました。
データの利用可能性に関する声明
該当事項はありません。
利益相反について
著者らは利益相反のないことを宣言している。
参考文献
Egerton, S.; Culloty, S.; Whooley, J.; Stanton, C.; Ross, R.P. The Gut Microbiota of Marine Fish. Front. Microbiol. 2018, 9, 873. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Schmidt, V.T.; Smith, K.F.; Melvin, D.W.; Amaral-Zettler, L.A. 塩分順化に伴う冬期魚類マイクロバイオームの群集形成。Mol. Ecol. 2015, 24, 2537-2550. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Li,Y.、Bruni,L.、Jaramillo-Torres,A.、Gajardo,K.、Kortner, T.M.、Krogdahl, A. アトランティックサーモンの海水相における食事性昆虫食に対する消化管および粘膜関連の腸内細菌群の異なる反応について。Anim. Microbiome 2021, 3, 8. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Harrison, B.K.; Myrbo, A.; Flood, B.E.; Bailey, J.V. Abrupt burial imparts persistent changes to bacterial diversity of turbidite-associated sediment profiles. Geobiology 2018, 16, 190-202. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Labonte、J.M.、Lever、M.A.、Edwards、K.J.、Orcutt、B.N. East Juan de Fuca Ridge Flankにおける深層堆積物微生物多様性に対する火成岩基地の影響。Front. Microbiol. 2017, 8, 1434. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Mills, H.J.; Reese, B.K.; Shepard, A.K.; Riedinger, N; Dowd, S.E.; Morono, Y.; Inagaki, F. Sulfate-Methane Transition Zone上、内、下の南海トラフの海底堆積物における代謝的活性細菌集団の特性評価. Front. Microbiol. 2012, 3, 113. [Google Scholar] [CrossRef].
Rud, I.; Kolarevic, J.; Holan, A.B.; Berget, I.; Calabrese, S.; Terjesen, B.F. Atlantic salmon post-smolt productionのための商業規模の再循環および半密閉養殖システムにおける細菌微生物相のディープシーケンサー。Aquac. Eng. 2017, 78, 50-62. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Lokesh, J.; Kiron, V. Transition from freshwater to seawater reshapes the skin-associated microbiota of Atlantic salmon. Sci. Rep. 2016, 6, 19707. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Lorgen-Ritchie, M.; Clarkson, M.; Chalmers, L.; Taylor, J.F.; Migaud, H.; Martin, S.A.M. A Temporally Dynamic Gut Microbiome in Atlantic Salmon During Freshwater Recirculating Aquaculture System (RAS) Production and Post-seawater Transfer. Front. Mar. Sci. 2021, 8, 711797. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Wang, J.; Jaramillo-Torres, A.; Li, Y.; Kortner, T.M.; Gajardo, K.; Brevik, O.J.; Jakobsen, J.V.; Krogdahl, A. 淡水期後半から海水中1年まで観察したアトランティックサーモンの腸管消化物における微生物相と機能成分の影響: 北極圏の商業規模の研究施設でのケーススタディ。Anim. Microbiome 2021, 3, 14. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Bukin, Y.S.; Galachyants, Y.P.; Morozov, I.V.; Bukin, S.V.; Zakharenko, A.S.; Zemskaya, T.I. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Sci. Data 2019, 6, 190007. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
海水および海底堆積物における細菌の多様性と群集組成の推定に及ぼす16S rRNA超可変領域の影響. Front. Microbiol. 2019, 10, 1640. [Google Scholar】【CrossRef】【PubMed】。
北大西洋北部の海洋微生物群集の多様性認識における16S rRNA可変領域の影響。Fems Microbiol. Lett. 2019, 366, fnz152. [Google Scholar】【CrossRef】【PubMed】。
Yarza, P.; Yilmaz, P.; Pruesse, E.; Glockner, F.O.; Ludwig, W.; Schleifer, K.H.; Whitman, W.B.; Euzeby, J.; Amann, R.; Rossello-Mora, R. 16S rRNA遺伝子配列による培養・未培養細菌とアーキアの分類統一. Nat. Rev. Microbiol. 2014, 12, 635-645. [Google Scholar] [CrossRef]を参照してください。
