シングルRNAイメージングの強化により、生きた動物の動的な遺伝子発現を明らかにした。

哉百名


シングルRNAイメージングの強化により、生きた動物の動的な遺伝子発現を明らかにした。

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ユーセン フー
ジンシュー・シュウ
Erqing Gaoさん、
Xueyuan Fanさん、
ジーリ・ウェイ（Jieli Wei）、
ビンチェン・イェ
スホン・シュウ 、
ウィールイ・マ
et al.著者一覧の拡大
浙江大学生命科学研究所がん分子細胞生物学浙江省重点実験室 （中国・浙江省
浙江大学第二附属病院国際バイオメディシンX研究センター（中国）；
浙江大学医学部第二附属病院幹細胞・再生医療センターおよび熱傷・創傷修復科（中国
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2023年3月3日
https://doi.org/10.7554/eLife.82178
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ユーセン フー
徐景秀（じょけいしゅう
高 爾慶
范雪源（ファン・シュエユアン
ジーリ・ウェイ
葉 秉成（イェ・ビンチェン
スホン シュウ
ウィールイ・マ

(2023)
シングルRNAイメージングの強化により、生きた動物の動的な遺伝子発現を明らかにした。

eLife 12:e82178.
https://doi.org/10.7554/eLife.82178
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記事
数値・データ
アブストラクト
生きた動物で内因性mRNAをイメージングすることは技術的に困難である。ここでは、高時間分解能のライブセルRNAイメージングを可能にするSuntagシステムによるMS2ベースの信号増幅と、内因性mRNAのイメージングのために1300 ntの24xMS2をゲノムに挿入するという障害を克服する8xMS2ステムループについて説明する。このツールを用いて、生きた線虫の表皮における遺伝子発現の活性化と内在性mRNAの動態を画像化することができた。
編集部からの評価
著者らは、MS2のシグナルを増幅し、より小さな挿入量でin vivoでのmRNAの追跡に十分対応できるようにした。この方法は、全長のMS2と同等の十分なシグナルを発生させるという確かな証拠を示しています。この研究は、以前に報告された同様の方法とともに、エレガンスや他の生物における1分子イメージングを検討している研究者にとって有用であろう。
https://doi.org/10.7554/eLife.82178.sa0
決定通知書
Scietyに関するレビュー
eLifeのレビュープロセス
はじめに
RNAは、DNAからタンパク質に遺伝情報を中継したり、それ自体で機能したりする。遺伝子発現制御におけるRNAの役割を明らかにするためには、1分子レベルでのRNAのライブセルイメージングが重要です（Buxbaum et al.、2015）。RNA結合タンパク質-蛍光タンパク質アプローチ（Bertrand et al., 1998）、CRISPRベースのシステム（Nelles et al., 2016; Yang et al., 2019）、蛍光体-RNAアプタマーペアを利用するもの（Chen et al., 2019; Paige et al., 2011; Sunbul et al., 2021）など、ライブセル内でRNAを可視化するさまざまなツールが開発されています（Braselmann et al., 2020; Le et al., 2022）。MS2ベースのシステムは最も広く使用されており、生細胞における1分子RNAイメージングの現在のゴールドスタンダードとなっている（Braselmannら、2020年；Bertrandら、1998年）。MS2は、バクテリオファージMS2コートタンパク質（MCP）によって特異的に結合された短いRNAステムループである。RNAを画像化するために、24xMS2を3′UTRまたは5′UTRに配置し、蛍光タンパク質をMCPに融合させる（MCP-FP）。細胞内で共発現させると、MS2-MCP結合により最大48個の蛍光タンパク質（2×24、1つのMS2に2つのMCPが結合している）がRNAにリクルートされます。これにより、1個のRNA分子を示す蛍光スポットが形成される（Braselmann et al.、2020）。
MS2システムは、転写から核外輸送、細胞内局在化、翻訳、そして最終的な分解に至るまで、mRNAのライフサイクル全体を追跡するのに成功しました（Braselmann et al.、2020；Le et al.、2022）。しかし、動物細胞におけるRNAイメージング研究のほとんどは、培養細胞株の外来性mRNAを使用して行われてきた。24xMS2（長さ約1300nt）を特定のゲノム遺伝子座にノックして、内在性mRNAをイメージングする必要がある。長鎖のゲノムへのノックインの難しさと効率の悪さは、MS2システムを用いて内因性mRNAを可視化する上で大きな障害となる。したがって、生きた動物細胞で1分子レベルで画像化された内因性mRNAが10個未満であることは驚くべきことではなく、生きた動物で画像化された内因性mRNAの例は依然として極めて稀である（Halsteadら、2015；Levoら、2022；Dufourtら、2021；Parkら、2014；Dasら、2018；Zimyaninら、2008；ForrestとGavis、2003；Leeら、2022）。過剰発現したmRNAは、内因性mRNAの発現や動態を忠実に再現していない可能性があるため、内因性mRNAイメージングのより高感度な技術の開発は、大きな価値があります。
研究成果
本研究では、MS2とシグナルアンプを組み合わせることで、より少ないMS2の繰り返し数（すなわち8xMS2 - 図1A参照）で、より多くの蛍光タンパク質をRNAにリクルートできるのではないかと推論した。これを実現するために、MS2とSuntagシステムを組み合わせました。Suntagは、その特異的な一本鎖可変フラグメント（scFv）抗体に結合する19アミノ酸のタンパク質タグです（Tanenbaum et al.、2014）。我々は、MCPを24xSuntag配列と融合させ、scFvをsfGFPと連結させました。細胞内で共発現させると、1つのMS2が2つのMCP-24xSuntag分子と相互作用し、さらに2×24のGFP分子をリクルートする（図1A）。Suntagはシグナル増幅器として機能するため、この複合システムはMS2-based signal amplification with Suntag System (MASS)と命名された。8xMS2を3′UTRに配置すると、MCP-Suntag-scFv-sfGFP相互作用により、最大384個（2×8×24）のGFPを1つのmRNAに繋ぎとめることができる（図1A）。これにより、単一のmRNAに関連した強いGFPスポットが形成され、ライブRNAイメージングが容易になります。
図1、6つの補足説明
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SuntagシステムによるMS2ベースのシグナル増幅を用いたβ-ACTIN mRNAのライブセルイメージング。
(A）従来のMS2-MCPシステムとSuntagシステムによるMS2ベースのシグナル増幅の模式図。(B) 生きたHeLa細胞におけるβ-ACTIN-8xMS2 mRNAの代表的な画像。sfGFP ...続きを見る
図1-ソースデータ1
qRT-PCR（Quantitative Reverse Transcription PCR）、smFISHおよびMASSで検出された病巣の数、HeLa細胞で検出されたmRNAのS/N比、速度、病巣強度。
https://cdn.elifesciences.org/articles/82178/elife-82178-fig1-data1-v3.xlsx
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図1-図解6
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MASSは、従来の24xMS2イメージングシステムよりも高い強度でmRNAを標識する。
(A, B) 図1-図5と同様であるが、各スポットの平均強度の分布を示した。(C) (A)の各スポットの平均強度。棒グラフは平均±...続きを見る
図1-図解5
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tdMCP-6xSuntagを用いたMASSは、mRNAの移動速度に影響を与えなかった。
(A, B) 従来の24xMS2システムで標識したβ-ACTIN-24xMS2 mRNAと、tdMCP-6xSuntag, tdMCP-12xSuntag, ...を用いたMASSで標識したβ-ACTIN-8xMS2 mRNAのmRNA移動速度の分布図。
図1-図解4
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MASSは従来の24xMS2方式よりも高いS/N比を持つ。
(A, C, E, G) 従来の24xMS2システムで標識したβ-ACTIN-24xMS2 mRNAと、tdMCP-6xSuntag、tdMCP-12xSuntag、tdMCP-24xSuntagを用いてMASSで標識したβ-ACTIN-8xMS2 mRNAの共焦点画像です。... もっと見る
図1-図解3
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MASSはmRNAの細胞内局在に影響を与えなかった。
(A）生きたHeLa細胞におけるβ-ACTIN-8xMS2 mRNAの共焦点画像。sfGFPの病巣が示されている。β-ACTIN-8xMS2、MCP-24xSuntag、およびscFv-sfGFPの構築物をHeLa細胞に共トランスフェクトした。画像は、12 ... もっと見る
図1-図解2
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MASSはmRNAの安定性に影響を与えなかった。
(A) MASSで標識したβ-ACTIN-8xMS2 V1またはβ-ACTIN-8xMS2 V7 mRNAとtdMCP-24xSuntagとの代表的な共焦点画像。(B）C-MYC-8xMS2、HSPA1A-8xMS2、KIF18B-8xMSの代表的な共焦点画像... もっと見る
図1-図解1
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HeLa細胞におけるtdMCP-24xSuntagを用いたsmFISHおよびMASSによるβ-ACTIN-8xMS2 mRNAの標識化。
(A) β-ACTIN-8xMS2タグ付きmRNAを標的としたプローブの模式図。プローブ-1：MS2ステムループに対するもの、プローブ-2：リンカー領域に対するもの。(B) β-ACTIN-8xMS2ラベルの代表的な共焦点画像... もっと見る
コンセプトの証明として、8xMS2 V14をβ-ACTIN mRNAの3′UTRに融合させ、HeLa細胞にトランスフェクトした。MASSの必要な要素（MS2、MCP、24xSuntag、scFv抗体）がすべて存在する場合、明るいGFPフォーカスが容易に検出された（図1B）。コントロールとして、これらの要素のいずれかを省略した場合、GFPフォーカスは検出されなかった（図1B）。MCP-24xSuntagでは、1つのMCP分子に最大24個のGFPを標識することができる。これは、MCP-24xSuntagの拡散速度が速すぎてスポットとして撮像できないためと思われます（図1B）。このように、GFPフォークは明らかにβ-ACTIN RNA分子を表している。
さらに、MS2ステムループに対するプローブとMS2ステムループ間のリンカー領域に対するプローブを用いて、MASSと1分子RNA蛍光in situハイブリダイゼーション（smFISH）を組み合わせて行った（図1C、図1-図1A, B）．その結果、MASSはsmFISHで検出されたスポットと比較して、同数のGFP fociを検出した（図1-図1C, 図1-source data 1）。さらに、GFP fociの大部分（72％）はβ-ACTIN-3′UTR-8xMS2 mRNAのsmFISHスポットと共焦点化した（図1C、D、図1-図1B、図1-source data 1）。すべてのMS2ステムループがMCPに結合するわけではないことが報告されている（Wu et al.、2012）。MASSでは8xMS2しか使用しなかったため、一部のmRNAがMCPに完全に結合せず、検出されなかったと考えられる。一方、smFISH実験では、8xMS2のステムループとリンカー領域にハイブリダイズするプローブは理論上16個までであり、一部のmRNAがsmFISHでミスラベルされた可能性があります。そのため、MASSフォーカスとsmFISHスポットの100%共焦点化は困難であった。以上のことから、MASSは生きた細胞において、単一のmRNA分子を検出し、特定の遺伝子からのmRNAの大部分を標識することができることが示されました。
