分子模倣を介したSARS-CoV-2スパイクタンパク質と常在細菌に対する抗体応答の相互調節

2023年11月9日 11:18

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論文|第31巻第11号、p1866-1881.e10、2023年11月08日

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分子模倣を介したSARS-CoV-2スパイクタンパク質と常在細菌に対する抗体応答の相互調節

https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(23)00411-0

マリーナ・ボンダレヴァ 23
リサ・ブジンスキー 23
パヴェル・デュレク 23
フィリップ・エンガルド
ミル＝ファルジン・マシュレギ 24, 25
アンドレイ・A・クルグロフ 24, 25, 26
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脚注を表示オープンアクセスDOI:https://doi.org/10.1016/j.chom.2023.10.007

ハイライト

SARS-CoV-2ワクチン接種により口腔内のS. salivariusが早期に増加する。

抗スパイクSARS-CoV-2抗体は分子模倣を介してS. salivariusに結合する

S.サリバリウスはマウスにおいて交差反応性抗スパイクAbsを誘導し、ウイルスクリアランスを助ける。

S.サリバリウスはワクチン接種者の唾液中の抗スパイク抗体を増加させる
まとめ
常在細菌叢は、粘膜抗体を誘発する抗原のレパートリーを提供する。場合によっては、これらの抗体は宿主タンパク質と交差反応を起こし、自己免疫を誘発したり、他の微生物抗原と交差反応を起こしたりする。我々は、口腔微生物叢が分子模倣を介して唾液中の抗SARS-CoV-2スパイクIgG抗体を誘導することを証明した。唾液中の抗スパイクIgG抗体は、抗SARS-CoV-2ワクチン接種1ヵ月後のStreptococcus salivariusの存在量の増加と相関していた。S.サリバリウスを含むいくつかのヒト常在菌は、SARS-CoV-2中和モノクローナル抗体によって認識され、マウスにおいて交差反応性抗スパイク抗体を誘導し、SARS-CoV-2のクリアランスを促進した。特異的なS. salivariusタンパク質であるRSSL-01370は、Spike受容体結合ドメインと相同性のある領域を含んでおり、RSSL-01370でマウスを免疫すると、血清中に抗Spike IgG抗体が誘発された。さらに、S.サリバリウスを経口投与すると、ワクチン接種者の唾液中の抗スパイク抗体が増強された。これらのデータを総合すると、ヒトの微生物叢の異なる種がSARS-CoV-2 Spikeタンパク質の分子模倣体を発現し、防御免疫を増強する可能性があることが示された。
図抄録
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キーワード
微生物叢
口腔
分子模倣
SARS-CoV-2
抗体
交差反応性
はじめに
SARS-CoV-2は、スパイク（S）タンパク質と、様々な細胞型で発現しているアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）受容体との相互作用を介して細胞に感染する1,2,3。SARS-CoV-2のSタンパク質には、ACE2との相互作用を仲介し、ウイルス侵入を促進する受容体結合ドメイン（RBD）が含まれている。血液中の全身性抗体（主にIgG、IgM、IgA1）は、宿主に感染した後のウイルスの増殖を抑制するが、宿主への初感染を防ぐには、粘膜表面における抗原特異的抗体（IgA2、IgA1、IgM）の存在が必要である7。SARS-CoV-2のSタンパク質をコードするmRNAワクチンによる全身ワクチン接種は、鼻咽頭液中に抗S抗体Absを誘導することが知られているが、これらのAbsは長期間維持されることはなく8、唾液中の抗SARS-CoV-2抗体応答の維持機構は十分に解明されていない。
粘膜表面におけるAbsの分泌は、粘膜微生物叢が提示する抗原によって促進される可能性がある9 。ヒトの微生物叢には数百万個の遺伝子が含まれていると推定されており10 、Ab結合のためのエピトープが多数存在する可能性がある11 。微生物誘導免疫は、Citrobacter rodentium、Clostridiodes difficile、緑膿菌18,19,20、およびインフルエンザなどのウイルスによる微生物感染に対する防御を提供することが知られている。興味深いことに、HIV-1の糖タンパク質（gp）41を標的とする交差反応性Absは、異なる常在細菌叢によって誘導される24。さらに、このような微生物叢によって誘導されたgp41反応性B細胞は、エンベロープ（Env）糖タンパク質を用いたワクチン接種によって生成されたAbs応答を、HIV-1 Env上の非中和エピトープに迂回させる25。
26,27,28,29,30風邪のコロナウイルスに感染したことがある場合、SARS-CoV-2-RBD抗体の存在が報告されているが、この関連性は正式には証明されていない。交差反応性RBD分泌性IgA抗体（Abs）を誘導する抗原は不明なままである。今回我々は、中和抗RBD抗体がヒト微生物叢の常在菌を認識することを明らかにした。ワクチン接種による唾液中のAbsは、これらの常在菌の増殖を促進し、ワクチン接種者にこのような菌株を補充すると、口腔内の抗SARS-CoV-2 IgG濃度が上昇した。以上より、我々のデータは、唾液中の抗S抗体応答と上咽頭微生物叢の異なる細菌との相互制御を実証した。
結果
ワクチン接種中の口腔内細菌叢の変化は、唾液中Ab応答の誘導と関連している。
粘膜表面に存在するAbsは、上皮細胞（EC）層を介して体内から活発に輸送される。pIgRはIgAの輸送を仲介し、口腔および消化管のECに普遍的に発現している。したがって、健常人の唾液にはIgGとIgAの両方が含まれるが、腸管腔内内容物、すなわち糞便にはIgGは含まれず、IgAが含まれる（図1A-1C）。ワクチン接種後1ヵ月間の微生物とAbの相互作用を調べるため、19人の健康な参加者を募集した。その結果、血清中に抗ヌクレオカプシド（NCP）IgGが検出されたのは1人だけであった（図S1A）。次に、SARS-CoV-2に対する一次ワクチン接種後1カ月間の口腔内の抗S1 IgGおよびIgAの量を定量した（図1Dおよび1E）。BNT162b2を接種した19人の健常者（詳細情報は表S1）では、21日目の唾液中に多量の抗S1 IgG抗体（19人中10人）が検出されたが、他の9人は低い抗S1 IgG力価しか示さなかった。2回目のワクチン投与から7日後の28日目まで、すべての参加者でAb反応がさらに増加した（図1D）。これは血清中の抗SARS-CoV-2 S IgGの誘導と一致していた（図1F）。抗S1 IgAは血清中に存在したが、粘膜表面における抗S1 IgAまたは抗S3 IgAの有意な誘導は観察されなかった（図1E、1F、およびS1B）。したがって、以前の報告33と一致して、BNT162b2のワクチン接種は、初回ワクチン投与後21日目から、口腔に抗S IgG抗体を誘導した。
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図1BNT162b2ワクチン接種後1ヵ月間の口腔内抗体反応
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ワクチン接種により口腔内への抗S抗体分泌が誘導されることから、次にワクチン接種中に唾液中のAbsによる細菌コーティングのプロファイルが変化するかどうかを評価した。その結果、分泌されたIgAおよびIgG抗体による口腔内細菌叢の高いコーティングが観察された（図1G）。注目すべきは、ほとんどの細菌がIgAとIgGの両方のAbsに結合していたことである（図1Gおよび1H）。ワクチン接種後のさまざまな時点におけるさらなる分析により、有意な抗S Ab応答が発現した時点であるワクチン接種後21日目に、唾液中のIgG+IgA+細菌の頻度が増加することが明らかになった（図1D）。ワクチン接種による抗S IgG抗体の細菌組成への影響を解析するために、19人のワクチン接種前後の唾液微生物叢を比較した。口腔内細菌叢の全体的な多様性（Chao1、Simpson、およびShannon指数）は、ワクチン接種後も変化しなかった（図2A～2C）。しかし、一次接種後0日目と28日目の微生物叢の組成は、主成分分析（PCA）によって明らかになったように、別々にクラスター化していた（図2D）。唾液中の微生物叢は個体間変動が大きいだけでなく、個体内安定性も高いという特徴があるため34,35,36、ワクチン接種後の口腔内の微生物叢組成を追跡することにより、観察された違いが微生物叢の規則的な変動によるものかどうかを確認した（図S2）。唾液中微生物叢の組成の変化は、一次ワクチン接種後21日目から観察され、唾液中抗S 抗体応答の誘導と相関していた（図1DおよびS1B）が、それ以前には観察されなかったことから、口腔内微生物叢の組成変化は抗S抗体によって影響を受ける可能性があることがさらに示唆された。その後、0日目と28日目の効果量測定（LEfSe）と組み合わせた線形判別分析（LDA）による口腔内細菌叢組成の比較から、28日目の口腔内細菌叢では、連鎖球菌科と腸球菌科が濃縮されているのに対し、ミクロコッカス科とフソバクテリウム科のメンバーはそれぞれ減少していることが示された（図S2A）。属レベルでは、LEfSe分析により、28日目にTuricella、Nesterenkonia、Escherichia/Shigella、Pillibacter、Lachnoanaerobaculum、Selemonas、およびStreptococcusが濃縮されたのに対し、Rothia、Fusobacterium、Morococcus、およびCetobacteriumは減少したことが明らかになった（図2E）。ワクチン接種後、LEfSeで同定された細菌属の相対量を経時的に追跡したところ、Selemonas（19人中16人）、Pillibacter（19人中14人）、Streptococcus（19人中14人：0日目の8.8％±3.0％から28日目の12.1％±5.3％まで）の増加が観察された（図2F）。Fusobacteriumの減少（19例中14例）は一次ワクチン接種後28日目にのみ生じた（図2G）。Rothia属およびEscherichia/Shigella属の変化は統計的に有意ではなかった（図S2BおよびS2C）。溶連菌のLDAスコアが高いことから（図2E）、溶連菌属をさらに分類したところ、ワクチン接種後28日目の口腔内では、19人中14人において、Streptococcus australiusではなくStreptococcus salivariusの頻度が有意に増加していた（0日目と28日目のS. salivariusの平均値は0.8％±0.4％と1.8％±1.5％）（図2H）。S.salivariusの増加をさらに検証するために、最小エントロピー分解法を用いてワクチン接種中の溶連菌種を定義した37。S.salivariusに対応するオリゴタイプのみがワクチン接種経過中に増加し（図S3）、ワクチン接種が口腔内のS.salivariusの存在量と相関することがさらに示唆された。次に、S. salivariusの存在量と抗S Abレベルとの相関解析を行った。S.サリバリウスとウイルス中和能との間には0日目でも28日目でも相関は認められなかったが（図S4AおよびS4B）、この細菌のレベルは抗S1 IgGおよび抗S1 IgAの両方のレベルと相関しており（図S4C～S4F）、中和性および非中和性の抗S抗体の両方がS.サリバリウスの存在増強に影響している可能性が示唆された。
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図2BNT162b2ワクチン接種後1ヵ月間の口腔内細菌叢組成
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このような変化が微生物叢の時間的変化に起因する可能性があるかどうかをさらに検討するために、1ヶ月間の唾液細菌組成を評価する一般に入手可能なデータセットを分析した38,39。これらの研究では、レンサ球菌の存在量に差は観察されず、このような変化がワクチン接種に関連することがさらに示された（図S5A）。我々は以前、関節リウマチ（RA）患者は免疫後1カ月間は唾液中の抗S抗体産生を認めないことを報告した40。そこで次に、ワクチン接種中のRA患者の唾液微生物叢を解析した（図S5B）。唾液中の抗S抗体の欠如と一致して、RA患者におけるレンサ球菌の存在量はワクチン接種後28日間は変化しなかった（図S5B；表S2）。最後に、S. salivariusの存在量は、28日目の健常者とワクチン接種の数ヵ月後に募集した独立コホートの被験者との間で同程度であり、ワクチン接種中のS. salivariusの増加に時間的な影響があることが示唆された（図S5C；表S3）。注目すべきは、このような経時的な口腔内細菌叢の変動は、ワクチン接種に関連した下痢の症例がいくつか報告されているにもかかわらず、参加者において臨床的に関連する観察結果とは関連していなかったことである41。これらを総合すると、これらのデータは、経口抗S抗体Absと細菌叢組成の変化との関連をさらに裏付けている。
参加者は、ワクチン接種後21日目の唾液中抗S1 IgGレベルに差があり（図1D）、唾液中Ab反応は血清中抗Sレベルと相関していた（図S6A）。そこで、抗S IgG力価の観点から「高」（抗S1 IgG：60.5％±55％）反応者と「低」（抗S1 IgG：9.0％±5.1％）反応者に分け、口腔内細菌組成を比較した（図S6B～S6E）。これら2つのサブグループ間のLEfSe分析により、低反応者ではOlsenella属とPeptostreptococcaceae_insertae_sedis属が減少し、Solobacterium属とPseudomonas属が増加していることが明らかになった（図S6CおよびS6E）。Solobacteriumを除くこれらの細菌属はいずれも、ワクチン接種の経過中に有意な影響を受けなかった（図S6D）。この所見から、ワクチン接種中に観察された溶連菌の増加は、主に唾液中の抗S IgG応答のレベルに影響されたのではなく、むしろそのようなAbsの生成および分泌に関連していたことがわかる。
腸は常在細菌叢が密集している臓器であるため9、次にワクチン接種後1カ月間を通して、ワクチン接種が糞便微生物叢組成にも影響を及ぼすかどうかを解析した。一次ワクチン接種後28日間に抗S-SARS-CoV-2 IgA応答の有意な誘導は観察されず（図S7A）、微生物多様性（Chao1、Simpson、Shannon指数）の変化も観察されなかった（図S7B；データは示さず）。その後のLEfSe解析により、一次ワクチン接種後0～28日目の糞便微生物叢において、Leptotrichiaceae、Xanthomonodaceae、Succinivibrionaceaeの3つの細菌科と、Sneathia属、Anaerotruncus属、Herbaspirillum属、Succinivibrio属、Stenotrophomonas属の5つの属に変化が認められた（図S7C～S7G）。注目すべきことに、これらの細菌ファミリーは腸内微生物群集のマイナーなメンバー（相対存在量0.1％未満）である。したがって、ワクチン接種は、今回調査した時間枠では、糞便微生物叢組成に検出可能な影響を与えなかった。以上のことから、初回ワクチン接種後1ヵ月間は、唾液中への抗S-SARS-CoV-2 IgG抗体の分泌と関連して、糞便ではなく口腔内の微生物叢組成が明瞭な変化を示した。
抗S抗体Absは分子模倣を介して様々な微生物種を認識する。
口腔内の一時的な微生物叢組成は比較的安定しているが、それでも経時的にある程度の変動を示す34,35,36。ワクチン接種に伴う唾液中の微生物叢組成の変化は、抗S-SARS-CoV-2抗体の誘導と時間的に相関していることから、我々は、S特異的Absが異なる常在細菌に結合し、その存在量に影響を及ぼす可能性があると仮定した。この仮説を検証するために、健康な非ワクチン接種者（詳細については表S4）の糞便微生物叢を、SARS-CoV-2のSタンパク質のRBDに特異的な中和Abs（図3A〜3C）で染色した。結合活性のない2種類のモノクローナルAbsは、ヘビーカッパ（HK）（CV07-287）とヘビーラムダ（HL）（CV07-250；図3C）のアイソタイプコントロールとして用いた。ウサギおよびヒトモノクローナルAbsによる微生物叢の共染色から、RBDに特異的な異なるAbsが類似の細菌を認識する可能性があることが明らかになった（図S8A）。
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図3中和抗RBD抗体は異なる常在細菌を認識する
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抗RBD抗体が結合した細菌属を同定するため、蛍光活性化セルソーティング（FACS）でこれらの細菌を分離し、16SリボソームDNA（rDNA）の遺伝子型を決定した（図3D）。二次抗体（抗ヒトIgGおよび抗ウサギIgG）で標識された細菌は解析から除外した（File S1）。1つ以上の抗RBD抗体で認識される細菌属をいくつか同定できた（図3E; File S1）。ヒト抗RBDモノクローナルAbsはStreptococcus属、Escherichia属、Bifidobacteria属などに特異的な反応性を示した（図3E）。同定された細菌属は様々なドナーの間で異なっており(図3E)、微生物叢の個体間多様性が強調され、試験した抗RBD抗体が複数の異なる細菌属に結合できることを示している。抗RBD IgG抗体の微生物叢への結合は、使用した二次抗IgG抗体の結合パターン（File S1）や、非自己反応性で非RBD特異的なヒトHK mGO53 IgG Ab43の結合パターン（Figure S8B; File S1）とは異なっていた。それに加えて、3種類のS（非S1）結合性非中和Ab（HL CV03-163、HL CV03-177、HL CV05-115）について、微生物叢に対する反応性を解析した。微生物叢との結合を示したのはHL CV03-177のみであった（図S9AおよびS9B）。さらに16S配列を決定した結果、中和RBD特異的Absによって同定された細菌のパターンが明確で重複していないことが明らかになった（ファイルS1）。Absの非特異的結合をさらに解析するために、重鎖相補性決定領域3（CDRH3）領域のアミノ酸が1つだけ異なるクローン関連抗RBD Absを選択し（図S10A）、微生物叢への結合を解析した。CDRH3の単一アミノ酸置換は微生物叢への結合に影響を及ぼし、少なくともクローン化された細菌株の特異的認識をさらに論証した（図S10B）。我々は、中和抗RBD抗体がマイクロバイオームの異なる細菌種に結合できると結論づけた。
抗RBD抗体によって認識される細菌分子模倣体を同定するために、8人の健康なドナーの糞便微生物叢からこのような抗RBD抗体と結合する細菌をFACSで分離し、選択的細菌培地で嫌気培養条件下で培養した。個々の細菌コロニーを16S rDNA配列に従って同定した（図3Dおよび3F）。16S配列決定データ（図3E；ファイルS1）と一致して、2種のBacilli属、3種のStreptococcus属、2種のBifidobacterium属、2種のEnterococcus属、さらにVeillonella parvulaとAcidaminococcus intestinalisが同定された（図3F）。培養細菌を染色したところ、抗RBD抗体による認識が確認された（図S11AおよびS11B）。興味深いことに、ワクチン接種を受けたヒトの口腔内で増加していることが判明したS. salivariusは、試験した3種類のモノクローナル抗体とウサギの抗RBD抗体で認識された（図3FおよびS10C）。S. salivarius K12（Bactoblis）のプロバイオティック株もウサギ抗RBD抗体で認識された（図S11A）。注目すべきことに、いくつかの細菌培養物は抗RBD Absで部分的な染色しか示さなかったが、これはおそらく増殖中の細菌の不均一性または遺伝子発現のコミュニティ依存性の変動を反映していると考えられる（図S11）。
常在細菌株による交差反応性抗S抗体の誘導
RBDの明確な模倣細菌を同定した後、次にこれらのタンパク質を発現する細菌がin vivoで交差反応性抗RBD Ab反応を誘導できるかどうかを調べました。S.salivariusとB.pseudocatenulatumに注目し、S.salivariusはワクチン接種後1ヶ月以降にヒトで増加すること（図2H）、B.pseudocatenulatumの存在量はCOVID-19後の急性症候群の発症と逆相関することを考慮した44。これらの細菌が微生物叢の正常な構成要素である可能性を考慮し、C57BL/6マウスにS. salivarius K12またはB. pseudocatenulatumを経口投与して、交差反応性IgA反応が誘発されるかどうかを調べた。S. salivarius K12 と B. pseudocatenulatum の両方を経口投与したマウスでは、21 日以内に RBD に反応する糞便中 IgA が検出された（図 4A）。また、糞便上清はRBDとACE2の結合を阻害したことから、これらのRBD抗体には中和能力があることが示された（図4B）。
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図4常在細菌による交差反応性抗RBD SARS-CoV-2応答の誘導
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次に、マウスに常在細菌を経口投与することによって誘導されたIgA抗体によって認識されるSARS-CoV-2タンパク質のエピトープをマッピングした。SARS-CoV-2のSタンパク質を表す564のペプチドのうち、B. pseudocatenulatumとS. salivarius K12の両方によって誘導されたIgAは、ペプチド配列GFNCYFPLQSYGFQPTNGVを認識した（図4CおよびS12A）。実際、ウサギ抗RBD抗体およびヒトHL CV07-200抗RBD抗体のペプチド認識モチーフは、受容体結合モチーフ(RBM)エピトープにこの配列を含んでいた(図S12B-S12D)。このペプチドは、ACE2-RBD阻害のデータ（図4B）と一致して、RBDのRBMに対応し、S. salivarius K12の参照標準配列ライブラリー（RSSL）-01370と相同性を有する（図S12E〜S12G）。これらのデータは、S. salivarius K12およびB. pseudocatenulatumをマウスに経口投与すると、in vivoでSARS-CoV-2のSタンパク質のRBMと交差反応性のAbsを誘導できることを示している。
細菌溶解液のウェスタンブロット解析により、ウサギ抗RBD抗体およびヒト抗RBD IgG抗体HL CV07-200は、S. salivariusおよびB. pseudocatenulatumの個別のタンパク質を認識することが明らかになった（図4DおよびS13A-S13C）。大腸菌でコード遺伝子をクローニングし、このリコンビナントタンパク質を抗RBD 抗体で検出することで、S. salivarius K12 由来の RSSL-01370 が抗RBD 抗体に結合することを確認した（図 4E）。これらのデータを総合すると、常在細菌叢はRBDを選択的に模倣するタンパク質を発現し、抗RBD中和Absによって認識されることが示された。
RSSL-01370が抗RBD抗体を誘導することをさらに示すために、マウスに精製RSSL-01370を免疫した。その結果、RSSL-01370 を免疫すると、血清中に抗 RBD 抗体および抗 S1 IgG 抗体が誘導され、この細菌タンパク質が SARS-CoV-2 の S に対する交差反応性抗体を誘導できることが示された（図 5A）。RSSL-01370免疫マウスから得られた抗体のクローニングをさらに進めると、COVID-19患者から単離された抗体よりも高濃度ではあるが、ACE2発現293 T細胞へのS-偽型レンチウイルスの侵入を中和する抗体の存在が明らかになった（図5BおよびS14）。このように、S. salivarius由来のRSSL-01370タンパク質は、中和性の抗S抗体を誘導することができる。
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図5常在細菌によって誘発される交差反応性抗スパイク抗体によるSARS-CoV-2感染の阻害
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細菌が誘発するAb応答がウイルスクリアランスに及ぼすin vivoでの関連性をさらに検証するため、S. salivarius K12単独、またはB. pseudocatenulatumとB. longumの併用でC57BL/6マウスを免疫した。その結果、細菌混合ワクチンを接種したマウスは、S-偽型ウイルスによるACE2-293 T細胞の感染を阻害する能力が高いことがわかった（図5C）。そこで、次にK18-hACE2 Tgマウスに混合細菌を免疫し、3週間後に104組織培養感染用量（TCID）B1.1 SARS-CoV-2を経鼻感染させた。対照として、ミョウバンで乳化した全ウイルス不活化SARS-CoV-2（CoviVac）を免疫したマウスを用いた46。細菌を投与したマウスでは、疾患全体の有意な改善は認められなかったが（図5D）、肺からのウイルスクリアランスは促進された（図5Eおよび5F）。最後に、CoviVac で免疫したマウスは S. salivarius に反応する IgG 抗体も産生したことから（図 5G）、抗ウイルス免疫応答と特定の細菌株との交差反応性がさらに強調された。