松尾 泰、小宮 聡、安水 靖、安岡 泰、水島 健、高木 孝、Kryukov, K.、福田 晃、森本 泰、内藤 泰、他 MinIONナノポアシーケンスを用いたヒト腸内細菌群の16S rRNA遺伝子完全長アンプリコン解析による種レベルの分解能を実現した。BMC Microbiol. 2021, 21, 35. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Fujiyoshi, S.; Muto-Fujita, A.; Maruyama, F. Portable nanopore sequencerを用いた全長16S rRNA遺伝子による細菌群集の特性解析のためのPCR条件の評価. Sci. Rep. 2020, 10, 12580. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Johnson, J.S.; Spakowicz, D.J.; Hong, B.Y.; Petersen, L.M.; Demkowicz, P.; Chen, L.; Leopold, S.R.; Hanson, B.M.; Agresta, H.O.; Gerstein, M.; et al. 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysisの評価. Nat. Commun. 2019, 10, 5029. [Google Scholar] [CrossRef]を参照してください。
Shin, J.; Lee, S.; Go, M.J.; Lee, S.Y.; Kim, S.C.; Lee, C.H.; Cho, B.K. Analysis of the mouse gut microbiome using full-length 16S rRNA amplicon sequencing. Sci. Rep. 2016, 6, 29681. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Cusco、A; Catozzi、C; Vines、J; Sanchez、A; Francino、O. Nanopore sequencingを用いたロングアンプリコンの微生物叢プロファイリング。全長16S rRNA遺伝子とrrnオペロンの16S-ITS-23S。F1000Res 2018, 7, 1755. [Google Scholar] [CrossRef]を参照してください。
Dehler, C.E.; Secombes, C.J.; Martin, S.A. Environmental and physiological factors shape the gut microbiota of Atlantic salmon parr (Salmo salar L.). Aquaculture 2017, 467, 149-157. [Google Scholar] [CrossRef][グリーンバージョン].
Skrodenyte-Arbaciauskiene, V.; Virbickas, T.; Luksa, J.; Serviene, E.; Blazyte-Cereskiene, L.; Kesminas, V. Gut Microbiome of Wild Baltic Salmon (Salmo salar L.) Parr. Microb. Ecol. 2022, 84, 1294-1298. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Sprockett, D; Fukami, T.; Relman, D.A. 腸内細菌叢の初期構築における優先効果の役割。Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2018, 15, 197-205. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Dulski, T; Kujawa, R.; Godzieba, M.; Ciesielski, S. Effect of Salinity on the Gut Microbiome of Pike Fry (Esox lucius). Appl. Sci. 2020, 10, 2506. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
呉、P; 劉、Y; 李、C; 蕭、Y; 王、T; 林、L; 謝、Y. Collichthys lucidusの腸内微生物組成と中国珠江河口水域の微生物群との相互作用. Front. Environ. Sci. 2021, 9, 675856. [Google Scholar] [CrossRef].
Sundh, H; Nilsen, T.O.; Lindstrom, J.; Hasselberg-Frank, L.; Stefansson, S.O.; McCormick, S.D.; Sundell, K. Development of intestinal ion-transporting mechanisms during smoltification and seawater acclimation in Atlantic salmon Salmo salar. J. Fish Biol. 2014, 85, 1227-1252. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Dehler, C.E.; Secombes, C.J.; Martin, S.A.M. Seawater transfer alters the intestinal microbiota profiles of Atlantic salmon (Salmo salar L.). Sci. Rep. 2017, 7, 13877. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Milligan-Myhre、K; Small、C.M.; Mittge、E.K.; Agarwal、M; Currey、M; Cresko、W.A.; Guillemin、K。 腸内細菌に対する自然免疫応答は海洋と淡水のThreespine stickleback集団間で異なる。Dis. Model Mech. 2016, 9, 187-198. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Sernapesca. Informe Sanitario con Informacion Sanitaria de Agua Dulce y Mar Año 2021; Departamento de Salud Animal, Subdirección de Acuicultura, Gobierno de Chile: サンティアゴ、チリ、2021年。[Google Scholar】。］
Nisembaum, L.G.; Martin, P.; Lecomte, F.; Falcon, J. メラトニンと魚類のオスモレギュレーション。アトランティックサーモンSalmo salarのスモルト化に焦点をあてて。J. Neuroendocrinol. 2021, 33, e12955. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
サケ科魚類におけるパー・スモルト転換（smotification）と海水適応。選択された文献のレビュー。Aquaculture 1980, 21, 1-37. [Google Scholar] [CrossRef].
