喘息増悪のヒトモデルから、アレルギー性喘息に特異的な転写プログラムと細胞回路が明らかになった

2023年5月9日 11:31

サイエンスScience

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研究論文
アレルギーの方
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喘息増悪のヒトモデルから、アレルギー性喘息に特異的な転写プログラムと細胞回路が明らかになった

https://www.science.org/doi/10.1126/sciimmunol.abq6352?utm_medium=ownedSocial&utm_source=Twitter&utm_campaign=SciImmunology

JEHAN ALLADINA HTTPS://ORCID.ORG/0000-0003-0136-6859, NEAL P. SMITH HTTPS://ORCID.ORG/0000-0003-1394-3158, [...], AND BENJAMIN D. MEDOFF HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-2558-0449+17 authorsAuthors Info & Affiliations
科学免疫学
5 2023年5月
第8巻第83号
DOI: 10.1126/sciimmunol.abq6352

オフクロの喘息用気道
アブストラクト
イントロダクション
結果
ディスカション
材料と方法
謝辞
補足資料
参考文献及び注釈
オフクロの喘息用気道
アレルギー体質の人の中には、喘息や気道過敏性を持つ人もいます。アレルゲン暴露後の気道における細胞および分子事象が、アレルギー性喘息患者を単なるアレルギー患者から区別するかどうかについては不明確なままである。AlladinaとSmithらは、喘息の有無にかかわらず、ハウスダストマイトまたは猫アレルギーの人の肺セグメントで気管支鏡による実験的アレルゲン暴露を行った。チャレンジの1日後に気道から採取した細胞における細胞および遺伝子発現の変化を解析したところ、喘息患者では免疫細胞と構造細胞の両方が関与する細胞間相互作用の調節障害があり、修復を促進するよりもむしろ炎症を優先的に増幅させることがわかった。この発見は、喘息性肺疾患に特異的に関連する病原性細胞回路に関する新たな知見を提供するものです。-IRW
アブストラクト
喘息は、アレルギーや2型炎症と最もよく関連する慢性疾患である。しかし、気道炎症と喘息を規定する構造的変化を結びつけるメカニズムは、不完全に理解されている。アレルゲン誘発喘息増悪のヒトモデルを用いて、アレルギー性喘息患者とアレルギー性非喘息対照者の下気道粘膜を、単一細胞RNA配列決定法を用いて比較した。アレルゲンに応答して、喘息患者の気道上皮は非常にダイナミックで、マトリックス分解、粘液メタプラシス、糖化に関わる遺伝子を上昇させる一方、コントロールで観察される傷害修復経路や抗酸化経路を誘導することはできなかった。IL9を発現する病原性TH2細胞は喘息気道に特異的で、アレルゲン負荷後にのみ観察された。さらに、従来の2型樹状細胞（CD1Cを発現するDC2）とCCR2を発現する単球由来細胞（MC）は、アレルゲン後に喘息患者に特異的に富み、2型炎症を維持し病的な気道リモデリングを促進する遺伝子の発現が上昇した。一方、アレルギー性コントロールでは、アレルゲン暴露後に組織修復プログラムをアップレギュレートするマクロファージ様MCが豊富であり、これらの集団が喘息性気道リモデリングから保護する可能性が示唆された。細胞間相互作用解析により、喘息患者に特有のTH2-単核食細胞-基底細胞相互作用が明らかになった。これらの病原性細胞回路は、免疫細胞および構造細胞のタイプ2プログラミングと、TNFファミリーシグナル、細胞代謝の変化、抗酸化反応の失敗、成長因子シグナルの喪失など、タイプ2シグナルを維持し増幅する可能性のある追加経路によって特徴付けられた。したがって、我々の発見は、病原性エフェクター回路とプロレゾリューションプログラムの不在が、2型炎症に応答して構造的気道疾患を引き起こすことを示唆している。
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アレルゲンを見ず、アレルゲンを聞かず、アレルゲンを語らず
by Aurore C. A. Gay, Martijn C.ナウィーン
イントロダクション
喘息は、米国では13人に1人が罹患し、有病率が増加しています（1）。喘息の多くは、環境抗原に対するアレルギー性の炎症が特徴です（2）。しかし、吸入アレルゲンに感作されたすべてのアレルギー患者が喘息を発症するわけではなく、気道の炎症、気管支の過敏性、粘液分泌過多によって定義される下気道の疾患です（2、3）。そこで、アレルギー性喘息患者（AA）と喘息でないアレルギー体質の人の間で、アレルゲンに対する下気道反応の重要な違いを明らかにすることで、喘息を引き起こすメカニズムに関する基本的な知見を得ることができると考えました。
喘息の発症には、気道微小環境内の細胞クロストークが重要であることが認識されつつある（2-4）。このことと一致して、喘息の気道粘膜には、好酸球、肥満細胞、Tヘルパー2（TH2）細胞などの自然免疫細胞および適応型2型免疫細胞が、気道上皮に近接して局在していることが特徴です。さらに、マウスおよびヒトの研究により、アレルゲンチャレンジに応じた気道粘膜の上皮細胞の活性化と免疫細胞の濃縮を理解することが、喘息病態の解明に不可欠であることが立証されています（3-11）。
シングルセル転写アプローチにより、アレルギー疾患に関連する組織特異的な細胞サブセットの発見が容易になった。最近のヒト気道の定常解析では、病原性エフェクターTH2細胞、マスト細胞、分泌性気道上皮細胞（AEC）が健常対照と比較して喘息患者に濃縮されていることが示された（12〜16）。しかし、アレルゲンチャレンジに対するダイナミックな下気道粘膜反応の高次元解析は報告されていない。
気管支鏡下セグメントアレルゲンチャレンジ（SAC）は、アレルゲンによる喘息増悪の特徴を単一の気道セグメントで再現する強力な研究ツールであり、喘息関連経路の特定や喘息の新規治療薬の臨床効果予測に成功している（9、17、18）。我々はこれまでに、SACがAAsとアレルギー性非喘息コントロール（ACs）の両方で2型気道炎症を誘導することを明らかにしてきました（9）。しかし、喘息患者は、2型炎症の測定値が増加し、ムチン産生、上皮・上皮下厚、気道平滑筋厚の増加を含む気道構造変化を特異的に示す（9、19）。したがって、喘息患者には、2型炎症を増幅させる気道微小環境の細胞および転写プログラムがあり、粘膜炎症が喘息を定義する気道構造変化に関連しているという仮説が立てられる。