MS2ステムループでmRNAをタグ付けするとmRNAの安定性に影響を与える可能性があることが報告されており、これはMS2リピートの改良版を使用することで打ち消すことができる（Li et al., 2022; Vera et al., 2019）。我々は、モノマーMCPの2×タンデムリピート（tdMCP）を有するMS2-V14またはMS2-V721の使用にかかわらず、β-ACTIN-3′UTR-8xMS2 mRNAのGFPフォーカスが検出されたことを発見した（図1-図2A）。したがって、MS2ステムループとMCPの異なるバージョンを使用して、MASSを実施することができた。MASSによるイメージング中にmRNAの安定性が影響を受けるかどうかを直接検証するために、3つのmRNAの安定性を調べた： 中程度の安定性を持つmRNAとして報告されているMYC、HSPA1A、KIF18Bである（Vera et al., 2019; Sharova et al., 2009）。それらのmRNAの安定性は、8xMS2 V1のタグ付けによっても、MASSイメージングシステムの共発現によっても、大きな影響を受けないことがわかった（図1-図2B、C、図1-source data 1）。本研究では、3つのmRNAを調べただけであることは注目に値する。特定のmRNAの安定性がMASSによって影響を受けるかもしれない。もしそうであれば、イメージング実験にはMS2の改良版を使用する必要がある。
β-ACTINの3′UTRを持つmRNAがラメリポディアに局在することが報告されている（Katz et al.、2012）。これを裏付けるように、β-ACTIN-3′UTR-8XMS2 mRNAのGFPフォークは、HeLa細胞において実際にラメリポディアに局在することが確認された（図1-図3Aおよびビデオ1）。さらに、mRNAの局在がMASSによって影響を受けるかどうかを調べるために、マウス線維芽細胞株であるNIH/3T3細胞において、MASSまたは従来の24xMS2システムでβ-ACTIN-3′UTR mRNAを画像化しました。その結果、MASSまたは24xMS2システムで検出されたβ-ACTIN-3′UTR mRNAのGFPフォークは、同様の局在を示すことがわかりました（図1-図3B）。したがって、これらのデータは、MASSがRNAの細胞内局在に影響を与えないことを示唆した。
動画1
ダウンロード資産
生きたHeLa細胞におけるβ-ACTIN-8xMS2 mRNAのタイムラプスイメージング。
β-ACTIN-3′UTR-8xMS2mRNAのsfGFPフォークは、HeLa細胞のラメリポディアに局在する。白の破線は細胞を区分けしている。白い矢印はラメリポディアを示す。時間間隔、2秒 ... 続きを見る
MCP-24xSuntagを用いたMASSで単一RNA分子をイメージングできることを確認しました。次に、サンタグアレイの短い繰り返し配列（MCP-12xSuntag、MCP-6xSuntag）を用いたMASSが可能かどうか、従来の24xMS2イメージシステムと比較検討することを試みました。
従来の24xMS2 mRNAイメージングシステムでは、通常、核局在シグナル（NLS）をMCPに融合させてNLS-MCP-GFPをGFPに局在させていました。NLS-MCP-GFPは、mRNAに結合すると、mRNAとともに細胞質へ輸送される。この戦略により、β-ACTIN-3′UTR mRNAを1.21のシグナル対ノイズ比で検出できる（図1-figure supplement 4A, B, Figure 1-source data 1）。MCP-24xSuntagを用いたMASSは、1.79という最高のシグナル対比を示した。MCP-12xSuntagとMCP-6xSuntagは、β-ACTIN-3′UTR-8xMS2 mRNAを、従来の24xMS2システムよりも優れた1.42と1.48という同様のS/N比でラベルした（図1の図4C-I、図1のsource data1）。このように、MASSはイメージングに使用するSuntagのリピートの長さに関して柔軟性がある。Suntagの短いリピート（MCP-6xSuntag）を用いたMASSは、RNA標識に十分である。
MASSに関する重大な懸念として、mRNAの強力なタグ付けがmRNAのダイナミクスに影響を与える可能性があることが挙げられます。そこで、従来の24xMS2システム、あるいは長さの異なるSuntagアレイ（MCP-24xSuntag、MCP-12xSuntag、MCP-6xSuntag）を用いたMASSを用いて、β-ACTIN mRNAのライブセルでのイメージングを実施した。各イメージング条件におけるmRNAの移動速度を測定した。その結果、従来の24xMS2システムと比較して、MCP-24xSuntagまたはMCP-12xSuntagでMASS標識したmRNAは、より小さな速度を示し（図1-図5A、B、図1-source data 1）、より重い標識がmRNAの移動速度に影響することがわかった。一方、MCP-6xSuntagを用いたMASSで標識したmRNAは、従来の24xMS2システムで標識したものと同様の速度を示した（図1-figure supplement 5A, B, Figure 1-source data 1）。これらのデータは、mRNAの移動速度を測定するためにMASSを使用する場合、短いSuntagアレイ（MCP-6xSuntag）を使用する必要があることを指摘している。次に、従来の24xMS2システムやMASSで標識したβ-ACTIN mRNAの各GFPフォーカスの平均強度を、異なる長さのSuntagアレイ（MCP-24xSuntag、MCP-12xSuntag、MCP-6xSuntag）を用いて測定しました。その結果、MASSで検出されたGFPフォークは、24xMS2システムで検出されたものよりも高い強度を示した（図1-figure supplement 6, 図1-source data 1）。これらのデータは、MASSを用いることで、1つのmRNA分子がより多くのGFP分子と結合し、より高い蛍光強度を持つGFPスポットを形成できることを裏付けています。このようなアプリケーションでは、低出力レーザーを用いてmRNAを画像化できるため、不要な光毒性や光退色を抑え、高時間分解能でmRNAのダイナミクスを追跡することが可能です。
そこで、HeLa細胞において、β-ACTIN-3′UTR-8XMS2 mRNAを1秒間隔でタイムラプスイメージングしました（動画2）。その結果、mRNAのfociは様々なダイナミクスを示すことがわかった：(1)Fusion. GFPスポットが融合してより目立つスポットになる（図1E、ビデオ3）、（2）分裂する。大きなGFPフォシが小さなスポットに分裂する（図1Fおよびビデオ4）。GFPフォーカスが短時間接触した後、離れた（図1Gおよびビデオ5）ことから、細胞内に動的なRNA-RNA相互作用があることが示唆された；（4）動的な移動またはアンカーリング。β-ACTIN-3′UTR-8XMS2mRNAのほとんどのfociが細胞内で動的な動きを示したにもかかわらず、他のfociははるかに静的でほとんど動きを示さなかった（図1Hおよびビデオ6）。このことは、後者のmRNAが細胞内構造物に固定されている可能性を示唆している。
動画2
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HeLa細胞におけるβ-ACTIN-8xMS2 mRNAのsfGFPフォーカスの時間間隔1秒のタイムラプスイメージング。
スケールバー、5μm。
動画3
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HeLa細胞におけるβ-ACTIN-8xMS2 mRNAのsfGFPスポット（白と黄色の矢印）が融合して、より目立つ1つのスポットになる融合イベントを示すタイムラプスイメージングです。
時間間隔、2秒。スケールバー、5μm。
動画4
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HeLa細胞におけるβ-ACTIN-8xMS2 mRNAのsfGFPフォーカスの分裂現象を示すタイムラプスイメージング。大きなsfGFPフォーカスが小さなスポットに分裂する（白と黄色の矢印）。
時間間隔、1秒。スケールバー、1μm。
動画5
ダウンロード資産
HeLa細胞におけるβ-ACTIN-8xMS2 mRNAの2つのスポット（白矢印）間のsfGFPスポット（黄矢印）の過渡的な相互作用を示すタイムラプス画像。
時間間隔、2秒。スケールバー、1μm。
ビデオ6
ダウンロード資産
HeLa細胞におけるタイムラプスイメージングで、β-ACTIN-8xMS2 mRNAのsfGFPスポットが10秒間に渡って移動しないことを示す。
時間間隔、1秒。スケールバー、1μm。
私たちの最終目標は、生きた動物で内因性mRNAをイメージングするツールを開発することでした。ゲノムへの短い配列のノックインは、長い配列のそれよりもはるかに効率的であることがこれまでに報告されています（Wang et al., 2022; Paix et al., 2017）。MASSは、8xMS2（350 nt）をゲノム遺伝子座に挿入するだけでよいため、内在性mRNAのライブセルイメージングのために1300 ntの長い24xMS2をゲノムに挿入しなければならないという従来の障害を克服し、この利点を利用する。
次に、線虫である線虫を用いて、MASSが生きた動物のRNAイメージングに使用できるかどうかを具体的に検討しました。8xMS2をcdc-42 mRNAの3′UTRに配置し（図2-図1）、cdc-42-8xMS2、MCP-24xSuntag、scFv-sfGFPも生きた線虫の表皮で発現した。HeLa細胞での観察結果と同様に、明るいGFPフォークは、必要な要素がすべて存在する場合にのみ検出できた（図2-図1）。同様に、必須要素を除いた場合、病巣形成は完全に失敗した（図2-図1）。このように、MASSは生きた動物で外来RNAのイメージングを効率的に行うことができました。
次に、生きた動物の遺伝子発現の活性化と内因性mRNAの動態を可視化することを目指した。線虫の皮膚をモデルとし、複数の核を持つ表皮上皮で構成されています。レーザーや針で上皮に傷をつけると、その後、傷の修復のための特定の遺伝子発現や下流のシグナルカスケードがトリガーされ活性化されます（Xu and Chisholm, 2014; Figure 2A）。この目的のために、8xMS2を2つの内因性遺伝子、C42D4.3およびmai-1の3′UTR領域にノックし（図2Bおよび図2-図2A）、これらの発現レベルは創傷後に著しく増加すると報告された（Fuら、2020）。MCP-24xSuntagとscFv-sfGFPは、組織特異的プロモーターsemo-1とcol-19を用いて表皮で発現させた。次に、UVレーザーを用いて表皮のある領域を傷害した。傷をつける前、野生型（WT）でも8xMS2ノックイン動物でも、sfGFPの病巣はほとんど検出されなかった（図2Bおよび図2-図2A）。一方、C42D4.3およびmai-1 8xMS2ノックイン動物では、創傷から15分後に多数のGFPフォーカスが形成されたが、WT動物では見られなかった（図2Bおよび図2-図2A、ビデオ7-9）。この結果は、創傷によりC42D4.3とmai-1のmRNA発現が活性化したことを示唆している。これと一致して、qRT-PCRにより、C42D4.3およびmai-1のmRNAレベルが傷害の15分後に8倍以上アップレギュレートされた（図2Cおよび図2-図2B、図2-source data 1）ことから、GFP fociが内因性のC42D4.3-8xMS2およびmai-1-8xMS2 mRNAを検出できることが確認された。また、C42D4.3 mRNAの発現量（図2-図2C、図2-source data 1）と安定性（図2-図2D、図2-source data 1）は、WT、C42D4.3 8xMS2ノックイン動物、MASSイメージングシステム発現動物で同様で、MASSが内在性のC42D4.3 mRNAの発現レベルと安定性に影響しないことを示しています。
動画7
ダウンロード資産
レーザー照射後の線虫表皮における内因性C42D4.3-8xMS2 mRNAの動態をタイムラプスで観察した。
時間間隔：5秒、スケールバー：10μm。
ビデオ8
ダウンロード資産
レーザー創傷後の線虫表皮における内因性C42D4.3-8xMS2 mRNA動態のタイムラプスイメージング。
異なるワームを示す。時間間隔、5秒。スケールバー、10μm。
図2 5つのサプリメントを含む
アセットをダウンロードする アセットを開く
SuntagシステムによるMS2ベースのシグナル増幅を用いた線虫表皮の内在性mRNAのライブイメージング。
(A) 線虫の表皮における内在性mRNAのライブイメージングの戦略の概略図。(B）生きた線虫の表皮における内因性C42D4.3-8xMS2 mRNAの代表画像 ... もっと見る
図2-source data 1
qRT-PCR (Quantitative Reverse Transcription PCR)、線虫のMASSで検出されたmRNAのフォーシスの数、大きさ。
https://cdn.elifesciences.org/articles/82178/elife-82178-fig2-data1-v3.xlsx
Download elife-82178-fig2-data1-v3.xlsx
図2-図解5