次に、プロバイオティクスS. salivarius K12をヒトに経口投与した場合、ワクチン接種者の鼻咽頭S特異的Abレベルに影響を及ぼすかどうかを解析した。この目的のために、本研究に登録する少なくとも3カ月前に最後のワクチン接種を受けた完全ワクチン接種者に、107コロニー形成単位（CFU）のS. salivarius K12を2週間毎日経口補充した（コホートの詳細情報は表S6）。補充前と2週間後の唾液と血清の抗S Ab値を比較した。2週間以内に、S. salivarius K12の補給により、19人のプロバンドのうち13人の唾液中の抗S1 IgG反応が有意に増加した（0日目：8.5 ± 12.1 vs. 14日目：28.5 ± 48.8）。重要なことに、SARS-CoV-2のOmicron/B1.1.529変異体のRBDに対する反応性の増加も観察された（0日目：2.8 ± 5.8 vs. 14日目：6.7 ± 8.5）（図6B）。RSSL-01370とRBM480-496ペプチドとの間の相同性（図S12E）と一致して、S. salivarius K12の補充はまた、RBM480-496に対する唾液IgG抗体の力価を増加させた（0日目：9.0±10.37 vs. 14日目：17.6±18.4）（図6C）。K12を投与した19人のうち8人も、唾液中のS1特異的IgAの増加を示したが（0日目：17.6±13.2 vs. 14日目：26.4±23.2）、その差は統計学的有意差には達しなかった（図6A）。血清中の抗S IgGおよびIgA力価もまた、K12の補充によって有意な影響を受けなかった（図6D）。これらのデータは、S. salivarius K12の経口補充が、BNT162b2ワクチン接種ヒトの口腔内のS特異的IgG抗体の濃度を2週間以内に安定化させ、増加させることができることを示している。
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図6ワクチンを接種したヒトにおけるStreptococcus salivarius K12による交差反応性抗RBD SARS-CoV-2反応の誘導
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S.サリバリウスは口腔内に定着する常在菌であり、それ自体が局所的なIgA応答を誘導する可能性があることから、次にワクチン接種前の健常人（表S1；ワクチン接種試験0日目の参加者）の唾液中の交差反応性RBD特異的IgA抗体と年齢の関係を評価したところ、唾液中のS1結合性IgA応答の大きさはドナーの年齢と負の相関があることがわかった（図7A）。次に、RBDと交差反応する唾液中IgA抗体が、ワクチン未接種者のS. salivariusも認識するかどうかを検討した（表S7）。このため、S. salivarius、B. pseudocatenulatum、およびB. subtilisを、RBD反応性IgAを示すワクチン未接種のヒト（健常対照[HC]-RBD-IgA）の唾液とインキュベートした。その結果、HC-RBD-IgA陽性者の唾液にはS. salivariusおよびB. pseudocatenulatumを認識するIgA2が含まれていたが、陰性者の唾液には含まれていなかった（図7B）。これらのデータは、RBD反応性IgA2が、ワクチン未接種の未曝露者において、これらの細菌によって誘導され得ることを示している。
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図7ワクチン未接種者における常在菌を認識する交差反応性抗RBD IgA抗体
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ワクチン未接種のヒトでRBD反応性IgAが調節されるかどうかを調べるために、ワクチン未接種のヒトにプロバイオティクスS. salivarius K12を補充した（図S15A-S15D）。この環境では、2週間の補充で有意な抗S1 IgA唾液Ab応答は誘導されなかった。さらに、抗S1 IgGはこれらの参加者では検出されず、ワクチン接種の状況と一致した（図S15A；データは示さず）。口腔微生物叢組成のさらなる分析により、S. salivarius K12は、未処置群の個体と比較して、Actinomyces属およびSelemonas属の存在量を減少させたことが示された（図S15A〜S15D）。したがって、S. salivarius K12の補充は、ワクチン接種者においてのみ抗S IgGレベルに影響を与えた（図6）。
考察
微生物叢の構成は、パターン認識受容体による微生物叢の生得的感知、抗原提示細胞による抗原提示の調節、細菌代謝産物の免疫調節作用、交差反応性T細胞およびB細胞応答を介して、ワクチン接種の効率に影響を及ぼす47。特に、鼻咽頭微生物叢は、ACE2受容体の発現調節48、緊張型IFN応答の誘導49、および全身および粘膜のトランスフォーミング成長因子（TGF）-β1レベルの調節を介して、病原性空気感染ウイルス（ここではSARS-CoV-2）の感染からの宿主の保護に寄与している可能性があり、TGF-β1はIgA1およびIgA2へのAbクラススイッチ組換えを制御している。 50,51また、微生物叢の細菌は、粘膜免疫系に潜在的な分子模倣物質の膨大なレパートリーを提供し、病原体に対する交差反応性で既存の粘膜免疫を提供する可能性があることも明らかである。このように、常在細菌はヒトの病原体感染に対する感受性を非常に多様に変化させる一因となっている可能性がある。ここで我々は、BNT162b2ワクチン接種が、一方では口腔内の常在菌であるS. salivariusの持続性を支持し、他方ではS. salivariusの経口補充が口腔内の抗S抗体価を高めることを示した。このようなワクチン誘発Absと常在菌との相互作用は、Sタンパク質とS. salivariusのRSSL-01370タンパク質との間の分子模倣を介して起こり、それによってSARS-CoV-2感染時の防御のさらなるラインを提供する可能性がある。このように、我々は、SARS-CoV-2の文脈における、分子模倣を介した抗ウイルスAb応答と常在細菌叢の相互制御について述べている。
粘膜表面におけるAb-微生物叢相互作用は、標的となる細菌を減少させるか18、あるいは細菌の存続を促進させるかのいずれかである。興味深いことに、抗RBDモノクローナルAbsは腸内細菌叢に対して非常に広範な結合を示したが（図3E）、ワクチン接種により誘発された唾液Absは口腔内細菌叢の組成に有意な変化を引き起こさず、むしろ有益なプロバイオティック細菌の増殖を促進した。この研究により、SARS-CoV-2 Sタンパク質のRBDと、S. salivariusおよびB. pseudocatenulatumを含む異なる細菌ペプチド模倣体の両方に対するこのような交差反応性Absの存在が明らかになった。ワクチン接種者にプロバイオティクスであるS. salivarius K12を追加で経口投与したところ、口腔内の抗S抗体レベルも上昇した。これらのデータを総合すると、常在細菌と唾液Absの抗原特異的相互作用、およびS. salivariusとRBD特異的交差反応性Absの場合、正の制御フィードバックループが証明された。この研究の限界は、ワクチン接種後の分析期間が短いこととコホート数が少ないことである。この微生物叢とAbのクロストークの長期的な持続性を明らかにするためには、観察期間を長くし、参加人数を増やした追加研究が必要である。
SARS-CoV-2のS RBDを模倣した細菌が中和性粘膜Ab反応を増強することは、HIV-1ウイルスについて先に報告された同様の観察結果から支持される。SARS-CoV-2 Sタンパク質とは対照的に、微生物によって誘導されたgp41反応性Absは、Envワクチン接種によって生じたAb反応を、HIV-1 Envの中和エピトープから非中和エピトープへと転換させた。
SARS-CoV-2のSタンパク質の場合、私たちは、健康な未曝露の被験者において、ある種の細菌が既存の抗RBD IgA抗体と正の相関を示すことを観察し、S. salivariusとB. pseudocatenulatumをマウスに経口投与すると、このような交差反応性抗体が誘導されることを示した。このような既存のIgA抗体価は、ヒトでは関連するコロナウイルスに過去に暴露されているか、ヒトでは特定の細菌株が存在するがマウスでは存在しないことで説明できる。C57BL/6の糞便微生物叢の16S rRNA配列決定により、これらのマウスにS. salivariusおよびビフィズス菌が存在しないことがさらに裏付けられた（データは示さず）。同時に、ワクチンを接種したマウスも接種していないマウスも、IgA応答のさらなる増幅を示さなかった（図7およびS15）。さらに、RBD反応性IgAのde novo誘導とRBD特異的IgGの増加は、細菌のコロニー形成によって起こる可能性が示唆されたが、交差反応性IgAの誘導における関連コロナウイルスの寄与は、現時点では除外できない。この疑問の詳細については、さらなる実験が必要である。
既存の交差反応性IgAsは唾液と腸粘膜にのみ存在し、血液中には存在しないことから、全身性の免疫反応が誘導されたり、全身性IgAsの上皮通過輸送に大きな影響があるとは考えにくい。実際、総Igレベルの分析では、S. salivarius K12の投与による有意な変化は認められなかった（データは示さず）。これは、短命の形質細胞の誘導を含む、局所粘膜免疫細胞の柔軟な反応と思われる。興味深いことに、K12をマウスに投与すると抗S反応が誘導されたが、S. salivariusを常在菌として保有しているヒトにK12を投与しても、唾液中のS特異的IgAは有意に増加しなかった。対照的に、S. salivariusを添加したワクチン接種者では、唾液中の抗S1 IgG抗体の存在が増強された。これらのIgG抗体の産生が選別細胞によるものなのか、あるいは長寿命の形質細胞によるものなのか、またこの場合、上皮通過輸送が影響を受けるのかどうかについては、まだ明らかにされていない。このような増加は、野生型（WT）Sだけでなく、ヒトコロナウイルスHKU1のomicron RBDおよび配列関連RBDでも観察されたが、配列非関連NL63 RBDでは観察されなかったことを考えると（図6；データは示さず）、このようなAbsの誘導は、低親和性相互作用を介して粘膜表面で局所的に起こる可能性が考えられる。このように、分子模倣によって形成される分泌性Abおよび全身性Abのレパートリーを将来的に評価することは興味深い。このような唾液中和抗RBD Ab濃度の調節が、どの程度まで感染や疾患から身を守るかは、まだ明らかにされていない。我々は、S. salivariusのRSSL-01370がSに対する非中和および中和Abを誘導し、その後in vivoでのウイルスクリアランスを促進することを動物モデルで見出した。S. salivarius K12のCOVID-19に対する影響については、さらに2つの研究が行われた。別の研究では、S. salivarius K12で治療した患者において、重症のCOVID-19の改善が観察された55。このように、S. salivarius K12はウイルスクリアランスを促進する可能性があるが、より実質的な証拠を得るためには、より大規模な臨床研究が必要である。
宿主内在性因子とは別に、初期のウイルス量が疾患の転帰と重症度に影響する可能性がある56,57。また、重症COVID-19,58,59の間に微生物叢が変化するという証拠が増えつつあり、微生物叢の組成も重症化発症の危険因子である可能性が示唆されている58,59,60。重症度と関連する菌属については、データが矛盾しているが、これはおそらく患者コホートの不均一性と治療の違いによるものであろう。共通するのは、急性COVID-19が日和見菌の蔓延と免疫調節細菌の枯渇に関連していることである59。例えば、COVID-19患者の口腔咽頭微生物叢は、VeillonellaやMegasphaeraのような日和見病原体の濃縮とPseudopropionibacterium、Rothia、Streptococcus61の枯渇を特徴とし、Klebsiella、Acinetobacter、Serratiaの比率の増加は、疾患の重症度と相関している61。別の研究では、重症の患者では数種類の連鎖球菌が減少していることが明らかにされ、気管支肺胞洗浄液中のマイコプラズマ唾液量の多さと抗S IgG値の低さが特徴的であった62。さらに、ワクチン未接種者とワクチン接種者のCOVID-19期間中の口腔内細菌叢を比較したところ、ワクチン未接種者では肺炎桿菌や大腸菌を含む日和見菌種が濃縮されたのに対し、ワクチン接種者では唾液腺炎菌の存在が増強され、日和見菌種が減少したことが示された63。最後に、COVID-19感染後の口腔内微生物叢組成の縦断的評価により、COVID-19感染中にレンサ球菌が最初に消失したが、1年後に再び出現することが明らかになった64。COVID-19感染中の唾液微生物叢に関するわれわれのデータは、重症のCOVID-19感染中にレンサ球菌が減少することを裏付けている（図S16；表S8）。これらのデータを総合すると、ウイルスと微生物叢の組成の両方がCOVID-19の重症化に拍車をかけている可能性が示唆される。
以前の報告では、ワクチン接種による高い抗S抗体力価の発現に関連する一般的な糞便微生物叢の特徴が報告されており、S. salivariusは肥満度の高い人の血液中の中和抗体力価にプラスの影響を与えると報告されている65。ここで我々は、S. salivariusのような異なる細菌が、SARS-CoV-2 Sタンパク質のRBDの分子模倣物の発現によって、口腔内のSARS-CoV-2特異的Absの局所的存在に選択的に影響を与えることを証明した。ワクチン接種に伴う糞便微生物叢の一般的な組成の変化は見られなかったため、Ngらによって同定された細菌組成の変化は、今のところ解読されていない一般的な方法で機能している可能性が高い65。
まとめると、我々は、口腔-鼻咽頭路の微生物叢の異なる細菌が、SARS-CoV-2 Sタンパク質のRBDの分子的模倣によって、SARS-CoV-2に対する粘膜免疫の制御に寄与し、唾液免疫の持続を支持していることを、ここで初めて証明した。
STAR★方法
主要リソース表
試薬またはリソースソースの識別子
抗体
抗ヒトIgA1 Alexa Fluor 647 (clone: B3506B4) Southern Biotech Cat. 9130-31; RRID: AB_2796658
抗ヒトIgA2 Alexa Fluor 488（クローン：A9604D2）Southern Biotech Cat. 9140-30; RRID: AB_2796665
ウサギ SARS-CoV-2 スパイク中和抗体（クローン：HA14JL2302） Sino Biological Inc. Cat. 番号: 40592-R001; RRID: AB_2857936
COVID-19 患者から分離した中和抗体 Kreye et al.42 PMID: 33058755
抗ウサギ IgG Alexa647 Jackson ImmunoResearch Cat. 番号 111-606-144; RRID: AB_2338083
PE/Dazzle™ 594 抗ヒト IgG Fc リコンビナント BioLegend Cat. 番号: 366920; RRID: AB_2890798
ヤギ抗ヒト Ig (H+L 鎖) 抗体 Southern Biotech Cat. 番号: 2010-01; RRID: AB_2687525
ヤギ抗ヒトIgA Fab Southern Biotech Cat. 番号 2050-01; RRID: AB_2795701
ビオチン化抗ヒトIgA抗体 Southern Biotech Cat. 番号 2050-08; RRID: AB_2795706
抗ヒトIgG-AP ICN/Cappel Cat No.
抗ヒト IgA-AP Sigma-Aldrich Cat.No.
抗 SARS-CoV-2 スパイク糖タンパク質 S1 抗体 (クローン: CR3022) Abcam Cat. No. ab273073; RRID: AB_2848080
抗ヒト IgA FITC Sothern Biotech Cat. 番号 2052-02; RRID: AB_2795710
抗ウサギ Alexa 647 Jackson ImmunoResearch Cat. 111-606-144; RRID: AB_2338083
抗マウス IgA 抗体 DyLight® 650 Bethyl Laboratories Cat.No： A90-103D5; RRID: AB_10630982
ウサギ中和抗RBD抗体 Sino Biological Inc. Cat. No. 40592-R001; RRID: AB_2857936
抗ウサギ IgG-HRP Cell signaling Cat. 7074S; RRID: AB_2099233
抗ヒトIgG-HRP Southern Biotech Cat. 番号 2040-05; RRID: AB_2795644
細菌およびウイルス株
ロゼッタDE3 Sigma-Aldrich Cat. 番号 70954-3
化学的にコンピテントな大腸菌 TOP10 In house N/A
Streptococcus salivarius K12 ノボジン免疫 Cat. 番号 18170211
Streptococcus salivarius 本紙 N/A
Streptococcus australis/ Rubner 本紙 N/A
Streptococcus parasanguinis 本論文 N/A
大腸菌本紙 N/A
サフェンシス菌この論文
セレウス菌この論文
Escherichia fergusonii 本論文 N/A
Bifidobacterium pseudocatenulatum 本論文 N/A
ビフィドバクテリウム・ロンガム本紙 N/A
エンテロコッカス・ヒラエ本論文 N/A
エンテロコッカス・フェカリス本論文 N/A
アシダミノコッカス・インテスティナリス本論文 N/A
Veillonella parvula 本紙 N/A
全ウイルス不活化SARS-CoV-2ワクチン Kozlovskaya et al.46 PMID: 34427172
生物学的サンプル
ヒト糞便サンプル
ヒト唾液サンプル
ヒト血清サンプル
ヒト綿棒サンプル
マウス糞便サンプル本論文 N/A
マウス血清サンプル本論文 N/A
マウス肺サンプル
化学物質、ペプチド、リコンビナントタンパク質
DNase I Sigma Aldrich Cat. 番号 10104159001
KAPA HiFi HotStart ReadyMix Roche Cat. 番号 07958935001
Taqポリメラーゼ Rapidozym GmbH Cat. 番号 GEN-003-1000
dNTPミックス Thermo Fisher Scientific Cat. 番号 R0192
AmPure XP Beads Beckman Coulter Life Science Cat. 番号 A63881
Hoechst 33342溶液 Thermo Fisher Scientific Cat. 番号 62249
Sphero™ Rainbow Particles BD Biosciences Cat. 番号 559123
アキュドロップビーズ BD Biosciences Cat. 番号 345249
DEPC処理水 Invitrogen Cat. 番号 46-2224
脳心筋注入ブロス Sigma Cat. 番号 53286-100G
ファスティディアス寒天培地 Thermo Fisher Scientific Cat. 番号 12957138
Schaedler broth Roth Cat. 番号 5772.1
LB 培地 MP Biomedicals 社の Cat. 番号 113002032
2xTY 培地 MP Biomedicals Cat. 番号 113012031
PYG MEDIUM (modified) DSMZ www.dsmz.de
イソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) Invitrogen Cat. 番号 15529019
Restrictase NdeI New England BioLabs Cat. 番号 R0111S
Restrictase XhoI New England BioLabs Cat. 番号 R0146S
リコンビナント未特性タンパク質 RSSL-01370 本論文 N/A
HisPur™ コバルト樹脂 Thermo Fisher Scientific Cat. 番号 89964
ヒト IgA Genway Cat. 番号 E04696
ヒト IgG Jackson ImmunoResearch 社の Cat. 111-606-144
pNPP Sigma-Aldrich Cat. 番号 N2770
ストレプトアビジン-HRP Invitrogen Cat. 番号 88-7324-88
テトラメチルベンジジン（TMB）基質 Invitrogen Cat. 番号 88-7324-88
硫酸 25% Sigma-Aldrich Cat. 番号 1007161000
水酸化ナトリウム Roth Cat. 番号 6771.1
SARS-CoV-2 Spike S1 Subunit His-tag Protein R&D Cat. 番号 10522-CV
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) スパイクタンパク質 (RBD, His タグ) Sino biological Cat. 番号 40592-V08B-100
SARS-CoV-2 ヌクレオカプシド His タンパク質、CF R&D Cat. 番号 10474-CV
SARS-CoV-2 スパイク RBD タンパク質 (flag-his) (Omicron/B.1.1.529) SanyouBio Cat. 番号 PNA055
RBD ペプチド (RBD480-496: CNGVEGFNCYFPLQSYG) Eurogentek Cat. 番号: AS-65619
組み換え SARS-CoV-2 S タンパク質 RBD-Fc キメラ (キャリアフリー) BioLegend Cat. 番号：793106
固定可能な生菌色素 eFluor 450 Invitrogen Cat. 番号 50-112-8817
ACE2 タンパク質 Southern Biotech Cat. 番号 2010-01
ビオチン化 RBD Miltenyi Biotec Cat No.
プロテアーゼ阻害剤カクテル Roche Cat. 番号 11 836 145 001
ガラスビーズ MP Biomedicals Cat. 番号 6911100
脱脂乳 Roth Cat. 番号 68514-61-4
SuperSignal West Fempto Maximum Sensitivity サーモフィッシャーサイエンティフィック Cat No.
Trypsin (Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade) Promega Cat. 番号 V5280
2,5-ジヒドロキシ安息香酸 Sigma-Aldrich Cat. 番号 149357
アンピシリン Thermo Fisher scientific Cat. 番号 11593027
ポリエチレングリコール Sigma-Aldrich Cat. 番号 P7181
HAT培地サプリメント（50×） Hybri-Max Sigma-Aldrich Cat. 番号 H0262-10VL
ミョウバン Thermo Fisher Scientific Cat. 番号 77161
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific Cat. No. 11668019
重要な市販アッセイ
NGS 標準感度フラグメント解析キット Agilent Cat. 番号 DF-473-1000
Nextera XT Index Kit v2 Set C/D Illumina Cat. FC-131-2003
MiSeq Reagent Kit v3（600サイクル）Illumina Cat. MS1023003
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel Cat. 番号740609.50
Quick-DNA™ Fecal/Soil Microbe Miniprep Kit Zymo Research Cat. 番号 D6010
ペプチドマイクロアレイ・マルチウェル・レプリトープ SARS-CoV-2 スパイク糖タンパク質野生型 + 変異 JPT Peptide Technologies GmbH Cat. RT-MW-WCPV-S-V02
簡易便抽出装置 ALPCO Cat. 30-EZEX-100
寄託データ
生配列データ NCBI Sequence Read Archive (SRA) Bioproject： PRJNA738291
実験モデル細胞株
HEK293T細胞 Ferreira-Gomesら.50 PMID:33785765; RRID:CVCL_0063
ベロ細胞 Kozlovskaya et al.46 PMID:34427172; RRID:CVCL_0574
P3X63Ag8.653 骨髄腫細胞 ATCC Cat. CRL-1580; RRID:CVCL_4032
実験モデル生物／株
C57BL/6遺伝的背景のヘミ接合体K18-hACE2 Tgマウス(B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J) Jackson Laboratory JAX #034860 , RRID:IMSR_JAX:034860
C57BL/6J Jackson Laboratory JAX #000664 、