我々は、気管支鏡SACとシングルセルRNAシーケンス（scRNA-seq）を活用して、気道粘膜微小環境を定義し、アレルゲン曝露後にのみ観察される転写プログラムを特定した。AAとACを比較することで、喘息を定義する細胞および分子経路を、アレルギーだけに関連する経路から区別した。その結果、喘息患者の基底および分泌型AECでは、アレルゲン負荷に対する強固な転写応答が認められ、その特徴は粘液のメタプラシアとマトリックスのリモデリングに関与する遺伝子のアップレギュレーションであった。さらに、AECの解糖系遺伝子シグネチャーは喘息と関連し、一方、抗酸化および成長因子シグナル伝達経路は潜在的に保護的であることが確認された。IL9を発現する病原性TH2細胞は、SAC後の喘息気道でのみ認められ、炎症性メディエーターやメタロプロテアーゼを上昇させる従来の2型樹状細胞（DC2）や病原性単球由来細胞（MC）の濃縮も見られた。細胞間相互作用解析では、喘息に特有の免疫-上皮相互作用が強調され、TH2-単核食細胞（MNP）-基底細胞相互作用が優勢であったことから、これらの主要細胞サブセット間のクロストークがアレルギー性喘息の発症に重要であることが示唆されました。
結果
アレルゲン誘発喘息増悪のヒトモデルで気道粘膜の細胞景観が変容した
気道粘膜の免疫細胞や構造細胞の違いによって、喘息がアレルギーだけと区別されるという仮説を検証するために、喘息の有無にかかわらず、ハウスダストマイト（HDM）または猫に対するアレルギーを持つ成人61人と、非アレルギー性の健康な対照者5人を登録してSAC（図1A、データファイルS1、補足方法）を受けた（9、19）。アレルギーは、HDMまたは猫に対するアレルギー性鼻炎および/または結膜炎の臨床歴と定義し、皮膚プリックテスト（SPT）により確認された。定量的SPTは、各参加者のアレルギーレベルに応じて投与するアレルゲンの量を標準化するために使用した（図S1Aおよび補足方法）。ACは、喘息の既往がなく、1秒間の強制呼気量（FEV1）および強制生命維持能力（FVC）が正常で、メタコリンチャレンジテストが陰性であった。AAでは、軽度の喘息の既往があり、FEV1が予測値の75%以上、メタコリンチャレンジテスト陽性で気管支の過敏性が確認された。気管支肺胞洗浄（BAL）および第3～4世代の気道セグメントの気管支内ブラシサンプルを、ベースライン時およびアレルゲンおよび希釈剤投与24時間後に採取し、気管支鏡検査の手順の影響を制御した（図1B）。先行報告(9)と同様に、SACは両アレルギー群に強固な好酸球性炎症を誘発したが、それはアレルゲンにチャレンジしたセグメントに限定され、健常対照では観察されなかった（図1C)。

図1.SACを用いたアレルゲン誘発性喘息増悪のヒトモデル。
(A）ACおよびAA参加者の特徴。(B）気管支鏡によるSAC手順のデザイン。BALおよび気管支内ブラシサンプルは、ベースライン時（舌状部から）と、右上葉（RUL）への希釈液投与および右中葉（RML）へのアレルゲン投与の24時間後に採取した。AC参加者1名（上段）とAA参加者1名（下段）のベースライン時（左）とSAC後（右）のRML気道セグメントの代表画像。AA参加者では、アレルゲンに侵された分節気道が狭くなっており、SAC後に粘液が存在することがわかる。
(C）AA参加者1名のBALからのサイトスピン調製の代表画像と、非アレルギー性健常対照（HC；n＝5）、AC（n＝20）、AA（n＝22）のBAL好酸球の定量化。黒矢印は好酸球を、白矢印はリンパ球を示す。(D) 1人のAA参加者のベースライン時（Bln；上段）とアレルゲンチャレンジ後（Ag；下段）の気管支内ブラシサンプルの代表的なフローサイトメトリー。上皮細胞はCD326+CD45-として同定された。CD45+細胞のゲーティング後、CD19+ B細胞およびCD4+ T細胞、CD19-CD4-HLA-DR+抗原提示細胞が確認された。(E）分節気道から採取した気管支内ブラッシングサンプル（n＝21）に対してscRNA-seqを実施し、下流解析でAC（n＝4）とAA（n＝4）の違いを同定した。C）において、ボックスは中央値（線）とIQRを表し、ウィスカーは1.5×IQR以下の分布の残りに伸びており、ドットは個々のサンプルを表す。P値は、多重比較を調整するためにŠidák補正を用いた混合効果モデルを用いて生成した。***P < 0.001 および ****P < 0.0001。
アレルギー性炎症時の下気道粘膜の特徴を明らかにするため、気管支内ブラシサンプルのフローサイトメトリーを行い、CD4+ T細胞、CD19+ B細胞、HLA-DR+抗原提示細胞など、SAC後のCD45+免疫細胞の濃縮を確認した（図1D）。この方法では回収される細胞の数が限られており、細胞表面マーカーの重複発現により特定の細胞サブセットを特定することが困難であることから、我々はscRNA-seqを活用して、公平な分析フレームワークを用いて下気道粘膜の細胞集団を定義しました。4人のAA（25,397細胞）と4人のAC（26,755細胞）から収集した21の下気道ブラッシング（合計52,152細胞）から高品質のscRNA-seqデータを作成した（図1E、図S1、B、C、データファイルS2、S3）。ブラッシングは、ベースライン時（Bln；22,406細胞）およびアレルゲン（Ag；17,462細胞）または希釈液（Dil；12,284細胞）への曝露から24時間後に採取された。希釈液サンプルは、2つのAAと1つのACで採取できなかったため、他の実験条件との下流の統計的比較から除外された。下気道粘膜の細胞集団を定義するために、反復的な細胞クラスタリングを系統的に実行した。続いて、存在量の差、遺伝子発現の差（DGE）、細胞間相互作用の解析を行い、喘息とアレルギーだけを区別する集団、転写プログラム、細胞ネットワークを特定した（図1Eおよび材料と方法）。
主成分分析により、疾患グループと実験条件の両方によって引き起こされる変動性が明らかにされた（図S1D）。データ統合と教師なしクラスタリング解析（材料と方法）の結果、AEC（EPCAM）、CD4 T細胞（CD3D、CD4、IL7R）、CD8 T細胞（CD3D、CD8A）、MNP（LYZ）、B細胞（MS4A1）、肥満細胞（CPA3）、ナチュラルキラー細胞（GNLY）という7種類のグローバル細胞系列が確認された（図2、A-C、図S1E、データファイル S4）。すべての参加者と実験条件において、すべての細胞系譜が捕捉された（図S1E）。ベースラインでは、気道粘膜の景観は両群ともAECとCD8 T細胞で占められており（図2D）、希釈剤投与後も同様の細胞組成が観察された（図S1、FおよびG）。混合効果ロジスティック回帰を用いて、各疾患群に関連する細胞存在量の違いを特定した［AC：オッズ比（OR）＜1、AAs：OR＞1；図2E、fig.S1H、およびMaterials and Methods］（20）。B細胞（OR 4.48、95％信頼区間［1.73～11.61］）およびマスト細胞（OR 6.68、［3.20～13.94］）はいずれもベースラインで喘息と関連し、マスト細胞はアレルギー性疾患中にその場で増殖するサブセットに一致する遺伝子（CD38およびKIT）を発現した（図S1IとデータファイルS5）（13）。我々は、DGE［log2FC（fold change）＞0.5および偽発見率（FDR）＜0.5］を観察しなかった。1; 材料と方法]は、グループ間でB細胞またはマスト細胞で観察されなかったが、AAのマスト細胞は、マスト細胞の成長と生存に関わる遺伝子（IL3RA、IL2RA、BIRC3、BCL2）、化学走性（CXCR4、C5AR1）、およびKIT発現（RUNX1）をアップレギュレートしてアレルゲン挑戦に反応し、これらのパスウェイにより、ぜんそく性気道のマスト細胞濃縮が促されることを示唆した（図S1、J、Kならびにデータファイル S6）．アレルゲンチャレンジ後、免疫細胞が気道粘膜サンプルを支配した（Bln：9658細胞、43.1％；Ag：13,459細胞、77.1％）（図2F）。MNPの数は、両群ともアレルゲン暴露後に最も増加したが（AC：6.7%対33.4%、P = 0.009; AA：5.9% 対 28.1%, P = 0.02）、CD4 T細胞は喘息患者でのみ増加（7.1%対 20.6%, P = 0.03）した。