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内因性C42D4.3-8xMS2 mRNAの病巣は、BFP-8xMS2 mRNAの病巣よりも大きなサイズを示している。
(A) MCP-24xSuntagを用いたMASSによる線虫表皮のBFP-8xMS2 mRNAのタイムラプスイメージング。スケールバー、10μm。(B) 5分間、BFP-8xMS2 mRNAのfociのpunctaサイズの定量化、 ... 続きを見る
図2-図解4
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アクチノマイシンDの処理により、C42D4.3 mRNAのフォーカスの形成が阻害される。
線虫の表皮における内因性C42D4.3-8xMS2 mRNAを、創傷の前後にタイムラプスイメージングした。線虫は、創傷の3時間前にアクチノマイシンD（30μM）で処理した。白 ... もっと見る
図2-図解3
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線虫の表皮における内因性遺伝子発現の高速活性化と拡散。
創傷前後の生きた線虫の表皮における内因性C42D4.3-8xMS2 mRNAのタイムラプスイメージング。白い破線の円は傷の部位を示す。スケールバー、10μm。
図2-図解2
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SuntagシステムによるMS2ベースのシグナル増幅を用いた線虫の表皮における内因性mRNAのライブイメージング。
(A) 図2Aに記載した戦略を用いた、生きた線虫の表皮における内因性 mai-1-8xMS2 mRNAの代表的な画像。左：8xMS2無しのmai-1。右：8xMS2を使用したmai-1。画像 ... もっと見る
図2-図1
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SuntagシステムによるMS2ベースのシグナル増幅を用いた線虫のcdc42 mRNAのライブイメージング。
線虫のcdc42-8xMS2 mRNAの代表的な画像。sfGFP蛍光シグナルを示す。左パネル： cdc42-8xMS2、MCP-24xSuntag、scFv-sfGFPのコンストラクトを... もっと見る
ビデオ9
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レーザー照射後の線虫表皮における内因性mai-1-8xMS2 mRNAの動態をタイムラプスで観察した。
時間間隔、2秒、スケールバー、10μm。
C42D4.3とmai-1のmRNA発現量が創傷後に有意に増加したことから、転写が促進されることが予想された。GFPは転写が活発であれば、核内に広範な病巣を形成するはずである。しかし、核内に大きなGFPフォーカスが出現することを検出できなかった。線虫の表皮は、139個の核が異なる焦点面に配置された合胞体である。私たちの顕微鏡では、通常4-10個の核が存在する1つの焦点面のみを画像化することができました。そのため、転写が活発な核は焦点から外れてしまい、転写部位に形成されたGFPフォーカスが検出されなかったと考えられる。
次に、線虫の表皮に傷をつけた後の内因性C42D4.3-8xMS2 mRNAの動態を追跡した。その結果、創傷部位の近傍では、創傷後1分という早い段階でGFPフォーカスが検出された（図2D、図2-図3、動画7および8）。コントロールとして、遺伝子の転写を強力に阻害するアクチノマイシンDで線虫を前処理した。その場合、創傷後にGFPフォーカスは検出されなかった（図2-図4）。このことから、GFPフォークは新たに合成されたC42D4.3-8xMS2 mRNAであることが示された。このデータから、遺伝子発現の活性化と転写は極めて高速（この場合、刺激後1分以内）に起こることが示された。また、GFP病巣の出現は、傷害部位周辺から徐々に遠位部へと広がっていく。全病巣数は表皮で着実に増加した（図2D、E、図2-図3、動画7、8）。これらのデータから、創傷は傷害部位周辺で下流遺伝子発現を活性化するシグナルを生成することが示唆された。そして、そのシグナルは遠位領域まで拡散し、そこで遺伝子発現を誘導することができた。また、GFPフォーカスは優先的に融合を起こし、フォーカスのサイズが大きくなった（図2F、G、動画10、図2-source data 1）。一方、BFP-8xMS2を表皮に発現させ、MASSでイメージングした場合（図2-figure supplement 5A, Figure 2-source data 1）、このような融合現象はあまり見られず（動画11）、BFP-8xMS2 mRNAの点状サイズは5分間で一定となった（図2-figure supplement 5A-C, Figure 2-source data 1）。また、C42D4.3-8xMS2 mRNAのパンクチャサイズは、BFP-8xMS2 mRNAのそれよりも有意に大きかった（図2-図5C, 図2-source data 1）。これらのデータから、C42D4.3 mRNAは創傷後にクラスタリングを起こし、生体内でRNA顆粒を形成することが示唆された。我々の観察と一致するように、ショウジョウバエの胚ではmRNAが大きなクラスターを形成し、共翻訳されることが以前に報告されている（Dufourt et al., 2021）。
動画10
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線虫の表皮における内因性C42D4.3-8xMS2 mRNAとsfGFPの融合現象を示すタイムラプスイメージングで、小さなsfGFPスポット（白矢印）がより目立つスポットに融合していく。
時間間隔、5秒。スケールバー、5μm。
ビデオ11
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線虫の表皮におけるBFP-8xMS2 mRNAの動態をタイムラプスイメージングしたもの。
時間間隔は0.5秒、スケールバーは10μm。
考察
最近、PP7とSuntagまたはMoontagの組み合わせによるSunRISERおよびMoonRISERシステムにより、生きた細胞内で単一の外来mRNAのイメージングが可能になることが報告されている。計算および実験的アプローチにより、著者らはSunRISERシステムをさらに最適化し、SunRISERが生体細胞内で過剰発現したmRNAの長期イメージングに優れたアプローチを提供することを示しました（Guo and Lee, 2022）. SunRISERシステムとMASSの原理は似ており、タンパク質のシグナルアンプを使用してRNAイメージングのために高い蛍光シグナルを生成する。本研究では、MASSを従来の24xMS2 mRNAイメージングシステムと比較し、mRNAの安定性とダイナミクスに対するMASSの効果を特徴付けました。さらに、我々は主に、これまでの研究で検証されていない、生きた動物の内因性RNAを画像化するためのMASSの適用を検討しました。ここでは、このような信号増幅戦略が、従来のMS2ベースのライブセルRNAイメージングで使用される24xMS2と比較して、わずか8xMS2を利用する内因性mRNAのイメージングに有用であることを示しました。短いMS2の利点は、1300 ntの長い24xMS2をゲノム遺伝子座に挿入する際の困難さを軽減し、内在性mRNAのイメージングに大きなメリットをもたらします。本ツールにより、培養細胞や生きた動物における内因性レベルでのRNAの転写、核外輸送、細胞内局在、翻訳、RNAセンシング、分解などの研究が促進されることを期待しています。
材料と方法
セルライン
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HEK293T/17およびNIH/3T3細胞株は、Procell社から購入した。ヒト子宮頸がん細胞株HeLaは、Christine Mayr（Memorial Sloan Kettering Cancer Center）の研究室からの贈り物であった。細胞は、4500mg/lグルコース、10%ウシ胎児血清、100U/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で37℃、5%CO2で維持した。
ワーム培養
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すべての菌株は、特に断りのない限り、大腸菌OP50を含む線虫増殖培地（NGM）プレート上で20～22.5℃で培養した。WT 株として N2 Bristol 株を使用した。
哺乳類細胞用コンストラクト
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PCR反応は全てKOD One PCR Master Mix -Blue-(東洋紡)を用いて実施した。組換えクローニングはClonExpress One Step Cloning Kit (Vazyme)を用いて行った。
MS2コンストラクト
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MS2 V1コンストラクトについては、Singer Lab (Addgene, #27118 ) (Bertrand et al., 1998)によって報告されたMS2配列に基づいて2xMS2が設計された。2xMS2の配列は以下の通りである：ctgcaggtcgactctagaaaacatgaggatcacatgtctgcaggtcgactagaaaacatgaggatcacatgt。 EcoRI-2xMS2-EcoRV を合成して、EcoRI と EcoRV の制限部位を持つ pcDNA-puro-BFP バックボーンに挿入して pcDNA-puro-BFP-2xMS2 構築物とすることができた。EcoRV-2xMS2-XhoIを合成し、EcoRVおよびXhoI制限部位を持つpcDNA-puro-BFP-2xMS2バックボーンに挿入し、pcDNA-puro-BFP-4xMS2コンストラクトを作製しました。XhoI-2xMS2-ApaIを合成し、XhoIおよびApaI制限部位でpcDNA-puro-BFP-4xMS2バックボーンに挿入し、pcDNA-puro-BFP-6xMS2構築物を作製した。BamHI-2xMS2-EcoRIを合成し、BamHIおよびEcoRI制限部位でpcDNA-puro-BFP-6xMS2バックボーンに挿入し、pcDNA-puro-BFP-8xMS2コンストラクトを作製した。ライゲーションはT4 DNAリガーゼで行った。
pcDNA-puro-BFP-β-ACTIN-3′UTR-8xMS2を作るために、373bpの3′UTRを有するβ-ACTINコード配列をHEK293T/17細胞のcDNAからPCR増幅し、組み換えクローニングによってKpnIとBamHI制限部位を有するpcDNA-puro-BFP-8xMS2ベクトルに挿入した。プライマーはβ-ACTIN Fとβ-ACTIN Rを用い、3′UTRが373bpのβ-ACTINコード配列は、β-ACTIN F: TGAATCTGTACAAGAAGCTTGTACCGATGATGATCGCCGCGCTCG、 β-ACTIN R: TTCCACCACTGGACTAGTGATCCAAGCAATGCTATCACCTCCTGとした。また、この断片を組換えクローニングによりKpnIおよびBamHI制限部位を有するpcDNA-puro-BFP-6xMS2ベクターに挿入してpcDNA-puro-BFP-β-Aクチン-3′UTR-6xMS2 を得た。
pcDNA-puro-BFP-β-ACTIN-3′UTRは、HEK293T/17細胞のcDNAから3′UTRが373bpのβ-ACTINコード配列をPCR増幅し、組み換えクローニングによりKpnIおよびBamHIサイトを有するpcDNA-puro-BFPベクトルに挿入した。プライマーは、β-ACTIN Fとβ-ACTIN Rを用いた。
pcDNA-puro-BFP-β-ACTIN-3′UTR-24xMS2 V1.Aを作成する、 を作成するために、pcDNA-puro-BFP-β-ACTIN-3′UTR-6xMS2 V1ベクターからBFP-β-ACTIN-3′UTR配列を切り出し、ライゲーションによりNheIおよびEcoRIサイトを持つpcDNA-puro-EGFP-24xMS2（EGFPは同じ酵素で切断された）ベクターの中に挿入しました。