RRID:IMSR_JAX:000664
オリゴヌクレオチド
16SアンプリコンPCRフォワードプライマー 5'-TCgTCggCAg

CgTCAgATgTgTATAAgAgACAgCCTAC

gggNggCWgCAg-3' Klindworth et al.76 PMID: 22933715
16SアンプリコンPCRリバースプライマー 5'-gTCTCgTggg

CTCggAgATgTgTATAAgAgACAggACTACHVggg

TATCTAATCC-3' Klindworth et al.76 PMID:22933715
LPW57 5'-AgTTTgATCCTggCTCAg-3' Wooら.67 PMID:11040945
LPW58 5'-AGgCCCgggAACgTATTCAC-3' Woo et al.67 PMID:11040945
RSSL-01370フォワードプライマー

5'- CTCCATATgAATTTACCAAgTCACCATACAAggg -'3 この論文 N/A
RSSL-01370リバースプライマー

5'- gTggTCgACATTCACTTTTTCAgTTgCTACC -'3 本論文 N/A
組み換えDNA
pET-21b 発現ベクター Addgene Cat. 番号 69741-3
pCG1-SARS-CoV-2-S Hoffmann et al.2 PMID: 32142651
ソフトウェアおよびアルゴリズム
MiSeq Reporter ソフトウェア Illumina www.illumina.com
PANDAseq 2.11 GitHub www.github.com
Graphpad Prism 9.3.1 Prism https://www.graphpad.com
FlowJo v10 株式会社ツリースター www.flowjo.com
Mascot MS/MS イオン検索 Matrix Science www.matrixscience.com
Biotools ソフトウェア Bruker Daltonik www.bruker.com
ZEN 2.0 Carl Zeiss AG N/A
その他
Easy Stool Extraction Device ALPCO Cat. 30-EZEX-100
Agilent Fragment Analyzer 5200 Roche Cat. 番号 M5310AA
イルミナ MySeq 2500 イルミナ www.illumina.com
Spectramax plus 384 Molecular devices Cat. 番号 5510-236-04
COY 嫌気チャンバー COY Lab 製品 www.coylab.com
BD Influx® BD バイオサイエンス www.bdbiosciences.com
FACSCanto II BD Biosciences www.bdbiosciences.com
MACS Quant 16 Miltenyi Biotec www.miltenyibiotec.com
マイクロアレイスキャナー Innoscan 710。イノプシス www.innopsys.com
Chemi Doc XRS+ イメージングシステム Bio-Rad Cat. 番号 1708265
Ultraflex II MALDI-ToF-ToF 質量分析計 Bruker Daltonik www.bruker.com
Cryotome MH560 サーモフィッシャーサイエンティフィック www.assets.thermofisher.com
LSM 880 Carl Zeiss AG N/A
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リソースの有無
連絡先
リソースおよび試薬に関する詳細情報およびリクエストは、リードコンタクトであるAndrey Kruglov (kruglov@drfz.de)までご連絡ください。
利用可能な材料
プラスミド、細胞株、抗体、本試験で作製された細菌株は、主担当者に要請すれば入手可能である。
実験モデルおよび研究参加者の詳細
ヒトドナー
BNT162b2ワクチン接種試験における健常人は、BNT162-01試験（ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04380701）において同意を得ており、インフォームドコンセントフォームは162-01の手順に従って保存されている。表S1に参加者の年齢と性別の割合の中央値を示す。この研究に参加した他の個人は、ベルリン・シャリテ大学病院の倫理委員会の承認（EA4/019/21、EA2/200/21、EA2/010/21、EA2/066/20、EA4/188/20、EA2/002/21）に従って書面によるインフォームド・コンセントを行い、ヘルシンキ宣言に準拠していた。表S3、S4、S6、S7は、参加者の年齢中央値、男女比、治療法を報告している。表S2は、ワクチン接種後の口腔微生物叢の解析に登録された関節リウマチ患者の特徴を、年齢、性比、および投薬の中央値とともに報告したものである。表S8は、呼吸器感染症に罹患した参加者の年齢、性比、治療法の中央値であり、COVID-19感染はSARS-CoV-2 RNAのそれぞれのPCR分析によって確認された。参加者は全員、インフォームド・コンセントを得た上で研究に参加した。
健常人へのプロバイオティクス菌の補充
健康なボランティアを募集した。組み入れ基準は、SARS-CoV-2に対するワクチン接種を全コース受けており、最後のワクチン接種から3ヵ月以上経過していること（図6）、またはワクチン未接種であること（図S15；表S7）であった。参加者には、Streptococcus salivarius K12（Novozin immun; Bluestone pharma）50mg（107CFU）が提供され、1日1回睡眠前に摂取された。対照群にはサプリメントは与えなかった。血清と唾液を採取し、プロバイオティクス摂取0日目と14日目に抗スパイク抗体価を分析した。抗ヌクレオカプシドIgG抗体価は、試験中のSARS-CoV-2への曝露を除外するため、試験開始0日目と14日目に測定された。
マウス
C57Bl/6遺伝的背景のヘミ接合体K18-hACE2 Tgマウス(B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J)をJackson Laboratoryから購入した(JAX #034860 , RRID:IMSR_JAX:034860)。野生型C57Bl/6マウスはPushchino Animal Breeding Facility (Branch of the Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences)から入手した。すべての動物は、ロシア科学アカデミー・エンゲルハルト分子生物学研究所・生理活性化合物研究所共同利用センターまたは精密ゲノム編集・生物医学遺伝子技術センターでSPF条件下で飼育された。すべての動物実験は、ロシアの動物保護規則に従って実施され、RAS生理活性化合物研究所（プロトコルNo.50、2020年8月10日）およびRASエンゲルハルト分子生物学研究所（プロトコルNo.2、2022年9月14日）の現地倫理審査委員会の承認を得た。
マウス免疫
増殖した細菌を回収し、PBSで3回洗浄後、65℃で1時間熱不活化した。熱不活化した細菌を最終OD600が1.0になるように再懸濁した。C57Bl/6マウス（8-12週、雄雌とも）に200μlの熱死菌をi.p.注射し、経口投与から生菌ストックを増殖させ、PBSで数回洗浄し、OD600を1に調整し、毎日200μlの生菌を経口投与した。未同定タンパク質RSSL-01370を免疫するために、大腸菌でリコンビナントタンパク質RSSL-01370を生産し、精製した（STAR Methodsの該当セクションを参照）。マウス（C57Bl/6系統、8-12週齢、雌）1匹あたり20μgをミョウバン1：1、v/v（Thermo Scientific、Cat.No.77161）との混合物として腹腔内に注射した。ブースト免疫は一次注射後14日目に行った。すべての動物処置は、ロシアの動物保護規則に従って行った。
マウスのワクチン接種と感染
全ウイルス不活化SARS-CoV-2ワクチン（CoviVac）は、プロトタイプB.1.1 SARS-CoV-2株（GISAID ID EPI_ISL_428851）からVero細胞で製造した46。K18-hACE2 Tgマウス（8～12週、雄雌とも）には、0日目と14日目にCoviVacワクチンを筋肉内接種するか、ミョウバンまたはミョウバンで乳化した細菌混合物を腹腔内接種した46。 .1 SARS-CoV-2を、CoviVacまたはミョウバン（Thermo Scientific、Cat.No.77161）による2回目のワクチン接種から1週間後に経鼻感染させた。動物は毎日臨床検査を受け、体重を測定した。感染7日目にマウスを犠牲にした。
細菌培養
PYG培地とプレートはDSMZ（ドイツ微生物・細胞培養コレクション）の記載に従って調製した。1mlのPYG培地に300,000イベントを選別し、直接COY嫌気チャンバーに移した。選別した細菌をPYG、BHI（Brain heart infusion broth、Sigma、Cat.No.53286-100G）、Fastidious寒天プレート（Thermo Fisher Scientific、Cat.No.12957138）にプレーティングし、細菌を24時間増殖させた。コロニーを摘出し、PYG培地、BHIブロス、Schaedler broth (Roth, Cat. No. 5772.1)にそれぞれのプレートのコロニーを接種した。翌日、DNAを単離し、残りの菌体を40％グリセロールLB培地中、液体窒素または-80℃で凍結した。
方法の詳細
綿棒および唾液サンプルの調製
全唾液を採取チューブに採取し、+4℃で15分間、2000gで遠心分離した。上清は-80℃で保存し、さらに分析を行った。唾液ペレットは綿棒サンプルと同様に16S rDNA配列決定に使用した。綿棒は、Quick-DNA™ Fecal/Soil Microbe Miniprep Kit（Zymo Research、Cat. No.）綿棒は診療所から-80℃で入手し、さらに使用するまで凍結保存した。綿棒スティックは、すでにバッファー中に保存されているか、Bead Bashing™バッファーが綿棒ブラシを覆うように加えられていた。最大750μLの緩衝液をBashingBead™ Lysis Tubeに移し、37℃で13,000rpmで厳密に混合した。キットのプロトコールに従い、13,000 x gで5分間遠心後、上清を採取し、Zymo-Spin™ III-F Filterでもう一度ろ過した。その後、DNAを含む溶液をGenomic Lysis Bufferで処理し、DNAを含む溶液をDNA結合Zymo-Spin™ IICR Columnにサンプル全量がロードされるまで繰り返しかけた。結合したDNAをDNA Pre-Wash Bufferとg-DNA Wash Bufferで洗浄した。洗浄したDNAを50μLのDNA Elution Bufferで溶出し、Zymo-Spin™ III-HRC Filterでろ過してさらに精製した。調製した各サンプル2.5 μLを、16S rRNA法のセクションで説明したIllumina Nextera NGSプロトコルのアンプリコンPCRに直接ロードした。
BNT162b2ワクチン接種者の便サンプル調製
参加者の新鮮な便サンプルは、製造元の指示に従ってALPCO Easy Stool Extraction Deviceを用いて採取し、処理前に-80℃で保存した。解凍した便懸濁液を70μmフィルター（Falcon、Cat.No.352350）および30μmフィルター（CellTrics®、Sysmex、Cat.No.04-0042-2316）でろ過し、4000×gで遠心分離して細菌細胞をペレット化した。細菌を含まない上清を0.22μmシリンジトップ（Filtropur, Sarstedt Cat. No.83.1826.001）フィルターでろ過し、さらに使用するまで-80℃で保存した。ペレットは、Safe Seal 2 mL 反応チューブ（Sarstedt, Cat. No.
細菌分離のための便サンプル調製
健常対照者から採取した新鮮な便サンプルは、48時間以内に処理する前に氷上または4℃で保存した。便はオートクレーブ滅菌濾過したPBS（自社製、Steritop® Millipore Express®PLUS 0.22 μm、Cat.No: 2GPT05RE）で100μg/mLの割合で重量に応じて希釈し、ボルテックスとスパチュラでホモジナイズした。その後、糞便溶液を70μmフィルター（Falcon、Cat.No.352350）および30μmフィルター（CellTrics®、Sysmex、Cat.No.04-0042-2316）でろ過し、4000×gで遠心分離して細菌細胞をペレット化した。この遠心ステップの上清をもう一度13,000 x gで遠心し、残存細胞をペレット化した。細胞を含まない上清を0.22μmシリンジトップ（Filtropur、Sarstedt Cat. No.83.1826.001）フィルターでろ過し、さらに使用するまで-80℃で保存した。両遠心ステップのペレットをプールし、10 mLのPBSに再懸濁し、600 nmで細胞密度を測定した。OD0.4の細胞量を1mLの40％グリセロールin LB培地混合液に入れ、Safe Seal 2mL反応チューブ（Sarstedt, Cat.No.72.695.500）に保存し、-80℃に移した。
16S rRNA遺伝子の配列決定と解析
16S rRNA遺伝子の塩基配列決定のために、バルク微生物叢サンプルおよび選別サンプルから直接V3/V4領域を増幅した（プライマー配列： 5'-TCgTCggCAgCgTCAgATgTgTATAAgAgACAgCCTACgggNggCWgCAg-3'および5'-gTCTCgTggCTCggAgATgTgTATAAgAgACAggACTACHVggTATCTAATCC-3'）を、イルミナMiSeqシステムの「16Sメタゲノミックシーケンシングライブラリーの調製」に記載されているように、長時間の初期加熱ステップで増幅した。アンプリコンの後、ゲノムDNAをAmPure XP Beads (Beckman Coulter Life Science Cat. No. A63881)により、サンプルとビーズの比率を1:1.25 (v/v)で除去した。次に、アンプリコンのサイズと純度を1.5 %アガロースゲルでチェックし、適切であればNextera XT Index Kit v2 Set C/D (Illumina, FC-131-2003)を用いてインデックスPCRを行った。インデックスPCRの後、サンプルはAmPure XP Beads（Beckman Coulter Life Science Cat. No. A63881）を用いて、サンプルとビーズを1：0.8（v/v）の割合で再度洗浄した。その後、サンプルをキャピラリーゲル電気泳動（Agilent Fragment Analyzer 5200）で分析し、NGS標準感度フラグメント分析キット（Agilent Cat.）すべての適切なサンプルから2 nMのプールを作成し、Illumina MySeq 2500システムにロードした。
MiSeq Reporter Softwareを用いて生データを処理し、多重化を解除した。フォワードリードとリバースリードを、PANDAseq 2.11を使用して最小25塩基のオーバーラップ68で結合し、Ribosomal Database Projectの "classifier.jar" 2.13を使用して信頼度カットオフ50%で分類した69,70。コピー数を調整したカウントを細菌属に集約し、最小サイズに希釈し、phyloSeq 1.34を使用してアルファ多様性を推定した71。
生配列データは、NCBI Sequence Read Archive (SRA)にアクセッション番号PRJNA738291で寄託された。
NCBIの16SリボソームRNA配列74との類似性に基づく原種のアノテーションと、最小エントロピー分解（MED）に基づく教師なしオリゴタイピングである。類似性に基づくアプローチでは、megablastを用いた基本的なローカルアライメント検索を行い、100のベストヒットを得た。異なるStreptococcus属の配列の類似度は100%に達するため、最小公倍数祖先分類とは対照的に、同一性が等しい場合のベストヒットの分類群を割り当てた。オリゴタイピングアプローチは、Needleman Wunschアルゴリズムを用いて、Streptococcus readsとStreptococcus vulneris reference (NCBI Reference Sequence:NR_179383.1)の300-764 Region間のペアワイズ配列アラインメントに基づいている。アラインメントされた配列は、ギャップを維持し、潜在的な挿入を除去してマルチプルアラインメントを作成した。最小エントロピー分解は、Erenらが記述したように、0.6以上の臨界エントロピーを使用してオリゴタイプを分割し、ギャップや潜在的な挿入を考慮しないように行った75。各オリゴタイプの基になる可能性のある生物種は、NCBIのnr/ntヌクレオチドコレクションと同様に、16S rRNA配列の基本的なローカルアラインメント検索によって決定した。オリゴタイプは、マルチプルアラインメントと対応する核酸塩基との最小エントロピーの位置によって注釈付けされた。位置1は、Streptococcus vulnerisリファレンスの位置300に対応する。
微生物叢の染色
解凍中のグリセロール毒性を軽減するため、凍結した微生物株をオートクレーブ滅菌濾過したPBS 1 mLで補充した。サンプルを13,000 xgで10分間2回遠心分離し、上清を除去してペレットをPBSに再懸濁し、最終的に10テストに分けた。微生物叢サンプルの染色はすべて、DNase含有バッファー（PBS/0.2 % BSA/25 μg/μL DNase、Sigma Aldrich Cat.No.10104159001）中で行った。ヒト免疫グロブリンの染色は、検出抗体：抗ヒトIgA1 Alexa Fluor 647（クローン：B3506B4、Southern Biotech Cat.No.9130-31）、抗ヒトIgA2 Alexa Fluor 488（クローン：A9604D2、Southern Biotech Cat.No.9140-30）を1：50（v/v）で100μLに調製した。サンプルを4℃で30分間インキュベートし、5μM Hoechst 33342溶液（Thermo Fischer Scientific Cat. No. Spike タンパク質と類似した構造を検出するために、まず、0.5 μg のウサギ SARS-CoV-2 Spike 中和抗体（クローン：HA14JL2302、Sino Biological Inc. No.40592-R001）または COVID-19 患者から単離した中和抗体を 4℃で 15 分間投与した後、PBS で洗浄し、抗ウサギ IgG Alexa647（7,5μg/ml, Jackson ImmunoResearch Cat. No. 111-606-144）または抗ヒトIgG PE/ Dazzle™ 594（2μg/ml；BioLegendのCat.No.: 366920）で再度染色した。Hoechst 33342染色後、サンプルをPBSで洗浄し、13,000 x gで5分間遠心した。上清を除去した後、サンプルをPBS/0.2 % BSAに再懸濁した。サンプルを5 mL丸底チューブ（Falcon、Cat.No.352063）に移し、取得した。
微生物叢フローサイトメトリー
微生物叢サンプルの細胞計測にはすべてBD Influx® セルソーターを使用した。装置のシースバッファー（PBS）はオートクレーブ滅菌し、各フルイディクス起動前に滅菌ろ過（Steritop® Millipore Express®PLUS 0.22μm、Cat.No: 2GPT05RE）した。各採取の品質は、Sphero™ Rainbow Particles（BD Biosciences Cat. No. 559123）によるレーザーのアライメント、レーザー遅延、レーザー強度によって保証された。ソーティングのために、Accudrop Beads (BD Biosciences Cat. No. 345249)を用いて事前に滴下遅延を決定した。サンプルは15,000イベント以下で取得し、10,000イベント以下でソートした。Hoechst 33342陽性イベントは常に30万件記録した。100,000イベントまでのシーケンスをProtein Low Bindチューブ（Eppendorf Cat. No 022431102）に直接ソートし、サンプルを17,000 x gでスピンダウンし、残留ソートバッファーをDEPC処理水（Invitrogen Cat. No.）サンプルは約10μLのまま、さらに処理するまで-20℃で保存した。その後の細菌の培養には、PYG培地に直接ソーティングし、細胞をCOY嫌気チャンバーに直接移した。
細菌コロニーからの配列決定
中和抗RBD抗体に結合した細菌種を同定するために、増殖した細菌200μlからDNAをエタノール沈殿で単離した。単離されたDNAはその後、16S rDNA特異的プライマーLPW57とLPW58で増幅された67。簡単に言うと、細菌のDNAはTaq-ポリメラーゼ（0.005 u/μl, Rapidozym GmbH, Cat. 12 mM MgCl2（Rapidozym GmbH）、1 X GenTherm buffer（Rapidozym GmbH）、0.25 mM dNTP mix（Thermo Scientific、Cat.No. R0192）、およびLPW57とLPW 58（1μM、TIB Molbiol）を用いて、サーモサイクラーで35回の増幅サイクルを行った。DNA産物をゲル電気泳動で確認し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Cat. No. 740609.50)で精製した。精製されたPCR産物の濃度は15μl中5ng/μlに調整され、Eurofins Genomics社によるサンガー配列決定に送られた。配列の同一性はNCBIが提供するNucleotide Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)を用いて決定した。
酵素結合免疫吸着アッセイ
血清、唾液および糞便上清中の抗体価を検出するため、96ウェルプレートにヤギ抗ヒトIg（H+L鎖）抗体（Southern Biotech社、Cat.No.2010-01）またはヤギ抗ヒトIgA Fab（Southern Biotech社、Cat.No.2050-01）をそれぞれコートし、IgGおよびIgAを検出した。1x PBSTで30秒間洗浄した後、プレートを200μLの5% PBS/BSAで室温で1時間ブロッキングした。次に、プレートを200μLの1x PBSTで30秒ずつ3回洗浄した。血清および糞便上清をPBSで希釈し、100μLをプレートに加えた。標準品をPBSで希釈し、プレートに添加した： IgA（Genway, Cat. No. E04696）およびIgG（Janssen Biotech Inc. その後、プレートを200μLの1x PBSTで5回洗浄し、検出抗体を適用した：抗ヒトIgG-AP（ICN/Cappel、Cat No.59289）、抗ヒトIgA-AP（Sigma、Cat.No.A2043）、37℃で1時間インキュベートした。その後、プレートを200μLの1x PBSTで5回洗浄した。 100μLのpNPP（Sigma、Cat.No.N2770）を各ウェルに添加した。反応は3M NaOH（Roth: Cat.No.6771.1）の添加により停止させた。光学濃度は Spectramax（Molecular devices）で測定した。
酵素結合免疫吸着法による抗Spike抗体反応の解析
SARS-CoV-2特異的抗体価を測定するために、96ウェルプレートに0,5μg/ml組換えSARS-CoV-2スパイクS1サブユニットHisタグタンパク質（R&D 10522-CV）または0,5μg/ml組換えSARS-CoV-2（2019-nCoV）スパイクタンパク質（RBD、Hisタグ、Sino biological、Cat. 40592-V08B-100）、または0,5μg/ml組換えSARS-CoV-2ヌクレオカプシドHisタンパク質、CF（RnD Systems；Cat.No.10474-CV）、または0.5μg/ml組換えSARS-CoV-2スパイクRBDタンパク質（flag-his）（Omicron/B.1 .1.529) (SanyouBio、Cat. #PNA055 )タンパク質、または0,5μ/mlのRBDペプチド(RBD480-496: CNGVEGFNCYFPLQSYG; Eurogentek、Cat. No: AS-65619)。50 S1特異的IgAを検出するため、ビオチン化抗ヒトIgA抗体（Southern Biotech、Cat. No. PBSTで5回洗浄した後、ストレプトアビジン-HRP（Invitrogen、Cat.No.88-7324-88）を添加し、室温で30分間インキュベートし、PBSTで5回洗浄した後、テトラメチルベンジジン（TMB）基質（Invitrogen、Cat.No.88-7324-88）を添加した。反応は、2N H2SO4（Sigma-Aldrich: Cat.No.84736）の添加により停止した。唾液中の抗S1 IgG検出のために、抗ヒトIgG-AP（ICN/Cappel、Cat No.59289）を適用し、プレートを室温で1時間インキュベートした。その後、プレートを200μLの1x PBSTで5回洗浄し、100μLのpNPP（Sigma、Cat.No.N2770）を各ウェルに添加した。反応は3M NaOH（Roth: Cat.No.6771.1）の添加により停止させた。光学濃度をSpectramax plus 384(Molecular devices)で測定した。さらに、OD 値を各サンプル希釈液に対してプロットし、曲線下面積（AUC）を Graphpad Prism 9.3.1 を用いて定量した。K12補充試験における抗体価の相対的上昇は以下のように計算した： AUC(d14)/AUC(d0)∗100.
スパイクタンパク質に対する抗体応答解析のためのフローサイトメトリーアッセイ
血清中の "Wuhan "Spike特異的免疫グロブリンを検出するために、HEK293T細胞に野生型変異型SARS-CoV-2 Spikeタンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトした。翌日、抗SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein S1抗体（クローン：CR3022、Abcam、Cat.No.ab273073）で30分間染色し、PBS/0.2 % BSAで1回細胞を洗浄した後、ヤギ抗ヒトIgG-Alexa-647（Southern Biotech、Cat.No.2014-31）で染色し、トランスフェクト細胞の割合を決定した。さらにトランスフェクトした細胞を回収し、血清とともに30分間インキュベートした後、PBS/BSAで2回洗浄し、Fixable Viability Dye eFluor 450（Invitrogen, Cat.No.50-112-8817）の存在下、ヤギ抗ヒトIgG Alexa647（Southern Biotech, Cat.No.2014-31）および抗ヒトIgA FITC（Sothern Biotech, Cat.No.2052-02）で染色した。細胞をPBS/0.2%BSAで洗浄し、直接測定するか、2%パラホルムアルデヒド溶液に4℃で20分間固定した。サンプルはFACSCanto II（BD Biosciences）またはMACS Quant 16（Miltenyi Biotec）で取得し、FlowJo v10（Tree Star Inc.）解析ソフトウェアを用いて解析した。それぞれの蛍光チャンネルにおいて、蛍光強度の幾何平均値（MFI）Spike 発現細胞と非発現細胞を定量し、IgGとIgAについてΔMFI=MFI（S+）-MFI（S-）を求めた。さらに、ΔMFI 値を各血清希釈液に対してプロットし、Graphpad Prism 9.3.1 を用いて AUC を定量した。
抗RBD抗体のエピトープマッピング
エピトープマッピングは、ペプチドマイクロアレイマルチウェルレプリトープSARS-CoV-2 Spike glycoprotein wild type + mutations (JPT Peptide Technologies GmbH; RT-MW-WCPV-S-V02)を用いて行った。マイクロアレイをモノクローナル抗RBD抗体（最終濃度1 mcg/ml）またはマウス糞便上清（1:1希釈）と共に30℃で1時間、絶え間なく回転させながらインキュベートした。スライドを0.05 % Tween-20入りTBS緩衝液で3回洗浄し、さらに抗ウサギAlexa647 (Jackson ImmunoResearch Cat. No. 111-606-144)、抗ヒトIgG-Alexa647 (Southern Biotech; Cat. No.: 2040-31)、ヤギ抗マウスIgA Antibody DyLight® 650 (Bethyl Laboratories; Cat.No.: A90-103D5)を加え、30℃で1時間インキュベートした。サンプルをTBS-Tと脱イオン水で洗浄し、遠心分離で乾燥させた。ペプチドマイクロアレイは、マイクロアレイスキャナーInnoscan 710（Innopsys）を用いて分析した。蛍光強度はImagePixを用いて定量した。
ACE2-RBD相互作用の阻害
96ウェルプレートに100ng/mlのヒトACE2タンパク質（Southern Biotech、Cat.No.2010-01）をコートした。1x PBSTで30秒間洗浄した後、プレートを200μLの5% PBS/BSAで室温で1時間ブロックした。次に、プレートを200μLの1x PBSTで30秒ずつ3回洗浄した。糞便上清と陽性コントロールとしてのCOVID血清をPBSで希釈し、100μLをプレートに加えた。その後、200μLの1x PBSTで5回洗浄し、100ng/mlのビオチン化RBD（Miltenyi Biotec; Cat No:130-127-457）を加え、37℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した後、ストレプトアビジン-HRP（Invitrogen、Cat.No.88-7324-88）を添加し、RTで30分間インキュベートし、PBSTで5回洗浄した後、テトラメチルベンジジン（TMB）基質（Invitrogen、Cat.No.88-7324-88）を添加した。反応は、2N H2SO4（Sigma-Aldrich: Cat.No.84736）の添加により停止した。光学濃度はSpectramax（Molecular devices）で測定した。阻害の割合は以下の値を用いて定量した：阻害率100%はブランクウェルのOD値に対応し、阻害率0%はビオチン化RBDのみを添加したウェルに対応する。
スパイクSARS-CoV-2偽型レンチウイルスの作製
1.2×106個の293T細胞を10mLの増殖培地中、10cmシャーレにプレーティングした。翌日、Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）を用いて、5μgのpCMV-dR8-2、6.67μgのpUCHR-IR-GFP、および3.33μgのSタンパク質コードプラスミドで、製造者の指示に従って細胞をトランスフェクトした。その後、トランスフェクションから48時間後に上清を回収し、0.45μmのフィルターでろ過した後、PEG-6000沈殿を用いて濃縮し、分注して-80℃で保存した。ACE2発現293T細胞でPVを滴定し、フローサイトメトリーで評価した。
レンチウイルスの阻害
ACE2発現293T細胞を、実験前日に96ウェルプレートに2×104個/ウェルでプレーティングした。血清サンプルを増殖培地で連続的に2倍希釈した。唾液サンプルを1：10に希釈し、S-偽型ウイルスと混合し、37℃で1時間インキュベートした。この混合液をAce2-293T細胞に加え、37℃で1日間インキュベートした。感染はフローサイトメトリーで判定した。
肺組織学
病理組織学的検査用の肺を10％中性緩衝ホルマリンで室温48時間固定し、PBSで洗浄後、OCT培地でスナップ凍結した。Cryotome MH560（Thermo Fisher）を用いて肺切片（7μm）を切り出し、抗NCP抗体（Thermo Scientific、Cat No.PA5-119601）で染色した後、二次抗ウサギIgG（Jackson ImmunoResearch、Cat No.111-606-144）で染色し、共焦点顕微鏡LSM880（Zeiss）を用いて観察した。顕微鏡写真はLSM880で10倍の倍率で取得し、ZEN2（Zeiss）ソフトウェアを用いて処理した。NCP-APC強度の評価には、APCチャンネルのイベントの合計をスライドの2乗（mm2）で割り、二次のみのコントロールで正規化した。各生物学的サンプルについて、3～5 枚の連続したスライドを分析した。
ハイブリドーマの作製
P3X63Ag8.653骨髄腫細胞は、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むRPMI-1640培地で増殖させた。免疫動物の脾臓細胞をP3X63Ag8.653と1:1の割合で混合し、RPMI-1640培地を用いて数回洗浄した。細胞を穏やかに再懸濁し、ポリエチレングリコール（Sigma-Aldrich: Cat.P7181）1mLを1分間、絶えず撹拌しながら添加し、続いてRPMI-1640培地2mLを2分間、RPMI-1640培地10mLを1分間添加した。細胞を洗浄し、20％ウシ胎児血清、1％ペニシリン、ストレプトマイシン、100μMヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、16μMチミジンを含むRPMI-1640培地に2×106 /mLの濃度で再懸濁し、96ウェルプレートに1ウェル当たり100μLずつ分散させた。14日間、毎日培地の半分を除去し、新しい培地を加えた。細胞融合後6-8日目に最初のコロニーが認められた。10日目に、コロニーのあるウェルの上清をELISAでIgG産生とRSSL-01370およびRBD-Fc-Tagに対する反応性を分析した。
タンパク質ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング
48時間培養した細菌をペレット化し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むRIPA緩衝液に再懸濁した（Roche、カタログ番号11 836 145 001）。サンプルを50%の電圧で10秒パルスを5サイクル超音波処理し、その後氷上で30秒静止させた。超音波処理後、ガラスビーズ（MP Biomedicals、Cat.No.6911100）を細菌抽出液の全量の1/3量添加した。サンプルを30秒間ボルテックスした後、氷上で30秒間冷却した（合計5サイクル）。溶解液を20,000 xgで10分間スピンダウンし、上清を回収した。ウェスタンブロット分析では、サンプルを還元条件下で12% SDS-PAGEにかけ、PVDFメンブレン（Bio-Rad、Cat. No.1620177）に転写した。SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD-His Recombinant Protein (Sino Biological, Cat. No. 40592-V08B-100) を陽性対照として用いた。メンブレンは、TBSTバッファー中の5％脱脂乳（Roth、Cat.No.68514-61-4）中で、室温で1時間、絶え間なく振盪しながらインキュベートすることによりブロックした。続いて、ウサギ中和抗 RBD 抗体 (Sino Biological, Cat. No. 40592-R001) またはヒト由来 RBD 中和抗体とブロッキング液中で、室温で 1 時間、絶え間なく振盪しながらハイブリダイズさせた。その後TBSTで洗浄し、抗ウサギIgG-HRP（Cell signaling, Cat.No.7074S）または抗ヒトIgG-HRP（Southern Biotech, Cat.No.2040-05）と共に室温で1時間、一定に振盪しながらインキュベートした。SuperSignal West Fempto Maximum Sensitivity (Thermo Fisher scientific, Cat No. 34095) 基質キットを使用した。シグナルはChemi Docイメージングシステム（Bio-Rad）を用いて取得した。
タンパク質の質量分析
1D-PAGE後のタンパク質バンドを切り出し、100mLの0.1M NH4HCO3 (pH 7.5)と50%アセトニトリルの混合液でゲル片が透明になるまで50℃で2回洗浄した。タンパク質のシステイン結合を50mM NH4HCO3中10mM DTTで56℃、30分間還元し、15mMヨードアセトアミドで暗所、RT、30分間アルキル化した。DTTを加えるステップを繰り返した。その後、ゲル片を100mclのアセトニトリルで脱水し、風乾し、50mMの炭酸水素アンモニウム中の12mg/mLのトリプシン（Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade, Promega）溶液10mclで37℃で15時間処理した。ペプチドを20 mclの0.5%トリフルオロ酢酸水溶液で30分間超音波抽出し、SpeedVac (Labconco) で乾燥させ、3% ACN, 0.1% TFAに再懸濁した。サンプルからのアリコート（2 mcl）を0.3 mclの2,5-ジヒドロキシ安息香酸（SigmaAldrich: Cat. No: 149357）溶液（30 mgを400 mclの30%アセトニトリル/0.5%トリフルオロ酢酸に溶解）とスチールターゲット上で混合し、液滴を室温で乾燥させた。質量スペクトルは、Ndレーザーを装備したUltraflex II MALDI-ToF-ToF質量分析計（Bruker Daltonik、ドイツ）で記録した。MH]+分子イオンはリフレクターモードで測定し、質量ピークの測定精度は0.007%であった。フラグメントイオンスペクトルは、ヘリウムをコリジョンガスとして用い、低エネルギー衝突誘起解離によりわずかに加速されたレーザー誘起解離により生成された。フラグメントイオンの質量ピークの測定精度は1Daであった。見つかったMS/MSフラグメントとタンパク質の対応付けは、Biotoolsソフトウェア（Bruker Daltonik、ドイツ）とMascot MS/MSイオン検索を用いて行った。
タンパク質の発現
RSSL-01370遺伝子は、Streptococcus salivarius K12のゲノムDNAから以下のプライマーを用いて増幅した：5'- CTCCATATGAATTTACCAAGTCACCATACAAGGG -'3 および 5'- GTGGTCGACATTCACTTTTTCAGTTGCTACC -'3 その後、NdeIおよびXhoI制限部位を含むpET-21b発現ベクターにクローニングし、Rosetta DE3（Sigma Aldrich, Cat. 70954-3）化学的にコンピテントな細胞でNdeIとXhoI制限部位を含むpET-21b発現ベクターにクローニングした。次に、選択したクローンの一晩培養を、100μg/mlのアンピシリンを含む2xTY増殖培地に接種し、30℃でOD600が0,8になるまで絶え間なく振盪しながら増殖させた。30℃で4時間、0.6 mMのIPTGでタンパク質発現を誘導した。細菌溶解液を調製し、上記のように分析した。
タンパク質の精製
Hisタグを含むRSSL-01370タンパク質をRosetta DE3 (Sigma Aldrich, Cat. No. 70954-3)細胞で発現させ、細菌細胞懸濁液を4500rpmで20分間遠心し、300mM塩化ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、10mMイミダゾール、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むCo2+平衡化/洗浄バッファー、pH7,4 (Roche, Cat. No. 11 836 145 001)に再懸濁した。サンプルを50％の電圧で20秒パルスを5サイクル超音波処理し、その後氷上で30秒静止させた。溶解液を20,000xgで10分間スピンダウンし、過剰発現タンパク質を含む上清を回収した。上清をHisPur™ Cobalt resin（Thermo Scientific社製）にロードし、メーカーの説明書に従って精製した（Thermo Scientific社製、カタログ番号89964）。簡単に説明すると、タンパク質溶解液をロードした後、カラムを10mMのイミダゾール洗浄バッファーで洗浄し、150mMのイミダゾール溶出バッファーで未同定タンパク質RSSL-01370を溶出した。次に、300mM塩化ナトリウムと50mMリン酸ナトリウム（pH7,5）を含むバッファーに対して一晩透析を行い、タンパク質をさらに応用した。
定量と統計解析
2群間の統計的評価には、Mann-Whitney検定または非対検定が用いられた。独立変数を含む複数群間の統計的評価には、ダンの多重比較によるフリードマン検定を用いた。NCP タンパク質強度の評価には、蛍光チャンネルのイベント総和をスライド（mm2）の2乗で割り、連続するスライドを2次抗体のみで染色して得られた強度に対して正規化した。各生物学的サンプルについて、3-5枚の連続したスライドを分析した。介入前後の同一個体におけるデータの解析には、Wilcoxon matched-pairs signed rank testを用いた。相関を評価するために、Spearman相関を定量した。統計解析はGraphPad Prism 9.3.1を用いて行った。P値が0.05未満は統計的に有意とみなされた。
その他のリソース
ヒト参加者は、BNT162-01試験（ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04380701）およびベルリン・シャリテ大学病院の倫理委員会によって承認された試験（EA4/019/21、EA2/200/21、EA2/010/21、EA2/066/20、EA4/188/20、EA2/002/21）に従って登録され、ヘルシンキ宣言に従って実施された。
データとコードの利用可能性

微生物叢16SシーケンスデータはNCBI Sequence Read Archive (SRA)に寄託されており、出版日までに一般公開される予定である。アクセッション番号は主要リソース表に記載。ウェスタンブロットのオリジナル画像は原稿に含まれている。DOIはkey resources tableに記載されている。本論文で報告された顕微鏡データは、要求があれば主担当者が共有する。