図2.気道粘膜におけるアレルゲン誘発性免疫細胞の濃縮。
(A) 52,152個の高品質な単一細胞を、予測される細胞系譜で色分けしたUMAP包埋。NK、ナチュラルキラー。
(B) 各細胞系譜の上位の識別遺伝子セットを他のあらゆる系譜と比較して示すヒートマップ。カラースケールは、各クラスタの正規化遺伝子発現（平均ゼロ、単位分散）およびクラスタあたりの平均遺伝子数を示す（トップバー）。(C）各細胞系譜を規定するマーカー遺伝子の割合と発現レベルを示すドットプロット。ドットの大きさは各系譜内の各マーカーを発現する細胞の割合を示し、色の強さはスケールされた発現レベルを示す。(D）細胞密度のUMAP埋め込み画像。ベースライン時（左）とアレルゲン負荷後（右）の各細胞系譜の割合を他の細胞系譜と比較し、疾患グループ（AC：上、AA：下）でファセット化した。(E) ベースライン時およびアレルゲン暴露後の細胞系譜による疾患との関連性のOR。色分けは、AC（OR＜1、紫）またはAA（OR＞1、金）との有意な関連性を示す。(F) (B)で定義した各細胞系譜の寄与を、ベースライン時（Bln）およびアレルゲン負荷後（Ag）の全試料に対する割合（%）で示したものである。E）において、点とひげは、混合効果相関ロジスティック回帰モデルを用いて計算された95％信頼区間付きORを表す（P < 0.05 Tukey法による多重比較で補正）。(F)では、ボックスは中央値（線）とIQRを表し、ウィスカーは1.5×IQR以下の分布の残りに広がり、ドットは個々のサンプルを表している。P値は、多重比較を調整するためにŠidák補正を用いた混合効果モデルを用いて生成した。*P < 0.05および**P < 0.01。
喘息患者の基底上皮細胞および分泌上皮細胞は、アレルゲンに応答して転写プロファイルを広範囲に変化させた。
我々の先行研究では、喘息患者のAECは2型炎症に独特に敏感であることが示唆されている（9）。20,410個のAECをサブクラスタリングすることで、ベースライン時およびアレルギー性炎症の設定時にAECを特徴づける転写プログラムの詳細な特徴づけが可能となった。我々は、14の異なるAECサブセット（曲線下面積（AUC）≧0.75、疑似バルクDGE FDR＜0.05; 材料と方法）を特定し、トップマーカー遺伝子と公表されている転写データ（図3、A〜C、図S2、AおよびB、データファイルS4）を相互参照することで注釈を付けた（4、16、21〜25）。粘膜繊毛細胞（SCGB1A1、MUC5AC）を含む、3つの繊毛クラスター（FOXJI、PIFO）が観察された。先行研究では、喘息患者には粘液繊毛細胞が確認されたが、健常対照者には確認されなかった（16）。しかし、我々は喘息患者とACの両方で同様の数の粘液繊毛細胞を発見し、これらの細胞は喘息とアレルギーだけを区別するものではないことを示唆した。また、4つの基底細胞クラスター（KRT5とS100A2）が同定された。上基底細胞はTP63とKRT5の発現が低いことで基底細胞と区別され、循環基底細胞は増殖のマーカー（PCLAFとMKI67）を発現し、主に全体の遺伝子発現が低いことで区別されるクラスターは休止期（quiesBasal）と称された。3つの分泌型クラスターはセクレトグロビン遺伝子（SCGB1A1およびSCGB3A1）の発現量が高かった。杯細胞および休止期杯細胞（quiesGoblet）細胞は、繋留ムチン遺伝子（MUC5ACおよびMUC5B）を高発現していたが、クラブ細胞はムチンおよび杯細胞分化遺伝子（FOXA3およびSPDEF）の低発現によって区別されていた（4、16、21、23、26）。小さな漿液性クラスターは、漿液性細胞（LYZ、PRB3）と粘液性細胞（AZGP1、BPIFB2、MUC5B）の両方のマーカーを発現し、粘膜下腺のサンプリングを示唆していた。さらに、最近報告されたデューテロソーム（CCNO、CDC20B）、ヒロック（KRT13、SPRR3）、イオノサイト（FOXI1、CFTR）の集団も確認した（図3、A、B、図S2C）（4、16、21-25）。我々は、喘息関連メディエーターのAECサブセット特異的な発現を観察した（図3C）。基底細胞はIL33に富み、TSLPを特異的に発現していた。ペリオスチン（POSTN）は基底細胞とイオノサイトのサブセットの両方で発現し、イオノサイトはプロスタグランジンシグナルに関わる遺伝子（PTGS2およびPTGER3）も発現した。

図3.アレルゲン暴露後の基底上皮細胞および分泌上皮細胞における動的な転写反応。
(A) 20,410個のAECのサブクラスタリングから得られたUMAP包埋。(B) 各クラスタと他のAECクラスタとの比較で、上位の識別遺伝子セットを示すヒートマップ。カラースケールは、各クラスターの正規化遺伝子発現（平均ゼロ、単位分散）およびクラスターあたりの平均遺伝子数（トップバー）を示す。(C）AEC全体の遺伝子発現量と遺伝子を発現している細胞のパーセンテージを描いたドットプロット。(D）ベースラインと比較して、ACおよびAAにおいてSACによって誘導されたDEGの数を示す色強度（上部）を有するUMAPプロットである。AAとACについてクラスターで定量化したSACによって誘導されたDEGの数(下)。(E）疾患状態と実験条件の相互作用項を用いて、ACと比較してAAでアップレギュレート（上矢印）またはダウンレギュレート（下矢印）した遺伝子数で、SAC後に最もDEGが多い上位5つのAECクラスターを描写したベン図である。
核となる転写反応は表（右）に示されている。太字の遺伝子は、IL-13によって誘導される。(F) 選択したDEGのヒートマップ。カラースケールは、SAC後のAAとACの間のFC差を示す。白丸はFDR<0.1を示す。(D）擬似バルクカウント行列のWald検定を用いたFDR＜0.1およびlog2FC＞0.5に基づくDEG。(EおよびF）擬似バルク数マトリックス上の尤度比検定を用いたFDR < 0.1 およびlog2FC > 0.5に基づいてDEGを示した。