pcDNA-puro-BFP-β-ACTIN-3′UTR-8xMS2 V7を作るために、8xMS2 V7配列をAddgene construct (#140705) (Tutucci et al., 2018)に基づいて設計した。BamHI-8xMS2 V7-EcoRIを合成し、BamHIおよびEcoRI制限部位を有するpcDNA-puro-BFP-β-ACTIN-3′UTRベクターに挿入した。8xMS2 V7 の配列は pET263-pUC57 24xMS2V7 (Addgene, #140705 ) を参考にした。合成した配列は以下の通りである： ggatcctaaggtacctaattgcctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcaggtcgactctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcagtattcccgggttcattagatcctaaggtacctaattgcctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcaggtcgactctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcagtattcccgggttcattagatcctaaggtacctaattgcctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcaggtcgactctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcagtattcccgggttcattagatcctaaggtacctaattgcctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcaggtcgactctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcagtattcccgggttcattagatccgaattc.
pcDNA-puro-BFP-C-MYC-3′UTRを作るために、HeLa細胞のcDNAからプライマーC-MYC-3′UTR FとC-MYC-3′UTR Rを用いて250bpの長さのC-MYC-3′UTRをPCR増幅させた。このC-MYC-3′UTRを、組換えクローニングにより、KpnIおよびBamHI制限部位を有するpcDNA3.1-puro-BFPベクターに挿入した。c-myc-3′utr f: tgaatctgtacaagaagcttggtacccctcaacgttagcttcacc, c-myc-3′utr r: ctgcagggatccgtaaatcttaaaattttaaaaattcttaaatacaaatctgtt.
pcDNA-puro-BFP-C-MYC-3′UTR-8xMS2を作成するために、HeLa細胞のcDNAからプライマーC-MYC-3′UTR FおよびC-MYC-3′UTR Rを用いて250bpの長さを有するC-MYC-3′UTRをPCR増幅した。このC-MYC-3′UTRを、組換えクローニングにより、KpnIおよびBamHI制限部位を有するpcDNA3.1-puro-BFP-8xMS2ベクターに挿入した。c-myc-3′utr f: tgaatctgtacaagaagcttggtacccctcaacgttagcttcacc, c-myc-3′utr r: ctgcagggatccgtaaatcttaaaattttaaaaattcttaaatacaaatctgtt.
pcDNA-puro-BFP-HSPA1A-3′UTRを作るために、HeLa細胞のcDNAからプライマーHSPA1A-3′UTR FおよびHSPA1A-3′UTR Rを用いて200bpの長さのHSPA1A-3′UTRをPCR増幅した。C-MYC-3′UTRは、組換えクローニングにより、KpnIおよびBamHI制限部位を有するpcDNA3.1-puro-BFPベクターに挿入した。hspa1a-3′utr f: aagcttggtaccgccaaagccgcgggatc, hspa1a-3′utr r: ctgcagggatccgtattaaagaaatagtcgtaagatggcagtataaattca.
pcDNA-puro-BFP-HSPA1A-3′UTR-8xMS2を作るために、HeLa細胞のcDNAからプライマーHSPA1A-3′UTR FおよびHSPA1A-3′UTR Rを用いて200bpの長さのHSPA1A-3′UTRをPCR増幅した。C-MYC-3′UTRは、組換えクローニングにより、KpnIおよびBamHI制限部位を有するpcDNA3.1-puro-BFP-8xMS2ベクターに挿入した。hspa1a-3′utr f: aagcttggtaccgccaaagccgcgggatc, hspa1a-3′utr r: ctgcagggatccgtattaaagaaatagtcgtaagatggcagtataaattca.
pcDNA-puro-BFP-KIF18B-3′UTRを作るために、プライマーKIF18B-3′UTR FおよびKIF18B-3′UTR Rを用いてHeLa細胞のcDNAから1131bp長のKIF18B-3′UTRをPCR増幅した。このKIF18B-3′UTRを、組換えクローニングによりKpnIおよびBamHI制限部位を有するpcDNA3.1-puro-BFPベクターに挿入した。kif18b-3′utr f: tgaatctgtacaagaagcttggtaccgcagtggagacagcacg, kif18b-3′utr r: ctgcagggatccatcttcaccaggactgtggttgg.
pcDNA-puro-BFP-KIF18B-3′UTR-8xMS2を作るために、HeLa細胞のcDNAからプライマー KIF18B-3′UTR F KIF18B-3′UTR Rを用いて1131bpの長さのKIF18B-3′UTRをPCR増幅した。このKIF18B-3′UTRを、組換えクローニングにより、KpnIおよびBamHI制限部位を有するpcDNA3.1-puro-BFP-8xMS2ベクターに挿入した。kif18b-3′utr f: tgaatctgtacaagaagcttggtaccgcagtggagacagcacg, kif18b-3′utr r: ctgcagggatccatcttcaccaggactgtggttgg.
SuntagおよびMCPコンストラクト
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pcDNA-MCP-mCherry-6xGCN4コンストラクトを作るために、6xSuntag（6xGCN4）をpcDNA4TO-24xGCN4_v4-kif18b-24xPP7 (Addgene, #74928 ) (Yan et al.、 2016）をプライマー6xSuntag Fおよび6xSuntag Rを用いて、組換えクローニングによりBsrGIおよびApaI制限部位を有するpcDNA-MCP-mCherryベクターに挿入した。6xSuntag F: CACCGGCGCATGACGAGCTGTACAAGGGTGGAGTTCTGGAGGA, 6xSuntag R: GCTGATCAGCGGTTAACGGCCCTTATCCTGAGCCGGAACC.
pcDNA3.1-tdMCP-6xGCN4を作成するために、pcDNA-puro-tdMCP-12xSuntagからtdMCPを切り出し、ライゲーションによりKpnIおよびBsrGI制限サイトを有するpcDNA-MPC-mCherry-6xGCN4ベクトルに挿入しました。
pcDNA-puro-MCP-mCherry-12xSuntag構築物を作るために、12xSuntag（12xGCN4）をpcDNA4TO-24xGCN4_v4-kif18b-24xPP7 (Addgene, #74928 ) (Yan et al.、 2016）をプライマー12xSuntag Fおよび12xSuntag Rを用いて、12xSuntagを組換えクローニングによりBsrGIおよびApaI制限部位を有するpcDNA-MCP-mCherryベクターに挿入した。12xSuntag F: CACCGGCGCATGACGAGCTGTACAAGGGTGGAGTTCTGGAGGA, 12xSuntag R: GCTGATCAGCGGTTAACGGCCCTTAGCCCGAGCCCGAGCC.
pcDNA3.1-mCherry-12xGCN4を作成するために、プライマーmCherry-12xSuntag FおよびmCherry-12xSuntag Rを用いてpcDNA-puro-MCP-mCherry-12xSuntagからmCherry-12xGCN4をPCR増幅させた。mCherry-12xSuntagは、組換えクローニングによりKpnIおよびXbaI制限部位でpcDNA-MCP-mCherryベクターに挿入した。 mCherry-12xSuntag F: AGCGTTTAAACTTAAGGCTTGTACCATGTGAGCAAGGGCGAGAGGA, mCherry-12xSuntag R: GCTGATCAGCGGTTTAAACGGCCCTTAGCCCGAGCCCAGGCC.
pcDNA3.1-tdMCP-12xGCN4を作るために、tdMCPをファージUBC NLS-HA-2XMCP-tagRFPt (Addgene, #64541 ) (Halstead et al.,.) からPCR増幅した、 2015）をプライマーtdMCP-12xSuntag FおよびtdMCP-12xSuntag Rで増幅し、組換えクローニングによりKpnIおよびBsrGI制限部位を有するpcDNA-mCherry-12xSuntagベクターに挿入した。tdMCP-12xSuntag F:AGCGTTTAAACTTAAGGCTTGTACCTGCTAGCCGTTAAAATGGCTTCTAAC, tdMCP-12xSuntag R:TCCTCCAGAACCTCCACTTGTACATCATTCTAGAATCCGCGTAGAT.
pcDNA-puro-MCP-mCherry-24xSuntagコンストラクトを作るために、24xSuntag（24xGCN4）をプライマー24xSuntag Fおよび24xSuntag Rを用いてpcDNA4TO-24xGCN4_v4-kif18b-24xPP7 (Addgene, #74928 ) からPCR増幅した。24xSuntagは、組換えクローニングにより、BsrGIおよびApaI制限部位を有するpcDNA-MCP-mCherryベクターに挿入した。24xSuntag F: CACCGGCGCATGACGAGCTGTACAAGGGTGGAGTTCTGGAGGA, 24xSuntag R: GCTGATCAGCGTTAACGGCCCTTAACCCGAGCCAGAACC.
pcDNA3.1-mCherry-24xGCN4を作るために、プライマーmCherry-24xSuntag FおよびmCherry-24xSuntag Rを用いてpcDNA-puro-MCP-mCherry-24xSuntagからmCherry-24xGCN4をPCR増幅させた。mCherry-24xSuntagは、組換えクローニングによりKpnIおよびXbaI制限部位でpcDNA-MCP-mCherryベクターに挿入した。 mCherry-24xSuntag F：AGCGTTTAAACTTAAGGCTTGGTACCATGTGAGCAAGGGCGAGGA，mCherry-24xSuntag R：GCTGATCAGCGGTTTAAACGCCCTTAACCCGAGCCAACC.
pcDNA3.1-tdMCP-24xGCN4を作るには、pcDNA-puro-tdMCP-12xSuntagからtdMCPを切り取り、ライゲーションによりKpnIとBsrGIサイトを持つpcDNA3.1-mCherry-24xGCN4ベクトルに挿入しました。
pcDNA-puro-mCherry-24xSuntagコンストラクトを作るために、プライマーmCherry-24xSuntag FおよびmCherry-24xSuntag Rを用いてpcDNA-puro-MCP-mCherry-24xSuntagベクターからmCherry-24xSuntagをPCR増幅させた。その後、KpnIおよびXbaI消化によりpcDNA-puro-MCP-mCherryバックボーンからMCP-mCherryを切り離し、組換えクローニングによりmCherry-24xSuntagと置換した。 mCherry-24xSuntag F: AGCGTTTAAACTTAAGGCTTGGTACCATGTGAGCAAGGCGAGGA、mCherry-24xSuntag R: CAGCGGTTTAAACGGCCC.
pcDNA-puro-scFv-sfGFPコンストラクトを作るために、プライマーscFV-HAtag-sfGFP-GBI FおよびscFV-HAtag-sfGFP-GBI Rを用いてpHR-scFv-GCN4-sfGFP-GB1-dWPRE（アドジーン、#60907）からPCR増幅した。このscFV-HAtag-sfGFP-GBIを、組換えクローニングによりNheIおよびHindIII制限部位を有するpcDNA-puroベクターに挿入した。scFV-HAtag-sfGFP-GBI F: ACCCAAGCTGGCTAGCAACCATGGGCCGACATCGTG, scFV-HAtag-sfGFP-GBI R: GTGGATCCGAGCTCGTACCAAGCTTTATTCGTTACCGTGAAGGTTGTGTA.
pcDNA-puro-sfGFPコンストラクトを作るために、プライマーHAtag-sfGFP-GBI FとHAtag-sfGFP-GBI Rを用いてpcDNA-puro-scFv-sfGFPベクターからPCR増幅し、組み換えクローニングによりNheIとHindIII制限部位でHAtag-sfGFP-GBIがpcDNA-puroベクターに挿入した。HAtag-sfGFP-GBI F：CTATAGGGAGACCCAAGCTGCTAGCAACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACG, HAtag-sfGFP-GBI R：GCACACCACTGGACTAGTGG。