本研究中にオリジナルのコードは生成されていない。

本論文で報告されたデータを再分析するために必要な追加情報は、要求があれば主担当者から入手可能である。
謝辞
ワクチン接種臨床試験のセットアップにご協力いただいたUgur Sahin氏とÖzlem Türeci氏（Biontech社）に感謝する。Timo Rückert、Mona Massoud、Lennard Ostendorf、Marie Burnsには採血を手伝ってもらい、German Rheumatism Research Center Flow Cytometry Core Facilityのメンバー（T. Kaiser、J. Kirsch、R. Maier）にはFACS解析と細胞選別を手伝ってもらい、Mairi McGrath博士には丁寧な文章校正をしてもらった。D.Mazurov博士とN.Kruglova博士には試薬を分けていただき、R.Zvartsevにはマウスのジェノタイピングをしていただいた。本研究は、DFG（TRR241/B03およびTRR130 P16をH.-D.C.、A.R.、Clinical Research Unit KFO 5023 "BecauseY "プロジェクト番号504745852をA.A.K.、TR-SFB241/A01（375876048）、SFB1444/P11（427826188）、SPP1937-DI764/9-2をA.D.）、Dr. Rolf M. Schwiete Foundation（J.N.、L.B.、H.-D.C.）およびRussian Science Foundation（J.N.、L.B.、H.-D.C.）の支援を受けた。 D.C.）、ロシア科学財団助成金#21-14-00223（粘膜抗体応答の解析、A.A.K.へ）、ロシア基礎研究基金助成金#17-00-00435（V.M.G.）および#17-00-00268（A.A.K.）、ライプニッツ協会助成金（ライプニッツ共同優秀研究、TargArt［M.-F.M.］およびImpACt［M.-F.M.およびA.A.K.］）。 F.M.およびA.A.K.]）、ベルリン健康研究所（BIH）のStarting Grant-Multi-Omics Characterization of SARS-CoV-2 infection, Project 6, Identifying Immunological Targets in COVID-19、ベルリン州および欧州地域開発基金（ERDF 2014-2021, EFRE 1.8/11, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum）、ドイツ連邦教育研究省（CONANおよびTReATからM.-F.M.およびCOVIM. F.M.、COVIM P4がA.D.）、欧州研究会議（ERC-2010-AdG.20100317 IMMEMO Grant 268978）からA.R.、ILCAdapt（ERC-2021-AdG 101055309）からA.D.、欧州連合（GlycanTrigger, 101093997からA.D.）、ベルリン・アインシュタイン財団（アインシュタイン教授職からA.D.）。J.K.、S.M.R.、E.S.は、Charité-Universitätsmedizin BerlinおよびBerlin Institute of Healthの助成によるCharité Clinician Scientist Programに参加している。グラフの抄録はbiorender.comを用いて作成した。
著者貢献
構想、A.A.K.およびM.-F.M.、方法論、A.A.K.、M.-F.M.、P.D.、L.K.、M.D.、G.S.、M.B.、S.A.、I.V.S、およびV.M.G.、ソフトウェア、P.D.、調査、M.B.、S.A.、L.B.、P.L.、J.N.、A.A.K.、M.W.、J.K.、S.M.R.、I.S.、G.M.G、 M.F.-G.、E.S.-S.、S.Y.、T.S.、G.A.H.、C.T.、M.R.、D.M.、I.V.S.、M.D.、L.K.、A.L.、リソース、J.K.、S.M.R.、E.S.-S. S.、H.P.、E.S.、A.-L.S.、T.D.、S.Z.、E.V.、N.K.、K.J.S.、S.T.、A.D.、P.E.；執筆-原案、A.A.K、 M.W.、M.B.、L.B.、J.N.、P.D.、M.-F.M.、A.R.；執筆-校閲・編集、M.W.、M.B.、L.B.、J.N.、J.K.、M.F.-G. G.、S.M.R.、M.R.、G.S.、E.S.、A.-L.S.、T.D.、H.-D.C.、M.D.、L.K.、S.T.、A.R.、H.P.、P.E.；視覚化、A．P.D.、M.B.、L.B.、J.N.、プロジェクト管理、A.A.K.、M.-F.M.、L.K.、P.E.、S.T.、A.R.、A.D.、H.P.、資金獲得、H.-D.C.、A.R.、M.-F.M.、A.A.K.、H.P.、V.M.G.、J.K.、S.M.R.、E.S.。
利益申告
この研究に関連して、Deutsches Rheuma-Forschungszentrum（DRFZ）は特許を出願している。
インクルージョンと多様性
私たちは、包括的で多様性のある、公平な研究の実施を支持します。
補足情報
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資料S1. 図S1-S16
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表S1.唾液および糞便微生物叢の16S配列決定に使用した被験者の特徴、図1、2、7A、S1、S2、S3C、S4、S5、およびS6関連
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表S2. 図2およびS3Bに関連する、ワクチン接種後の口腔微生物叢の解析に登録されたRA患者の被験者特性
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表S3. 図2およびS3Cに関連する唾液微生物叢16S rDNA配列決定に使用した被験者の特徴
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表S4. 図3、7、S8、S9、およびS10に関連する、唾液および糞便サンプルのIgA測定と微生物叢への抗体の結合に使用した被験者の特徴
.xlsxのダウンロード (.02 MB)
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表S5. 図3に関連する抗RBD抗体によって認識されたS. salivariusタンパク質の質量分析結果
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表S6. 図6に関連するS. salivariusの補充に使用した被験者の特徴
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表S7. ワクチン未接種ドナーのS. salivarius補充に使用した被験者の特性（図6およびS14に関連
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表S8. 図2、7、およびS16に関連する、綿棒の微生物叢の16S配列決定に使用した被験者の特徴
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ファイルS1. 図3に関連する、様々な抗体によって認識される細菌の量
参考文献
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日本学術振興会特別研究員
パブコメ
概要
全文
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グーグル奨学生
Cao Y.
蘇乙。
Guo X.
Sun W.
Deng Y.
Bao L.
Zhu Q.
Zhang X.
Zheng Y.
Geng C.
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SARS-CoV-2に対する強力な中和抗体が、回復期患者のB細胞のハイスループット単一細胞シークエンシングによって同定された。
Cell. 2020; 182: 73-84.e16
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.025
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スコープス (799)
パブコメ
要旨
全文
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グーグル奨学生
Ju B.
Zhang Q.
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孫 J.
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SARS-CoV-2感染によって惹起されるヒト中和抗体。
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スコープス (170)
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グーグル奨学生
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スコープス (161)
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要旨
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グーグル奨学生
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スコープス (118)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ザラテ・ブラデス C.R.
蓬莱玲子
マタパリル M.J.
アジャミ N.J.
ウォン M.
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伊藤圭一
チャン C.C.
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免疫特権部位における自己免疫を誘発する代理抗原の供給源としての腸内細菌叢。
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スコープス (43)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ジル-クルスC.
ペレス-柴山C.
デ・マーチンA.
ロンキ F.
ファン・デル・ボルヒトK.
ニーダー R.
オンダー L.
リュトゲ M.
ノヴコヴィッチ M.
ニンドル V.
ら
微生物叢由来のペプチド模倣体が致死的炎症性心筋症を引き起こす。
Science. 2019; 366: 881-886
https://doi.org/10.1126/science.aav3487
論文で見る
スコープス (151)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
グライリング T.M.
デナー C.
チェン X.
ヒューズ K.
イニゲス A.J.
ボチット M.
ルイズ D.Z.
レンフロー S.C.
ヴィエイラ S.M.
ラフ W.E.
他
ループスにおける自己免疫の引き金としてのヒト自己抗原Ro60の常在菌オルソログ。
Sci. Transl. Med. 2018; 10eaan2306
https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aan2306
論文で見る
スコープス (186)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
Ren Z.
Wang Y.
Duan T.
パテル J.
リゲット T.
ロダ E.
ブラフマ S.
ゴスワミ R.
ライチョウ C.
バーンR.
他
細菌アクアポリン-Zとヒトアクアポリン-4との交差免疫反応性：視神経脊髄炎との関連性の可能性。
J. Immunol. 2012; 189: 4602-4611
https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200486
論文で見る
スコープス (28)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
プラナス R.
サントスR.
トマス-オジェP.
クルチアーニ C.
ルッテロッティ A.
フェイグル W.
シェーレン＝ウィーマーズ N.
エスペホ C.
エイシャーチ H.
ピニージャ C.
他
GDP-l-フコース合成酵素はDRB3∗02:02多発性硬化症患者におけるCD4(+)T細胞特異的自己抗原である。
Sci. Transl. Med. 2018; 10eaat4301
https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aat4301
論文で見る
スコープス (62)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
バンカー J.J.
エリクソン S.A.
フリン T.M.
ヘンリー C.
コバル J.C.
マイゼル M.
ジャブリ B.
アントノプロス D.A.
ウィルソン P.C.
ベンデラックA.
天然の多反応性IgA抗体は、腸内細菌叢を被覆する。
Science. 2017; 358eaan6619
https://doi.org/10.1126/science.aan6619
論文で見る
スコープス (268)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ロバック O.H.
ハイメサットM.M.
クルグロフA.A.
プリペンス S.
ニンネマンJ.
グートビア B．
レッペ K.
ホッホレイン H.
スーター M．
キルシュニングC.J.
他
抗生物質治療による二次性IgA欠乏症は緑膿菌肺炎に対する感受性を高める。
J. Clin. Invest. 2018; 128: 3535-3545
https://doi.org/10.1172/JCI97065
論文で見る
スコープス (66)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
スコット N.A.
アンドルーサイトA.
アンデルセンP.
ローソンM.
アルコン-ジナーC.
ルクレール C.
カイム S.
ル・ガール G.
ショウ T.
コノリーJ.P.R.
他
抗生物質はマクロファージのホメオスタシスを乱すことにより、腸管T細胞免疫の持続的な調節障害を引き起こす。
Sci. Transl. Med. 2018; 10eaao4755
https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aao4755
論文で見る
スコープス (179)
クロス
グーグル奨学生
長尾-北本
レスリーJ.L.
北本聡
ジン C.
トムソン K.A.
ギランド3世 M.G.
クファ P.
Goto Y.
ジェンク R.R.
石井C.
他
インターロイキン22を介した宿主の糖鎖形成は、腸内細菌叢の代謝活性を調節することにより、Clostridioides difficile感染を予防する。
Nat. Med. 2020; 26: 608-617
https://doi.org/10.1038/s41591-020-0764-0
論文で見る
スコープス (104)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
一戸崇
パン I.K.
熊本祐子
ピーパー D.R.
ホー J.H.
マレー T.S.
岩崎明彦
微生物叢は気道インフルエンザAウイルス感染に対する免疫防御を制御する。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011; 108: 5354-5359
https://doi.org/10.1073/pnas.1019378108
論文で見る
日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
シャウプL.
ムートS.
ローゲルL.
Kofoed-Branzk M.
メルキオールF.
リーネンクラウス S．
ガナル・ヴォナルブルグ S.C.
クライン M．
グエンデル F．
ハイン T．
他
微生物によって誘導されたI型インターフェロンは、樹状細胞のポイズド基底状態を指示する。
Cell. 2020; 181: 1080-1096.e19
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.022
論文で見る
スコープス(105)
パブコメ
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ステファン K.L.
キム M.V.
岩崎敦
カスパー D.L.
常在細菌叢によるウイルス感染に対する自然抵抗性の調節。
Cell. 2020; 183: 1312-1324.e10
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.10.047
論文で見る
スコープス (111)
パブコメ
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
トラマ A.M.
ムーディ M.A.
アラム S.M.
イェーガー F.H.
ロックウッド B.
パークス R．
ロイド K.E.
ストラーチャック C．
スチャース R．
ファルガー A．
他
HIV-1エンベロープgp41抗体は、常在細菌と交差反応性を共有する回腸末端B細胞に由来する可能性がある。
Cell Host Microbe. 2014; 16: 215-226
https://doi.org/10.1016/j.chom.2014.07.003
記事で見る
スコープス (89)
PubMed
概要
全文
全文PDF
グーグル・スカラー
ウィリアムズ W.B.
リャオ H.X.
ムーディ M.A.
ケプラー T.B.
アラム S.M.
ガオ F.
ヴィーエ K.
トラマ A.M.
ジョーンズ K.
Zhang R.
他
HIV-1ワクチン。gp41-微生物叢交差反応性抗体によるHIV-1ワクチン誘発免疫の転用。
Science. 2015; 349aab1253
https://doi.org/10.1126/science.aab1253
論文で見る
スコープス(154)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ン K.W.
フォークナー N.
コーニッシュ G.H.
ローザ A.
ハーベイ R.
フサイン S．
ウルファーツ R．
アール C．
ヴロベル A.G.
ベントン D.J.
他
ヒトにおけるSARS-CoV-2に対する既存および新生体液性免疫。
Science. 2020; 370: 1339-1343
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論文で見る
スコープス (494)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
シムラ E.R.
マンカ M.A.
ジャセミ S.
ウッザウ S.
ルビーノ S.
マンチャ P.
ビッティ A.
パレルモ M.
セキ L.A.
HCoV-NL63とSARS-CoV-2は、CoV-2流行前および流行中に採取された人々の血清中の体液性反応によって認識されるエピトープを共有している。
微生物。2020; 81993
https://doi.org/10.3390/microorganisms8121993
論文で見る
スコープス (16)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
Majdoubi A.
ミハルスキー C.
オコネル S.E.
ダダ S.
ナルパラ S.R.
ジェリナス J.P.
ミタ D.
チャン C．
ウィンクラー D.F.
バサッパ M．
他
非感染成人の大多数がSARS-CoV-2に対する既存の抗体反応性を示す。
JCIインサイト。2021; 6e146316
https://doi.org/10.1172/jci.insight.146316
論文で見る
スコープス(24)
クロス
グーグル奨学生
アンダーソン E.M.
グッドウィンE.C.
ヴェルマ A.
アレバロ C.P.
ボルトン M.J.
ウィーリック M.E.
グーマ S．
マカリスターC.M.
クリステンセン S.R.
ウィーバーJ.
他
季節性ヒトコロナウイルス抗体はSARS-CoV-2感染時に増強されるが、防御とは関連しない。
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https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.010
論文で見る
スコープス(214)
パブコメ
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ソーカルA.
シャペールP.
バルバ-スパエスG.
ローザー A.
Fourati S.
アッザウイ I.
バンデンベルヘ A.
フェルナンデス I.
メオラ A.
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論文で見る
スコパス (185)
パブコメ
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
シュピーケルマンG.M.
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ウォード E.S.
デュモンJ.
ディッキンソン B.L.
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レセプターを介した免疫グロブリンGの成体における粘膜横断輸送：哺乳類肺におけるFcRnの機能発現。
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論文で見る
スコープス (328)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ワイブルグO.L.
ウレンT.K.
シンプフェンドルファーK.
ヨハンセン F.E.
ブラントザエグ P.
ストルグネルR.A.
自然免疫系分泌抗体はサルモネラ・チフスムリウムの自然感染を防御する。
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論文で見る
スコープス (213)
PubMed
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グーグル奨学生
シェイク-モハメドS.
イッショウ B.
チャオ G.Y.C.
Zuo M.
コーエン C.
ルスティグ Y.
ナハス G.R.
サロモン-シュルマンR.E.
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他。
拡大ヒトマイクロバイオームプロジェクトにおける菌株、機能、動態。
Nature. 2017; 550: 61-66
https://doi.org/10.1038/nature23889
論文で見る
スコープス (689)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
Wang J.
Jia Z.
Zhang B.
Peng L.
Zhao F.
生体内ヒト口腔微生物叢の蓄積を追跡することにより、消化管への入り口における微生物群集動態を解明。
Gut. 2020; 69: 1355-1356
https://doi.org/10.1136/gutjnl-2019-318977
論文で見る
スコープス (35)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
エレンA.M.
ボリシーG.G.
ヒューズ S.M.
マーク・ウェルチ J.L.
ヒト口腔マイクロバイオームのオリゴタイピング解析。
Proc. Natl. Sci. USA. 2014; 111: E2875-E2884
https://doi.org/10.1073/pnas.1409644111
論文で見る
スコープス (214)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
Bacci G.
メンゴーニA.
エミリアーニG.
キエッリーニ C.
チプリアーニ E.G.
ビアンコーニ G.
カンガネッラ F.
ファニ R.
閉鎖環境における520日間の縦断的研究によるヒト唾液微生物叢の回復力の定義：Mars500ミッション。
マイクロバイオーム。2021; 9152
https://doi.org/10.1186/s40168-021-01070-5
論文で見る
スコープス (4)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
山崎晃。
小倉和彦
南和彦
鴎外K.
堀口剛史
岡本聡
向井和彦
健康な若年成人女性における月経周期に伴う口腔マイクロバイオームの変化。
Front. Cell. Infect. Microbiol. 2023; 131119602
https://doi.org/10.3389/fcimb.2023.1119602
論文で見る
スコープス (0)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ボンダレヴァ M.
レッツP.
カーバーグ K.
シュレーゼンマイヤーE.
セミン・I.
リンコン・アレバロ H.
デルナー T.
マシュレギ M.F.
ステファンスキー A.L.
クルグロフ A.A.
COVID-19ワクチン3回接種後の関節リウマチ患者における交差反応性粘膜抗SARS-CoV-2抗体反応の誘発。
J. Autoimmun. 2022; 133102918
https://doi.org/10.1016/j.jaut.2022.102918
論文で見る
スコープス (0)
クロス
グーグル奨学生
赤石剛
高橋俊彦
佐藤聡
金 X.
マサムネ A.
石井敏明
COVID-19ワクチン接種後の長引く下痢：症例報告と文献的検討．
東北J. Exp. Medicine. 2022; 257: 251-259
https://doi.org/10.1620/tjem.2022.J043
論文で見る
スコープス(2)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
クライJ.
ラインケ S.M.
コルナウ H.C.
サンチェス-センディンE.
コーマン V.M.
リウ・H.
ユアン M.
ウー N.C.
Zhu X.
リー C.D.
他。
治療用非自己反応性SARS-CoV-2抗体は、COVID-19ハムスターモデルにおいて肺病変を予防する。
Cell. 2020; 183: 1058-1069.e19
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.09.049
論文で見る
スコープス(212)
パブコメ
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ワーデマンH.
ユラソフ S.
シェーファー A.
ヤングJ.W.
メフレ E.
ヌッセンツヴァイク M.C.
初期ヒトB細胞前駆体による優勢な自己抗体産生。
Science. 2003; 301: 1374-1377
https://doi.org/10.1126/science.1086907
論文で見る
日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
リウ Q.
マックJ.W.Y.
スーQ.
Yeoh Y.K.
Lui G.C.
Ng S.S.S.
Zhang F.
Li A.Y.L.
Lu W.
Hui D.S.
他。
急性COVID-19症候群患者の前向きコホートにおける腸内細菌叢動態。
Gut. 2022; 71: 544-552
https://doi.org/10.1136/gutjnl-2021-325989
論文で見る
スコープス (170)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
バレットC.
アルバレス-マルティンP.
フォアタ F.
ルノー P.
Berger B.
レンチバイオティック・バクテリオシン産生菌Streptococcus salivarius K12株のゲノム配列。
J. Bacteriol. 2012; 194: 5959-5960
https://doi.org/10.1128/JB.01268-12
論文で見る
スコープス (10)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
コズロフスカヤ L.I.
ピニアエワ A.N.
Ignatyev G.M.
ゴルデイチュク I.V.
ヴォロク V.P.
ロゴワ Y.V.
シショワ A.A.
コフパク A.A.
イヴィン Y.Y.
アントノワL.P.
他
前臨床試験におけるCOVID-19不活化ワクチン（CoviVac）の長期液性免疫原性、安全性および防御効果。
Emerg. Microbes Infect. 2021; 10: 1790-1806
https://doi.org/10.1080/22221751.2021.1971569
論文で見る
スコープス (44)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
リン D.J.
ベンソン S.C.
リン M.A.
プレンドランB.
微生物叢によるワクチン接種に対する免疫応答の調節：その意味と潜在的メカニズム。
Nat. Immunol. 2022; 22: 33-46
https://doi.org/10.1038/s41577-021-00554-7
論文で見る
スコープス (84)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ゲバ-ザトルスキーN.
セフィクE.
クアL.
パスマンL.
タン・T.G.
オルティス-ロペスA.
ヤノーツァン T.B.
ヤン・L.
ジュップ R.
マティスD.
他。
ヒト腸内細菌叢から免疫調節生物を探索。
Cell. 2017; 168: 928-943.e11
https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.01.022
論文で見る
スコープス (477)
パブコメ
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ブラッドリーK.C.
フィンスターブッシュ K.
シュネップD.
クロッタ S.
ロリアン M.
デイビッドソン S．
フックス S.Y.
ステヘリ P．
ワックA.
肺間質細胞における微生物叢主導性の強直性インターフェロンシグナルは、インフルエンザウイルス感染から保護する。
Cell Rep. 2019; 28: 245-256.e4
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.05.105
論文で見る
スコープス（167）
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
フェレイラ-ゴメスM.
クルグロフ A.
デュレク P.
ハインリッヒF.
ティツィアンC.
ハインツ G.A.
パスクアル・レグアンA.
デュ W．
モセス R.
ファンC.
他
重症COVID-19のSARS-CoV-2は、自分自身を標的としないTGF-β支配の慢性免疫応答を誘導する。
Nat. Commun. 2021; 121961
https://doi.org/10.1038/s41467-021-22210-3
論文で見る
スコープス (109)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ベラー A.
クルグロフA.
デュレクP.
フォン・ゲッツェV.
ヴェルナー K.
ハインツ G.A.
ニンネマンJ.
レーマン K.
マイアー R.
ホフマンU.
他
特異的微生物叢は、マウスのパイエルパッチのT濾胞ヘルパー細胞においてTGF-βを誘導することにより、腸管IgAレベルを高める。
Eur. J. Immunol. 2020; 50: 783-794
https://doi.org/10.1002/eji.201948474
論文で見る
スコープス (44)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ドナルドソンG.P.
ラディンスキー M.S.
ユー K.B.
サンダース J.G.
ユー・ビー・ビー
チョウ W.C.
コナー M.E.
アール A.M.
ナイト R．
ビョークマン P.J.
マズマニアン S.K.
腸内細菌叢は粘膜コロニー形成に免疫グロブリンAを利用する。
Science. 2018; 360: 795-800
https://doi.org/10.1126/science.aaq0926
論文で見る
スコープス (363)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ジェフリーズJr.
サシャ C.R.
ポラーラ J.
ハイムス J.
イェーガー F.H.
デニソン S.M.
マクガイア E.
クンツ E．
ユーダイリー J.A.
トラマ A.M.
他
大腸B細胞由来のHIV-1 gp120特異的モノクローナル抗体の機能と親和性成熟。
Mucosal Immunol. 2016; 9: 414-427
https://doi.org/10.1038/mi.2015.70
論文で見る
スコープス (13)
PubMed
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
DIピエロF.
コロンボ M.
S. salivarius K12の小児への投与は、SARS-CoV-2感染率を低下させる可能性がある。
Minerva Med. 2021; 112: 514-516
https://doi.org/10.23736/S0026-4806.21.07487-5
論文で見る
スコープス (6)
クロス
グーグル奨学生
ディ・ピエロ F.
イクタダー S.
ムムタズ S.U.
ベルトゥッチョーリ A.
レッキア M.
ゼルビナーティ N.
カーン A.
COVID-19入院患者におけるStreptococcus salivarius K12の臨床効果：予備的研究の結果。
微生物。2022; 101926
https://doi.org/10.3390/microorganisms10101926
論文で見る
Scopus (7)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ファインジルバー J.
リーガンJ.
コクセン K.
コリー・H.
ウォン C.
ローゼンタール A.
ウォーラル D．
ギゲル F．
ピエチョッカ・トローチャ A．
アティオ C.
他。
SARS-CoV-2ウイルス量は、疾患の重症度と死亡率の増加と関連している。
Nat. Commun. 2020; 115493
https://doi.org/10.1038/s41467-020-19057-5
論文で見る
スコープス (535)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
リウ・Y.
Yan L.M.
Wan L.
Xiang T.X.
Le A.
Liu J.M.
ピーリス M.
プーン・L.L.M.
Zhang W.
COVID-19の軽症例および重症例におけるウイルス動態。
Lancet Infect. Dis. 2020; 20: 656-657
https://doi.org/10.1016/S1473-3099(20)30232-2
論文で見る
スコパス(1153)
パブコメ
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
Yeoh Y.K.
ズオ T.
Lui G.C.
Zhang F.
Liu Q.
Li A.Y.
Chung A.C.
Cheung C.P.
Tso E.Y.
Fung K.S.
et al.
腸内細菌叢組成は、COVID-19患者における疾患の重症度と免疫応答の機能不全を反映している。
Gut. 2021; 70: 698-706
https://doi.org/10.1136/gutjnl-2020-323020
論文で見る
スコープス(648)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ズオ T.
張 F.
Lui G.C.Y.
Yeoh Y.K.
Li A.Y.L.
Zhan H.
ワン Y.
チョン A.C.K.
Cheung C.P.
チェン・N.
他。
COVID-19患者の入院期間中の腸内細菌叢の変化。
Gastroenterology. 2020; 159: 944-955.e8
https://doi.org/10.1053/j.gastro.2020.05.048
論文で見る
スコープス(904)
パブコメ
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
Gu S.
Chen Y.
Wu Z.
Chen Y.
Gao H.
Lv L.
Guo F.
Zhang X.
Luo R.
Huang C.
他。
COVID-19またはH1N1インフルエンザ患者における腸内細菌叢の変化。
Clin. Infect. Dis. 2020; 71: 2669-2678
https://doi.org/10.1093/cid/ciaa709
論文で見る
スコープス (457)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
Ma S.
Zhang F.
Zhou F.
Li H.
Ge W.
Gan R.
Nie H.
Li B.
Wang Y.
Wu M.
他。
メタゲノム解析により、COVID-19患者における口腔咽頭微生物叢の変化が明らかになった。
Signal Transduct. Target. Ther. 2021; 6191
https://doi.org/10.1038/s41392-021-00614-3
論文で見る
スコープス (70)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
スライマン I.
チョンM.
エンジェルL.
ツェイ J.J.
ウー・B.G.
ヨン S.T.
クロリコフスキー K.
リー Y．
デュアー R.
シュルーガーR.
他。
機械的人工呼吸を受けたCOVID-19患者の下気道における微生物シグネチャーと臨床転帰不良との関連。
Nat. Microbiol. 2021; 6: 1245-1258
https://doi.org/10.1038/s41564-021-00961-5
論文で見る
スコープス (63)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
デヴィ P.
クマリ P.
ヤダヴ A.
タライB.
ブディラジャ S.
シャミム U.
パンデイ R.
転写活性の高い上咽頭常在菌と日和見微生物の動態が、COVID 19ワクチン接種のブレークスルーにおける軽症症状を規定する。
PLoS Pathog. 2023; 19e1011160
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011160
記事で見る
Scopus (2)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
Cui G.Y.
ラオ B.C.
Zeng Z.H.
Wang X.M.
Ren T.
Wang H.Y.
Luo H.
Ren H.Y.
Liu C.
Ding S.Y.
et al.
COVID-19患者における1年追跡後の口腔および腸内マイクロバイオームと血漿メタボロミクスの特性化。
Mil. Mil. Med Res.
https://doi.org/10.1186/s40779-022-00387-y
論文で見る
スコープス(14)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ウン S.C.
Peng Y.
Zhang L.
モク C.K.
Zhao S.
Li A.
Ching J.Y.
Liu Y.
Yan S.
Chan D.L.S.
et al.
腸内細菌叢組成はSARS-CoV-2ワクチンの免疫原性および有害事象と関連している。
Gut. 2022; 71: 1106-1116
https://doi.org/10.1136/gutjnl-2021-326563
論文で見る
スコープス (57)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
上原修
安孫子由美子
安孫子洋一
森川敏
平木大輔
原田 F.
川野雄一郎
虎谷聡
松岡秀樹
パウデルD.
他。
COVID-19ワクチン接種後の健康な口腔環境の人の口腔マイクロバイオームの変化。
BMC Oral Health. 2022; 2250
https://doi.org/10.1186/s12903-022-02093-6
論文で見る
スコープス (12)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ウー P.C.
レオン P.K.
レオン K.W.
ユエン K.Y.
骨髄移植レシピエント由来の腸内細菌科細菌の16SリボソームRNA遺伝子配列決定による同定。
Mol. Pathol. 2000; 53: 211-215
https://doi.org/10.1136/mp.53.4.211
論文で見る
スコープス (61)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
マセラ A.P.
バートラムA.K.
トラスコフスキーJ.M.
ブラウン D.G.
Neufeld J.D.
PANDAseq：イルミナ配列のペアエンドアセンブラ。
BMC Bioinformatics. 2012; 1331
https://doi.org/10.1186/1471-2105-13-31
論文で見る
スコープス (1544)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
コール J.R.
ワンQ.
フィッシュJ.A.
チャイ B.
マクガレル D.M.
サン Y.
ブラウン C.T.
ポラス-アルファロA.
クスケ C.R.
Tiedje J.M.
リボソームデータベースプロジェクト：ハイスループットrRNA解析のためのデータとツール。
Nucleic Acids Res.
https://doi.org/10.1093/nar/gkt1244
論文で見る
スコープス (2919)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
王 Q.
ガリティG.M.
タイジェJ.M.
コール J.R.
新細菌分類法へのrRNA配列の迅速な割り当てのためのナイーブベイズ分類法。
Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73: 5261-5267
https://doi.org/10.1128/AEM.00062-07
論文で見る
日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
マクマーディ P.J.
ホームズ S.
微生物センサスデータのインタラクティブな解析とグラフィックスのためのRパッケージ。
PLoS One. 2013; 8e61217
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061217
論文で見る
日本学術振興会特別研究員
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
ヤリ・オクサネン F.G.B.
フレンドリーM.
キントR.
レジャンドル P.
マクグリン D.
ミンチン P.R.
オハラ R.B.
シンプソンG.L.
ソリモスP.
ヘンリー M．
他
ビーガン：コミュニティエコロジーパッケージ。
2020
https://CRAN.R-project.org/packahe=vegan
記事で見る
グーグル・スカラー
セガタ N.
イザードJ.
ウォルドロンL.
ゲヴァースD.
ミロポルスキーL.
ギャレット W.S.
ハッテンハワーC.
メタゲノミックバイオマーカーの発見と解説。
ゲノムバイオロジー 2011; 12R60
https://doi.org/10.1186/gb-2011-12-6-r60
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
セイヤーズ E.W.
ベックJ.
ボルトン E.E.
ブーレクシスD.
ブリスター J.R.
カネセ K．
コモー D.C.
ファンク K．
キム S．
クリムケ W．
他。
国立生物工学情報センターのデータベースリソース。
Nucleic Acids Res. 2021; 49: D10-D17
https://doi.org/10.1093/nar/gkaa892
論文で見る
スコープス (388)
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
エレンA.M.
モリソン H.G.
レスコー P.J.
ルヴェイヨーJ.
ヴィネイス J.H.
Sogin M.L.
最小エントロピー分解：高スループットマーカー遺伝子配列の高感度分割のための教師なしオリゴタイピング。
ISME J. 2015; 9: 968-979
https://doi.org/10.1038/ismej.2014.195
論文で見る
スコープス (370)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
クリントワースA.
プルエッセE.
シュヴァーT.
ペプリーズJ.
クアスト C.
ホーン M.
Glöckner F.O.
一般的な16SリボソームRNA遺伝子PCRプライマーの古典的および次世代シーケンサーに基づく多様性研究のための評価。
Nucleic Acids Res.
https://doi.org/10.1093/nar/gks808
論文で見る
日本農芸化学会
PubMed
クロス
グーグル奨学生
論文情報
出版履歴
出版 2023年11月8日
受理受理：2023年10月6日
改訂版受理 2023年7月11日
受理：2023年7月11日受理日：2022年9月28日
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.chom.2023.10.007

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図1BNT162b2ワクチン接種後1ヵ月間の経口抗体反応
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図2BNT162b2ワクチン接種後1ヵ月間の口腔微生物叢組成
図1BNT162b2ワクチン接種後1ヵ月間の口腔内細菌叢組成
図3中和抗RBD抗体は異なる常在菌を認識する
図3中和抗RBD抗体が常在菌を認識する
図4常在細菌による交差反応性抗RBD SARS-CoV-2反応の誘導
図サムネイルgr5
図5常在細菌によって誘発される交差反応性抗スパイク抗体によるSARS-CoV-2感染の阻害
図サムネイルgr6
図6ワクチン接種したヒトにおけるStreptococcus salivarius K12による交差反応性抗RBD SARS-CoV-2応答の誘導
図サムネイルgr7
図7ワクチン非接種者における常在菌を認識する交差反応性抗RBD IgA抗体
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ARTICLE| VOLUME 31, ISSUE 11, P1866-1881.E10, NOVEMBER 08, 2023
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論文|第31巻第11号、p1866-1881.e10、2023年11月08日

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分子模倣を介したSARS-CoV-2スパイクタンパク質と常在細菌に対する抗体応答の相互調節
マリーナ・ボンダレヴァ 23
リサ・ブジンスキー 23
パヴェル・デュレク 23
フィリップ・エンガルド
ミル＝ファルジン・マシュレギ 24, 25
アンドレイ・A・クルグロフ 24, 25, 26
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脚注を表示オープンアクセスDOI:https://doi.org/10.1016/j.chom.2023.10.007

ハイライト

SARS-CoV-2ワクチン接種により口腔内のS. salivariusが早期に増加する。

抗スパイクSARS-CoV-2抗体は分子模倣を介してS. salivariusに結合する

S.サリバリウスはマウスにおいて交差反応性抗スパイクAbsを誘導し、ウイルスクリアランスを助ける。

RRID:IMSR_JAX:000664
オリゴヌクレオチド
16SアンプリコンPCRフォワードプライマー 5'-TCgTCggCAg

CgTCAgATgTgTATAAgAgACAgCCTAC

gggNggCWgCAg-3' Klindworth et al.76 PMID: 22933715
16SアンプリコンPCRリバースプライマー 5'-gTCTCgTggg