Johansson, L.H.; Timmerhaus, G.; Afanasyev, S.; Jorgensen, S.M.; Krasnov, A. Atlantic salmon (Salmo salar L.) の脱皮と海水移動は、免疫転写体の全身抑制に関連している。フィッシュ・シェルフィッシュ・イムノル. 2016, 58, 33-41. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Sahlmann, C.; Djordjevic, B.; Lagos, L.; Mydland, L.T.; Morales-Lange, B.; Øvrum Hansen, J.; Ånestad, R.; Mercado, L.; Bjelanovic, M.; Press, C.M.; et al. Yeast as a protein source during smoltification of Atlantic Salmon (Salmo salar L.), enhancing performance and modulates health. アクアカルチャー 2019, 513, 734396. [Google Scholar] [CrossRef]を参照してください。
Valenzuela-Muñoz, V.; Gallardo-Escarate, C.; Benavente, B.P.; Valenzuela-Miranda, D.; Nunez-Acuna, G.; Escobar-Sepulveda, H.; Valdes, J.A. 全ゲノム転写発現プロファイルにより、大西洋サケ海水適応時のトランスポゾン遺伝子とノンコーディングRNAに関する新規知見が明らかになりました。バイオロジー2021, 11, 1. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Lane, D.J. 16S/23S rRNA シークエンシング。In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics; Stackebrandt, E., Goodfellow, M., Eds.; Wiley: Hoboken, NJ, USA, 1991; Volume 4, pp.115-175. [Google Scholar】。］
Wick, R. Porechop: Oxford Nanoporeリードのためのアダプタートリマー。2018. Available online: https://github.com/rrwick/Porechop (accessed on 15 July 2022).
Rodriguez-Perez, H.; Ciuffreda, L.; Flores, C. NanoCLUST: A species-level analysis of 16S rRNA nanopore sequencing data. バイオインフォマティクス 2021, 37, 1600-1601. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Dixon, P. VEGAN, a package of R functions for community ecology. J. Veg. Sci. 2003, 14, 927-930. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
R-Core-Teamです。R: A Language and Environment for Statistical Computing; R Foundation for Statistical Computing: Vienna, Austria, 2020. [Google Scholar】を参照してください。］
Douglas, G.M.; Maffei, V.J.; Zaneveld, J.R.; Yurgel, S.N.; Brown, J.R.; Taylor, C.M.; Huttenhower, C.; Langille, M.G.I. PICRUSt2 によるメタゲノム機能推定。Nat. Biotechnol. 2020, 38, 685-688. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Caspi, R.; Billington, R.; Fulcher, C.A.; Keseler, I.M.; Kothari, A.; Krummenacker, M.; Latendresse, M.; Midford, P.E.; Ong, Q.; Ong, W.K.; et al. The MetaCyc database of metabolic Pathways and enzymes. Nucleic Acids Res. 2018, 46, D633-D639. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Parks, D.H.; Tyson, G.W.; Hugenholtz, P.; Beiko, R.G. STAMP: Statistical analysis of taxonomic and functional profiles. バイオインフォマティクス 2014, 30, 3123-3124. [Google Scholar] [CrossRef]を参照してください。
トンプソン、F.L.、ゲバース、D、トンプソン、C.C.、ダウィント、P、ナザー、S、ホステ、B、マン、C.B、スイングス、J. マルチフォーカス配列解析に基づくビブリオの系統と分子識別。Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71, 5107-5115. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Valdes, A.M.; Walter, J.; Segal, E.; Spector, T.D. Role of gut microbiota in nutrition and health. BMJ 2018, 361, k2179. [Google Scholar] [CrossRef]を参照してください。
Ofek, T.; Lalzar, M.; Izhaki, I.; Halpern, M. 健康および病気のティラピアの腸および脾臓の微生物相組成. Anim. Microbiome 2022, 4, 50. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Llewellyn, M.S.; McGinnity, P.; Dionne, M.; Letourneau, J.; Thonier, F.; Carvalho, G.R.; Creer, S.; Derome, N. The biogeography of the atlantic salmon (Salmo salar) gut microbiome. ISME J. 2016, 10, 1280-1284. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Eilers, H.; Pernthaler, J.; Amann, R. Enrichment中の浮遊性海洋細菌の継代。培養によるシフトを詳しく見る。Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, 4634-4640. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