pcDNA3.1-tdMCP-sfGFPを作るために、プライマーtdMCP-sfGFP FおよびtdMCP-sfGFP Rを用いて、pcDNA-puro-scFv-sfGFPからsfGFPをPCR増幅した。このsfGFPを、組換えクローニングによりBsrGIおよびApaI制限部位を有するpcDNA-tdMCP-12xGCN4ベクターに挿入した。tdMCP-sfGFP F: CGCGGATTCTAGAATGTGATGTACAGTTCAGGAGCGCGGAA, tdMCP-sfGFP R: GCTGATCAGCGGTTTAAACGGCCCTTATTCGTTACCGTGAAGGTTTTGTA.
pcDNA3.1-NLS-tdMCP-sfGFPを作成するために、NLS配列を合成し、NheI制限部位を持つpcDNA3.1-tdMCP-sfGFPベクターに挿入しました。NLSの配列は以下の通りである：ccaaaaaagaaaagaaaagtt。
線虫のためのコンストラクト
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組換えクローニングはClonExpress One-Step Cloning Kit(Vazyme)を用いて実施した。
Pcol-19-mKate2::CDC-42-8xMS2 は、2つの PCR 増幅断片の組換えクローニングにより作製した。断片1：Pcol-19-mKate2::CDC-42は、プライマーzju4844でPcol-19-mKate2::CDC-42構築物からPCR増幅した： CAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATCAAGおよびzju4845： CTAGAGAATATGCACTTCTTCTTCTCCTG。フラグメント2：8xMS2は、プライマーzju4555でpcDNA-puro-BFP-β-ACTIN-3′UTR-8xMS2からPCR増幅した： CAGGAGAAGAAGAAGTGCAATTCTAGCTGCAGGTCGACTCTAGAAAACおよびzju4556：GCTGGTCGAATTCGCCCTTACATGGGTGATCCTCATGTTTC。
Psemo-1-MCP-24xSuntagは、2つのPCR増幅断片の組換えクローニングによって生成された。断片1：Psemo-1は、プライマーzju4540：TGAGACTTTTCTTGGCGGおよびzju4541：AGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGを用いてPsemo-1-tomm-20-linker-mKate2-tbb構築物からPCR増幅されたものだった。フラグメント2：MCP-24xSuntagは、プライマーzju4538：TCACAAGTTTGTACAAAAAGCAGGCTATGGCTTCTAACTTACTCAGTTCGおよびzju4539：GTGCCGCCAAGAAAAGTCTCATTAACCCGAGCCAGAACCCでpcDNA-pro-MCP-mCherry-24xSuntag構築からPCR増幅しました。
Pcol-19-BFP-8xMS2は、2つのPCR増幅断片の組換えクローニングによって生成された。断片1：Pcol-19-8xMS2は、プライマーzju4764を用いてPcol-19-mKate2：：CDC-42-8xMS2からPCR増幅した： GGGAGGTGATAGCATTGCTTGGおよびzju4765： TCAGCGGTTTAAACGGを使用した。フラグメント2：BFPは、プライマーzju5441：CCCGTTTAAACCCGCTGAATTTGCGTCGCTGCAATTCTTATCACおよびzju5442：ATCCAAGCAATGCTATCACCTCCCAGATCCGGCTCCATTAAGCTTGTGでPcol-19-lifact-BFPをPCR増幅した。
Pcol-19-scFv-sfGFPは、2つのPCR増幅断片の組換えクローニングによって生成された。断片1：Pcol-19は、プライマーzju4550を用いてpCR8-Pcol-19-GFP-CDC-42構築物からPCR増幅した： AAGGGCGAATTCGACCCAGCおよびzju4551: ACCGGTGAGCTACCTGTACを用いた。フラグメント2：scFv-sfGFPを、プライマーzju4552：GGTACAGGTAGAGCTCACCGGTGCAACCATGGGCCGACおよびzju4553：GCTGGTCGAATTCGCCCTTTTACTCTAGACTCGAGCGGCを用いて、pcDNA-puro-scFv-sfGFP構築物からPCR増幅した。
Pcol-19-sfGFPは、プライマーzju5038：TACCCATACGATGTTCCAGATTACGおよびzju5039：GGTTGCACCGTGAGCTCを用いてKLD Enzyme mix（NEB）を用いてPcol-19scFv-sfGFPプラスミドからscFvを取り去って生成した。
Psemo-1-MCPは、プライマーzju5040：TGAGACTTTTCTTGGCGGCAおよびzju5041：TCCTCCAGAACCTCCACCを用いてKLD Enzyme mix（NEB）を用いてPsemo-1-MCP-24xSuntagプラスミドから24xSuntagを除去して生成した。
Psemo-1-24xSuntagは、プライマーzju5042：GGATCATCAGGTGCTGGATCCGおよびzju5043：AGCCTGCTTTTGTACAAACTTGを用いてKLD Enzyme mix（NEB）を用いてプラスミドPsemo-1-MCP-24xSuntagプラスミドからMCPを取り除くことにより生成した。
コンストラクトはAddgeneに寄託される。
トランスジェニックワーム
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染色体外配列トランスジェニックワームの作製には、プラスミドの異なる組み合わせを使用した。簡単に説明すると、Psemo-1-MCP-24xSuntagの50ng/μlプラスミド、Pcol-19-抗体-sfGFPの10ng/μlプラスミドおよび10ng/μl共射マーカーPttx-3-RFPをN2およびノックイン動物に注射した。染色体外の菌株は以下の通りである： SHX3314： Pcol-19-mKate2::CDC-42-8xMS2, Psemo-1-MCP-24xSuntag, Pcol-19-scFv-sfGFP(zjuEx2144); SHX3749: Pcol-19-mKate2::CDC-42-8xMS2; Psemo-1-MCP; Pcol-19-scFv-sfGFP(zjuEx2031);SHX3751: Pcol-19-mKate2:： CDC-42-8xMS2； Psemo-1-MCP-24xSuntag； Pcol-19-sfGFP(zjuEx2033); SHX3755： Pcol-19-mKate2：． CDC-42-8xMS2； Psemo-1-24xSuntag； Pcol-19-scFv-sfGFP(zjuEx2037); SHX3757: Pcol-19-mKate2::CDC-42； Psemo-1-MCP-24xSuntag； Pcol-19-scFv-sfGFP(zjuEx2144); SHX3908： C42D4.3-8xMS2（syb5468）；Psemo-1-MCP-24xSuntag；Pcol-19-scFv-sfGFP（zjuEx2144）；SHX3909：mai-1-8xMS2（syb5458）；Psemo-1-MCP-24xSuntag；およびPcol-19-scFv-sfGFP（zjuEx2144）；SHX4319：Pcol-19-BFP-8xMS2（zjuEx2429）．
トランスフェクション
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すべてのトランスフェクションにLipofectamine 2000（Invitrogen）およびEndofectin MAX（Genecopoeia）を使用した。
ライブセルイメージング
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図1および動画1～6の画像について：
HeLa細胞を35mmガラス底ディッシュ（NEST、801001）に0.13×106の密度でプレーティングした。示された構築物をHeLa細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから12〜24時間後に、60倍の対物レンズを備えたスピニングディスク共焦点顕微鏡（Nikon T2 Microscope; Apo ×60 oil; 1.4 NA）を用いて、SoRaモードで細胞を撮像した。露光時間は500msであった。タイムラプスイメージングでは、時間間隔を1秒または2秒に設定した。画像はFIJI（ImageJ）を用いて解析した。
サプリメントに示す画像について：
HeLa細胞を35mmガラス底ディッシュ（BGI、BGX-03520-100）に0.8×106の細胞数でプレーティングして12時間培養した。指示された構築物をHeLa細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから12時間後、SoRaモードを使用して、60倍の対物レンズを備えたスピニングディスク共焦点顕微鏡（Olympus SpinSR10 Microscope; Apo ×60 oil; 1.5 NA）により細胞を画像化した。異なるパラメータを使用した：
画像は補足に示す： 露光時間は500ms。
mRNAの移動速度を算出するためのタイムラプスイメージング： 露光時間は200ms、インターバルは217msに設定した。15フレームを記録。
強度とS/Nを計算するためのZスタックイメージング： 露光時間は500msとした。レンジモードを使用し、z間隔0.5μmで5面のスタックを得た。
細胞内での1分子FISHと画像取得
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MS2のステムループとリンカー領域に対するsmFISHプローブとして、2つの3′Cy3蛍光標識DNAオリゴ（プローブ-1：catgggtgatcctcatgt、プローブ-2：ttctagagtcgacctgca）をTsingkeによって合成された。HeLa細胞を35mmガラス底ディッシュ（BGI, BGX-03520-100）に0.8×106の密度でプレーティングして12時間増殖させ、示した構築物でトランスフェクションした。トランスフェクションから12時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、2％ホルムアルデヒドで37℃、10分間固定し、PBSで5分間、それぞれ2回洗浄した。その後、PBSを捨て、2mlの70％エタノールを添加した。プレートは4℃で8時間保持した。70％エタノールを吸引し、1mlの洗浄バッファー（2×SSC（クエン酸生理食塩水）、10％ホルムアミド、RNaseフリー水）を加え、5分間RTでインキュベートした。ハイブリダイゼーションミックスは、10％デキストラン硫酸、10％ホルムアミド、2×SSC、2mMリボヌクレオシドバナジル複合体（NEB）、200μg/ml酵母tRNA（Sigma、10109495001）、10nMプローブ-1、および10nMプローブ-2を混合して調製しました。各プレートに、800μlのハイブリダイゼーションミックスを加え、37℃で16時間ハイブリダイゼーションした。プレート上の固定された細胞を、暗所であらかじめ温めた洗浄バッファー（1ml、37℃）で30分間（各回15分間）2回洗浄し、その後PBSTで1回素早く洗浄し、3時間以内にイメージングするためにPBSTに保管した。画像は、Airyscan超解像モードを備えた共焦点ZEISS LSM 880を使用して撮影した。
CRISPR-Cas9を介した線虫の遺伝子ノックイン
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C424.3-8xMS2(syb5468)およびmai-1-8xMS2(syb5458)ノックイン動物は、CRISPR-Cas9システムを用いて作出した。簡単に説明すると、2つの修復テンプレートをpDD282プラスミド内でギブソンアセンブリー法を用いてクローニングした。sgRNA、修復テンプレート、Peft-3-Cas9-NLS-pU6-dpy-10 sgRNA、および共注マーカーとしてPmyo-2-cherryをN2ワームに注入した。ノックイン動物は、PCRによる遺伝子型判定と塩基配列の決定によって確認された。ローラーまたはダンピー動物はヒートショックまたはアウトクロスを行い、マーカーを除去した。本研究で使用したsgRNAの配列は以下の通りである： C42D4.3 sg1 (CCAAAACTTGCTTGCCAGAACTT); C42D4.3 sg2 (CCAGAACTTTCGGACAATAATTG); mai-1 sg1 (ACAACATCAGCAACGACTGAAGG); mai-1 sg2 (CGACTGAAGGAAATCGAGAAAGG). 正確な配列のノックインは、以下のように記述されている： GGGGTGATAGCATGCTTGATCCCTGAGTCCGACTGAAAACATGAGATCACCCATCTGCAGTCCGAC tctagaaaacatgaggatcacccatgtgaattcctgaggtcgactagaaaacatgaggatcacccatgtctgcaggtcgactagaaaacatgaggatcacatgtgatcctgagtcgactactagaaaacacatgtcacatgatcaggtctgacacatgtctagctgagactagaacatgagcccagtctgtgtctgctagagaaaaaactgagcagtgacactgctacatcacactgtctccgctgacatgagactgacactgacattccgcgcgcgcgacatgtgacacacacacacatctctaactgctgagatactaactaactaactcGacattcccacattgtgtggcccagtgacacacacactaCTaCT