CTCggAgATgTgTATAAgAgACAggACTACHVggg

5'- CTCCATATgAATTTACCAAgTCACCATACAAggg -'3 この論文 N/A
RSSL-01370リバースプライマー

5'- gTggTCgACATTCACTTTTTCAgTTgCTACC -'3 本論文 N/A
組み換えDNA
pET-21b 発現ベクター Addgene Cat. 番号 69741-3
pCG1-SARS-CoV-2-S Hoffmann et al.2 PMID: 32142651
ソフトウェアおよびアルゴリズム
MiSeq Reporter ソフトウェア Illumina www.illumina.com
PANDAseq 2.11 GitHub www.github.com
Graphpad Prism 9.3.1 Prism https://www.graphpad.com
FlowJo v10 株式会社ツリースター www.flowjo.com
Mascot MS/MS イオン検索 Matrix Science www.matrixscience.com
Biotools ソフトウェア Bruker Daltonik www.bruker.com
ZEN 2.0 Carl Zeiss AG N/A
その他
Easy Stool Extraction Device ALPCO Cat. 30-EZEX-100
Agilent Fragment Analyzer 5200 Roche Cat. 番号 M5310AA
イルミナ MySeq 2500 イルミナ www.illumina.com
Spectramax plus 384 Molecular devices Cat. 番号 5510-236-04
COY 嫌気チャンバー COY Lab 製品 www.coylab.com
BD Influx® BD バイオサイエンス www.bdbiosciences.com
FACSCanto II BD Biosciences www.bdbiosciences.com
MACS Quant 16 Miltenyi Biotec www.miltenyibiotec.com
マイクロアレイスキャナー Innoscan 710。イノプシス www.innopsys.com
Chemi Doc XRS+ イメージングシステム Bio-Rad Cat. 番号 1708265
Ultraflex II MALDI-ToF-ToF 質量分析計 Bruker Daltonik www.bruker.com
Cryotome MH560 サーモフィッシャーサイエンティフィック www.assets.thermofisher.com
LSM 880 Carl Zeiss AG N/A
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リソースの有無
連絡先
リソースおよび試薬に関する詳細情報およびリクエストは、リードコンタクトであるAndrey Kruglov (kruglov@drfz.de)までご連絡ください。
利用可能な材料
プラスミド、細胞株、抗体、本試験で作製された細菌株は、主担当者に要請すれば入手可能である。
実験モデルおよび研究参加者の詳細
ヒトドナー
BNT162b2ワクチン接種試験における健常人は、BNT162-01試験（ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04380701）において同意を得ており、インフォームドコンセントフォームは162-01の手順に従って保存されている。表S1に参加者の年齢と性別の割合の中央値を示す。この研究に参加した他の個人は、ベルリン・シャリテ大学病院の倫理委員会の承認（EA4/019/21、EA2/200/21、EA2/010/21、EA2/066/20、EA4/188/20、EA2/002/21）に従って書面によるインフォームド・コンセントを行い、ヘルシンキ宣言に準拠していた。表S3、S4、S6、S7は、参加者の年齢中央値、男女比、治療法を報告している。表S2は、ワクチン接種後の口腔微生物叢の解析に登録された関節リウマチ患者の特徴を、年齢、性比、および投薬の中央値とともに報告したものである。表S8は、呼吸器感染症に罹患した参加者の年齢、性比、治療法の中央値であり、COVID-19感染はSARS-CoV-2 RNAのそれぞれのPCR分析によって確認された。参加者は全員、インフォームド・コンセントを得た上で研究に参加した。
健常人へのプロバイオティクス菌の補充
健康なボランティアを募集した。組み入れ基準は、SARS-CoV-2に対するワクチン接種を全コース受けており、最後のワクチン接種から3ヵ月以上経過していること（図6）、またはワクチン未接種であること（図S15；表S7）であった。参加者には、Streptococcus salivarius K12（Novozin immun; Bluestone pharma）50mg（107CFU）が提供され、1日1回睡眠前に摂取された。対照群にはサプリメントは与えなかった。血清と唾液を採取し、プロバイオティクス摂取0日目と14日目に抗スパイク抗体価を分析した。抗ヌクレオカプシドIgG抗体価は、試験中のSARS-CoV-2への曝露を除外するため、試験開始0日目と14日目に測定された。
マウス
C57Bl/6遺伝的背景のヘミ接合体K18-hACE2 Tgマウス(B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J)をJackson Laboratoryから購入した(JAX #034860 , RRID:IMSR_JAX:034860)。野生型C57Bl/6マウスはPushchino Animal Breeding Facility (Branch of the Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences)から入手した。すべての動物は、ロシア科学アカデミー・エンゲルハルト分子生物学研究所・生理活性化合物研究所共同利用センターまたは精密ゲノム編集・生物医学遺伝子技術センターでSPF条件下で飼育された。すべての動物実験は、ロシアの動物保護規則に従って実施され、RAS生理活性化合物研究所（プロトコルNo.50、2020年8月10日）およびRASエンゲルハルト分子生物学研究所（プロトコルNo.2、2022年9月14日）の現地倫理審査委員会の承認を得た。
マウス免疫
増殖した細菌を回収し、PBSで3回洗浄後、65℃で1時間熱不活化した。熱不活化した細菌を最終OD600が1.0になるように再懸濁した。C57Bl/6マウス（8-12週、雄雌とも）に200μlの熱死菌をi.p.注射し、経口投与から生菌ストックを増殖させ、PBSで数回洗浄し、OD600を1に調整し、毎日200μlの生菌を経口投与した。未同定タンパク質RSSL-01370を免疫するために、大腸菌でリコンビナントタンパク質RSSL-01370を生産し、精製した（STAR Methodsの該当セクションを参照）。マウス（C57Bl/6系統、8-12週齢、雌）1匹あたり20μgをミョウバン1：1、v/v（Thermo Scientific、Cat.No.77161）との混合物として腹腔内に注射した。ブースト免疫は一次注射後14日目に行った。すべての動物処置は、ロシアの動物保護規則に従って行った。
マウスのワクチン接種と感染
全ウイルス不活化SARS-CoV-2ワクチン（CoviVac）は、プロトタイプB.1.1 SARS-CoV-2株（GISAID ID EPI_ISL_428851）からVero細胞で製造した46。K18-hACE2 Tgマウス（8～12週、雄雌とも）には、0日目と14日目にCoviVacワクチンを筋肉内接種するか、ミョウバンまたはミョウバンで乳化した細菌混合物を腹腔内接種した46。 .1 SARS-CoV-2を、CoviVacまたはミョウバン（Thermo Scientific、Cat.No.77161）による2回目のワクチン接種から1週間後に経鼻感染させた。動物は毎日臨床検査を受け、体重を測定した。感染7日目にマウスを犠牲にした。
細菌培養
PYG培地とプレートはDSMZ（ドイツ微生物・細胞培養コレクション）の記載に従って調製した。1mlのPYG培地に300,000イベントを選別し、直接COY嫌気チャンバーに移した。選別した細菌をPYG、BHI（Brain heart infusion broth、Sigma、Cat.No.53286-100G）、Fastidious寒天プレート（Thermo Fisher Scientific、Cat.No.12957138）にプレーティングし、細菌を24時間増殖させた。コロニーを摘出し、PYG培地、BHIブロス、Schaedler broth (Roth, Cat. No. 5772.1)にそれぞれのプレートのコロニーを接種した。翌日、DNAを単離し、残りの菌体を40％グリセロールLB培地中、液体窒素または-80℃で凍結した。
方法の詳細
綿棒および唾液サンプルの調製
全唾液を採取チューブに採取し、+4℃で15分間、2000gで遠心分離した。上清は-80℃で保存し、さらに分析を行った。唾液ペレットは綿棒サンプルと同様に16S rDNA配列決定に使用した。綿棒は、Quick-DNA™ Fecal/Soil Microbe Miniprep Kit（Zymo Research、Cat. No.）綿棒は診療所から-80℃で入手し、さらに使用するまで凍結保存した。綿棒スティックは、すでにバッファー中に保存されているか、Bead Bashing™バッファーが綿棒ブラシを覆うように加えられていた。最大750μLの緩衝液をBashingBead™ Lysis Tubeに移し、37℃で13,000rpmで厳密に混合した。キットのプロトコールに従い、13,000 x gで5分間遠心後、上清を採取し、Zymo-Spin™ III-F Filterでもう一度ろ過した。その後、DNAを含む溶液をGenomic Lysis Bufferで処理し、DNAを含む溶液をDNA結合Zymo-Spin™ IICR Columnにサンプル全量がロードされるまで繰り返しかけた。結合したDNAをDNA Pre-Wash Bufferとg-DNA Wash Bufferで洗浄した。洗浄したDNAを50μLのDNA Elution Bufferで溶出し、Zymo-Spin™ III-HRC Filterでろ過してさらに精製した。調製した各サンプル2.5 μLを、16S rRNA法のセクションで説明したIllumina Nextera NGSプロトコルのアンプリコンPCRに直接ロードした。
BNT162b2ワクチン接種者の便サンプル調製
参加者の新鮮な便サンプルは、製造元の指示に従ってALPCO Easy Stool Extraction Deviceを用いて採取し、処理前に-80℃で保存した。解凍した便懸濁液を70μmフィルター（Falcon、Cat.No.352350）および30μmフィルター（CellTrics®、Sysmex、Cat.No.04-0042-2316）でろ過し、4000×gで遠心分離して細菌細胞をペレット化した。細菌を含まない上清を0.22μmシリンジトップ（Filtropur, Sarstedt Cat. No.83.1826.001）フィルターでろ過し、さらに使用するまで-80℃で保存した。ペレットは、Safe Seal 2 mL 反応チューブ（Sarstedt, Cat. No.
細菌分離のための便サンプル調製
健常対照者から採取した新鮮な便サンプルは、48時間以内に処理する前に氷上または4℃で保存した。便はオートクレーブ滅菌濾過したPBS（自社製、Steritop® Millipore Express®PLUS 0.22 μm、Cat.No: 2GPT05RE）で100μg/mLの割合で重量に応じて希釈し、ボルテックスとスパチュラでホモジナイズした。その後、糞便溶液を70μmフィルター（Falcon、Cat.No.352350）および30μmフィルター（CellTrics®、Sysmex、Cat.No.04-0042-2316）でろ過し、4000×gで遠心分離して細菌細胞をペレット化した。この遠心ステップの上清をもう一度13,000 x gで遠心し、残存細胞をペレット化した。細胞を含まない上清を0.22μmシリンジトップ（Filtropur、Sarstedt Cat. No.83.1826.001）フィルターでろ過し、さらに使用するまで-80℃で保存した。両遠心ステップのペレットをプールし、10 mLのPBSに再懸濁し、600 nmで細胞密度を測定した。OD0.4の細胞量を1mLの40％グリセロールin LB培地混合液に入れ、Safe Seal 2mL反応チューブ（Sarstedt, Cat.No.72.695.500）に保存し、-80℃に移した。
16S rRNA遺伝子の配列決定と解析
16S rRNA遺伝子の塩基配列決定のために、バルク微生物叢サンプルおよび選別サンプルから直接V3/V4領域を増幅した（プライマー配列： 5'-TCgTCggCAgCgTCAgATgTgTATAAgAgACAgCCTACgggNggCWgCAg-3'および5'-gTCTCgTggCTCggAgATgTgTATAAgAgACAggACTACHVggTATCTAATCC-3'）を、イルミナMiSeqシステムの「16Sメタゲノミックシーケンシングライブラリーの調製」に記載されているように、長時間の初期加熱ステップで増幅した。アンプリコンの後、ゲノムDNAをAmPure XP Beads (Beckman Coulter Life Science Cat. No. A63881)により、サンプルとビーズの比率を1:1.25 (v/v)で除去した。次に、アンプリコンのサイズと純度を1.5 %アガロースゲルでチェックし、適切であればNextera XT Index Kit v2 Set C/D (Illumina, FC-131-2003)を用いてインデックスPCRを行った。インデックスPCRの後、サンプルはAmPure XP Beads（Beckman Coulter Life Science Cat. No. A63881）を用いて、サンプルとビーズを1：0.8（v/v）の割合で再度洗浄した。その後、サンプルをキャピラリーゲル電気泳動（Agilent Fragment Analyzer 5200）で分析し、NGS標準感度フラグメント分析キット（Agilent Cat.）すべての適切なサンプルから2 nMのプールを作成し、Illumina MySeq 2500システムにロードした。
MiSeq Reporter Softwareを用いて生データを処理し、多重化を解除した。フォワードリードとリバースリードを、PANDAseq 2.11を使用して最小25塩基のオーバーラップ68で結合し、Ribosomal Database Projectの "classifier.jar" 2.13を使用して信頼度カットオフ50%で分類した69,70。コピー数を調整したカウントを細菌属に集約し、最小サイズに希釈し、phyloSeq 1.34を使用してアルファ多様性を推定した71。
生配列データは、NCBI Sequence Read Archive (SRA)にアクセッション番号PRJNA738291で寄託された。
NCBIの16SリボソームRNA配列74との類似性に基づく原種のアノテーションと、最小エントロピー分解（MED）に基づく教師なしオリゴタイピングである。類似性に基づくアプローチでは、megablastを用いた基本的なローカルアライメント検索を行い、100のベストヒットを得た。異なるStreptococcus属の配列の類似度は100%に達するため、最小公倍数祖先分類とは対照的に、同一性が等しい場合のベストヒットの分類群を割り当てた。オリゴタイピングアプローチは、Needleman Wunschアルゴリズムを用いて、Streptococcus readsとStreptococcus vulneris reference (NCBI Reference Sequence:NR_179383.1)の300-764 Region間のペアワイズ配列アラインメントに基づいている。アラインメントされた配列は、ギャップを維持し、潜在的な挿入を除去してマルチプルアラインメントを作成した。最小エントロピー分解は、Erenらが記述したように、0.6以上の臨界エントロピーを使用してオリゴタイプを分割し、ギャップや潜在的な挿入を考慮しないように行った75。各オリゴタイプの基になる可能性のある生物種は、NCBIのnr/ntヌクレオチドコレクションと同様に、16S rRNA配列の基本的なローカルアラインメント検索によって決定した。オリゴタイプは、マルチプルアラインメントと対応する核酸塩基との最小エントロピーの位置によって注釈付けされた。位置1は、Streptococcus vulnerisリファレンスの位置300に対応する。
微生物叢の染色
解凍中のグリセロール毒性を軽減するため、凍結した微生物株をオートクレーブ滅菌濾過したPBS 1 mLで補充した。サンプルを13,000 xgで10分間2回遠心分離し、上清を除去してペレットをPBSに再懸濁し、最終的に10テストに分けた。微生物叢サンプルの染色はすべて、DNase含有バッファー（PBS/0.2 % BSA/25 μg/μL DNase、Sigma Aldrich Cat.No.10104159001）中で行った。ヒト免疫グロブリンの染色は、検出抗体：抗ヒトIgA1 Alexa Fluor 647（クローン：B3506B4、Southern Biotech Cat.No.9130-31）、抗ヒトIgA2 Alexa Fluor 488（クローン：A9604D2、Southern Biotech Cat.No.9140-30）を1：50（v/v）で100μLに調製した。サンプルを4℃で30分間インキュベートし、5μM Hoechst 33342溶液（Thermo Fischer Scientific Cat. No. Spike タンパク質と類似した構造を検出するために、まず、0.5 μg のウサギ SARS-CoV-2 Spike 中和抗体（クローン：HA14JL2302、Sino Biological Inc. No.40592-R001）または COVID-19 患者から単離した中和抗体を 4℃で 15 分間投与した後、PBS で洗浄し、抗ウサギ IgG Alexa647（7,5μg/ml, Jackson ImmunoResearch Cat. No. 111-606-144）または抗ヒトIgG PE/ Dazzle™ 594（2μg/ml；BioLegendのCat.No.: 366920）で再度染色した。Hoechst 33342染色後、サンプルをPBSで洗浄し、13,000 x gで5分間遠心した。上清を除去した後、サンプルをPBS/0.2 % BSAに再懸濁した。サンプルを5 mL丸底チューブ（Falcon、Cat.No.352063）に移し、取得した。
微生物叢フローサイトメトリー
微生物叢サンプルの細胞計測にはすべてBD Influx® セルソーターを使用した。装置のシースバッファー（PBS）はオートクレーブ滅菌し、各フルイディクス起動前に滅菌ろ過（Steritop® Millipore Express®PLUS 0.22μm、Cat.No: 2GPT05RE）した。各採取の品質は、Sphero™ Rainbow Particles（BD Biosciences Cat. No. 559123）によるレーザーのアライメント、レーザー遅延、レーザー強度によって保証された。ソーティングのために、Accudrop Beads (BD Biosciences Cat. No. 345249)を用いて事前に滴下遅延を決定した。サンプルは15,000イベント以下で取得し、10,000イベント以下でソートした。Hoechst 33342陽性イベントは常に30万件記録した。100,000イベントまでのシーケンスをProtein Low Bindチューブ（Eppendorf Cat. No 022431102）に直接ソートし、サンプルを17,000 x gでスピンダウンし、残留ソートバッファーをDEPC処理水（Invitrogen Cat. No.）サンプルは約10μLのまま、さらに処理するまで-20℃で保存した。その後の細菌の培養には、PYG培地に直接ソーティングし、細胞をCOY嫌気チャンバーに直接移した。
細菌コロニーからの配列決定
中和抗RBD抗体に結合した細菌種を同定するために、増殖した細菌200μlからDNAをエタノール沈殿で単離した。単離されたDNAはその後、16S rDNA特異的プライマーLPW57とLPW58で増幅された67。簡単に言うと、細菌のDNAはTaq-ポリメラーゼ（0.005 u/μl, Rapidozym GmbH, Cat. 12 mM MgCl2（Rapidozym GmbH）、1 X GenTherm buffer（Rapidozym GmbH）、0.25 mM dNTP mix（Thermo Scientific、Cat.No. R0192）、およびLPW57とLPW 58（1μM、TIB Molbiol）を用いて、サーモサイクラーで35回の増幅サイクルを行った。DNA産物をゲル電気泳動で確認し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Cat. No. 740609.50)で精製した。精製されたPCR産物の濃度は15μl中5ng/μlに調整され、Eurofins Genomics社によるサンガー配列決定に送られた。配列の同一性はNCBIが提供するNucleotide Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)を用いて決定した。
酵素結合免疫吸着アッセイ
血清、唾液および糞便上清中の抗体価を検出するため、96ウェルプレートにヤギ抗ヒトIg（H+L鎖）抗体（Southern Biotech社、Cat.No.2010-01）またはヤギ抗ヒトIgA Fab（Southern Biotech社、Cat.No.2050-01）をそれぞれコートし、IgGおよびIgAを検出した。1x PBSTで30秒間洗浄した後、プレートを200μLの5% PBS/BSAで室温で1時間ブロッキングした。次に、プレートを200μLの1x PBSTで30秒ずつ3回洗浄した。血清および糞便上清をPBSで希釈し、100μLをプレートに加えた。標準品をPBSで希釈し、プレートに添加した： IgA（Genway, Cat. No. E04696）およびIgG（Janssen Biotech Inc. その後、プレートを200μLの1x PBSTで5回洗浄し、検出抗体を適用した：抗ヒトIgG-AP（ICN/Cappel、Cat No.59289）、抗ヒトIgA-AP（Sigma、Cat.No.A2043）、37℃で1時間インキュベートした。その後、プレートを200μLの1x PBSTで5回洗浄した。 100μLのpNPP（Sigma、Cat.No.N2770）を各ウェルに添加した。反応は3M NaOH（Roth: Cat.No.6771.1）の添加により停止させた。光学濃度は Spectramax（Molecular devices）で測定した。
酵素結合免疫吸着法による抗Spike抗体反応の解析
SARS-CoV-2特異的抗体価を測定するために、96ウェルプレートに0,5μg/ml組換えSARS-CoV-2スパイクS1サブユニットHisタグタンパク質（R&D 10522-CV）または0,5μg/ml組換えSARS-CoV-2（2019-nCoV）スパイクタンパク質（RBD、Hisタグ、Sino biological、Cat. 40592-V08B-100）、または0,5μg/ml組換えSARS-CoV-2ヌクレオカプシドHisタンパク質、CF（RnD Systems；Cat.No.10474-CV）、または0.5μg/ml組換えSARS-CoV-2スパイクRBDタンパク質（flag-his）（Omicron/B.1 .1.529) (SanyouBio、Cat. #PNA055 )タンパク質、または0,5μ/mlのRBDペプチド(RBD480-496: CNGVEGFNCYFPLQSYG; Eurogentek、Cat. No: AS-65619)。50 S1特異的IgAを検出するため、ビオチン化抗ヒトIgA抗体（Southern Biotech、Cat. No. PBSTで5回洗浄した後、ストレプトアビジン-HRP（Invitrogen、Cat.No.88-7324-88）を添加し、室温で30分間インキュベートし、PBSTで5回洗浄した後、テトラメチルベンジジン（TMB）基質（Invitrogen、Cat.No.88-7324-88）を添加した。反応は、2N H2SO4（Sigma-Aldrich: Cat.No.84736）の添加により停止した。唾液中の抗S1 IgG検出のために、抗ヒトIgG-AP（ICN/Cappel、Cat No.59289）を適用し、プレートを室温で1時間インキュベートした。その後、プレートを200μLの1x PBSTで5回洗浄し、100μLのpNPP（Sigma、Cat.No.N2770）を各ウェルに添加した。反応は3M NaOH（Roth: Cat.No.6771.1）の添加により停止させた。光学濃度をSpectramax plus 384(Molecular devices)で測定した。さらに、OD 値を各サンプル希釈液に対してプロットし、曲線下面積（AUC）を Graphpad Prism 9.3.1 を用いて定量した。K12補充試験における抗体価の相対的上昇は以下のように計算した： AUC(d14)/AUC(d0)∗100.
スパイクタンパク質に対する抗体応答解析のためのフローサイトメトリーアッセイ
血清中の "Wuhan "Spike特異的免疫グロブリンを検出するために、HEK293T細胞に野生型変異型SARS-CoV-2 Spikeタンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトした。翌日、抗SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein S1抗体（クローン：CR3022、Abcam、Cat.No.ab273073）で30分間染色し、PBS/0.2 % BSAで1回細胞を洗浄した後、ヤギ抗ヒトIgG-Alexa-647（Southern Biotech、Cat.No.2014-31）で染色し、トランスフェクト細胞の割合を決定した。さらにトランスフェクトした細胞を回収し、血清とともに30分間インキュベートした後、PBS/BSAで2回洗浄し、Fixable Viability Dye eFluor 450（Invitrogen, Cat.No.50-112-8817）の存在下、ヤギ抗ヒトIgG Alexa647（Southern Biotech, Cat.No.2014-31）および抗ヒトIgA FITC（Sothern Biotech, Cat.No.2052-02）で染色した。細胞をPBS/0.2%BSAで洗浄し、直接測定するか、2%パラホルムアルデヒド溶液に4℃で20分間固定した。サンプルはFACSCanto II（BD Biosciences）またはMACS Quant 16（Miltenyi Biotec）で取得し、FlowJo v10（Tree Star Inc.）解析ソフトウェアを用いて解析した。それぞれの蛍光チャンネルにおいて、蛍光強度の幾何平均値（MFI）Spike 発現細胞と非発現細胞を定量し、IgGとIgAについてΔMFI=MFI（S+）-MFI（S-）を求めた。さらに、ΔMFI 値を各血清希釈液に対してプロットし、Graphpad Prism 9.3.1 を用いて AUC を定量した。
抗RBD抗体のエピトープマッピング
エピトープマッピングは、ペプチドマイクロアレイマルチウェルレプリトープSARS-CoV-2 Spike glycoprotein wild type + mutations (JPT Peptide Technologies GmbH; RT-MW-WCPV-S-V02)を用いて行った。マイクロアレイをモノクローナル抗RBD抗体（最終濃度1 mcg/ml）またはマウス糞便上清（1:1希釈）と共に30℃で1時間、絶え間なく回転させながらインキュベートした。スライドを0.05 % Tween-20入りTBS緩衝液で3回洗浄し、さらに抗ウサギAlexa647 (Jackson ImmunoResearch Cat. No. 111-606-144)、抗ヒトIgG-Alexa647 (Southern Biotech; Cat. No.: 2040-31)、ヤギ抗マウスIgA Antibody DyLight® 650 (Bethyl Laboratories; Cat.No.: A90-103D5)を加え、30℃で1時間インキュベートした。サンプルをTBS-Tと脱イオン水で洗浄し、遠心分離で乾燥させた。ペプチドマイクロアレイは、マイクロアレイスキャナーInnoscan 710（Innopsys）を用いて分析した。蛍光強度はImagePixを用いて定量した。
ACE2-RBD相互作用の阻害
96ウェルプレートに100ng/mlのヒトACE2タンパク質（Southern Biotech、Cat.No.2010-01）をコートした。1x PBSTで30秒間洗浄した後、プレートを200μLの5% PBS/BSAで室温で1時間ブロックした。次に、プレートを200μLの1x PBSTで30秒ずつ3回洗浄した。糞便上清と陽性コントロールとしてのCOVID血清をPBSで希釈し、100μLをプレートに加えた。その後、200μLの1x PBSTで5回洗浄し、100ng/mlのビオチン化RBD（Miltenyi Biotec; Cat No:130-127-457）を加え、37℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した後、ストレプトアビジン-HRP（Invitrogen、Cat.No.88-7324-88）を添加し、RTで30分間インキュベートし、PBSTで5回洗浄した後、テトラメチルベンジジン（TMB）基質（Invitrogen、Cat.No.88-7324-88）を添加した。反応は、2N H2SO4（Sigma-Aldrich: Cat.No.84736）の添加により停止した。光学濃度はSpectramax（Molecular devices）で測定した。阻害の割合は以下の値を用いて定量した：阻害率100%はブランクウェルのOD値に対応し、阻害率0%はビオチン化RBDのみを添加したウェルに対応する。
スパイクSARS-CoV-2偽型レンチウイルスの作製
1.2×106個の293T細胞を10mLの増殖培地中、10cmシャーレにプレーティングした。翌日、Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）を用いて、5μgのpCMV-dR8-2、6.67μgのpUCHR-IR-GFP、および3.33μgのSタンパク質コードプラスミドで、製造者の指示に従って細胞をトランスフェクトした。その後、トランスフェクションから48時間後に上清を回収し、0.45μmのフィルターでろ過した後、PEG-6000沈殿を用いて濃縮し、分注して-80℃で保存した。ACE2発現293T細胞でPVを滴定し、フローサイトメトリーで評価した。
レンチウイルスの阻害
ACE2発現293T細胞を、実験前日に96ウェルプレートに2×104個/ウェルでプレーティングした。血清サンプルを増殖培地で連続的に2倍希釈した。唾液サンプルを1：10に希釈し、S-偽型ウイルスと混合し、37℃で1時間インキュベートした。この混合液をAce2-293T細胞に加え、37℃で1日間インキュベートした。感染はフローサイトメトリーで判定した。
肺組織学
病理組織学的検査用の肺を10％中性緩衝ホルマリンで室温48時間固定し、PBSで洗浄後、OCT培地でスナップ凍結した。Cryotome MH560（Thermo Fisher）を用いて肺切片（7μm）を切り出し、抗NCP抗体（Thermo Scientific、Cat No.PA5-119601）で染色した後、二次抗ウサギIgG（Jackson ImmunoResearch、Cat No.111-606-144）で染色し、共焦点顕微鏡LSM880（Zeiss）を用いて観察した。顕微鏡写真はLSM880で10倍の倍率で取得し、ZEN2（Zeiss）ソフトウェアを用いて処理した。NCP-APC強度の評価には、APCチャンネルのイベントの合計をスライドの2乗（mm2）で割り、二次のみのコントロールで正規化した。各生物学的サンプルについて、3～5 枚の連続したスライドを分析した。
ハイブリドーマの作製
P3X63Ag8.653骨髄腫細胞は、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むRPMI-1640培地で増殖させた。免疫動物の脾臓細胞をP3X63Ag8.653と1:1の割合で混合し、RPMI-1640培地を用いて数回洗浄した。細胞を穏やかに再懸濁し、ポリエチレングリコール（Sigma-Aldrich: Cat.P7181）1mLを1分間、絶えず撹拌しながら添加し、続いてRPMI-1640培地2mLを2分間、RPMI-1640培地10mLを1分間添加した。細胞を洗浄し、20％ウシ胎児血清、1％ペニシリン、ストレプトマイシン、100μMヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、16μMチミジンを含むRPMI-1640培地に2×106 /mLの濃度で再懸濁し、96ウェルプレートに1ウェル当たり100μLずつ分散させた。14日間、毎日培地の半分を除去し、新しい培地を加えた。細胞融合後6-8日目に最初のコロニーが認められた。10日目に、コロニーのあるウェルの上清をELISAでIgG産生とRSSL-01370およびRBD-Fc-Tagに対する反応性を分析した。
タンパク質ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング
48時間培養した細菌をペレット化し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むRIPA緩衝液に再懸濁した（Roche、カタログ番号11 836 145 001）。サンプルを50%の電圧で10秒パルスを5サイクル超音波処理し、その後氷上で30秒静止させた。超音波処理後、ガラスビーズ（MP Biomedicals、Cat.No.6911100）を細菌抽出液の全量の1/3量添加した。サンプルを30秒間ボルテックスした後、氷上で30秒間冷却した（合計5サイクル）。溶解液を20,000 xgで10分間スピンダウンし、上清を回収した。ウェスタンブロット分析では、サンプルを還元条件下で12% SDS-PAGEにかけ、PVDFメンブレン（Bio-Rad、Cat. No.1620177）に転写した。SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD-His Recombinant Protein (Sino Biological, Cat. No. 40592-V08B-100) を陽性対照として用いた。メンブレンは、TBSTバッファー中の5％脱脂乳（Roth、Cat.No.68514-61-4）中で、室温で1時間、絶え間なく振盪しながらインキュベートすることによりブロックした。続いて、ウサギ中和抗 RBD 抗体 (Sino Biological, Cat. No. 40592-R001) またはヒト由来 RBD 中和抗体とブロッキング液中で、室温で 1 時間、絶え間なく振盪しながらハイブリダイズさせた。その後TBSTで洗浄し、抗ウサギIgG-HRP（Cell signaling, Cat.No.7074S）または抗ヒトIgG-HRP（Southern Biotech, Cat.No.2040-05）と共に室温で1時間、一定に振盪しながらインキュベートした。SuperSignal West Fempto Maximum Sensitivity (Thermo Fisher scientific, Cat No. 34095) 基質キットを使用した。シグナルはChemi Docイメージングシステム（Bio-Rad）を用いて取得した。
タンパク質の質量分析
1D-PAGE後のタンパク質バンドを切り出し、100mLの0.1M NH4HCO3 (pH 7.5)と50%アセトニトリルの混合液でゲル片が透明になるまで50℃で2回洗浄した。タンパク質のシステイン結合を50mM NH4HCO3中10mM DTTで56℃、30分間還元し、15mMヨードアセトアミドで暗所、RT、30分間アルキル化した。DTTを加えるステップを繰り返した。その後、ゲル片を100mclのアセトニトリルで脱水し、風乾し、50mMの炭酸水素アンモニウム中の12mg/mLのトリプシン（Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade, Promega）溶液10mclで37℃で15時間処理した。ペプチドを20 mclの0.5%トリフルオロ酢酸水溶液で30分間超音波抽出し、SpeedVac (Labconco) で乾燥させ、3% ACN, 0.1% TFAに再懸濁した。サンプルからのアリコート（2 mcl）を0.3 mclの2,5-ジヒドロキシ安息香酸（SigmaAldrich: Cat. No: 149357）溶液（30 mgを400 mclの30%アセトニトリル/0.5%トリフルオロ酢酸に溶解）とスチールターゲット上で混合し、液滴を室温で乾燥させた。質量スペクトルは、Ndレーザーを装備したUltraflex II MALDI-ToF-ToF質量分析計（Bruker Daltonik、ドイツ）で記録した。MH]+分子イオンはリフレクターモードで測定し、質量ピークの測定精度は0.007%であった。フラグメントイオンスペクトルは、ヘリウムをコリジョンガスとして用い、低エネルギー衝突誘起解離によりわずかに加速されたレーザー誘起解離により生成された。フラグメントイオンの質量ピークの測定精度は1Daであった。見つかったMS/MSフラグメントとタンパク質の対応付けは、Biotoolsソフトウェア（Bruker Daltonik、ドイツ）とMascot MS/MSイオン検索を用いて行った。
タンパク質の発現
RSSL-01370遺伝子は、Streptococcus salivarius K12のゲノムDNAから以下のプライマーを用いて増幅した：5'- CTCCATATGAATTTACCAAGTCACCATACAAGGG -'3 および 5'- GTGGTCGACATTCACTTTTTCAGTTGCTACC -'3 その後、NdeIおよびXhoI制限部位を含むpET-21b発現ベクターにクローニングし、Rosetta DE3（Sigma Aldrich, Cat. 70954-3）化学的にコンピテントな細胞でNdeIとXhoI制限部位を含むpET-21b発現ベクターにクローニングした。次に、選択したクローンの一晩培養を、100μg/mlのアンピシリンを含む2xTY増殖培地に接種し、30℃でOD600が0,8になるまで絶え間なく振盪しながら増殖させた。30℃で4時間、0.6 mMのIPTGでタンパク質発現を誘導した。細菌溶解液を調製し、上記のように分析した。
タンパク質の精製
Hisタグを含むRSSL-01370タンパク質をRosetta DE3 (Sigma Aldrich, Cat. No. 70954-3)細胞で発現させ、細菌細胞懸濁液を4500rpmで20分間遠心し、300mM塩化ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、10mMイミダゾール、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むCo2+平衡化/洗浄バッファー、pH7,4 (Roche, Cat. No. 11 836 145 001)に再懸濁した。サンプルを50％の電圧で20秒パルスを5サイクル超音波処理し、その後氷上で30秒静止させた。溶解液を20,000xgで10分間スピンダウンし、過剰発現タンパク質を含む上清を回収した。上清をHisPur™ Cobalt resin（Thermo Scientific社製）にロードし、メーカーの説明書に従って精製した（Thermo Scientific社製、カタログ番号89964）。簡単に説明すると、タンパク質溶解液をロードした後、カラムを10mMのイミダゾール洗浄バッファーで洗浄し、150mMのイミダゾール溶出バッファーで未同定タンパク質RSSL-01370を溶出した。次に、300mM塩化ナトリウムと50mMリン酸ナトリウム（pH7,5）を含むバッファーに対して一晩透析を行い、タンパク質をさらに応用した。
定量と統計解析
2群間の統計的評価には、Mann-Whitney検定または非対検定が用いられた。独立変数を含む複数群間の統計的評価には、ダンの多重比較によるフリードマン検定を用いた。NCP タンパク質強度の評価には、蛍光チャンネルのイベント総和をスライド（mm2）の2乗で割り、連続するスライドを2次抗体のみで染色して得られた強度に対して正規化した。各生物学的サンプルについて、3-5枚の連続したスライドを分析した。介入前後の同一個体におけるデータの解析には、Wilcoxon matched-pairs signed rank testを用いた。相関を評価するために、Spearman相関を定量した。統計解析はGraphPad Prism 9.3.1を用いて行った。P値が0.05未満は統計的に有意とみなされた。
その他のリソース
ヒト参加者は、BNT162-01試験（ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04380701）およびベルリン・シャリテ大学病院の倫理委員会によって承認された試験（EA4/019/21、EA2/200/21、EA2/010/21、EA2/066/20、EA4/188/20、EA2/002/21）に従って登録され、ヘルシンキ宣言に従って実施された。
データとコードの利用可能性