ヒロック細胞は、扁平上皮の分化（KRT13とKRT4）、バリアの完全性（SPRR3とECM1）、免疫応答（IL1A、S100A8、ALOX15）に関わる遺伝子を発現した（図3、BとC、図S2C）。ヒロック細胞は、基底細胞と分泌細胞の間の高度に増殖性のある移行集団として説明されている（4, 23, 25）。今回のデータセットでは、ヒロック細胞は増殖マーカーを発現せず、Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP)空間では基底細胞と分泌細胞の間に集まっていなかった。しかし、クラブ細胞群の中に、ヒロック細胞マーカーを発現し、以前マウス気管でのみ報告された移行性の「ヒロッククラブ」細胞（図S2、CおよびD、データファイルS7）と一致する個別の領域を同定した（23）。ヒトでは、ヒロック細胞は鼻粘膜にしか報告されていない(25)。scRNA-seqの結果を検証するために、喘息患者の肺を摘出し、免疫蛍光染色を行ったところ、気道にKRT13+細胞が連続的に存在し、その上に繊毛細胞がないことが確認された（図S2E)。アトピー性皮膚炎や好酸球性食道炎では、角化した扁平上皮細胞が2型炎症を感知して増強し、バリア機能不全を誘導することがある(27)。これと一致して、喘息患者のヒロック細胞は、インターロイキン13（IL-13）応答性遺伝子を発現し、このサブセットで高濃縮され、喘息と関連し、上皮バリア機能障害を誘導するカルパイン14（CAPN14）を含んでいた（図S2F）（28、29）。これらの知見は、ヒロック細胞が、アレルゲンに対する下気道反応の方向付けにおいて、これまで認識されていなかった役割を担っている可能性を示唆している。
AECサブセットの定量化では、群間の有意差は認められなかったが（図S2GおよびデータファイルS3）、混合効果ロジスティック回帰では、ベースライン時のACとquiesGoblet（OR 0.39, [0.50～1.51] ）およびアレルゲン負荷後の重層細胞（OR 0.35, [0.17～0.75] ）間の関連性が明らかになった（図S2、H、I）。繊毛細胞（OR 2.10, [1.25～3.54] ）およびイオン細胞（OR 2.59, [1.34～5.02] ）は、ベースライン時の喘息患者との関連性が見られた。アレルゲンチャレンジに対するAECsの反応を評価するために、ベースラインと比較してアレルゲン後に差次的に発現した遺伝子（DEGs; log2FC > 0.5 and FDR < 0.1; Materials and Methods）の数を定量化した（図3DおよびデータファイルS6）。喘息患者のAECは、ACと比較して、アレルゲン負荷後に転写プロファイルを著しく変化させた（総DEGs = AAでは4286、ACでは269）。喘息患者のゴブレット細胞は、アレルゲン負荷に対する転写反応が最も大きく（DEGs = 1454）、次いで上基底細胞（DEGs = 850）、quiesGoblet（DEGs = 645）、クラブ（DEGs = 472）、基底細胞（DEGs = 323）、これらのAECサブセットはアレルギー性炎症時に中心的役割を果たすと考えられる。ベースラインでは、グループ間の転写の差はほとんど見られなかった（データファイルS6）。アレルゲンチャレンジによって誘導されるDEGの数が多いことから、アレルゲンチャレンジ後の喘息に特異的に関連するDEGを同定するために、疾患群と実験条件の相互作用項を作成した（FDR < 0.1; Materials and Methods and data file S6）。この相互作用項を用いると、喘息に特異的な基底クラスターと分泌クラスターにまたがる65の共有DEGが同定された（図3E）。このコア反応は、炎症性シグナル伝達、組織リモデリング、解糖に関わる遺伝子とともに、IL-13誘導遺伝子のアップレギュレーション、および抗酸化遺伝子のダウンレギュレーションによって特徴づけられていた。
また、喘息患者とACの間でサブセット特異的なDEGを同定し、喘息に関連するAEC生物学の新しい側面を浮き彫りにした。アレルギー性コントロールの基底細胞および基底上細胞は、アレルゲンチャレンジ後の傷害修復反応によって特徴付けられ、アラーキン（IL33およびHMGB1）と好中球化学吸引物質（CXCL6）の発現が増加していた（図3F）。一方、喘息患者のこれらの細胞は、2型炎症細胞のリクルートとシグナル伝達（CCL26とIL13RA1）、粘液メタプラシア（SPDEF）、細胞外マトリックス（ECM）分解を促進し結合組織の再生と生着を可能にする遺伝子（MMP1とMMP7）を発現上昇させた（POSTNとLOXL4）。次に、相互作用項によって同定されたDEGのIngenuity Pathway Analysis（IPA）を行い、各群の上皮細胞における転写変化の上流制御因子の可能性を特定し、｜z score｜＞2を有意とした（材料と方法およびデータファイルS8）。
喘息患者において、最も強く予測された上流制御因子は、IL-13と線維芽細胞増殖因子2（FGF2）（｜zスコア｜＝2.45）であり、いずれも気道炎症とリモデリングに関与する（図S2J）。
ACはまた、杯細胞のストレス応答遺伝子（S100A8およびHMGB2）を、組織の完全性および血管新生（VEGFA）および抗酸化防御（GSTA1、GSTA2、およびGSTA4）を制御する遺伝子とともにアップレギュレートした（図3F）。喘息患者のすべての分泌クラスターは、杯細胞の分化を指示するシグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子6（STAT6）誘導転写因子であるSPDEFを上昇させたが（26）、喘息患者の杯細胞はさらに、ムチン糖鎖形成および水和を制御する遺伝子（GCNT4およびGALNT10）および気道表面液体pHを制御する遺伝子（CA2およびSLC26A4）も上昇させた（30）。喘息患者において、最も強く予測された杯細胞の上流制御因子は、上皮成長因子受容体（EGFR; |z score| = 2.0; 図S2J）で、杯細胞の過形成とムチン生成を促進しうる（21、31、32).これらの結果から、気道基底細胞および分泌細胞は、アレルギー性炎症時に非常に動的な細胞であることが明らかになり、それらが喘息発症を促進するメカニズムが明らかになった。
IL9を発現する病原性TH2細胞は、アレルゲンチャレンジ後の喘息気道に特異的である。
TH2細胞は、気道におけるアレルゲンに対する炎症反応において中心的な役割を担っている（2, 6, 9）。18,714個のT細胞をサブクラスタリングしたところ、上位マーカー遺伝子（AUC 0.75以上、擬似バルクDGE FDR < 0.05；資料と方法、データファイルS4）と公開されている転写データ（16、33-39）を相互参照することで注釈が付いた10種類のサブセットが特定され、4つのCD8 T細胞サブセット、5つのCD4 T細胞サブセット、小さなガンマデータT細胞 (TRDC) 集団が含まれていました（図4、A、B、図S3、A、B）。静止状態のCD8 T細胞は、全体的な遺伝子発現が低いことで区別された。CD8 T（GZMK）細胞は後期エフェクター遺伝子（EOMESとKLRG1）に富み、CD8 T（CLIC3）とCD8 T（EGR2）細胞はともに組織常在メモリマーカー（ITGAE、ITGA1、CD69）に富むことが分かった。これらの知見は、遺伝子セット濃縮解析（GSEA）（図S3C、材料と方法、およびデータファイルS7）でも支持された（36）。CD4 T細胞サブセットには、CD4制御性T（Treg）（FOXP3）、CD4 TH2（GATA3）、CD4 T（CD40LG）、CD4 TH17（RORA）、および最近報告されたインターフェロン（IFN）応答CD4 THIFNR（ISG15）集団（33、37、38）。