薬物治療
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アクチノマイシンD原液をDMSO（ジメチルスルホキシド）に溶解し、M9で希釈して作業濃度30μMとした。若齢成虫期のワームを、1.5mlの微量遠心管を用いて100μlのアクチノマイシンD（APExBIO；カタログ番号A4448）溶液（大腸菌OP50含有）中で20℃、3時間インキュベートした。その後、虫を新鮮なNGMプレートに移し、乾燥させてから傷つけ、画像化した。
線虫におけるmRNA安定性試験
詳細なプロトコルを請求する
WT、C42D4.3-8xMS2ノックイン動物、MASSイメージングシステム発現動物、MASSイメージングシステム発現C42D4.3-8xMS2ノックイン動物のワーム（n = 200）を、200μlアクチノマイシンD溶液（E. coil OP50含有）中で20℃、0、3、6時間インキュベートした（1.5 mlチューブを用いた）。処理したワームは、C42D4.3発現のqRT-PCR（Quantitative Reverse Transcription PCR）用のRNAを抽出するために使用した。
細胞内mRNA安定性試験
詳細なプロトコルを請求する
3つの外来遺伝子（C-MYC、HSPA1A、KIF18B）を選択した。各遺伝子について、8xMS2あり、なしの2種類のプラスミドを構築した。トランスフェクションは3つのグループで行った： BFP-gene-3′UTR、BFP-gene-3′UTR-8xMS2、およびtdMCP-24xSuntagおよびscFV-sfGFPと共トランスフェクションしたBFP-gene-3′UTR-8xMS2。HeLa細胞を12ウェルプレートに0.3×106の密度でプレーティングして24時間増殖させ、示した構築物でトランスフェクションした。トランスフェクションの12時間後、5μg/mlのActinomycin D（Act D、APExBIO、A4448）を添加し、また、無処理の最初のサンプルを収集した。Act D処理を行った細胞は、3時間後と6時間後に別々に回収した。すべてのサンプルは、qRT-PCR（Quantitative Reverse Transcription PCR）のためのRNA抽出に使用された。
ウオーディングアッセイ
詳細なプロトコルを請求する
マイクロポイントUVレーザーを用いて、若齢成虫期のワームの表皮に傷をつけた。簡単に説明すると、若成虫期のワームをスライド上の4％アガロースゲルにマウントし、12μMレバミソールでナルコ化し、Micropoint UVレーザーで傷をつけた。エネルギーは65から70の範囲であった。繰り返し周波数は10Hzで、5回繰り返した。
線虫のライブイメージング
詳細なプロトコルを請求する
虫の画像は、スピニングディスク共焦点顕微鏡Nikon Eclipse TiにAndor共焦点スキャンユニット（100倍、NA1.46対物）を装着して撮影した。Z-sectionとタイムラプスはAndor IQソフトウェアを用いて設定し、画像を撮影した。創傷誘発反応については、UVレーザー前の30秒と創傷後の900秒を含む930秒間、2秒ごとに撮像した単一の共焦点面を画像とした。カメラEMゲインは80であった。緑色蛍光は488nmのレーザーで、赤色蛍光は561nmのレーザーで可視化された。GFPチャネルの露光時間は280ms、RFPチャネルの露光時間は120msであった。通常時は、0.5秒ごとに600秒間撮像したシングルコンフォーカルプレーンの画像で、カメラEMゲインは140であった。GFPチャネルの露光時間は110msであった。
sfGFP fociのサイズと数の定量化
詳細なプロトコルを請求する
sfGFPのサイズと数は、Fijiソフトウェア（https://imagej.net/imagej-wiki-static/Fiji）を用いて定量化した。バックグラウンド強度を閾値とし、Analyze Particlesコマンドを用いて、fociのサイズと数を算出した。パンクチャのサイズと数の値は、GraphPadを用いて統計的に解析した。穿刺のサイズと数については、創傷部位の周囲600×400ピクセルを選んで解析した。サイズと数の変化は、標準偏差（SD）を持つ平均値を用いて定量化した。
線虫におけるqRT-PCR（Quantitative Reverse Transcription PCR)
詳細なプロトコルを請求する
TRIzol試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて100匹の若成虫から全RNAを抽出し、NanoDrop（Thermo, USA）を用いた分光測光により定量し、HiScriptIIIReverseTranscriptase（Vazyme、中国）を用いて逆転写した。 qRT-PCRはSYBR Green Supermix（Vazyme）を用いてrbd-1をハウスキーピング遺伝子として行った。本研究では、以下のプライマーを使用した。
rbd-1、フォワード（fwd）CACGGAACAGCAACTACGGA、リバース（rev）CGGCTTGTTTGCATCACCAA；C42D4.3、fwd GCCAGACTCTTGCCTCTCAA、rev CACGCGTGATCTTCC；mai-1, fwd CGGCTCAATCCGTGAAGC, rev TGTTGCTTTGCGTCATC.
細胞におけるqRT-PCR(定量的逆転写PCR)
詳細なプロトコルを請求する
RNA isolater (Vazyme, R401-01) を用いて Total RNA を抽出し、HiScriptIIIReverseTranscriptase (Vazyme, R323-01) を用いて逆転写した。qRT-PCR は ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, Q711-03) により GAPDH を house-keeping 遺伝子として実施した。遺伝子のqRT-PCR用プライマーは、BFPでプライマーF、遺伝子でプライマーRとして設計した。本試験では以下のプライマーを使用した。
bfp-c-myc F: tactgcgacctccctagcaa、
bfp-c-myc r: tactgcgacctccctagcaa、
bfp-hspa1a f: actgcgacctccctagcaa、
bfp-hspa1a r: tctccaccttgccgtgttgg、
bfp-kif18b f: atactgcgacctccctagca、
bfp-kif18b r: cgcacccgtaccactacttg、
gapdh f: gcgagatccctccaaaatcaa、
GAPDH R: GTTCACACCATGACGAACAT.
線虫における統計解析
詳細なプロトコルを請求する
統計解析は、GraphPad Prism 7 (La Jolla, CA)を用いて実施した。一元配置分散分析（多重比較はANOVA）、二元比較はノンパラメトリックマンホイットニーテストを使用した。NSは有意ではない、*はp<0.05、***はp<0.01、***はp<0.001、***はp<0.0001を示している。特に断りのない限り、バーは平均値±SDを表す。
細胞における定量化および統計解析
smFISH解析
詳細なプロトコルを請求する
smFISHとMASSで検出されたmRNAの数、またコロカライズの比率を定量化するために、2色チャンネル画像のスポット検出にFiji Plugin (https://imagej.net/imagej-wiki-static/Fiji)-ComDet を使用しました。データはExcelで解析し、散布図はGraphPad Prism9で作成した。
qRT-PCRによるmRNAの発現レベル
詳細なプロトコルを請求する
統計解析は、GraphPad Prism 9を使用して行った。多重比較には一元配置分散分析、二重比較には非対称t-testを使用した。NSは有意ではない、*はp<0.05、**はp<0.01、***はp<0.001、***はp<0.0001を示す。特に断りのない限り、バーは平均値±SDを表す。
強度とS/N比
詳細なプロトコルを請求する
FijiプラグインTrackmate（Tinevez et al., 2017）を使用して、単一平面画像を解析に使用した。粒子サイズは0.3μmと推定し、Differences of Gaussian（DoG）フィルタを適用してすべてのスポットを検出した。Simple LAP tracker」粒子連結アルゴリズムを使用し、連結最大距離は15μm、ギャップ閉鎖距離は15μm、ギャップ閉鎖最大フレームは2でした。 強度とS/N比はTrackMateで生成し、SPSSによるヒストグラムグラフ、Excelによる曲線図の生成のための元データとしました。
速度解析
詳細なプロトコルを請求する
従来の24xMS2 mRNAイメージングシステムでは、NLSをMCPに融合させてNLS-MCP-GFPを核に局在させていたため、細胞質内のmRNAを高いS/N比で検出することができました。しかし、核内のmRNAは明確に検出することができない。そのため、速度解析を行う際には、核内のシグナルを除外し、細胞質内のmRNAフォーカスのみを解析対象としました。
1分子追跡は、FijiプラグインTrackmate（Tinevez et al.、2017）を使用して2Dで実施しました。スポット検出の精度を高めるため、細胞質を重なりのないいくつかの部分に切り取った。単一粒子は、TrackMateを起動する前に設定した217 msの時間間隔でフレームごとにセグメント化した。また、単一スポットを追跡するためのパラメータは、「強度と信号対雑音」で説明したものと同じであった。各mRNA fociの速度はTrackMateによって生成され、SPSSによるヒストグラムグラフ、Excelによる曲線図の生成のための元データとなった。
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データの入手方法
動画1～11には、図のソースデータが含まれています。図1-source data 1には、細胞における統計解析のためのソースデータが含まれています。図2-source data 1には、線虫での統計解析の元データが含まれています。
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決定通知書
ロバート・H・シンガー
Reviewing Editor; Albert Einstein College of Medicine, United States.
ジェームズ・L・マンリー
シニアエディター、コロンビア大学（米国
(i)読者のためにプレプリントと一緒に掲載されるパブリックレビュー、(ii)著者へのフィードバック（修正依頼を含む）です（下図）。また、編集者がこの論文のどこを面白いと思ったか、あるいは重要だと思ったかを説明するアクセプトサマリーも含まれています。
査読後の決定通知書
論文「Enhanced Single RNA Imaging Reveals Dynamic Gene Expression in Live Animals」をeLifeに投稿していただき、ありがとうございます。あなたの論文は、4名の査読者（うち1名は査読編集委員会のメンバー）によって査読され、シニアエディターであるJames Manleyによって評価が統括されました。査読者は匿名を選択しました。
査読者は互いのレビューについて議論し、査読編集者は修正投稿の準備のためにこれを起草しました。査読者全員が、MASSによる標識化のコンセプトには肯定的ですが、mRNAに影響を与えることなく機能していることに完全には納得していません。彼らは全員、タグ付けされたmRNAとタグ付けされていないmRNA、あるいは単独でタグ付けされたmRNAを比較して厳密に報告するデータをさらに要求しています。
重要な修正点
著者らのMASSシステムと、この分野の標準であるMS2システムとの比較を行っていない。1分子イメージングにおけるこのアプローチの妥当性、およびタグ付けがmRNAの生理作用に及ぼす影響について疑問がある。この方法でタグ付けされたmRNAが、タグ付けされていないのと同じように振る舞うことを示す、より厳密なアプローチが必要である。また、固定した細胞でのFISH画像との比較や、広範囲にタグ付けした場合としない場合の速度の測定なども提案されています。mRNAに大量のタンパク質が付着することで、不活性化される可能性があるのかもしれない。
参考文献には、この分野の類似研究（Guo et alなど）が含まれておらず、より詳細に議論し比較する必要がある。
シグナルとノイズに対するシグナル増加の定量的評価を行うこと。査読者の多くのコメントと提案を参照すること。
査読者2（著者への提言）：