微生物叢16SシーケンスデータはNCBI Sequence Read Archive (SRA)に寄託されており、出版日までに一般公開される予定である。アクセッション番号は主要リソース表に記載。ウェスタンブロットのオリジナル画像は原稿に含まれている。DOIはkey resources tableに記載されている。本論文で報告された顕微鏡データは、要求があれば主担当者が共有する。

本研究中にオリジナルのコードは生成されていない。

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RELX of antibody responses against the SARS-CoV-2 Spike protein and commensal microbiota via molecular mimicry

Open AccessDOI:https://doi.org/10.1016/j.chom.2023.10.007

Highlights

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1. SARS-CoV-2 vaccination induces an early increase in S. salivarius in the oral cavity
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1. Anti-Spike-SARS-CoV-2 antibodies bind to S. salivarius via molecular mimicry
•
1. S. salivarius induces cross-reactive anti-Spike Abs in mice, aiding virus clearance
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1. S. salivarius boosts salivary anti-Spike antibodies in the vaccinees

Summary

The commensal microflora provides a repertoire of antigens that illicit mucosal antibodies. In some cases, these antibodies can cross-react with host proteins, inducing autoimmunity, or with other microbial antigens. We demonstrate that the oral microbiota can induce salivary anti-SARS-CoV-2 Spike IgG antibodies via molecular mimicry. Anti-Spike IgG antibodies in the saliva correlated with enhanced abundance of Streptococcus salivarius 1 month after anti-SARS-CoV-2 vaccination. Several human commensal bacteria, including S. salivarius, were recognized by SARS-CoV-2-neutralizing monoclonal antibodies and induced cross-reactive anti-Spike antibodies in mice, facilitating SARS-CoV-2 clearance. A specific S. salivarius protein, RSSL-01370, contains regions with homology to the Spike receptor-binding domain, and immunization of mice with RSSL-01370 elicited anti-Spike IgG antibodies in the serum. Additionally, oral S. salivarius supplementation enhanced salivary anti-Spike antibodies in vaccinated individuals. Altogether, these data show that distinct species of the human microbiota can express molecular mimics of SARS-CoV-2 Spike protein, potentially enhancing protective immunity.

Graphical abstract

Keywords

Introduction

SARS-CoV-2 infects cells via the interaction of the Spike (S) protein with the angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) receptor, which is expressed by various cell types.
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The S protein of SARS-CoV-2 contains a receptor-binding domain (RBD) that mediates its interaction with ACE2 and promotes viral entry.
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Blocking of this crucial interaction by monoclonal anti-SARS-CoV-2-RBD antibodies (Abs) confers protection of the host against infection of target cells.
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Systemic Abs in the blood (mainly IgG, IgM, and IgA1) curtail virus propagation after infection of the host, whereas the presence of antigen-specific Abs at the mucosal surfaces (IgA2, IgA1, and IgM) is required to prevent initial infection of the host.
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Although systemic vaccination with a mRNA vaccine encoding the S protein of SARS-CoV-2 is known to induce anti-S Abs in the nasopharyngeal fluid, these Abs are not maintained for a long time,
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and the mechanisms ensuring the maintenance of salivary anti-SARS-CoV-2 Ab responses are poorly understood.
Secretion of Abs at mucosal surfaces can be enhanced by antigens presented by the mucosal microbiota.
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It is estimated that the human microbiota contains several millions of genes,
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thus potentially providing a plethora of epitopes for Ab binding.
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Some of these epitopes may resemble host proteins, potentially inducing cross-reactive autoimmunity,
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whereas others may mimic proteins from different microorganisms and provide cross-protective immunity.
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Microbiota-induced immunity is known to provide protection against microbial infections by Citrobacter rodentium, Clostridiodes difficile, Pseudomonas aeruginosa
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and by viruses such as influenza.
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Protection is mediated by increasing the fitness of the innate immune system via tonic type I interferon (IFN) production
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and by cross-reactive Ab responses.
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Interestingly, cross-reactive Abs targeting glycoprotein (gp)41 of HIV-1 are induced by distinct commensal microbiota.
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Furthermore, such microbiota-induced gp41 reactive B cells diverted the Ab response generated by vaccination using envelope (Env) glycoprotein to non-neutralizing epitopes on HIV-1 Env.
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Several studies have reported the presence of SARS-CoV-2-RBD Abs in unexposed healthy individuals.
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Induction of such Abs in previous infections with common cold coronaviruses has been postulated, but this link has not been formally proven. The original antigens inducing cross-reactive RBD secretory IgA Abs have remained obscure. Here, we show that neutralizing anti-RBD Abs recognize distinct commensal strains in the human microbiota. Vaccination-induced salivary Abs promoted the expansion of these commensals, and supplementation of vaccinated individuals with one such strain increased the concentrations of anti-SARS-CoV-2 IgG in the oral cavity. Altogether, our data demonstrate a cross-regulation of salivary anti-S Ab responses and distinct bacteria of the nasopharyngeal microbiota.

Results

Oral microbiota changes during vaccination are associated with the induction of salivary Ab responses

Abs that are found at the mucosal surfaces are actively transported from the body through the layer of epithelial cells (ECs). For this transport from the basolateral to the apical side of ECs lining the mucosal tract, ECs express specific receptors, such as the neonatal Fc receptor (FcRn) and the polymeric immunoglobulin receptor (pIgR).
31
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The pIgR mediates the transport of IgA and is ubiquitously expressed by ECs of the oral and gastrointestinal tract. FcRn mediates the transport of IgG, and in adult humans, it is expressed only by EC of the oral cavity.
31
Accordingly, saliva of healthy individuals contains both IgG and IgA, whereas the luminal content, i.e., feces, of the gut contains IgA but not IgG (Figures 1A–1C). We recruited 19 healthy participants to study the microbiota-Ab interaction during the first month after vaccination. Among them, only one of the participants exhibited anti-nucleocapsid (NCP) IgG in the serum (Figure S1A), whereas the others lacked such Abs, indicating their naive status with regard to SARS-CoV-2 exposure. Next, we quantified the amount of anti-S1 of S IgG and IgA in the oral cavity during the first month after the primary vaccination against SARS-CoV-2 (Figures 1D and 1E). For 19 healthy participants vaccinated with BNT162b2 (Table S1 for detailed information), high amounts of anti-S1 IgG Abs (in 10 of the 19 participants) were detectable in the saliva at day 21, whereas the other 9 showed only low anti-S1 IgG titers. The Ab response further increased in all participants until day 28, 7 days after administration of the second dose of the vaccine (Figure 1D). That was in line with the induction of serum anti-SARS-CoV-2 S IgG (Figure 1F). No significant induction of anti-S1 or anti-S3 IgA at the mucosal surfaces was observed, although anti-S1 IgA was present in the serum (Figures 1E, 1F, and S1B). Thus, in agreement with a previous report,
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vaccination with BNT162b2 induced anti-S IgG Abs in the oral cavity, starting from day 21 after the initial vaccine dose.

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Since vaccination induced the secretion of anti-S Abs into the oral cavity, we next evaluated whether the profile of bacterial coating with salivary Abs changes during vaccination. We observed high coating of oral microbiota by secreted IgA and IgG Abs (Figure 1G). Noteworthy, most of the bacteria were bound by both IgA and IgG Abs (Figures 1G and 1H). Further analysis at various time points after vaccination revealed increased frequencies of IgG+IgA+ bacteria in the saliva at day 21 after vaccination, the time point when significant anti-S Ab responses had developed (Figure 1D). To analyze the impact of vaccination-induced anti-S IgG Abs on the bacterial composition, we compared salivary microbiota before and after vaccination in 19 individuals. The overall diversity (Chao1, Simpson, and Shannon indexes) of the oral microbiota did not change following vaccination (Figures 2A–2C). However, the composition of microbiota at day 0 and day 28 after primary dose clustered separately, as revealed by principal-component analysis (PCA) (Figure 2D). Since the salivary microbiota is characterized by not only high inter-individual variability but also high intra-individual stability,
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we checked whether the observed differences were due to the regular fluctuation of microbiota by following oral microbiota composition after vaccination (Figure S2). Changes in the composition of salivary microbiota were observed starting from day 21 after primary vaccination, correlating with the induction of salivary anti-S Ab responses (Figures 1D and S1B), but not before, further suggesting that compositional changes of the oral microbiota can be influenced by anti-S Abs. Subsequent comparison of oral microbiota composition by linear discriminant analyses (LDAs) combined with effect size measurements (LEfSe) at day 0 and day 28 showed that Streptococcaceae and Enterococcaceae families were enriched in the oral microbiota at day 28, whereas Micrococcaceae and Fusobacteriaceae family members were reduced, respectively (Figure S2A). At the genus level, LEfSe analysis revealed that at day 28, Turicella, Nesterenkonia, Escherichia/Shigella, Pillibacter, Lachnoanaerobaculum, Selemonas, and Streptococcus were enriched at day 28, whereas Rothia, Fusobacterium, Morococcus, and Cetobacterium were found to be diminished at day 28 (Figure 2E). When following relative abundances of bacterial genera identified by LEfSe over time after vaccination, we observed an increase of Selemonas (in 16 of the 19 participants), Pillibacter (in 14 of the 19), and Streptococcus (in 14 of the 19: from 8.8% ± 3.0% at day 0 till 12.1% ± 5.3% at day 28) (Figure 2F). A reduction in Fusobacterium (in 14 of the 19) occurred only on day 28 after primary vaccination (Figure 2G). Changes in Rothia and Escherichia/Shigella genera were not statistically significant (Figures S2B and S2C). In view of the high LDA score of Streptococci (Figure 2E), further classification of Streptococcus genera showed that frequencies of Streptococcus salivarius, but not Streptococcus australius, were significantly increased in the oral cavity at day 28 after vaccination, in 14 of the 19 participants (means of S. salivarius at days 0 and day 28 were 0.8% ± 0.4% and 1.8% ± 1.5%) (Figure 2H). To further verify the increase of S. salivarius, we have defined Streptococci species during vaccination by minimal entropy decomposition approach.
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Only oligotypes corresponding to S. salivarius were increased during the vaccination course (Figure S3), further suggesting that vaccination correlates with the S. salivarius abundance in the oral cavity. Next, we performed correlation analysis of S. salivarius abundance with anti-S Ab levels. Although no correlation was observed between S. salivarius and virus-neutralizing capacity neither at day 0 nor day 28 (Figures S4A and S4B), levels of this bacteria correlated with the levels of both anti-S1 IgG and anti-S1 IgA (Figures S4C–S4F), suggesting that both neutralizing and non-neutralizing anti-S Abs may have an impact on the enhanced presence of S. salivarius.

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To further address whether such changes might be attributed to the temporal changes in the microbiota, we have analyzed publicly available datasets evaluating the salivary bacterial composition during 1 month.
38
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39
We did not observe any differences in Streptococcus abundance in those studies, further indicating that such changes are associated with vaccination (Figure S5A). We have previously reported that rheumatoid arthritis (RA) patients do not develop salivary anti-S Abs during the first month after immunization.
40
Thus, we next analyzed the salivary microbiota in RA patients during vaccination (Figure S5B). Consistent with the lack of salivary anti-S Abs, Streptococcus abundance in RA patients did not change during the first 28 days after vaccination (Figure S5B; Table S2). Finally, the S. salivarius abundance was similar between healthy individuals at day 28 and subjects from an independent cohort recruited several months after vaccination, suggesting a temporal effect on the S. salivarius increase during vaccination (Figure S5C; Table S3). Of note, such temporal oral microbiota fluctuations were not associated with any clinically relevant observations in the participants, despite some reported cases of diarrhea associated with vaccination.
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Altogether, these data further support a link between oral anti-S Abs and changes in the microbiota composition.
Participants differed in their salivary anti-S1 IgG levels at day 21 after vaccination (Figure 1D), and their salivary Ab response correlated with serum anti-S levels (Figure S6A). We therefore divided them into “high” (anti-S1 IgG: 60.5% ± 55%) and “low” (anti-S1 IgG: 9.0% ± 5.1%) responders in terms of anti-S IgG titers and compared their oral bacterial composition (Figures S6B–S6E). LEfSe analysis between these two subgroups revealed decreased Olsenella and Peptostreptococcaceae_insertae_sedis and enhanced abundances of Solobacterium and Pseudomonas in low responders (Figures S6C and S6E). None of these bacterial genera, except Solobacterium, were significantly affected during the course of vaccination (Figure S6D). This finding indicates that the observed increase in Streptococci during vaccination was not primarily influenced by the levels of salivary anti-S IgG responses but rather associated with the generation and secretion of such Abs.
Since the intestine is an organ densely populated with commensal microbiota,
9
we next analyzed whether vaccination also impacted the fecal microbiota composition throughout the first month after vaccination. We neither observed any significant induction of anti-S-SARS-CoV-2 IgA responses during the 28 days after primary vaccination (Figure S7A), nor changes in microbial diversity (Chao1, Simpson, and Shannon indexes) (Figure S7B; data not shown). Subsequent LEfSe analysis revealed that three bacterial families, Leptotrichiaceae, Xanthomonodaceae, and Succinivibrionaceae, and 5 respective genera, Sneathia, Anaerotruncus, Herbaspirillum, Succinivibrio, and Stenotrophomonas, were changed in the fecal microbiota between days 0 and 28 after the primary vaccine dose (Figures S7C–S7G). Notably, these bacterial families represent minor (relative abundance less than 0.1%) members of the microbial community of the gut. Thus, vaccination did not detectably affect fecal microbiota composition in the time window studied here. Altogether, the oral, but not fecal, microbiota composition exhibited distinct changes during the first month after the application of the initial dose of the vaccine that was associated with the secretion of anti-S-SARS-CoV-2 IgG Abs into the saliva.

Anti-S Abs recognize various microbial species via molecular mimicry

The temporal microbiota composition in the oral cavity is relatively stable, but it still exhibits some degree of fluctuation over time.
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Given that changes in the composition of salivary microbiota upon vaccination did correlate in time with the induction of anti-S-SARS-CoV-2 Abs, we hypothesized that S specific Abs might bind to distinct commensal bacteria and influence their abundance. To test this hypothesis, we stained the fecal microbiota of healthy, non-vaccinated individuals (Table S4 for detailed information) with neutralizing Abs specific for the RBD of the S protein of SARS-CoV-2 (Figures 3A–3C) that were either generated by immunizing rabbits or were cloned from hospitalized COVID-19 patients.
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The rabbit Ab and 13 of the 15 human monoclonal neutralizing Abs tested bound to distinct commensal bacteria. The two monoclonal Abs without binding activity were used as isotype controls heavy kappa (HK) CV07-287 and heavy lambda (HL) (CV07-250; Figure 3C). Co-staining of microbiota with rabbit and human monoclonal Abs revealed that different Abs specific for RBD may recognize similar bacteria (Figure S8A), indicating that the bound bacteria may express surface antigens mimicking the RBD of SARS-CoV-2.

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To identify the bacterial genera bound by the anti-RBD Abs, we isolated those bacteria by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and determined their 16S ribosomal DNA (rDNA) genotype (Figure 3D). Bacteria that had been labeled by the secondary Abs (anti-human IgG and anti-rabbit IgG) were excluded from the analysis (File S1). We could identify several bacterial genera recognized by one or more of the anti-RBD Abs (Figure 3E; File S1). The monoclonal human anti-RBD Abs showed specific reactivity toward Streptococcus, Escherichia, Bifidobacteria, and others (Figure 3E). Genera identified differed among various donors (Figure 3E), highlighting the inter-individual diversity of the microbiota and showing that the anti-RBD Abs tested could bind to several distinct bacterial genera. The binding of the anti-RBD IgG Abs to the microbiota was distinct, as far as it differed from that of the secondary anti-IgG Abs used (File S1), and from the binding pattern of a non-autoreactive, non-RBD specific human HK mGO53 IgG Ab
43
(Figure S8B; File S1). In addition to that, 3 S (non-S1) binding, non-neutralizing Abs (HL CV03-163, HL CV03-177, and HL CV05-115) were analyzed for their reactivity to the microbiota. Only HL CV03-177 showed binding to the microbiota (Figures S9A and S9B). Further 16S sequencing revealed the distinct, non-overlapping pattern of bacteria identified by neutralizing, RBD-specific Abs (File S1). To further analyze the non-specific binding of Abs, we have selected clonally related anti-RBD Abs that differed only by one amino acid in their heavy-chain complementarity-determining region 3 (CDRH3) region (Figure S10A) and analyzed their binding to the microbiota. Single amino acid substitution of CDRH3 affected the binding to microbiota, further arguing for specific recognition of at least cloned bacterial strains (Figure S10B). We concluded that neutralizing anti-RBD Abs can bind to distinct bacterial species of the microbiome.
To identify the bacterial molecular mimics recognized by the anti-RBD Abs, we isolated bacteria binding to such Abs from the fecal microbiota of eight healthy donors by FACS and cultivated them in selective bacterial media under anaerobic culture conditions. Individual bacterial colonies were identified according to their 16S rDNA sequences (Figures 3D and 3F). Consistently with 16S sequencing data (Figure 3E; File S1), two Bacilli species, three Streptococcus species, two Bifidobacterium species, two Enterococcus species, as well as Veillonella parvula and Acidaminococcus intestinalis were identified (Figure 3F). Staining of cultured bacteria confirmed their recognition by anti-RBD Abs (Figures S11A and S11B). Interestingly, S. salivarius that was found to be increased in the oral cavity of vaccinated humans was recognized by three of the monoclonal Abs tested and the rabbit anti-RBD Abs (Figures 3F and S10C). A probiotic strain of S. salivarius K12 (Bactoblis), was also recognized by the rabbit anti-RBD Abs (Figure S11A). Of note, some bacterial cultures showed only partial staining with anti-RBD Abs, probably reflecting the heterogeneity of bacteria during growth or community-dependent variability in gene expression (Figure S11).

Induction of cross-reactive anti-S Abs by commensal microbiota strains

Having identified distinct bacterial mimics of RBD, we next investigated whether the bacteria expressing these proteins could induce a cross-reactive anti-RBD Ab response in vivo. We focused on S. salivarius and B. pseudocatenulatum, taking into account that S. salivarius is increased in humans after the first month upon vaccination (Figure 2H) and on B. pseudocatenulatum abundance which inversely correlates with the development of the post-COVID-19 acute syndrome.
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Considering that these bacteria can be normal constituents of the microbiota, we fed C57BL/6 mice by oral gavage with S. salivarius K12 or B. pseudocatenulatum to test whether a cross-reactive IgA response would be induced. Within 21 days, fecal IgA reactive to RBD was detectable in mice fed with both S. salivarius K12 and B. pseudocatenulatum (Figure 4A). Fecal supernatants also inhibited binding of RBD to ACE2, indicating that those RBD Abs had neutralizing capacity (Figure 4B).

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We next mapped the epitopes of the S SARS-CoV-2 protein, recognized by the IgA Abs that were induced by oral supplementation of mice with the bacteria. Of the 564 peptides representing the S protein of SARS-CoV-2, IgA induced by both B. pseudocatenulatum and S. salivarius K12 recognized the peptide sequence GFNCYFPLQSYGFQPTNGV (Figures 4C and S12A). Indeed, the peptide recognition motifs of rabbit anti-RBD and human HL CV07-200 anti-RBD Abs included this sequence in their receptor-binding motif (RBM) epitope (Figures S12B–S12D). This peptide corresponds to the RBM of RBD, in line with the ACE2-RBD inhibition data (Figure 4B), and has homology to reference standard sequence library (RSSL)-01370 of S. salivarius K12 (Figures S12E–S12G). These data show that oral supplementation of mice with S. salivarius K12 and B. pseudocatenulatum can induce Abs cross-reactive to the RBM of the S protein of SARS-CoV-2 in mice in vivo.
Western blot analysis of bacterial lysates revealed that rabbit anti-RBD Abs and the human anti-RBD IgG Ab HL CV07-200 recognize discrete proteins of S. salivarius and B. pseudocatenulatum (Figures 4D and S13A–S13C). We identified the S. salivarius protein by mass-spectrometry as the uncharacterized protein RSSL-01370, putative dextransucrase (Table S5).
45
We confirmed the binding of RSSL-01370 from S. salivarius K12 to anti-RBD Abs, by cloning the encoding gene in E. coli and detecting this recombinant protein with the anti-RBD Abs (Figure 4E). Taken together, these data demonstrate that distinct commensal microbiota expresses proteins that selectively mimic RBD and that are recognized by neutralizing anti-RBD Abs.
To further show that RSSL-01370 can induce anti-RBD Abs, mice were immunized with purified RSSL-01370. Consistently, RSSL-01370 immunization induced anti-RBD and anti-S1 IgG Abs in the serum, indicating that this bacterial protein can induce cross-reactive Abs against the S of SARS-CoV-2 (Figure 5A). Further cloning of Abs from RSSL-01370 immunized mice revealed the presence of Abs that neutralize S-pseudotyped lentivirus entry into ACE2-expressing 293 T cells, albeit at higher concentrations than Abs isolated from COVID-19 patients (Figures 5B and S14). Thus, RSSL-01370 protein from S. salivarius can induce neutralizing anti-S Abs.

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To further test the in vivo relevance of bacteria-induced Ab responses on viral clearance, we immunized C57BL/6 mice either with S. salivarius K12 alone or in combination with B. pseudocatenulatum and B. longum. We noted that mice vaccinated with the bacterial mixture showed a higher capability to inhibit infection of ACE2-293 T cells with S-pseudotyped virus (Figure 5C). Thus, we next immunized K18-hACE2 Tg mice with the bacterial mixture and infected them with 104 tissue-culture infectious dose (TCID) B1.1 SARS-CoV-2 intranasally 3 weeks later. Mice immunized with whole-virion inactivated SARS-CoV-2 (CoviVac) emulsified in alum were used as control.
46
Although bacteria-treated mice did not show any significant amelioration of overall disease (Figure 5D), virus clearance from the lungs was accelerated (Figures 5E and 5F), suggesting that cross-reactive Abs contribute to the viral clearance in vivo. Finally, mice immunized with CoviVac also produced IgG Abs reacting to S. salivarius (Figure 5G), further highlighting the cross-reactivity between anti-viral immune responses and certain bacterial strains.
We next analyzed whether oral supplementation of humans with the probiotic S. salivarius K12 affects the nasopharyngeal S-specific Ab levels in vaccinated individuals. To this end, fully vaccinated individuals who had their last vaccination at least 3 months prior to enrollment in this study were supplemented orally with 107 colony-forming unit (CFU) of S. salivarius K12 daily for 2 weeks (Table S6 for detailed information on the cohort). Their salivary and serum anti-S Ab levels were compared before supplementation and 2 weeks later. Within 2 weeks, S. salivarius K12 supplementation induced a significant increase in anti-S1 IgG responses in the saliva of 13 of the 19 probands (day 0: 8.5 ± 12.1 vs. day 14: 28.5 ± 48.8), an increase that was not observed in the control group (Figure 6A). Importantly, we also observed increased reactivity toward the RBD of the Omicron/B1.1.529 variant of SARS-CoV-2 (day 0: 2.8 ± 5.8 vs. day 14: 6.7 ± 8.5) (Figure 6B). Consistent with the homology between RSSL-01370 and the RBM480–496 peptide (Figure S12E), S. salivarius K12 supplementation also increased titers of salivary IgG Abs against RBM480–496 (day 0: 9.0 ± 10.37 vs. day 14: 17.6 ± 18.4) (Figure 6C). Eight of the 19 K12-treated participants also exhibited an increase in salivary S1-specific IgA (day 0: 17.6 ± 13.2 vs. day 14: 26.4 ± 23.2), but the difference did not reach statistical significance (Figure 6A). Serum anti-S IgG and IgA titers were also not significantly affected by K12 supplementation (Figure 6D). These data indicate that oral supplementation with S. salivarius K12 can stabilize and increase the concentration of S-specific IgG Abs in the oral cavity of BNT162b2 vaccinated humans within 2 weeks.

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Since S. salivarius is a commensal bacterium that colonizes the oral cavity and may induce local IgA responses there by itself, we next assessed the relation of cross-reactive RBD-specific IgA Abs and the age in the saliva of healthy individuals before vaccination (Table S1; participants at day 0 of vaccination study) and found that the magnitude of the S1-binding IgA responses in the saliva negatively correlated with the age of the donors (Figure 7A). We then addressed whether salivary IgA Abs cross-reacting to RBD would also recognize S. salivarius in unvaccinated individuals (Table S7). For this, S. salivarius, B. pseudocatenulatum, and B. subtilis were incubated with saliva from unexposed, unvaccinated humans who exhibited RBD-reactive IgA (healthy controls [HC]-RBD-IgA). We found that the saliva from HC-RBD-IgA positive, but not from negative, individuals contained IgA2 recognizing S. salivarius and B. pseudocatenulatum (Figure 7B). These data show that RBD-reactive IgA2 can be induced by these bacteria in unexposed, unvaccinated individuals.

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To address whether RBD-reactive IgA can be modulated in unvaccinated humans, we supplemented unvaccinated humans with probiotic S. salivarius K12 (Figures S15A–S15D). In this setting, 2 weeks of supplementation did not induce any significant anti-S1 IgA salivary Ab responses. In addition, anti-S1 IgG was not detected in these participants, consistent with their vaccination status (Figure S15A; data not shown). Further analysis of the oral microbiota composition showed that S. salivarius K12 reduced the abundance of Actinomyces and Selemonas genera when compared with individuals of an untreated group (Figures S15A–S15D). Thus, S. salivarius K12 supplementation affected the levels of anti-S IgG only in vaccinated individuals (Figure 6).