TH2、TH17、THIFNRクラスターの同一性は、GSEAによって確認された（図4C、図S3C、データファイルS7）（33、39）。CD8T細胞は、ベースライン時に両群でT細胞の最も大きな割合を占め、アレルゲンチャレンジ後もACのT細胞の最大の割合を維持した（図4D、図S3D、およびデータファイルS3）。一方、CD4 T（CD40LG）、Treg、TH2細胞の割合は、アレルゲンチャレンジ後の喘息患者において増加した。TH2の多さは、ベースライン時（OR 3.57, [1.71～7.45] ）とアレルゲンチャレンジ後（OR 3.43, [1.87～6.29] ）の両方で喘息と関連していた（図4E、図S3E、およびデータファイル S5）。CD4 T（CD40LG）（OR2.12、［1.23〜3.68］）およびTreg（OR3.47、［2.20〜5.47］）もアレルゲンチャレンジ後の喘息と関連していた。TH2集団をさらに調べると、病原性機能の亢進に関連する遺伝子（PTGDR2およびHPGDS）およびTH2偏光サイトカインの受容体（IL1RL1およびIL17RB）を発現する細胞のサブセットが特定された（図4Fおよび図S3F）（33-35）。

図4.喘息気道に特異的なIL9発現の病原性TH2細胞。
(A) 18,714個のT細胞のサブクラスタリングから得られたUMAP包埋。(B) 各クラスターの上位の識別遺伝子セットを、他のすべてのT細胞クラスターと比較し、クラスターごとの平均遺伝子数を示すヒートマップ（トップバー）。(C) CD4 TH2、TH17、およびTHIFNRクラスターのGSEAで、これらのクラスターのマーカー遺伝子をSeumoisら（33）の公開T細胞遺伝子セットと比較した（データファイルS7）。(D）ベースライン時（左）とアレルゲン負荷後（右）の各T細胞サブセットの割合を、他のあらゆるT細胞サブセットと比較して表示した細胞密度のUMAP埋め込み画像で、疾患グループ（AC：上、AA：下）でファセット化した。(E) ベースライン時およびアレルゲンチャレンジ後のクラスターによる疾患関連性のOR。(F) 遺伝子発現を示す疑似カラーリングを用いた病原性TH2遺伝子のフィーチャー・プロット。(G)遺伝子発現を示す擬似カラーリングを用いたIL9発現のフィーチャープロット、グループごとにファセットした。(H）IL-9のBAL濃度（AC、n＝14；AA、n＝18）。E）において、点とひげは、混合効果相関ロジスティック回帰モデルを用いて計算したORと95％信頼区間を表す（P < 0.05はTukey法による多重比較で補正）。F）および（G）において、細胞数およびパーセント（%）は、すべてのT細胞サブセットにわたる遺伝子発現を表す。遺伝子発現をlog(CPM)でスケーリングした。H）において、ボックスは中央値（線）とIQRを表し、ウィスカーは1.5×IQRを超えない範囲で分布の残りに伸びている。
P値は、多重比較を調整するためにŠidák補正を用いた混合効果モデルを用いて生成した。*P < 0.05、***P < 0.01、***P < 0.0001.
アレルゲンチャレンジに対するT細胞の応答を評価するために、ベースラインと比較してアレルゲン後のDEG数（log2FC > 0.5 およびFDR < 0.1; 材料と方法）を定量化したところ、喘息患者のTH2（DEG = 76）とCD4 T（CD40LG）（DEG = 54）に最も多くのDEGが認められた（図S3GおよびデータファイルS6）。アレルゲンチャレンジ後のグループ間で同定されたDEGはほとんどなかった（図S3、HとI、およびデータファイルS6）。IL9は、アレルゲンに応答して喘息TH2細胞で最もアップレギュレートされた遺伝子であった（logFC 8.3, FDR = 2.8×10-8）．IL9を発現する病原性TH2細胞は、これまでにAAsの血液中に存在することが報告されているが（33）、気道では報告されていない。我々のモデルでは、IL9発現TH2細胞はアレルゲンチャレンジ後にのみ観察され、喘息性気道に非常に特異的であった（図4Gおよび図S3J）。これらの細胞は、IL-9産生の誘導因子（PPARGとIRF4）にも富んでいた（図S3F）（33、40、41）。さらに、BALサンプルのIL-9タンパク質レベルは、アレルゲンチャレンジに反応して増加し、ACと比較して喘息患者で高かった（中央値［四分位範囲、IQR］：489.9 [429.9 to 583.5] 対 33.5 [10.2 to 238.9] pg/ml、P < 0.0001）（図4H）。IL-9は、マスト細胞の活性化とプロフィブロティックメディエーターの発現を直接促進し、TH2細胞による2型サイトカインのオートクライン生産を誘導し、IL-13の誘導を介してAECムチン生産を間接的に増加させることができる（40、42～44）。IL9Rの発現は、過去の報告（図S1IおよびS3F）と同様に、肥満細胞および病原性TH2で確認された（16、45）。これらの結果は、気道の病原性TH2細胞、特にIL9の発現が、喘息とアレルギーだけを区別することを実証しています。さらに、アレルゲンによって誘導されたIL-9の発現が、2型炎症を増幅し、病的な気道リモデリングを促進する可能性が示唆された。
DC2およびCCR2発現MCは、アレルゲンチャレンジ後の喘息患者において濃縮されているが、マクロファージ様MCはACsにおいて濃縮されている
MNPは、喘息のマウスモデルで2型炎症を維持するのに必要である（46）。しかし、ヒトのアレルギー性気道炎症の文脈におけるMNPサブセットの正確な役割とその機能特化は、まだ十分に理解されていない。MNPは、アレルギー性炎症時に肺に集められ（図1Dおよび2、DおよびF）、樹状細胞（DC）、マクロファージ（Mac）およびMCを含む（47-49）。8510個のMNP細胞のサブクラスタリングにより、トップマーカー遺伝子（AUC 0.75以上、疑似バルクDGE FDR < 0.05; 材料と方法およびデータファイルS4）と公開されている転写データ（図5、A～C、図S4、AおよびB）を相互参照することで注釈付けられた14種類のサブセットを特定した（49～58）。DCサブセットには、DC1（CLEC9A）、DC2（CD1C）、移動性DC（migDC；CCR7）、形質細胞DC（pDC；TCF4）、Axl-Siglec6 DC（AXL）などがあった。3つのクラスターは、ベースラインサンプルにおけるその豊富さに基づいてMacとして注釈され、その組織居住性を示している。Mac1（FABP4）およびquiesMacs（全体的に遺伝子発現が低いことで定義）は、正規のMac（MARCO、MSR1、VSIG4）および脂質代謝遺伝子（FABP4、APOE）に富み、これまでに報告されている内腔Macs（16、25、51）と一致している。Mac2（A2M）は、補体ファミリー遺伝子（C1QA、C1QB、C1QC）の発現が高く、正統的Macマーカーの相対発現が低いことから、最近マウスで特徴付けられた気道関連Mac（AAM）を連想させた（57、58）。

図5.喘息患者とACのMNPプロファイルは異なる。