  1. 44行目： 44行目：生きた動物での内因性mRNAのイメージングを報告した先行研究がもっとある。
    Forrest and Gavis, "Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila", Current Biology, 13, 1159 (2003)
    Leeら、"Real-time visualization of mRNA synthesis during memory formation in live mice" PNAS, 119, e2117076119 (2022)

  2. 410行目：線虫のライブイメージングについて、より詳細に記述する必要がある。例えば、スピニングディスク共焦点顕微鏡のモデル、対物レンズメーカー、Zスタック間隔、露光時間またはピクセル滞留時間、タイムラプスの間隔と時間など。また、著者らは図2にz max-projection画像を示したのだろうか？また、画像処理についても記載が必要です。
    査読者3（著者への提言）：

  • 文法とスペルを再確認する（例：25行目の「themeself」）。

  • 曖昧さを避けるために、いくつかの部分の書き換えを検討する（例えば、43行目の10 mRNAs or mRNAs from 10 genes?)。

  • イントロダクションをもう少し充実させると、読者に著者らの研究の重要性を理解してもらえる。

  • Methodsのライブイメージングの項では、線虫の固定化方法など、より詳細な説明が必要である。

  • MS2ステムループのバージョンが異なると結果が異なるため、どのバージョンを使用したかを明確にする必要がある。例えば、バージョン5は、細胞内で安定に凝集する性質があるため、標的mRNAが分解された後でも、MCPシグナルの集積を誘導することができるそうです。
    レビュアー4号（著者への提言）：

  1. コンストラクトに関する十分な詳細が記載されているが、線虫のイメージングに関する情報は最小限である。Zスタック情報（何面、ステップサイズ）、時間分解能、使用カメラと設定、レーザー設定などを提供する必要がある。

  2. 病巣の大きさの解析。直感的には、1つのドットに1、2、3、...のmRNAを持つ病巣の量子的なサイズを予想するが、見かけ上/測定上のサイズの増加は線形でない可能性がある。図2Fは、時間経過に伴う病巣の大きさを示しているが、この文脈では不可解に見える。
    a. プラトーに達する前の最初の上昇（最初の2分間）をどのように解釈すればよいのでしょうか。測定のアーチファクトなのだろうか？
    b. b. 量子的なサイズを仮定すると、プロットされた平均値+/-半は誤解を招く可能性がある。個々のサイズの散布図があれば、より理にかなっている。あるいは、いくつかの代表的な時点（例えば、3-6分と10-15分の2つのプラトー）におけるサイズ分布を提供することもできるだろう。
    c. c.関連して、どの程度までユニットサイズ/シングルmRNAシグナルを推測できるのか？c.関連して、単位サイズ/単一mRNAシグナルをどの程度推測できるか？拡大した画像の中には、同等の最小サイズの病巣が多数あるような印象を受けるが、これは単一mRNAの可能性がある？
    d. y軸は何ですか？直径（um）でしょうか？大きさは体積で定量的なので、プロットの一部をd3で作成する方が理にかなっているのでは？

  3. 現在の試薬の有用性の範囲について、いくつかの機会を逃している。例えば、以下のようなことです：
    a. 核内のシグナルを見ることで、転写や転写後の初期制御を把握することは可能か？
    b. b. イメージングの実用的な深さ方向への浸透度はどの程度か？表皮細胞の深部（基底部）で妥当なシグナルを得ることができるのか？あるいは、ワームの裏側（幼虫のステージによって、イメージングに必要な距離が異なる）。

  4. 4.アベリングの生理学的関連性/潜在的干渉に関するいくつかの表現型アッセイは、システムの有用性を大幅に強化することができます。著者らが検討すべきいくつかの提案：
    a. cdc-42の標識化： cdc-42の標識：創傷修復におけるアクトミオシンダイナミクスに影響を与えるか？cdc-42の標識：創傷修復におけるアクトミオシンダイナミクスに影響を与えるか？
    b. タグ付けされた3つの遺伝子のいずれかについて、タグ付けされた対立遺伝子（Null/機能喪失対立遺伝子を超えるヘテロ接合体）による機能救済があるか？

  5. 5.最適化の範囲について何らかの解析と考察があれば、この分野にとって非常に有益である。
    a. シグナルとバックグラウンドの比率はどの程度か？単純化・直線外挿で、10倍、20倍、50倍の増幅率でアベリング（GFPの採用数）を減らすことは考えられるか？
    b. 光毒性や長期間のイメージングという点で、このイメージングセッティングはどの程度実用的か？レンズ後のレーザーのパワーメーターの読み出しができれば、最も客観的で他の研究室にも転用可能である。そうでない場合は、使用したレーザーと設定についてのより詳細な文書があれば助かる。

  6. コミュニティがこの論文に熱狂的に反応し、試薬に多くの関心が集まることを期待しています。eLifeのオープンサイエンス精神に基づき、著者らはAddgeneやCGCなどの公開プラットフォームへのコンストラクトやワーム株の寄託を肯定する必要がある。
    https://doi.org/10.7554/eLife.82178.sa1
    著者からの回答
    本質的な修正：
    著者らのMASSシステムと、この分野の標準であるMS2システムとの比較を行っていない。1分子イメージングに対するこのアプローチの妥当性、およびmRNAの生理学に対するタグ付けの影響について疑問がある。この方法でタグ付けされたmRNAが、あたかもタグ付けされていないかのように振る舞うことを示す、より厳密なアプローチが必要である。また、固定した細胞でのFISH画像との比較や、広範囲にタグ付けした場合としない場合の速度の測定なども提案されています。mRNAに大量のタンパク質が付着することで、不活性化される可能性があるのかもしれない。
    参考文献には、この分野の類似研究（Guo et alなど）が含まれておらず、より詳細に議論し比較する必要がある。
    シグナルとノイズに対するシグナル増加の定量的評価を行うこと。査読者の多くのコメントと提案を参照すること。
    私たちの原稿に時間を割いてくださり、励ましのコメントをくださった編集者の方々に感謝します。FISH実験を行い、シグナル-ノイズ、シグナル強度をより定量的に評価し、mRNAの安定性を調べ、従来のMS2システムとMASSで速度を測定しました。
    レビュアー#2（著者への提言）：

  7. 44行目です： 生きた動物での内因性mRNAのイメージングを報告した先行研究がもっとある。
    Forrest and Gavis, "Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila", Current Biology, 13, 1159 (2003)
    より多くの参考文献を提供してくださった査読者の方に感謝いたします。不足分の文献を追加しました。
    の文献を新版原稿の2ページ目に掲載した。

  8. 410行目：線虫のライブイメージングについて、より詳細に記述する必要がある。例えば、スピニングディスク共焦点顕微鏡のモデル、対物レンズメーカー、Zスタック間隔、露光時間またはピクセル滞留時間、タイムラプスの間隔と時間など。また、著者らは図2にz max-projection画像を示したのだろうか？また、画像処理についても記載が必要です。
    25ページのメソッドセクションと不足している情報を更新しました。
    査読者3（著者への提言）：

  • 文法とスペルをダブルチェックする（例：25行目の「"I"」）。

  • 曖昧さを避けるために、いくつかの部分の書き換えを検討する（例えば、43行目の10 mRNAs or mRNAs from 10 genes?）
    曖昧な表現があったことをお詫びいたします。文法とスペルをチェックし、"anged "しました。
    "t "n個以下のmR "As "から "t "n個以下の遺伝子からのmRNA "へ。

  • もう少し充実した紹介があれば、読者は著者の研究の重要性を理解することができるだろう。
    最近、RNAイメージングに関する美しい総説がいくつか発表されていることに気づきました。そこで、それらの論文を引用し、短い紹介文を書きました。

  • Methodsのライブイメージングの項では、線虫の固定化方法など、より詳細な説明が必要です。
    現在、メソッドセクションを更新し、不足している情報を26ページに追加しました。

  • MS2ステムループのバージョンが異なると、異なる結果が得られるため、著者はどのバージョンを使用したかを明確にする必要がある。例えば、バージョン5は、細胞内で安定して凝集するという性質から、標的mRNAが分解された後でもMCPシグナルのクラスタリングを誘導することができます。
    本研究では、MS2ステムループのV1バージョンを使用しました。この情報を原稿に追記しました。また、MS2ステムループの最適化バージョンであるMS2 V7をテストしたところ、MASSもMS2 V7で動作することがわかりました。この新しいデータを図1-図解2 に追加しました。
    レビュアー#4（著者への提言）：

  1. コンストラクトに関する十分な詳細が記載されているが、線虫のイメージングに関する情報は最小限である。z-stack情報（何面、ステップサイズ）、時間分解能、使用カメラと設定、レーザー設定などを提供する必要がある。
    メソッドセクションを更新し、不足している情報を 26 ページに追加した。

  2. 病巣の大きさの解析 直感的には、1つのドットに1、2、3、...のmRNAを持つ病巣の量子化サイズを予想するが、見かけ上/測定上のサイズの増加は線形でない可能性がある。図2Fは、時間経過に伴う病巣の大きさを示しているが、この文脈では不可解に見える。
    a. プラトーに達する前の最初の上昇（最初の2分間）をどのように解釈すればよいのでしょうか。測定のアーチファクトなのだろうか？
    線虫の表皮に存在するBFP-8xMS2 mRNAを撮像しました。その結果、BFP-8xMS2 mRNAのGFPフォーカスの大きさは、時間の経過とともに一定になることがわかりました。また、内因性のC42D4.3-8xMS2 mRNAの大きさは、BFP-8xMS2 mRNAのGFPフォーカスの大きさよりも大きいことがわかりました。これらのデータは、内因性C42D4.3 mRNAのGFP焦点のサイズが大きくなっていることが、測定によるアーチファクトではないことを示しています。
    このデータから、創傷後最初の2分間で転写が促進され、それらのmRNAが素早くクラスター化してRNA顆粒を形成していることが示唆されました。
    b. 定量的なサイズを仮定すると、プロットされた平均値+/-半は誤解を招く可能性がある。個々の大きさの散布図があれば、より理解しやすい。あるいは、いくつかの代表的な時点（例えば、3-6分と10-15の2つのプラトー）におけるサイズ分布を提供することも可能である。
    我々は、5つの代表的な時点（創傷後1分、2分、3分、4分、5分）における各GFP焦点の個々の大きさの散布図を作成した。その情報をFigure 2-figure supplement 5に追加した。
    c. 関連して、ユニットサイズ/シングルmRNAシグナルはどの程度まで推測できるのか？c.関連して、ユニットサイズ/シングルmRNAシグナルをどの程度まで推測できるか？拡大した画像の中には、同等のサイズと最小のサイズの病巣が多数あるような印象を受けるものがあるが、これはシングルmRNAの可能性がある？
    確かに細胞内には大小のmRNAの病巣が存在します。私たちは、線虫の表皮にある外因性のBFP8xMS2 mRNAをイメージングし、内因性のC42D4.3-8xMS2 mRNAのGFP焦点の大きさは、BFP-8xMS2 mRNAのそれよりも大きいことを発見しました。これらのデータから、C42D4.3-8xMS2 mRNAの大きなGFPフォークはmRNAグラニュールであることが示唆されました。最も小さいサイズのGFPフォーカスは、単一のmRNAであるはずです。これらの新しいデータを図2-図5と7ページの本文に追加しました。
    また、MASSと1分子RNA FISHを組み合わせて実施しました。その結果、MASSはsmFISHで検出されたスポットと比較して、同程度の数のGFPフォーカスを検出することがわかりました。また、GFP fociの大部分（72%）が、smFISHで検出されたb-ACTIN8xMS2 mRNAのスポットと共焦点化した。このことから、MASSは単一のmRNAを標識できることが示唆された。
    分子であり、最小限の大きさのGFPフォークは単一mRNAであると考えられる。図1、図1-図1、および3ページの本文に新しいデータを追加しました。
    d. Y軸は何ですか？直径（um）でしょうか？サイズは体積で量的なものなので、プロットの一部をd3で作成する方が理にかなっているのでしょうか？
    y軸はGFP fociの面積(µm2)です。図2および図2-図5で、この不足している情報を追加しました。