Discussion

The microbiota composition influences the efficiency of vaccination via innate sensing of microbiota by pattern recognition receptors, modulation of antigen presentation by antigen-presenting cells, immunomodulatory effects of bacterial metabolites, and cross-reactive T and B cell responses.
47
In particular, the nasopharyngeal microbiota may contribute to the protection of the host from infection with pathogenic airborne viruses, here SARS-CoV-2, via modulating the ACE2 receptor expression,
48
induction of tonic type I IFN responses,
49
and via tuning of systemic and mucosal transforming growth factor (TGF)-β1 levels, with TGF-β1 controlling Ab class switch recombination to IgA1 and IgA2.
50
,
51
It is also evident that bacteria of the microbiota provide a vast repertoire of potential molecular mimics for the mucosal immune system, which may provide cross-reactive, pre-existing mucosal immunity against pathogens. Thus, commensal bacteria may contribute to the highly variable susceptibility of humans toward infection with the pathogen. Here, we show that, on one hand, BNT162b2 vaccination supports the persistence of the commensal S. salivarius in the oral cavity, and on the other hand, oral supplementation of S. salivarius enhanced anti-S Abs in the oral cavity. Such interaction between vaccine-induced Abs and commensal bacterium occurs via molecular mimicry between S protein and RSSL-01370 protein of S. salivarius and thereby may provide a further line of protection upon SARS-CoV-2 infection. Thus, we describe the mutual regulation of anti-viral Ab responses and commensal microbiota via molecular mimicry in the context of SARS-CoV-2.
Ab-microbiota interactions at the mucosal surfaces may either result in the depletion of targeted bacteria
18
or in facilitating their persistence.
52
Here, we observe that a SARS-CoV-2 S-expressing vaccine induces salivary Abs correlating with the expansion of certain strains of Streptococci, including S. salivarius, in line with the notion that vaccine-triggered Abs may help these commensals to persist in the oral cavity. Interestingly, although monoclonal anti-RBD Abs showed quite broad binding toward intestinal microbiota (Figure 3E), vaccination-elicited salivary Abs did not induce significant changes in the composition of the oral microbiota but rather promoted the growth of beneficial probiotic bacteria. This work reveals the existence of such cross-reactive Abs against both the RBD of SARS-CoV-2 S protein and distinct bacterial peptide mimics, including those of S. salivarius and B. pseudocatenulatum. Additional oral supplementation of vaccinated people with the probiotic S. salivarius K12 also enhanced the levels of anti-S Abs in the oral cavity. Altogether, these data demonstrate antigen-specific interactions of commensal bacteria and salivary Abs, and in the case of S. salivarius and RBD-specific, cross-reactive Abs, a positive regulatory feedback loop. A limitation of this study is the short period of analysis after vaccination and the small cohort size. Additional studies with longer observation periods and more participants are needed to determine the persistence of this microbiota-Ab crosstalk in the long run.
Bacterial mimics of SARS-CoV-2 S RBD, enhancing a neutralizing mucosal Ab response, are supported by similar observations reported earlier for the HIV-1 virus. In that case, gp41- and gp120-reactive Abs showed cross-reactivity against distinct mimics of microbiota.
24
,
25
,
53
In contrast to the SARS-CoV-2 S protein, microbiota-induced gp41-reactive Abs diverted the Ab response generated by Env vaccination from neutralizing to non-neutralizing epitopes on HIV-1 Env.
25
Thus, it will be important to understand why microbial mimics support or deviate protective immune responses.
In case of the SARS-CoV-2 S protein, we observed a positive correlation of certain bacteria with preexisting anti-RBD IgA Abs in healthy, unexposed subjects, and oral supplementation with S. salivarius and B. pseudocatenulatum induced such cross-reactive Abs in mice. Such preexisting IgA Abs can be explained by the previous exposure of related coronaviruses in humans or the presence of certain bacteria strains in humans, but not in mice. 16S rRNA sequencing of C57BL/6 fecal microbiota further supported the lack of S. salivarius and Bifidobacteria in these mice (data not shown) and further introduction of these bacteria elicited intestinal IgA response in mice. At the same time, both vaccinated and non-vaccinated did not show further amplification of IgA response (Figures 7 and S15). Further suggesting that de novo induction of RBD-reactive IgA and increase in RBD-specific IgG may occur by the colonization of the bacteria, but the contribution of related coronaviruses in the induction of cross-reactive IgAs cannot be excluded at this point. Further experiments are needed to address this question in detail.
Since the pre-existing, cross-reactive Abs are found only in the salivary and intestinal mucosa, but not in the blood, it is unlikely that systemic immune reactions are induced or that the trans-epithelial transport of systemic Abs is significantly affected. Indeed, our analysis of total Ig levels did not reveal any significant changes upon S. salivarius K12 administration (data not shown). It appears to be a flexible reaction of the local mucosal immune cells, including the induction of short-lived plasma cells. Interestingly, introduction of K12 into mice induced anti-S responses, whereas K12 administration in humans, who harbor S. salivarius as commensal, did not significantly increase S-specific IgA in the saliva. By contrast, vaccinated persons supplemented with S. salivarius showed the enhanced presence of salivary anti-S1 IgG Abs. Whether these IgG Abs are produced by sort-or long-lived plasma cells, and whether in this case trans-epithelial transport is affected, remains to be shown. Considering that such an increase has been observed not only for wild-type (WT) S but also for omicron RBD and sequence-related RBD of human coronavirus HKU1, but not for sequence-unrelated NL63 RBD (Figure 6; data not shown), it is conceivable that the induction of such Abs may happen locally at the mucosal surfaces via low-affinity interactions. Thus, it would be interesting to evaluate in the future the secreted and systemic Ab repertoire that can be shaped via molecular mimicry. To what extent these modulations of neutralizing salivary anti-RBD Ab concentrations protect from infection and disease remains to be shown. We have found that RSSL-01370 of S. salivarius can induce both non-neutralizing and neutralizing Abs against S and subsequently promote viral clearance in vivo in an animal model. Two additional studies addressed the impact of S. salivarius K12 on COVID-19. In one study, K12 supplementation reduced the incidence of COVID-19 in children during 30 days of K12 supplementation.
54
Another study observed an amelioration of severe COVID-19 in patients treated with S. salivarius K12.
55
Thus, S. salivarius K12 may promote viral clearance, but larger clinical studies are required in order to provide more substantial evidence for this.
Apart from host-intrinsic factors, the initial virus load may affect disease outcome and severity,
56
,
57
and there is increasing evidence of microbiota changes during severe COVID-19,
58
,
59
suggesting that the microbiota composition may be a risk factor for the development of severe disease as well.
58
,
59
,
60
The data are conflicting in terms of the genera associated with disease severity, which is probably due to the heterogeneity of the patient cohorts and differences in treatment. A common denominator is that acute COVID-19 is associated with the prevalence of opportunistic bacteria and depletion of immunomodulatory bacteria.
59
For instance, a distinct oropharyngeal microbiota composition in the COVID-19 patients, characterized by enrichment of opportunistic pathogens such as Veillonella and Megasphaera and depletion of Pseudopropionibacterium, Rothia, and Streptococcus
61
as well as increased ratios of Klebsiella, Acinetobacter, and Serratia correlate with disease severity.
61
Another study revealed that several Streptococci species were depleted in patients with severe disease, which was characterized by high levels of Mycoplasma salivarium and lower anti-S IgG levels in the bronchoalveolar lavage fluid.
62
Further comparison of oral microbiota during COVID-19 in unvaccinated and vaccinated individuals showed enrichment of opportunistic bacterial species, including S. pneumoniae and E. coli in unvaccinated patients, whereas vaccinated individuals showed enhanced the presence of S. salivarius and fewer opportunistic species.
63
Finally, a longitudinal assessment of the oral microbiota composition after COVID-19 infection revealed that Streptococcus disappeared initially during COVID-19 infection but again reappeared after 1 year.
64
Our data on the salivary microbiota during COVID-19 confirm the depletion of Streptococcus during severe COVID-19 (Figure S16; Table S8). Altogether, these data suggest that both viral and microbiota composition may fuel severity of COVID-19.
Earlier reports have described generic fecal microbiota signatures associated with the development of high anti-S Ab titers upon vaccination and with S. salivarius being described as positively impacting the titers of neutralizing Abs in the blood of individuals with a high body-mass index.
65
The presence of other bacteria was reported to correlate with the levels of systemic Ab titers induced by vaccination.
65
The mechanisms of action have been obscure. Here, we demonstrate that distinct bacteria, such as S. salivarius, impact on the local presence of SARS-CoV-2-specific Abs in the oral cavity selectively, by the expression of molecular mimics of the RBD of the SARS-CoV-2 S protein. Since we have not seen changes in the general composition of fecal microbiota upon vaccination, those changes in bacterial composition identified by Ng and colleagues most likely function in a so far not deciphered, generic way.
65
Another study also revealed vaccination-induced changes of the oral microbiome.
66
Unfortunately, however, S-specific Ab responses were not analyzed in that study, and the mechanisms involved remained obscure.
In summary, we here provide the first evidence that distinct bacteria of the microbiota of the oro-nasopharyngeal tract contribute to the regulation of mucosal immunity to SARS-CoV-2 by means of their molecular mimicry of the RBD of the SARS-CoV-2 S protein and that they support the persistence of salivary immunity.

STAR★Methods

Key resources table

REAGENT or RESOURCESOURCEIDENTIFIERAntibodiesAnti-human IgA1 Alexa Fluor 647 (clone: B3506B4)Southern BiotechCat. No. 9130-31; RRID: AB_2796658Anti-human IgA2 Alexa Fluor 488 (clone: A9604D2)Southern BiotechCat. No. 9140-30; RRID: AB_2796665Rabbit SARS-CoV-2 Spike Neutralizing Antibody (clone: HA14JL2302)Sino Biological Inc.Cat. No: 40592-R001; RRID: AB_2857936Neutralizing Antibody isolated from COVID-19 patientsKreye et al.
42
PMID: 33058755Anti-rabbit IgG Alexa647Jackson ImmunoResearchCat. No. 111-606-144; RRID: AB_2338083PE/Dazzle™ 594 anti-human IgG Fc RecombinantBioLegendCat. No.: 366920; RRID: AB_2890798Goat anti-human Ig (H+L chain) antibodySouthern BiotechCat. No. 2010-01; RRID: AB_2687525Goat anti-human IgA FabSouthern BiotechCat. No. 2050-01; RRID: AB_2795701Biotinylated anti-human IgA antibodySouthern BiotechCat. No. 2050-08; RRID: AB_2795706Anti-human IgG-APICN/CappelCat No. 59289; RRID: AB_2334819Anti-human IgA-APSigma-AldrichCat.No. A2043; RRID: AB_1839770Anti-SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein S1 antibody (clone: CR3022)AbcamCat. No. ab273073; RRID: AB_2848080Anti-human IgA FITCSothern BiotechCat. No. 2052-02; RRID: AB_2795710Anti-rabbit Alexa 647Jackson ImmunoResearchCat. No. 111-606-144; RRID: AB_2338083Anti-Mouse IgA Antibody DyLight® 650Bethyl LaboratoriesCat.No.: A90-103D5; RRID: AB_10630982Rabbit neutralizing anti-RBD antibodySino Biological Inc.Cat. No. 40592-R001; RRID: AB_2857936Anti-rabbit IgG-HRPCell signalingCat. No. 7074S; RRID: AB_2099233Anti-human IgG-HRPSouthern BiotechCat. No. 2040-05; RRID: AB_2795644Bacterial and virus strainsRosetta DE3Sigma-AldrichCat. No. 70954-3Chemically competent E.coli TOP10In houseN/AStreptococcus salivarius K12Novozin immunCat. No. 18170211Streptococcus salivariusThis paperN/ASterptococcus australis/ RubnerThis paperN/AStreptococcus parasanguinisThis paperN/AEscherichia ColiThis paperN/ABacillus safensisThis paperN/ABacillus cereusThis paperN/AEscherichia fergusoniiThis paperN/ABifidobacterium pseudocatenulatumThis paperN/ABifidobacterium longumThis paperN/AEnterococcus hiraeThis paperN/AEnterococcus faecalisThis paperN/AAcidaminococcus intestinalisThis paperN/AVeillonella parvulaThis paperN/AWhole-virion inactivated SARS-CoV-2 vaccineKozlovskaya et al.
46
PMID: 34427172Biological samplesHuman fecal samplesThis paperN/AHuman saliva samplesThis paperN/AHuman serum samplesThis paperN/AHuman swab samplesThis paperN/AMurine fecal samplesThis paperN/AMurine serum samplesThis paperN/AMurine lung samplesThis paperN/AChemicals, peptides, and recombinant proteinsDNase ISigma AldrichCat. No. 10104159001KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheCat. No. 07958935001Taq-polymeraseRapidozym GmbHCat. No. GEN-003-1000dNTP mixThermo Fisher ScientificCat. No. R0192AmPure XP BeadsBeckman Coulter Life ScienceCat. No. A63881Hoechst 33342 solutionThermo Fisher ScientificCat. No. 62249Sphero™ Rainbow ParticlesBD BiosciencesCat. No. 559123Accudrop Beads BDBiosciencesCat. No. 345249DEPC treated waterInvitrogenCat. No. 46-2224Brain heart infusion brothSigmaCat. No. 53286-100GFastidious agar platesThermo Fisher ScientificCat. No. 12957138Schaedler brothRothCat. No. 5772.1LB mediumMP BiomedicalsCat. No. 1130020322xTY mediumMP BiomedicalsCat. No. 113012031PYG MEDIUM (modified)DSMZwww.dsmz.deIsopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)InvitrogenCat. No. 15529019Restrictase NdeINew England BioLabsCat. No. R0111SRestrictase XhoINew England BioLabsCat. No. R0146SRecombinant Uncharacterised protein RSSL-01370This paperN/AHisPur™ Cobalt resinThermo Fisher ScientificCat. No. 89964Human IgAGenwayCat. No. E04696Human IgGJackson ImmunoResearchCat. No- 111-606-144pNPPSigma-AldrichCat. No. N2770Streptavidin-HRPInvitrogenCat. No. 88-7324-88Tetramethylbenzidine (TMB) SubstrateInvitrogenCat. No. 88-7324-88Sulfuric acid 25%Sigma-AldrichCat. No. 1007161000Sodium hydroxideRothCat. No. 6771.1SARS-CoV-2 Spike S1 Subunit His-tag ProteinR&DCat. No. 10522-CVSARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (RBD, His Tag)Sino biologicalCat. No. 40592-V08B-100SARS-CoV-2 Nucleocapsid His Protein, CFR&DCat. No. 10474-CVSARS-CoV-2 Spike RBD protein (flag-his) (Omicron/B.1.1.529)SanyouBioCat. No. PNA055RBD peptide (RBD480-496: CNGVEGFNCYFPLQSYG)EurogentekCat. No: AS-65619Recombinant SARS-CoV-2 S Protein RBD-Fc Chimera (carrier-free)BioLegendCat. No. 793106Fixable Viability Dye eFluor 450InvitrogenCat. No. 50-112-8817ACE2 proteinSouthern BiotechCat. No. 2010-01Biotinylated RBDMiltenyi BiotecCat No: 130-127-457Protease inhibitors cocktailRocheCat. No. 11 836 145 001glass beadsMP BiomedicalsCat. No. 6911100non-fat milkRothCat. No. 68514-61-4SuperSignal West Fempto Maximum SensitivityThermo Fisher scientificCat No. 34095Trypsin (Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade)PromegaCat. No. V52802,5-dihydroxybenzoic acidSigma-AldrichCat. No. 149357AmpicillinThermo Fisher scientificCat. No. 11593027Polyethylene glycolSigma-AldrichCat. No. P7181HAT Media Supplement (50×) Hybri-MaxSigma-AldrichCat. No. H0262-10VLAlumThermo Fisher ScientificCat. No. 77161Lipofectamine 2000Thermo Fisher ScientificCat. No. 11668019Critical commercial assaysNGS standard sensitivity fragment analysis kitAgilentCat. No. DF-473-1000Nextera XT Index Kit v2 Set C/DIlluminaCat. No. FC-131-2003MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle)IlluminaCat. No. MS1023003NucleoSpin Gel and PCR Clean-up KitMacherey-NagelCat. No. 740609.50Quick-DNA™ Fecal/Soil Microbe Miniprep KitZymo ResearchCat. No. D6010Peptide microarray multiwell replitope SARS-CoV-2 Spike glycoprotein wild type + mutationsJPT Peptide Technologies GmbHCat. No. RT-MW-WCPV-S-V02Easy Stool Extraction DeviceALPCOCat. No. 30-EZEX-100Deposited dataRaw sequence dataNCBI Sequence Read Archive (SRA)Bioproject: PRJNA738291Experimental models: Cell linesHEK293T cellsFerreira-Gomes et al.
50
PMID: 33785765; RRID:CVCL_0063Vero cellsKozlovskaya et al.
46
PMID: 34427172; RRID:CVCL_0574P3X63Ag8.653 myeloma cellsATCCCat. No. CRL-1580; RRID:CVCL_4032Experimental models: Organisms/strainsHemizygous K18-hACE2 Tg mice (B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J) on C57Bl/6 genetic backgroundJackson LaboratoryJAX #034860 , RRID:IMSR_JAX:034860C57BL/6JJackson LaboratoryJAX #000664 ,

RRID:IMSR_JAX:000664Oligonucleotides16S Amplicon PCR Forward Primer 5'-TCgTCggCAg

CgTCAgATgTgTATAAgAgACAgCCTAC

gggNggCWgCAg-3’Klindworth et al.
76
PMID: 2293371516S Amplicon PCR Reverse Primer 5'-gTCTCgTggg

CTCggAgATgTgTATAAgAgACAggACTACHVggg

TATCTAATCC-3’Klindworth et al.
76
PMID: 22933715LPW57 5'-AgTTTgATCCTggCTCAg-3’Woo et al.
67
PMID: 11040945LPW58 5'-AGgCCCgggAACgTATTCAC-3’Woo et al.
67
PMID: 11040945Uncharacterised protein RSSL-01370 Forward Primer

5'- CTCCATATgAATTTACCAAgTCACCATACAAggg -'3This paperN/AUncharacterised protein RSSL-01370 Reverse Primer

5'- gTggTCgACATTCACTTTTTCAgTTgCTACACC -'3This paperN/ARecombinant DNApET-21b expression vectorAddgeneCat. No. 69741-3pCG1-SARS-CoV-2-SHoffmann et al.
2
PMID: 32142651Software and algorithmsMiSeq Reporter SoftwareIlluminawww.illumina.comPANDAseq 2.11GitHubwww.github.comGraphpad Prism 9.3.1Prismhttps://www.graphpad.comFlowJo v10Tree Star Inc.www.flowjo.comMascot MS/MS ion searchMatrix Sciencewww.matrixscience.comBiotools softwareBruker Daltonikwww.bruker.comZEN 2.0Carl Zeiss AGN/AOtherEasy Stool Extraction DeviceALPCOCat. No. 30-EZEX-100Agilent Fragment Analyzer 5200RocheCat. No. M5310AAIllumina MySeq 2500Illuminawww.illumina.comSpectramax plus 384Molecular devicesCat. No. 5510-236-04COY anaerobic chamberCOY Lab productswww.coylab.comBD Influx®BD Bioscienceswww.bdbiosciences.comFACSCanto IIBD Bioscienceswww.bdbiosciences.comMACS Quant 16Miltenyi Biotecwww.miltenyibiotec.comMicroarray scanner Innoscan 710.Innopsyswww.innopsys.comChemi Doc XRS+ imaging systemBio-RadCat. No. 1708265Ultraflex II MALDI-ToF-ToF mass spectrometerBruker Daltonikwww.bruker.comCryotome MH560Thermo Fisher Scientificwww.assets.thermofisher.comLSM 880Carl Zeiss AGN/A

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Resource availability

Lead contact
Further information and requests for resources and reagents should be directed to and will be fulfilled by the lead contact, Andrey Kruglov (kruglov@drfz.de).
Materials availability
Plasmids, cell lines and antibodies, bacterial strains generated during the study are available upon request to the lead contact.

Experimental model and study participant details

Human Donors
Healthy individuals within BNT162b2 vaccination study were consented within the BNT162-01 study (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04380701) and informed consent forms are archived as per 162-01 procedures. Table S1 reports median age and sex proportions among the participants. Other individuals participating in this study gave written informed consent according to the approval of the ethics committee at the Charité University Hospital Berlin (EA4/019/21, EA2/200/21, EA2/010/21, EA2/066/20, EA4/188/20 and EA2/002/21) and was in compliance with the Declaration of Helsinki. Tables S3, S4, S6, and S7 reports median age, sex proportions and treatments regimes among the participants. Table S2 reports characteristics of rheumatoid arthritis patients enrolled in the analysis of oral microbiota after vaccination with the median of age, sex proportions, and medications. Table S8 reports median age, sex proportions and treatments regimes among the participants suffering from respiratory infections, COVID-19 infection was confirmed by respective PCR analysis for SARS-CoV-2 RNA. All the participants gave informed consent to participate in the study before taking part.
Supplementation of healthy individuals with probiotic bacteria
Healthy volunteers were recruited. Inclusion criteria were: full course of vaccination against SARS-CoV-2, with the time after last vaccination being more than 3 months (Figure 6) or unvaccinated (Figure S15; Table S7). Participants were provided with 50 mg (107 CFU) of Streptococcus salivarius K12 (Novozin immun; Bluestone pharma) which was taken once per day before sleep. Control participants were not provided with any additional supplements. Serum and saliva were collected and analyzed for anti-Spike antibody titers at day 0 and day 14 of probiotic supplementation. Anti-nucleocapsid IgG titers were measured at day 0 and day 14 of the study to exclude the exposure of participants to SARS-CoV-2 during the study.
Mice
Hemizygous K18-hACE2 Tg mice (B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J) on C57Bl/6 genetic background were purchased from the Jackson Laboratory (JAX #034860 , RRID:IMSR_JAX:034860). Wild type C57Bl/6 mice were acquired from the Pushchino Animal Breeding Facility (Branch of the Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences). All animals were maintained under SPF conditions at the Center for Collective Use of the Institute of Physiologically Active Compounds or the Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences. All animal procedures were performed in accordance with Russian regulations of animal protection and approved by the local Ethics Review Committees at the Institute of Physiologically Active Compounds RAS (protocol No 50, August 10, 2020) and the Engelhardt Institute of Molecular Biology RAS (protocol No 2, September 14, 2022).
Mice immunizations
Grown bacteria were collected, washed three times with PBS and heat-inactivated at 65 °C for 1 hr. Heat inactivated bacteria were resuspended with final OD600 equals 1.0. C57Bl/6 mice (8-12 weeks, both males and females) were injected with 200 μl of heat-killed bacteria i.p. From oral gavage, live bacteria stocks were grown, washed with PBS several times, OD600 was adjusted to 1, 200 μl of live bacteria was gavaged every day. For the immunization with the uncharacterized protein RSSL-01370 recombinant protein RSSL-01370 was produced in E.coli and purified (see corresponding section in STAR Methods). 20 μg per mouse (C57Bl/6 strain, 8-12 weeks old, females) was injected intraperitoneally as a mixture with Alum 1:1, v/v (Thermo Scientific, Cat. No. 77161). Boost immunization was done at day 14 after primary injection. All animal procedures were performed in accordance with Russian regulations of animal protection.
Mice vaccination and infection
Whole-virion inactivated SARS-CoV-2 vaccine (CoviVac) was produced from the prototype B.1.1 SARS-CoV-2 strain (GISAID ID EPI_ISL_428851) in Vero cells.
46
K18-hACE2 Tg (8-12 weeks, both males and females) were vaccinated intramuscularly with CoviVac vaccine or intraperitoneally with alum or bacteria mixture emulsified in alum at day 0 and day 14.
46
At day 21, K18-hACE2 Tg mice were infected intranasally at 104 TCID50 (25 μL into each nostril) with B.1.1 SARS-CoV-2 one week following the second vaccination with CoviVac or Alum (Thermo Scientific, Cat. No. 77161). Animals were clinically examined and weighed daily. On day 7 of infection mice were sacrificed.
Bacteria culture
PYG medium and plates were prepared as described by the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures). 300,000 events were sorted into 1 ml of PYG medium and directly transferred to a COY anaerobic chamber. Sorted bacteria were plated on PYG, BHI (Brain heart infusion broth, Sigma, Cat. No. 53286-100G) and Fastidious agar plates (Thermo Fisher Scientific, Cat. No. 12957138) and bacteria were grown for 24 hours. Colonies were picked and PYG medium, BHI broth and Schaedler broth (Roth, Cat. No. 5772.1) were inoculated with colonies from the respective plates. The next day, DNA was isolated and the remaining bacteria were frozen in 40% glycerol LB medium in liquid nitrogen or – 80 °C.