(A) 8510個のMNPのサブクラスタリングから得られたUMAPエンベッディング。(B)他のMNPクラスターと比較した各クラスターの上位判別遺伝子セットとクラスターあたりの平均遺伝子数を示すヒートマップ（トップバー）。(C) MNPクラスター間の遺伝子発現量と遺伝子を発現している細胞の割合を示すドットプロット。(D) ベースライン時（左）とアレルゲン負荷後（右）の各MNPサブセットの割合を他のMNPサブセットと比較して表示した細胞密度のUMAPエンベッド、疾患グループによるファセット（AC：上、AA：下）。(E) ベースライン時およびアレルゲン暴露後のクラスターによる疾患関連性のOR。E）において、点とひげは、混合効果相関ロジスティック回帰モデルを用いて計算された95％信頼区間付きORを表す（P < 0.05 Tukey法による複数比較で補正）。
5つのクラスターは、正規の単球遺伝子（CD14、VCAN、FCN1）の高い発現と、MacおよびDCマーカーのさまざまな発現に基づいて、MCと命名された。これは、MCのよく説明された可塑性と一致する（47、48、59）。休止期のMCは、単球の可塑性のマーカーによって特徴付けられ、残りのMCクラスターよりも全体的に遺伝子発現レベルが低かった。MC1はIFN応答性遺伝子（GBP1、STAT1、WARS）を高レベルで発現し、CXCR3リガンド（CXCL9、CXCL10、CXCL11）を特異的に発現した（図5Cおよび図S4C）。
MC2は、マトリックスと相互作用する遺伝子（SPP1、MERTK、LGMN）に富み、以前に報告された肺常在集団と一致した（50-52）。MC3は、組織修復に関わる遺伝子（AREG、VEGFA、HBEGF）と、単球が炎症を抑え、再生Macに分化するのに必要な転写因子であるNR4A1を明確に発現した（60、61）。一方、MC4はMacマーカーの発現が低く、未分化単球に関連する遺伝子（TMEM176B、AIF1、CSF1R）の発現が高く、単球走化性受容体CCR2に富むことから、最近採用された未熟なMacと一致する。
組織MCとMacは肺のホメオスタシスにおいて重要な役割を果たし、その割合の不均衡は肺疾患と関連している（50, 62）。Mac1（FABP4）はベースライン時に両群で豊富であったが、DCサブセットは稀であった（図5D、図S4D、およびデータファイルS3）。混合効果ロジスティック回帰を用いると、MC2（SPP1）の豊富さはベースライン時のACと関連し（OR 0.52, [0.31～0.89] ）、休止状態のMCは喘息患者と関連した（OR 2.05, [1.59～2.66] ）；図5、DおよびE、fig.S4E、およびデータファイルS5）。アレルゲンのチャレンジは、ACと喘息患者の間で異なるMNPプロファイルの劇的な変化を引き起こした。Mac1およびMac様MC（MC1、MC2、MC3）の多さは、アレルゲンチャレンジ後のACと関連していたが、MC4（OR 2.77, [1.29～5.92] ）およびDC2（OR 2.11, [1.23～3.61] ）の多さは、喘息患者との関連があった。気管支内ブラシサンプルのフローサイトメトリーにより、SAC後のACと比較して喘息患者におけるDC2（CD45+HLA-DRhiCD1c+）の濃縮が確認された（6.6% [2.6～9.2%] 対 2.9% [2.4～3.2%], P = 0.02; 図 S4F）。
アレルゲンチャレンジ後の各群におけるMNPサブセットの濃縮に関連する遺伝子を特定するために、最小絶対縮小・選択操作（LASSO）モデリング（経験的P<0.01カットオフ；fig.S4, G to I, Materials and Methods, and data file S9）。ACにおけるMC2（SPP1）およびMC3（AREG）の濃縮は、EGFRシグナル伝達（AREGおよびEGFR）と関連していた。リンパ毒素遺伝子（LTBおよびLTA）は、喘息患者のDC2（CD1C）濃縮と正の相関があったが、ACのMC2（SPP1）およびMC3（AREG）の濃縮と負の相関があった。リンパ毒素は腫瘍壊死因子（TNF）ファミリーメンバーであり、そのシグナル伝達は粘膜表面での免疫細胞の凝集と、DC成熟やDC-T細胞相互作用を含む組織内のエフェクター免疫応答をオーケストレーションする(63).分泌されたLTαは、膜結合型LTβとヘテロ三量体を形成し、LTβRを介してシグナルを伝達する。我々は、LTBRがMNPとAECで主に発現していることを確認した（図S4J）。これらのデータは、気道におけるリンパトキシンシグナルが、喘息におけるMNPの制御において重要な役割を果たす可能性を示唆している。
CCR2発現MCは、喘息気道において未熟で病原性のある状態で存続する
単球は、炎症時に組織に集められ、組織微小環境によってプログラムされる高度に可塑的な細胞である（47、48、59）。マウスモデルでは、これらの細胞は一過性に炎症性であるが、その後、炎症を解決するMacに分化することが示唆されている（48、59、62）。気道粘膜における単球由来サブセット間の移行があるかどうかを調べるため、RNA速度解析と潜伏時間解析を用いて細胞の軌跡を推測したところ、MC4（CCR2）からMC2（SPP1）、MC3（AREG）への移行を高い信頼性で予測した（図6A、および図S5、A、B、ならびに材料および方法）。速度解析により、MC2（SPP1）が終末集団であることが確認され、MC3（AREG）が中間状態であることが示唆されました。この分化軌道に沿った細胞は、Macのアイデンティティと生存（MARCO、PPARG、CSF1）、ファゴリソソーム機能（LAMP1、CTSD、CTSL）、脂質代謝（APOC1、MGLL、FABP5）に関連する遺伝子の発現を順次獲得しました（図6B、データファイルS10）。

図6.SAC後の喘息患者の気道MCにおける病原性転写プログラム。
(A) UMAP包埋に投影されたストリームラインとして可視化されたMNPクラスターのサブセットのRNA速度。(B) 推定された分化の軌跡に沿って相関する上位100の系統ドライバー遺伝子の遺伝子発現パターンのヒートマップ。(C) ALIにおける血中CD14+単球とAECsの共培養モデル。ベースラインの血中CD14+単球と4日目（d4）と21日目（d21）に採取した共培養細胞からなる33,566個の細胞のクラスタリングから得られたUMAP包埋画像。Mono、単球；moMac、単球由来Mac；mito、ミトコンドリア。(D）気道MNPサブクラスター（図5A）の遺伝子セットスコア（x軸）を用いた、血液CD14+単球（0日目；d0）およびd4およびd21共培養からのmoMacのアライメント（図5A）。(E）共培養のd21における直交再構成による免疫蛍光染色は、Hoechst核カウンターステイン（シアン）を用いて、p63+基底細胞層（イエロー）に統合されたCD45+免疫細胞（マゼンタ）を示す。CD45+免疫細胞（マゼンタ）は、顕著な細胞質突起とMERTKおよびC1qの発現を示す（黄色）。
(FとG）MC2（F）とMC4（G）におけるDEGを表すボルケーノプロットで、SAC後のAC（紫）とAA（金）を比較した。縦の点線は｜log2FC｜＝0.5のカットオフ、横の点線はFDRカットオフ＝0.1のカットオフを表す。(H and I) (F)と(G)で同定されたDEGに基づき、MC2 (H)とMC4 (I)の上流制御因子を予測した（AC：紫、AA：金色）。縦実線はzスコアのカットオフ値｜2｜を表す。(J) MC成熟シーケンスの概要図。(FとG) 擬似バルクカウント行列のWald検定によるFDR < 0.1 および log2FC > 0.5 に基づくDEGs。