  3. 現在の試薬の有用性の範囲について、いくつかの機会を逸した。例えば、以下のようなものです：
    a. 転写や転写後初期の制御を捉えるために、核内のシグナルを見ることは可能か？
    創傷後、転写が促進されることが予想されました。しかし、核に大きなGFPフォーカスが出現することを検出できなかった。線虫の表皮は、139個の核が異なる焦点面に配置された合胞体である。私たちの顕微鏡では、通常4～10個の核が存在する1つの焦点面のみを画像化することができました。そのため、転写が活発な核は焦点から外れていた可能性が高い。この点については、原稿（6ページ）で説明した。
    b. イメージングの実用的な深さ方向の浸透度は？表皮細胞の奥側（基底側）でもそれなりの信号が得られるのでしょうか？あるいは、ワームの裏側（幼虫のステージによって、イメージングに必要な距離が異なる）。
    私たちのスピニング顕微鏡の実用的な深さ方向の透過率は50μmです。線虫の表皮の深さは60μmです。そのため、表皮細胞の基底面しか撮像できない。

  4. 標識の生理学的関連性や潜在的な干渉に関するいくつかの表現型アッセイは、システムの有用性を大幅に強化することができます。著者らが検討すべきいくつかの提案：
    a. cdc-42の標識化： cdc-42の標識：創傷修復におけるアクトミオシンダイナミクスに影響を与えるか？cdc-42の標識：創傷修復におけるアクトミオシンダイナミクスに影響を与えるか？
    我々は、8xMS2をcdc-42 mRNAの3′UTRにタグ付けした。cdc-42 mRNAのコード配列は変更されていない。我々は以前、表皮の傷によってCDC-42タンパク質の急速なクラスター化が誘導されることを発見した。線虫の表皮でcdc-42-8xMS2 mRNAを過剰発現させ、MASSで標識したところ、CDC-42タンパク質が同様にクラスター化したことから、MASSはCDC-42の機能に影響を与えないことがわかった。従って、創傷修復におけるアクトミコシンの動態には影響がなかったと考えられる。cdc-42-8xMS2 mRNAで発現させたワームでは、発達障害は観察されなかった。
    b. タグ付けされた3つの遺伝子のいずれかについて、タグ付けされた対立遺伝子（Null/機能喪失対立遺伝子を超えるヘテロ接合体）による機能的救済？
    我々は8xMS2を内因性C42D4.3およびmai-1 mRNAの3′UTRにタグ付けした。C42D4.3およびmai-1 mRNAのコード配列は変更されなかった。MASSはC42D4.3遺伝子の発現量とmRNAの安定性に影響を与えないことが示された。C42D4.3およびmai-1の機能には影響がないと予想され、タグ付きワームの発達障害も観察されなかった。したがって、タグ付き対立遺伝子による機能レスキュー実験は行わなかった。

  5. 最適化の範囲について何らかの解析や考察があれば、この分野では非常に有用である。
    a. シグナルとバックグラウンドの比はどのくらいか？単純化・直線外挿を駆使して、10倍、20倍、50倍の増幅率で標識（GFPの採用数）を減らすことは考えられるか？
    S/N比については、さらに多くの実験と解析を行いました。従来の24xMS2システム、あるいはサンタグアレイのリピート数を変えたMASS（MCP-24xSuntag、MCP-12xSuntag、MCP-6xSuntag）で、過剰発現したb-ACTIN mRNAをイメージングしました。従来の24xMS2システムでは、MCPに核局在シグナル（NLS）を付加した従来のプロトコルに従ったところ、b-ACTIN mRNAはS/N比1.21で良好に検出されました。
    MASSは従来の24xMS2システムと比較して、同等以上のS/N比を示すことがわかりました。(MCP-24xSuntagを用いたMASS：1.79、MCP-12xSuntagを用いたMASS：1.48、MCP-6xSuntagを用いたMASS：1.42）。これらのデータから、サンタグを信号増幅器として使用することで、バックグラウンドノイズが増加しないことがわかりました。
    b. 光毒性や長期間の撮像の観点から、撮像設定はどの程度実用的か。もし著者がレンズ後のレーザーのパワーメーターの読み出しを提供できれば、最も客観的で他のラボに転送可能である。もしそうでなければ、使用したレーザーと設定についてのより詳細な文書があれば助かります。
    我々は、レンズ後のレーザーのパワーメーターの読み出しは持っていない。方法のセクションを更新し、使用したレーザーと設定に関する情報を26ページに追加しました。
    時間間隔2秒で15分連続撮影したところ、線虫に有意な光毒性は見られませんでした。
    今回の研究では、MASSがより長時間のイメージングに使用できるかどうかは検証していません。しかし、MASSと同様の戦略を用いたSunRISERにより、長期（10分間のフレームレートで24時間）のライブセルmRNAイメージングが可能になったことが最近発表されています（Guo, Y. and Lee, R.E.C., Cell Reports Methods, 2022）。これらを総合すると、Guoと我々は、MS2システムとSuntagシステムをシグナルアンプとして組み合わせることで、ライブセルにおける長期的かつ内因性のmRNAイメージングを行うことが効率的な戦略であることを実証しました。

  6. 私は、この出版に対してコミュニティが熱狂的に反応し、試薬に多くの関心が寄せられると期待しています。eLifeのオープンサイエンス精神に基づき、著者らは、AddgeneやCGCなどの公開プラットフォームへのコンストラクトやワーム株の寄託を肯定すべきです。
    ご提案ありがとうございました。
    本紙掲載後、AddgeneとCGCに掲載。
    https://doi.org/10.7554/eLife.82178.sa2
    論文・著者情報
    著者詳細
    ユーセン フー
    浙江大学生命科学研究所がん分子細胞生物学浙江省重点実験室、杭州、中国
    貢献度
    形式分析、検証、調査、可視化、方法論、執筆（原案）、プロジェクト管理、執筆（レビュー・編集）。
    共同研究
    徐景秀、高二青
    競合する利益
    競合する利害関係者の申告なし
    徐景秀（じょけいしゅう
    浙江大学第二附属病院国際バイオメディシンX研究センター（中国・杭州市
    貢献度
    形式分析、検証、調査、可視化、方法論、執筆（原案）、プロジェクト管理、執筆（レビュー・編集）。
    共同研究
    胡裕岑、高二青
    競合する利益
    競合する利害関係者の申告なし
    高 爾慶
    浙江大学第二附属病院国際バイオメディシンX研究センター（中国・杭州市
    貢献度
    形式分析、検証、調査、可視化、方法論
    共同研究
    ユーセン・フー、ジンシュウ・シュウ
    競合する利益
    競合する利害関係者の申告なし
    范雪源（ファン・シュエユアン
    浙江大学生命科学研究所がん分子細胞生物学浙江省重点実験室、杭州、中国
    貢献度
    メソドロジー
    競合する利益
    競合する利益はないと宣言 "このORCID iDは、この記事の著者を識別する："0000-0001-8297-1596。
    ジーリ・ウェイ
    浙江大学生命科学研究所がん分子細胞生物学浙江省重点実験室、杭州、中国
    貢献度
    監修、メソドロジー
    競合する利益
    競合する利害関係者の申告なし
    葉 秉成（イェ・ビンチェン
    浙江大学生命科学研究所がん分子細胞生物学浙江省重点実験室、杭州、中国
    貢献度
    メソドロジー
    競合する利益
    競合する利害関係者の申告なし
    スホン シュウ
    浙江大学第二附属病院国際バイオメディシンX研究センター（中国・杭州市
    浙江大学医学部第二附属病院幹細胞・再生医療センターおよび熱傷・創傷修復科（中国・杭州市
    貢献度
    概念化、形式分析、監修、資金獲得、調査、可視化、方法論、プロジェクト管理、執筆-レビュー・編集
    お問い合わせ先
    shxu@zju.edu.cn
    競合する利益
    競合する利益はないと宣言 "このORCID iDは、この記事の著者を識別する："0000-0002-4079-340Xを。
    ウィールイ・マ
    浙江大学生命科学研究所がん分子細胞生物学浙江省重点実験室、杭州、中国
    貢献度
    概念化、形式分析、監督、資金獲得、調査、可視化、方法論、執筆-原案、プロジェクト管理、執筆-レビュー・編集
    お問い合わせ先
    maweirui@zju.edu.cn
    競合する利益
    競合する利益はないと宣言 "このORCID iDは、この記事の著者を識別する："0000-0002-9193-7311。
    ファンディング
    中国国家自然科学基金(31972891)
    スホン シュウ
    イノベーションとアントレプレナーシップをリードする (TD2020006)
    ウィールイ・マ
    浙江大学(2021QN81027)
    ウィールイ・マ
    中国国家重点研究開発プログラム(2021YFA1101002)
    スホン シュウ
    中国国家重点研究開発プログラム(2021YFA1300302)
    スホン シュウ
    浙江省自然科学基金会 (2-2060203-21-001)
    スホン シュウ
    資金提供者は、研究デザイン、データ収集、解釈、および出版への投稿の決定には一切関与していない。
    謝辞
    Maラボのメンバー全員から有益な議論をいただいたことに感謝する。HeLa細胞、pcDNAベクター、Suntagコンストラクトを提供してくれたChristine Mayr (Memorial Sloan Kettering Cancer Center)に感謝します。Jian Zhang (雲南大学)には、原稿の批判的な読み方や示唆をいただいた。本研究は、中国国家重点研究開発計画（2021YFA1101002、2021YFA1300302）、中国国家自然科学基金（31972891）、浙江省自然科学基金（2-2060203-21-001）からSXに、生命科学研究所、杭州先導革新起業チーム（TD2020006）、浙江大学ヤングフェロウ（2021QN81027）からWMにスタートアップ資金を提供しています。
    シニアエディター
    ジェームズ・L・マンリー コロンビア大学（米国
    レビュー編集部
    ロバート・H・シンガー（アルバート・アインシュタイン医科大学、米国
    出版履歴
    受領しました： 2022年7月26日
    プレプリントを掲載しました： 2022年7月28日（プレプリントを見る）
    受理されました： 2023年3月1日
    アクセプトされた原稿が公開されました： 2023年3月3日(バージョン1)
    アクセプトされた原稿を更新しました： 2023年3月8日(バージョン2)
    レコードのバージョンが公開されました： 2023年3月22日(バージョン3)
    著作権について
    © 2023, Hu, Xu, Gao et al.
    この記事は、原著者および出典を明記することを条件に、無制限の使用と再配布を許可するクリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの条件の下で配布されています。
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