Method details

Swabs and saliva sample preparation
Whole saliva was collected in collection tubes and centrifuged at 2000g for 15 min at +4°C. Supernatant was stored at -80 °C for further analysis. Saliva pellets were further used for 16S rDNA sequencing similarly to the swab samples. Swabs were prepared for 16S rDNA sequencing with an adapted protocol of the Quick-DNA™ Fecal/Soil Microbe Miniprep Kit (Zymo Research, Cat. No. D6010). Swabs were obtained from clinics at – 80 °C and kept frozen until further use. The swab stick was either already stored in buffer or Bead Bashing™ buffer was added to cover the swab brush. Up to 750 μL of the buffer solutions were transferred to a BashingBead™ Lysis Tube and rigorously mixed at 13,000 rpm at 37 °C. Following the kits protocol, the supernatant was harvested after centrifugation at 13,000 x g for 5 min and once more filtered by Zymo-Spin™ III-F Filter. The DNA containing solution was then treated with Genomic Lysis Buffer and the containing DNA was put on a DNA binding Zymo-Spin™ IICR Column repeatedly until the entire sample volume was loaded. The bound DNA was washed with DNA Pre-Wash Buffer and g-DNA Wash Buffer. The washed DNA was eluted in 50 μL DNA Elution buffer and once further purified by filtration through the Zymo-Spin™ III-HRC Filter. 2.5 μL of each of the prepared samples was directly loaded to the amplicon PCR of the Illumina Nextera NGS protocol described in the 16S rRNA method section.
Stool sample preparation from BNT162b2 vaccinated individuals
Fresh stool samples from participants were collected using ALPCO Easy Stool Extraction Device according to the manufacturer’s instructions and were stored at -80°C before processing. Thawed stool suspensions were filtered through 70 μm (Falcon, Cat. No. 352350) and 30 μm filters (CellTrics®, Sysmex, Cat. No. 04-0042-2316) and centrifuged at 4000 x g to pellet the bacterial cells. Bacteria-free supernatant was filtered through a 0.22 μm syringe top (Filtropur, Sarstedt Cat. No. 83.1826.001) filter and stored at – 80°C until further use. Pellets were resuspended in 1 mL of a 40 % glycerol in LB medium mixture in Safe Seal 2 mL reaction tubes (Sarstedt, Cat. No. 72.695.500) and stored at – 80°C.
Stool sample preparation for bacteria isolation
Fresh stool samples from healthy controls were stored on ice or at 4°C before processing within 48 h. The stool was diluted in autoclaved and sterile-filtered PBS (in-house, Steritop® Millipore Express®PLUS 0.22 μm, Cat. No: 2GPT05RE) according to weight in the ratio 100 μg/mL and homogenized by vortex and spatula. The feces solution was then subsequently filtered through 70 μm (Falcon, Cat. No. 352350) and 30 μm filters (CellTrics®, Sysmex, Cat. No. 04-0042-2316) and centrifuged at 4000 x g to pellet the bacterial cells. The supernatant of this centrifugation step was once more centrifuged at 13,000 x g to pellet residual cells. The cell free supernatant was filtered through a 0.22 μm syringe top (Filtropur, Sarstedt Cat. No. 83.1826.001) filter and stored at – 80°C until further use. Pellets of both centrifugation steps were pooled and re-suspended in 10 mL PBS to measure the cell density at 600 nm. For each working stock a cell amount resembling 0.4 OD was stored in 1 mL of a 40 % glycerol in LB medium mixture in Safe Seal 2 mL reaction tubes (Sarstedt, Cat. No. 72.695.500) and transferred to – 80°C.
16S rRNA gene sequencing and analysis
For 16 S rRNA gene sequencing, we amplified the V3/V4 region directly from the bulk microbiota samples and from the sorted samples (primer sequences: 5'-TCgTCggCAgCgTCAgATgTgTATAAgAgACAgCCTACgggNggCWgCAg-3’ and 5'-gTCTCgTgggCTCggAgATgTgTATAAgAgACAggACTACHVgggTATCTAATCC-3’) with a prolonged initial heating step as described by “16S Metagenomic Sequencing Library Preparation” for the Illumina MiSeq System. After the amplicon the genomic DNA was removed by AmPure XP Beads (Beckman Coulter Life Science Cat. No. A63881) with a 1:1.25 ratio of sample to beads (v/v). Next the amplicons were checked for their size and purity on a 1.5 % agarose gel and if suitable subjected to the index PCR using the Nextera XT Index Kit v2 Set C/D (Illumina, FC-131-2003). After index PCR the samples were cleaned again with AmPure XP Beads (Beckman Coulter Life Science Cat. No. A63881) in a 1: 0.8 ratio of sample to beads (v/v). Samples were then analyzed by capillary gel electrophoresis (Agilent Fragment Analyzer 5200) for correct size and purity with the NGS standard sensitivity fragment analysis kit (Agilent Cat. No. DF-473). Of all suitable samples a pool of 2 nM was generated and loaded to the Illumina MySeq 2500 system.
Raw data were processed and de-multiplexed using MiSeq Reporter Software. Forward and reverse reads were combined using PANDAseq 2.11 with a minimum overlap of 25 bases
68
and classified using “classifier.jar” 2.13 from the Ribosomal Database Project with a confidence cutoff of 50%.
69
,
70
The copy number adjusted counts were agglomerated to bacterial genera, rarefied to the smallest size and alpha diversity were estimated using phyloSeq 1.34.
71
Principle coordinate analysis were performed using Bray–Curtis dissimilarity distance using vegan 2.5-7.
72
The linear discriminant analysis were performed using LEfSe, based on copy number adjusted counts normalized to 1M reads.
73
Raw sequence data were deposited at the NCBI Sequence Read Archive (SRA) under the accession number PRJNA738291.
Two approaches were performed to refine the classification of the Streptococcus on genus level: annotation of the underlying species based on similarities to NCBI’s 16S ribosomal RNA sequences
74
as well as unsupervised oligotyping based on minimum entropy decomposition (MED).
37
,
75
Both approaches were performed for reads assigned to the Streptococcus by the RDP classifier. For the similarity based approach a basic local alignment search was performed using megablast to retrieve 100 best hits. Because of the high similarity of the sequences from different Streptococcus species reaching up to 100% identity, the taxa of the best hits in case of equal identities were assigned in contrast to the lowest common ancestor classification. The oligotyping approach was based on pairwise sequence alignments between the Streptococcus reads and the 300-764 Region of a Streptococcus vulneris reference (NCBI Reference Sequence:NR_179383.1) using the Needleman Wunsch algorithm. The aligned sequences were aligned by keeping gaps and removing potential insertions to generate the multiple alignment. The minimal entropy decomposition was performed as described by Eren et al. using a critical entropy above 0.6 to split oligotypes and not considering gaps or potential insertions.
75
The possible underlying species for each oligotype was determined by basic local alignment search on 16S rRNA sequences as well as NCBI’s nr/nt nucleotide collections. The oligotypes were annotated by positions of the minimal entropies with the multiple alignments and the corresponding nucleobase. Position 1 corresponds to the position 300 of the Streptococcus vulneris reference.
Microbiota staining
The frozen microbiota stocks were topped up with 1 mL of autoclaved and sterile-filtered PBS to reduce glycerol toxicity while thawing. Samples were centrifuged at 13,000 xg for 10 min twice, the supernatant removed and the pellets re-suspended in PBS and finally divided into 10 tests. All staining of microbiota samples were performed in a DNase containing buffer (PBS/ 0.2 % BSA/25 μg/μL DNase, Sigma Aldrich Cat. No. 10104159001). Staining for human immunoglobulins was performed in 100 μL with 1:50 (v/v) of the detection antibodies: anti-human IgA1 Alexa Fluor 647 (clone: B3506B4, Southern Biotech Cat. No. 9130-31), anti-human IgA2 Alexa Fluor 488 (clone: A9604D2, Southern Biotech Cat. No. 9140-30). The samples were incubated for 30 minutes at 4 ° C and directly topped up with 1 mL of a 5 μM Hoechst 33342 solution (Thermo Fischer Scientific Cat. No. 62249) for another 30 min at 4 °C. For the detection of Spike protein- similar structures, the samples were first incubated in 50 μL containing 0.5 μg rabbit SARS-CoV-2 Spike Neutralizing Antibody (clone: HA14JL2302, Sino Biological Inc. Cat. No: 40592-R001) or Neutralizing Antibody isolated from COVID-19 patients for 15 min at 4 °C then washed with PBS and stained again in 50 μL of the anti-rabbit IgG Alexa647 (7,5μg/ml, Jackson ImmunoResearch Cat. No. 111-606-144) or anti-human IgG PE/ Dazzle™ 594 (2μg/ml; BioLegend Cat. No.: 366920) which was then topped up with 5 μM Hoechst 33342 solution. After Hoechst 33342 staining samples were washed with PBS and centrifuged at 13,000 x g for 5 min. After removal of supernatant, the samples were re-suspended in PBS/ 0.2 % BSA. The samples were transferred to 5 mL round bottom tubes (Falcon, Cat. No. 352063) for acquisition.
Microbiota Flow Cytometry
We used a BD Influx® cell sorter for all cytometric investigations of the microbiota samples. The sheath buffer (PBS) for the instrument was autoclaved and sterile filtered (Steritop® Millipore Express®PLUS 0.22 μm, Cat. No: 2GPT05RE) before each fluidics start up. The quality of each acquisition was assured by the alignment of lasers, laser delays and laser intensities by Sphero™ Rainbow Particles (BD Biosciences Cat. No. 559123). For sorting, the drop delay was determined prior with Accudrop Beads (BD Biosciences Cat. No. 345249). Samples were acquired with an event rate below 15,000 events and sorted with an event rate below 10,000 events. We always recorded 300,000 Hoechst 33342 positive events. We sorted up to 100,000 events for sequencing directly into Protein Low Bind tubes (Eppendorf Cat. No 022431102), spun down the sample at 17,000 x g and replaced residual sorting buffer by DEPC treated water (Invitrogen Cat. No. 46-2224). The samples were stored in approx. 10 μL at -20 °C until further processing. For subsequent cultivation of bacteria, we sorted directly into PYG medium and transferred the cells directly into a COY anaerobic chamber.
Sequencing from bacterial colonies
For the identification of the bacterial species bound to the neutralizing anti-RBD antibodies, the DNA from 200 μl of the grown bacteria was isolated with ethanol precipitation. The isolated DNA was subsequently amplified by the 16S rDNA specific primers LPW57 and LPW58.
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In brief, bacterial DNA was amplified with Taq-polymerase (0.005 u/μl, Rapidozym GmbH, Cat. No. GEN-003-1000), 3.12 mM MgCl2 (Rapidozym GmbH), 1 X GenTherm buffer (Rapidozym GmbH), 0.25 mM dNTP mix (Thermo Scientific, Cat. No. R0192) and LPW57 and LPW 58 (1μM, TIB Molbiol) for 35 amplification cycles in a thermocycler. The DNA product was verified by gel electrophoresis and purified with the NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Cat. No. 740609.50). The concentration of the purified PCR product was adjusted to 5 ng/μl in 15 μl and send to Sanger sequencing by Eurofins Genomics. Sequence identity was determined with the Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) provided by NCBI.
Enzyme-linked immunosorbent assay
For the detection of antibody titers in sera, saliva and fecal supernatants 96-well plates were coated with goat anti-human Ig (H+L chain) antibody (Southern Biotech, Cat. No. 2010-01) or goat anti-human IgA Fab (Southern Biotech, Cat. No. 2050-01) antibody for the detection of IgG and IgA respectively. After washing with 1x PBST for 30 seconds, the plates were blocked with 200 μL of 5% PBS/BSA for 1 hour at room temperature. Next, plates were washed 3 times with 200 μL of 1x PBST for 30 seconds at a time. The sera and fecal supernatants were diluted in PBS and 100 μL were added to the plate. Standards were diluted in PBS and applied to the plate: IgA (Genway, Cat. No. E04696) and IgG (Janssen Biotech Inc.,) then the plates were incubated over night at 4°C. After that, plates were washed 5 times with 200 μL of 1x PBST and detection antibodies were applied: anti-human IgG-AP (ICN/Cappel, Cat No. 59289), anti-human IgA-AP (Sigma, Cat.No. A2043), and were incubated for 1 hour at 37°C. Subsequently, the plates were washed 5 times with 200 μL of 1x PBST 100 μL of pNPP (Sigma, Cat. No. N2770) was added to each well. Reactions were stopped by addition of 3M NaOH (Roth: Cat. No. 6771.1). Optical densities were measured on Spectramax (Molecular devices).
Analysis of anti-Spike antibody responses by enzyme-linked immunosorbent assay
To determine the SARS-CoV-2 specific antibody titers, 96-well plates were coated overnight with either 0,5 μg/ml recombinant SARS-CoV-2 Spike S1 Subunit His-tag Protein (R&D 10522-CV) or 0,5 μg/ml recombinant SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (RBD, His Tag, Sino biological, Cat. No. 40592-V08B-100) or 0,5 μg/ml recombinant SARS-CoV-2 Nucleocapsid His Protein, CF (RnD Systems; Cat. No. 10474-CV) or 0.5 μg/ml recombinant SARS-CoV-2 Spike RBD protein (flag-his) (Omicron/B.1.1.529) (SanyouBio, Cat. #PNA055 ) protein or 0,5 μ/ml of RBD peptide (RBD480-496: CNGVEGFNCYFPLQSYG; Eurogentek, Cat. No: AS-65619). Plates were washed, blocked and the administration of sera and saliva were done as previously described.
50
To detect S1-specific IgA, a biotinylated anti-human IgA antibody (Southern Biotech, Cat. No. 2050-08) was applied, followed by an incubation for 1 h at room temperature. After washing 5 times with PBST, streptavidin-HRP (Invitrogen, Cat. No. 88-7324-88) was added and after 30 min of incubation at RT and 5 times washing with PBST, Tetramethylbenzidine (TMB) Substrate (Invitrogen, Cat. No. 88-7324-88) was added. The reaction was stopped by addition of 2N H2SO4 (Sigma-Aldrich: Cat. No. 84736). For anti-S1 IgG detection in saliva anti-human IgG-AP (ICN/Cappel, Cat No. 59289) was applied and plates were incubated for 1 hour at room temperature. Subsequently, the plates were washed 5 times with 200 μL of 1x PBST and 100 μL of pNPP (Sigma, Cat. No. N2770) was added to each well. Reactions were stopped by addition of 3M NaOH (Roth: Cat. No. 6771.1). Optical densities were measured on Spectramax plus 384(Molecular devices). OD values were further plotted against respective sample dilutions and areas under the curve (AUC) were quantified using Graphpad Prism 9.3.1. Relative increase in antibody titers for K12 supplementation study was calculated as following: AUC(d14)/AUC(d0)∗100.
Flow cytometric assay for analysis of antibody responses against Spike protein
For the detection of “Wuhan” Spike specific immunoglobulins in serum, HEK293T cells were transfected with a plasmid expressing wild-type variant SARS-CoV-2 Spike protein. The next day, the proportion of transfected cells was determined by staining with anti-SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein S1 antibody (clone: CR3022, Abcam, Cat. No. ab273073) for 30 min, washing the cells once with PBS/ 0.2 % BSA and subsequent staining with goat anti-human IgG-Alexa-647 (Southern Biotech, Cat. No. 2014-31). Further transfected cells were collected and incubated with sera for 30 min, washed twice with PBS/BSA and stained with goat anti-human IgG Alexa647 (Southern Biotech, Cat. No. 2014-31), and anti-human IgA FITC (Sothern Biotech, Cat. No. 2052-02) in the presence of Fixable Viability Dye eFluor 450 (Invitrogen, Cat. No. 50-112-8817). Cells were washed with PBS/ 0.2 % BSA and either measured directly or fixed in 2 % paraformaldehyde solution for 20 min at 4°C. Samples were acquired on a FACSCanto II (BD Biosciences) or a MACS Quant 16 (Miltenyi Biotec) and analyzed using FlowJo v10 (Tree Star Inc.) analysis software. In the respective fluorescent channels, geometric mean of fluorescent intensity (MFI) Spike expressing cells and non-expressing cells was quantified and ΔMFI=MFI (S+)-MFI (S-) for IgG and IgA was determined. ΔMFI values were further plotted against respective serum dilutions and AUC were quantified using Graphpad Prism 9.3.1.
Epitope mapping for anti-RBD antibodies
Epitope mapping was performed using peptide microarray multiwell replitope SARS-CoV-2 Spike glycoprotein wild type + mutations (JPT Peptide Technologies GmbH; RT-MW-WCPV-S-V02). Microarray was incubated with monoclonal anti-RBD antibodies (final concentration 1 mcg/ml) or mouse fecal supernatants (1:1 dilution) at 30 oC for 1 hour with constant rotation. Slides were washed three times with TBS buffer with 0,05 % Tween-20 and further incubated with anti-rabbit Alexa 647 (Jackson ImmunoResearch Cat. No. 111-606-144), anti-human IgG-Alexa647 (Southern Biotech; Cat. No.: 2040-31), goat anti-Mouse IgA Antibody DyLight® 650 (Bethyl Laboratories; Cat.No.: A90-103D5) at 30 °C for 1 hour. Samples were washed with TBS-T and deionized water, dried by centrifugation. Peptide microarray was analysed using microarray scanner Innoscan 710 (Innopsys). Fluorescence intensities were quantified using ImagePix.
Inhibition of ACE2-RBD interaction
96-well plates were coated with 100ng/ml of human Ace2 protein (Southern Biotech, Cat. No. 2010-01). After washing with 1x PBST for 30 seconds, the plates were blocked with 200 μL of 5% PBS/BSA for 1 hour at room temperature. Next, plates were washed 3 times with 200 μL of 1x PBST for 30 seconds at a time. Fecal supernatants and COVID serum as positive control were diluted in PBS and 100 μL were added to the plate. The plates were incubated at 37°C for 1 h. After that, plates were washed 5 times with 200 μL of 1x PBST and 100 ng/ml of biotinylated RBD (Miltenyi Biotec; Cat No: 130-127-457) was applied and plates were incubated for 1 hour at 37°C. After washing 5 times with PBST, streptavidin-HRP (Invitrogen, Cat. No. 88-7324-88) was added and after 30 min of incubation at RT and 5 times washing with PBST, Tetramethylbenzidine (TMB) Substrate (Invitrogen, Cat. No. 88-7324-88) was added. The reaction was stopped by addition of 2N H2SO4 (Sigma-Aldrich: Cat. No. 84736). Optical densities were measured on Spectramax (Molecular devices). Percentage of inhibition was quantified using the following values: 100% of inhibition corresponded to OD values of blank wells, 0% of inhibition corresponded to the wells where only biotinylated RBD was added.
Generation of Spike SARS-CoV-2 pseudotyped lentivirus
1.2 × 106 293T cells were plated in a 10 cm Petri dish in 10 mL of growth medium. The next day, the cells were transfected with 5 μg pCMV-dR8-2, 6.67 μg pUCHR-IR-GFP, and 3.33 μg of the S-protein coding plasmid using Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer’s instruction. Then, 48 h post transfection, supernatant was collected, was filtered through 0.45 μm filters, concentrated using PEG-6000 precipitation, aliquoted, and stored at −80 °C. PVs were titrated on ACE2-expressing 293T cells and assessed by flow cytometry.
Inhibition of lentivirus
Ace2 expressing 293 T cells were plated at 2 × 104 cells/well into 96-well plates the day prior to experiment. Serum samples were serially twice-fold diluted in growth medium saliva samples were diluted 1:10, mixed with S-pseudotyped virus and incubated for 1 h at 37 °C. The mixture was then added to Ace2-293T cells and incubated for 1 day at 37 °C. Infection was determined by flow cytometry.
Lung histology
Lungs for histopathological examination were fixed in 10% neutral buffered formalin for 48 hours at room temperature, washed with PBS and snap-frozen in OCT medium. Lung sections (7 μm) were cut using Cryotome MH560 (Thermo Fisher), were stained with anti-NCP antibody (Thermo Scientific, Cat. No. PA5-119601), followed by secondary anti-rabbit IgG (Jackson ImmunoResearch, Cat No. 111-606-144) and examined using confocal microscope LSM880 (Zeiss). Microphotographs were obtained by LSM880 at 10x magnification and processed using ZEN2 (Zeiss) software. For the evaluation of NCP-APC intensity, the sum of events in APC channel was divided to the square of slide (mm2) and normalized to secondary only control. For each biological sample 3-5 consecutive slides were analyzed.
Hybridoma generation
P3X63Ag8.653 myeloma cells were grown in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin, and streptomycin. Splenocytes from immunized animals were mixed with P3X63Ag8.653 in a 1:1 ratio and washed several times using RPMI-1640 medium. Cells were gently resuspended, followed by the addition of 1 mL of polyethylene glycol (Sigma-Aldrich: Cat.P7181) for 1 minute with constant stirring, followed by 2 mL of RPMI-1640 medium for 2 minutes, and 10 mL of RPMI-1640 medium for 1 minute. Cells were washed and resuspended at a concentration of 2×106 /mL in RPMI-1640 medium containing 20% fetal bovine serum, 1% penicillin, streptomycin, 100 μM hypoxanthine, 0.4 μM aminopterin, and 16 μM thymidine, and dispersed on a 96-well plate at 100 μL per well. For 14 days, half of the medium was removed daily and new medium was added. The first colonies were noted on days 6-8 after cell fusion. On day 10, the supernatant in the wells with colonies were analyzed for IgG production and reactivity against RSSL-01370 and RBD-Fc-Tag by ELISA.
Protein gel electrophoresis and Western blotting
48 h bacterial cultures were pelleted and were resuspended in RIPA buffer containing protease inhibitors cocktail (Roche, Cat. No. 11 836 145 001). Samples were sonicated at 50% voltage for 5 cycles of 10 sec pulses followed by 30 sec rest on ice. After sonication glass beads (MP Biomedicals, Cat. No. 6911100) were added as 1/3 of total volume to the bacterial extract. Samples were vortexed for 30 sec followed by chilling on ice for 30 sec (for a total of 5 cycles). Lysates were spun down for 10 min at 20,000 xg and supernatant was collected. For western blot analysis, samples were run on 12% SDS-PAGE under reducing conditions and transferred to PVDF membrane (Bio-Rad, Cat. No. 1620177). SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD-His Recombinant Protein (Sino Biological, Cat. No. 40592-V08B-100) was used as a positive control. The membrane was blocked by incubation in 5% non-fat milk (Roth, Cat. No. 68514-61-4) in TBST buffer for 1 h at room temperature with constant shaking. The membrane was subsequently hybridized with rabbit neutralizing anti-RBD antibody (Sino Biological, Cat. No. 40592-R001) or human derived RBD neutralizing antibodies in blocking solution for 1h at room temperature with constant shaking. It was then washed in TBST and incubated with anti-rabbit IgG-HRP (Cell signaling, Cat. No. 7074S) or with anti-human IgG-HRP (Southern Biotech, Cat. No. 2040-05) for 1 h at room temperature with constant shaking. SuperSignal West Fempto Maximum Sensitivity (Thermo Fisher scientific, Cat No. 34095) substrate kit was used. The signal was acquired using Chemi Doc imaging system (Bio-Rad).
Mass-spectroscopy analysis of proteins
The protein bands after 1D-PAGE were excised and washed twice with 100 mL of 0.1 M NH4HCO3 (pH 7.5) and 50% acetonitrile mixture at 50oC until the piece of gel becomes transparent. Protein cysteine bonds were reduced with 10mM DTT in 50 mM NH4HCO3 for 30 min at 56 °C and alkylated with 15 mM iodoacetamide in the dark at RT for 30 min. The step with adding DTT was repeated. Then gel pieces were dehydrated with 100 mcl of acetonitrile, air-dried and treated by 10 mcl of 12 mg/mL solution of trypsin (Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade, Promega) in 50 mM ammonium bicarbonate for 15 h at 37oC. Peptides were extracted with 20 mcl of 0.5% trifluoroacetic acid water solution for 30 min with sonication, dried in a SpeedVac (Labconco) and resuspended in 3% ACN, 0.1% TFA. Aliquots (2 mcl) from the sample were mixed on a steel target with 0.3 mcl of 2,5-dihydroxybenzoic acid (SigmaAldrich: Cat. No: 149357) solution (30 mg in 400 mcl of 30% acetonitrile/0.5% trifluoroacetic acid), and the droplet was left to dry at room temperature. Mass spectra were recorded on the Ultraflex II MALDI-ToF-ToF mass spectrometer (Bruker Daltonik, Germany) equipped with an Nd laser. The [MH]+ molecular ions were measured in reflector mode, the accuracy of the mass peak measurement was 0.007%. Fragment ion spectra were generated by laser-induced dissociation, slightly accelerated by low-energy collision-induced dissociation, using helium as a collision gas. The accuracy of the fragment ions mass peak measurement was 1Da. Correspondence of the found MS/MS fragments to the proteins was performed with the help of Biotools software (Bruker Daltonik, Germany) and a Mascot MS/MS ion search.
Protein expression
RSSL-01370 gene was amplified from the genomic DNA of Streptococcus salivarius K12 using the following primers: 5'- CTCCATATGAATTTACCAAGTCACCATACAAGGG -'3 and 5'- GTGGTCGACATTCACTTTTTCAGTTGCTACACC -'3 and subsequently cloned into pET-21b expression vector containing NdeI and XhoI restriction sites in Rosetta DE3 (Sigma Aldrich, Cat. No. 70954-3) chemically competent cells. Next, overnight culture of the selected clone was inoculated into 2xTY growth medium containing 100 μg/ml of ampicillin and grown at 30 °C with constant shaking until OD600 reached 0,8. Protein expression was induced by 0,6 mM of IPTG for the next 4 hours at 30 °C. Bacterial lysate was prepared and analysed as described above.
Protein purification
RSSL-01370 protein containing His-tag was expressed in Rosetta DE3 (Sigma Aldrich, Cat. No. 70954-3) cells, bacterial cell suspension was centrifuged at 4500 rpm for 20 min and resuspended in Co2+ Equilibration/Wash buffer containing 300 mM sodium chloride, 50 mM sodium phosphate, 10mM imidazole and protease inhibitors cocktail, pH7,4 (Roche, Cat. No. 11 836 145 001). Sample was sonicated at 50% voltage for 5 cycles of 20 sec pulses followed by 30 sec rest on ice. Lysate was spun down for 10 min at 20,000xg and supernatant containing overexpressed protein was collected. The supernatant was loaded onto HisPur™ Cobalt resin (Thermo Scientific) and purified according to the manufacturer instructions (Thermo Scientific, Cat. No. 89964). Briefly, after loading the protein lysate the column was washed with 10 mM imidazole wash buffer and the uncharacterized protein RSSL-01370 was eluted using 150 mM imidazole elution buffer. Next, overnight dialysis against buffer containing 300 mM sodium chloride and 50 mM sodium phosphate (pH 7,5) was performed for the further applications of the protein.

Quantification and statistical analysis

Mann-Whitney or unpaired test was used for statistical evaluation between two groups. Friedman test with Dunn’s multiple comparisons for statistical evaluation between multiple groups containing independent variables was used. For the evaluation of NCP protein intensity, the sum of events in fluorescent channel was divided to the square of slide (mm2) and normalized to intensity derived by staining the consecutive slide with secondary antibody only. For each biological sample 3-5 consecutive slides were analyzed. Wilcoxon matched-pairs signed rank test was used for analysis of data generated in the same individual before and after intervention. To evaluate correlations, Spearman correlation was quantified. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 9.3.1. P-values less than 0.05 were considered statically significant. ns - not significant.

Additional resources

Human participants were enrolled in the study according BNT162-01 study (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04380701) and in the studies approved by the ethics committee at the Charité University Hospital Berlin (EA4/019/21, EA2/200/21, EA2/010/21, EA2/066/20, EA4/188/20 and EA2/002/21) and were performed in compliance with the Declaration of Helsinki.

Data and code availability

•
1. Microbiota 16S sequencing data have been deposited at NCBI Sequence Read Archive (SRA) and will be publicly available by the date of publication. Accession numbers are listed in the key resources table. Original western blot images are included in the manuscript. The DOI is listed in the key resources table. Microscopy data reported in this paper will be shared by the lead contact upon request.
•
1. No original code has been generated during this study.
•
1. Any additional information required to reanalyze the data reported in this paper is available from the lead contact upon request.

Acknowledgments

We would like to thank Ugur Sahin and Özlem Türeci (Biontech) for the setup of the vaccination clinical study. We are grateful to Timo Rückert, Mona Massoud, Lennard Ostendorf, and Marie Burns for the help in blood collection, to the members of the German Rheumatism Research Center Flow Cytometry Core Facility (T. Kaiser, J. Kirsch, and R. Maier) for help with FACS analysis and cell sorting and to Dr. Mairi McGrath for her careful text editing. We are grateful to Dr. D. Mazurov and Dr. N. Kruglova for sharing the reagents and R. Zvartsev for mice genotyping. Work was supported by DFG (TRR241/B03 and TRR130 P16 to H.-D.C., A.R., and Clinical Research Unit KFO 5023 “BecauseY” Project number 504745852 to A.A.K.; TR-SFB241/A01 (375876048), SFB1444/P11(427826188), SPP1937-DI764/9-2 to A.D.), Dr. Rolf M. Schwiete Foundation (J.N., L.B., and H.-D.C.) and Russian Science Foundation grants # 21-14-00223 (analysis of mucosal antibody responses, to A.A.K.) and Russian Fund for Basic Research #17 -00-00435 (V.M.G.) and #17 -00-00268 (A.A.K.), by grants from the Leibniz Association (Leibniz Collaborative Excellence, TargArt [M.-F.M.] and ImpACt [M.-F.M. and A.A.K.]), the Berlin Institute of Health (BIH) with the Starting Grant-Multi-Omics Characterization of SARS-CoV-2 infection, Project 6, Identifying Immunological Targets in COVID-19, the state of Berlin and the European Regional Development Fund (ERDF 2014–2021, EFRE 1.8/11, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum), and the German Federal Ministry of Education and Research (CONAN and TReAT to M.-F.M. and COVIM P4 to A.D.), by the European Research Council through the Advanced Grants IMMEMO (ERC-2010-AdG.20100317 IMMEMO Grant 268978) to A.R. and ILCAdapt (ERC-2021-AdG 101055309) to A.D., by European Union (GlycanTrigger, 101093997 to A.D.); the Einstein Foundation Berlin (Einstein Professorship to A.D.). J.K., S.M.R., and E.S. are enrolled in the Charité Clinician Scientist Program funded by the Charité-Universitätsmedizin Berlin and the Berlin Institute of Health. Graphical abstract has been generated using biorender.com.

Author contributions

Conceptualization, A.A.K. and M.-F.M.; methodology, A.A.K., M.-F.M., P.D., L.K., M.D., G.S., M.B., S.A., I.V.S., and V.M.G.; software, P.D.; investigation, M.B., S.A., L.B., P.L., J.N., A.A.K., M.W., J.K., S.M.R., I.S., G.M.G., M.F.-G., E.S.-S., S.Y., T.S., G.A.H., C.T., M.R., D.M., I.V.S., M.D., L.K., and A.L.; resources, J.K., S.M.R., E.S.-S., H.P., E.S., A.-L.S., T.D., S.Z., E.V., N.K., K.J.S., S.T., A.D., and P.E.; writing – original draft, A.A.K., M.W., M.B., L.B., J.N., P.D., M.-F.M., and A.R.; writing – review & editing, M.W., M.B., L.B., J.N., J.K., M.F.-G., S.M.R., M.R., G.S., E.S., A.-L.S., T.D., H.-D.C., M.D., L.K., S.T., A.R., H.P., and P.E.; visualization, A.A.K., P.D., M.B., L.B., and J.N.; project administration, A.A.K., M.-F.M., L.K., P.E., S.T., A.R., A.D., and H.P.; funding acquisition, H.-D.C., A.R., M.-F.M., A.A.K., H.P., V.M.G., J.K., S.M.R., and E.S.

Declaration of interests

Related to this work, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum (DRFZ) has filed a patent application.

Inclusion and diversity

We support inclusive, diverse, and equitable conduct of research.

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Published: November 8, 2023
Accepted: October 6, 2023
Received in revised form: July 11, 2023
Received: September 28, 2022

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Graphical Abstract
Figure 1Oral antibody responses during first month of BNT162b2 vaccination
Figure 2Oral microbiota composition during first month of BNT162b2 vaccination
Figure 3Neutralizing anti-RBD antibodies recognize distinct commensal bacteria
Figure 4Induction of cross-reactive anti-RBD SARS-CoV-2 response by commensal bacteria
Figure 5Inhibition of SARS-CoV-2 infection by cross-reactive anti-Spike antibodies elicited by commensal bacteria
Figure 6Induction of cross-reactive anti-RBD SARS-CoV-2 response by Streptococcus salivarius K12 in vaccinated humans
Figure 7Cross-reactive anti-RBD IgA antibodies in non-vaccinated individuals recognize commensal bacteria

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分子模倣を介したSARS-CoV-2スパイクタンパク質と常在細菌に対する抗体応答の相互調節

ハイライト

SARS-CoV-2ワクチン接種により口腔内のS. salivariusが早期に増加する。

抗スパイクSARS-CoV-2抗体は分子模倣を介してS. salivariusに結合する

S.サリバリウスはマウスにおいて交差反応性抗スパイクAbsを誘導し、ウイルスクリアランスを助ける。

本研究中にオリジナルのコードは生成されていない。

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ハイライト

SARS-CoV-2ワクチン接種により口腔内のS. salivariusが早期に増加する。

抗スパイクSARS-CoV-2抗体は分子模倣を介してS. salivariusに結合する

S.サリバリウスはマウスにおいて交差反応性抗スパイクAbsを誘導し、ウイルスクリアランスを助ける。

本研究中にオリジナルのコードは生成されていない。

Highlights

Summary

Graphical abstract

Keywords

Introduction

Results

Oral microbiota changes during vaccination are associated with the induction of salivary Ab responses

Anti-S Abs recognize various microbial species via molecular mimicry

Induction of cross-reactive anti-S Abs by commensal microbiota strains

Discussion

STAR★Methods

Key resources table

Resource availability

Experimental model and study participant details

Method details

Quantification and statistical analysis

Additional resources

Data and code availability

Acknowledgments

Author contributions

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Inclusion and diversity

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