さらに、末梢血から単離したヒトCD14+古典単球（9668細胞）、および気液界面（ALI）での単球と初代AECの共培養の4日後（8759細胞）と21日後（15139細胞）（図6C、図S5、CおよびD、材料と方法、データファイルS2およびS4）に対して、scRNA-seqを行ってこの過渡期関係を問い直しました。3つのMNPクラスターと7つのAECクラスターを含む10の異なる集団を同定した（AUC≧0.75および擬似バルクDGE FDR < 0.05; Materials and Methods）。MNPクラスターには、0日目の末梢血から採取した古典的単球（mono; CD14）とDC2（CD1C）の小さな集団、さらに4日目と21日目の両方の共培養で確認された単球由来Mac（moMacs; C1QA）が含まれていた（図6C、図S5C）。気道粘膜MNPマーカー遺伝子から得られた遺伝子セットスコア（図5BおよびデータファイルS4）を用いると、血液由来の0日目の単球はMC4（CCR2）と一致する一方、共培養4日後のmoMacはMC2（SPP1）と最も近く一致し、RNA速度解析で予測された分化連続性と一致している（図6Dおよび図S5E）。21日間培養したmoMacは、Mac2（A2M）と同様の転写プロファイルを獲得し、補体遺伝子（C1QA、C1QB、C1QC）およびMERTKに非常に富んでいた（図6Dおよび図S5E）。Mac2（A2M）と転写的に類似しているマウスAAMは、CCR2+単球によって補充され、気道上皮に統合され、樹状形態を示す（57、58）。そこで、21日目の共培養の免疫蛍光染色を行い、これらの細胞が上皮基底層と共焦点化し、樹状突起を獲得し、C1QとMERTKを発現することを確認した（図6E）。
続いて、アレルゲンチャレンジ後のMNPサブセットにおけるDEGの数（log2FC > 0.5 およびFDR < 0.1; 材料と方法）をベースラインと比較して定量化し（図S5FおよびデータファイルS6）、転写応答はACと比較して喘息患者で大きいことがわかった（AAにおける総DEG = 671対ACにおける89）。喘息患者のMC4は、アレルゲンに対する転写反応が最も大きく（DEGs = 289）、次いでMC2（DEGs = 122）、DC2（DEG = 94）、Mac2（DEGs = 48）だった。アレルギー性喘息に特異的なMNPの転写変化を同定するために、次に、アレルゲンチャレンジ後のグループ間のDEGを同定した（図S5GおよびデータファイルS6）。アレルゲンチャレンジに応答して、MC2（SPP1）とMC4（CCR2）は、グループ間で最も多くのDEGを有していた。ACでは、MC2（SPP1）は、単球およびMacの走化性と生存（CCL2およびCSF1）、ファゴリソソーム機能（MARCO、CD163およびCTSD）、および脂質の輸送と代謝（ACSL1およびABCA1）に関わる遺伝子を上昇させた（図6F）。一方、喘息患者のMC2は、2型炎症時の免疫細胞の走化性（CCL17、CCL26）、抗原提示（HLADRB1、HLADPA1、CIITA）、エイコサノイド合成（ALOX15、GGT5）に関わる遺伝子をアップレギュレートした。また、ACのMC4（CCR2）は、単球やMacの走化性と生存に関わる遺伝子（OSM、CCL4）や、組織修復を司る遺伝子（HBEGF、VEGFA）、活性酸化種の除去に関わる遺伝子（NAMPT、SOD2）を上昇させたが、喘息患者はECM分解と病的リモデリングの関わる遺伝子（MMP9、MMP12、ADAM19）を上昇させた（図6G）。
アレルゲン負荷後のグループ間のDEGのIPAおよびKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）パスウェイ解析を用いて、グループ間の転写差を駆動する可能性のあるシグナル伝達経路（pORA < 0.1）と上流制御因子を予測し、｜z score｜＞2を有意とした（材料と方法およびデータファイル S8）。ACのMC2（SPP1）では、喘息患者（抗原処理と提示、C型レクチン受容体、Wnt）と比較して、異なる予測シグナル伝達経路［ファゴライソソーム、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）］が特定された（図S5H）。ACにおけるMC2（SPP1）の予測された上流制御因子は、Macの生存とアイデンティティを指示し、CSF1（NCOA1）とPPARγシグナル（MED1）の制御因子を含み、GRIP1をコードするNCOA2とともに、抗炎症Mac表現型（｜z score｜ = 2.0）を促進した（図6H）（64）。一方、IL-4（｜zスコア｜＝3.36）とIL-13（｜zスコア｜＝2.45）は、喘息患者におけるMC2（SPP1）の転写変化の最も強い予測ドライバーであった。
また、ACのMC4（CCR2）では、喘息患者（アラキドン酸代謝、Janus kinase（JAK）-STAT）と比較して、補体カスケード、核因子κB（NF-κB）、PPARという異なる予測シグナル伝達経路が確認された（図S5H）。STAT3（｜zスコア｜＝2.12）は、ACにおけるMC4（CCR2）の転写変化の最も強い予測上流制御因子であったが、IL-4/IL-13シグナルを媒介するSTAT6（｜zスコア｜＝1.73）については喘息患者で有意ではない傾向が観察された（図6I）。多くのSTAT6誘導遺伝子（ALOX15、CCL17、MMP12）は、アレルゲン負荷後の喘息患者のMNPクラスター全体に濃縮されていた（図S5I）。これらのデータは、ACにおいて、MC表現型は、エンドサイトクリアランス、Macの分化と生存、血管新生と組織修復を促進する栄養因子の発現に重要な因子のオートクライン産生によって特徴づけられることを示唆している。一方、喘息患者におけるSTAT6を介したIL-4/IL-13シグナルは、Macの分化を阻止または停止し、代わりに炎症シグナル伝達、抗原提示、および病的気道リモデリングに関わる遺伝子の発現上昇を特徴とする病原性MC表現型を誘導すると考えられる（図6Jにまとめている）。
喘息性気道は、病原性TH2-MNP-基底細胞インタラクテオームによって特徴づけられる。
気道上皮細胞と免疫細胞間の細胞クロストークは、アレルギー性炎症の開始期と解消期に重要である（2-4、65、66）。そこで、CellPhoneDB（67）を用いて、アレルゲン負荷後のACと喘息患者に特異的な受容体-リガンド対を予測した（経験的P < 0.001カットオフ；材料と方法およびデータファイルS11）。両群で予測されたユニークな相互作用の数が最も多かったのは、AECとMNPサブセット間であった（図7Aおよび図S6A）。喘息患者においては、残りの相互作用はTH2細胞によって支配されていた。

図7.アレルゲン暴露後の喘息気道における病原性細胞インタラクテオーム。