トンプソン，F.L.，飯田哲也，スイングス，J.ビブリオの生物多様性．Microbiol. Mol. Biol. Rev.2004、68、403-431。[Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Austin, B.; Austin, D.A. Aeromonadaceae representative (Aeromonas salmonicida). 細菌性魚類病原体、養殖魚と野生魚の病気;Springer: Cham, Switzerland, 2016. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Mann, B.C.; Bezuidenhout, J.J.; Swanevelder, Z.H.; Grobler, A.F. MinION 16S datasets of a commercially available microbial community allows the evaluation of DNA extraction and data analyses. Data Brief 2021, 36, 107036. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Rozas, M; Brillet, F; Callewaert, C; Paetzold, B. MinION Nanopore Sequencing of Skin Microbiome 16S and 16S-23S rRNA Gene Amplicon. Front. Cell Infect. Microbiol. 2021, 11, 806476. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
海産魚類における腸内細菌叢の多様性は宿主関連因子によって形成されることを明らかにした。Mol. Ecol. 2020, 29, 5019-5034. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
メタボロミクスと魚の栄養。メタボロミクスと魚の栄養：持続可能な飼料開発という文脈でのレビュー。Rev. Aquac. 2018, 12, 261-282. [Google Scholar] [CrossRef]を参照してください。
Díaz, E.; Ferrández, A.; Prieto, M.A.; García, J.L. Escherichia coliによる芳香族化合物の生分解。Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001, 65, 523-569, table of contents. [Google Scholar] [CrossRef]を参照。
Rimoldi, S.; Torrecillas, S.; Montero, D.; Gini, E.; Makol, A.; Valdenegro, V.V.; Izquierdo, M.; Terova, G. Assessment of dietary supplementation with galactomannan oligosaccharides and phytogenics on gut microbiota of European sea bass (Dicentrarchus Labrax) fed low fishmeal and fish oil-based diet. PLoS ONE 2020, 15, e0231494. [Google Scholar] [CrossRef][グリーンバージョン].
Dalsgaard, J.; Lund, I.; Thorarinsdottir, R.; Drengstig, A.; Arvonen, K.; Pedersen, P.B. 北欧諸国におけるRASでの異なる種の養殖について。現状と将来の展望。Aquac. Eng. 2013, 53, 2-13. [Google Scholar] [CrossRef][グリーンバージョン].
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Morales-Rivera, M.F.; Valenzuela-Miranda, D.; Nuñez-Acuña, G.; Benavente, B.P.; Gallardo-Escárate, C.; Valenzuela-Muñoz, V. Atlantic Salmon (Salmo salar) Transfer to Seafood by Gradual Salinity Exhibinates an Increase in The Intestinal Microbus Abundance and Richness. Microorganisms 2023, 11, 76. https://doi.org/10.3390/microorganisms11010076
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Morales-Rivera、Valenzuela-Miranda、Nuñez-Acuña、Benavente BP、Gallardo-Escárate C、Valenzuela-Muñoz V. Atlantic Salmon (Salmo salar) Transfer to Seafood by Gradual Salinity Exhibinates the Intestinal Microbial Abundance and Richness, The Increase in the Intestinal Microbial As. Microorganisms. 2023; 11(1):76. https://doi.org/10.3390/microorganisms11010076
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モラレス＝リベラ、マリア・F、ディエゴ・バレンズエラ＝ミランダ、グスタボ・ヌニェス＝アクーニャ、バーバラ・P・ベナベンテ、クリスティアン・ガラルド＝エスカレート、バレンティナ・バレンズエラ＝ムニョス。2023. "Atlantic Salmon (Salmo salar) Transfer to Seawater by Gradual Salinity Exhibited an Increase in The Intestinal Microbial Abundance and Richness" Microorganisms 11, no. 1: 76. https://doi.org/10.3390/microorganisms11010076.
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