(A）ACおよびAAにおいて、最もユニークな受容体-リガンド相互作用を持つ上位25の細胞-細胞ペア（異なる細胞系列間の相互作用に限定）。階層は相互作用の数を表す（階層1：50以上、階層2：40〜49、階層3：30〜39）。(B）AAsでSACした後のTH2-AECsとTH2-MNPsの予測される相互作用を示すドットプロットである。(C）LIGHT（TNFSF14；AC：n＝13、AA：n＝14）およびLTα（AC：n＝13、AA：n＝16）のBAL濃度。(D）AAsおよびACsにおけるSAC後のAEC-MNP間の予測された相互作用を示すドットプロットである。(E）CCL22、CCL26、MMP-12、およびTGFαのBAL濃度（AC：n＝13、AA：n＝14）。(F）アレルギー性喘息における病原性TH2-MNP-基底細胞インタラクテオームの概要図。(B)と(D)では、ドットの大きさが有意性を示し（真：経験的P < 0.001）、色の濃さが疾患群に対する相互作用の特異性［-log10（ランク）］を示している。C）と（F）では、ボックスは中央値（線）とIQRを表し、ウィスカーは1.5×IQRを超えない範囲で分布の残りに伸びている。C）および（F）において、P値は多重比較を調整するためにŠidák補正を用いた混合効果モデルを用いて生成されたものである。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
喘息患者では、TH2からのTNFファミリーメンバー（TNF、LTA、TNFSF14）および2型サイトカイン（IL4、IL13）が、AECおよびMNPサブセット間で相互作用すると予測された（図7Bおよび図S6B）。BALにおけるタンパク質の検証では、アレルゲンチャレンジ後、ACと比較して喘息患者のLIGHT（TNFSF14; 229.1 [84.8 to 584.6] 対 119.6 [37.1 to 211.6] pg/ml, P = 0.006）およびLTα（43.3 [12.8 to 124.3] 対 11.7 [7.2 to 26.8] pg/ml, P = 0.03 ）が増えることが示されました（図 7C）．TH2は、IL33R/IL1RL1-IL33およびLIFR-LIFを介してAECサブセットと相互作用することが予測された。TH2とMNPは、T細胞の局在化（CCR4-CCL17）、免疫シナプス形成（ICAM2-インテグリンαLβ2複合体）、コスト刺激（CTLA4-CD86、ICOS-ICOSLG）、T細胞の偏向（TGFBR3-TGFB1、CCR2-CCL2）に関わる受容体と配位子のペアを通じて相互作用すると予測されている（40、68）。さらに、T細胞の走化性（CCR4-CCL22）や免疫調節（CD226-PVR、TIGIT-PVR）に重要なものを含む、TH2とDC2間の特定の予測される相互作用も観察された。
MNPはACの複数のAECサブセットと相互作用することが予測されたが、喘息患者では基底細胞が主な相互作用するAECサブセットであった（図7A）。IL-1シグナル伝達に有利な相互作用は、CellPhoneDB分析によって、また受容体-リガンド対の線形モデリングを行うことによってACで同定された（FDR < 0.1; 図7D, fig.S6, C to E, Materials and Methods, and data file S11 and S12）。MNPからのIL1Bは、両群とも基底細胞上でその同族受容体IL1R1と相互作用すると予測されたのに対し、このサイトカインは、喘息患者ではデコイ受容体IL1R2とのみ相互作用すると予測された。IL-1R2はIL-4/IL-13によって誘導され、IL-1βの効果に拮抗する（69、70）。喘息患者において、予測されたAEC-MNP相互作用は、非正規のWntおよびトランスフォーミング成長因子β（TGFβ）シグナルとともに、炎症性白血球の移動に関与した。
TGFβは上皮特異的なインテグリンαvβ6と相互作用することが予測され、TGFβの活性化を媒介し、気道構造リモデリングを促進する（71）。TRAIL（TNFSF10）シグナル伝達も喘息患者に濃厚であり、その炎症作用に加えて、アレルギー性喘息においてメタロプロテアーゼ産生をアップレギュレートして気道リモデリングを促進することができる（72）。EGFRシグナルは、ACと比較して喘息患者では基底細胞と異なるMNP由来のリガンドとの間で起こることが予測された。具体的には、組織修復を促進することが知られているEGFRリガンド（AREGおよびHBEGF）がACを特徴づけていた（73、74）のに対し、喘息患者は上皮性ムチン生成を促進するTGFAを介して独自に相互作用していた（31、32）。
AEC-MNPクロストークをさらに特徴づけるために、NicheNet解析（75）を行い、アレルギーと喘息を区別するこれらの細胞タイプ間の制御ネットワークを特定した（材料と方法およびデータファイルS13）。そこで、リガンドとその下流ターゲットを、アレルゲンチャレンジ後に喘息患者とACの間で発現が異なる遺伝子と定義した（データファイルS6）。ACの細胞間コミュニケーション経路は、サブセット間で成長因子シグナルと傷害修復反応によって特徴付けられた（図S6、FおよびG）。一方、喘息患者では、STAT6誘導シグナルや気道リモデリングのメディエーターを含む基礎的なMNP相互作用が支配的であった。これらの知見を検証するために、ACと比較した喘息患者のBALタンパク質レベルを定量化した（図7Eおよび図S6H）。STAT6誘導ケモカインのタンパク質レベルは、アレルゲンチャレンジ後、ACと比較して喘息患者で高かった（CCL22: 19,080.6 [8876.2 to 22,692.5] 対 7927.6 [1301.3 to 13,504.2] pg/ml, P < 0.0001; CCL26: 627.5 [176.1 to 1276.9] versus 76.9 [20.9 to 126.5] pg/ml, P < 0.0001) また、ムチン生成と病的気道リモデリングに関わるタンパク質レベル (TGFα：59.7 [20.1 to 211.4] 対 32.2 [15.6 to 55.2] pg/ml, P = 0.003; matrix metalloproteinase-12 (MMP-12)：745.7 [176.7 to 1957.7] 対 228.6 [69.7 to 493.5] pg/ml, P = 0.02）．全体として、これらのデータは、ACで観察される保護的な傷害-修復応答を上書きし、それによって喘息病理学（図7Fに要約）を駆動する可能性がある支配的なTH2-MNP-基底細胞相互作用を支持している。
考察
本研究では、アレルギー性喘息患者とアレルギー性非喘息患者を直接比較し、喘息発症に関連する下気道における細胞サブセットと転写エフェクタープログラムを同定した。アレルゲン負荷に応答して、喘息患者の基底上皮細胞および分泌上皮細胞は、マトリックス分解、粘液形成、糖化に関わる遺伝子を上昇させ、ACで観察される抗酸化経路を誘導することはできなかった。アレルゲンのチャレンジは、IL9を発現する病原性TH2細胞を誘導し、喘息患者の気道にDC2（CD1C）と未熟な炎症性MCを濃縮することになった。これらの細胞タイプ間のクロストークは、気道炎症の持続と増幅、およびアレルギー性喘息を定義する病理学的構造リモデリングに不可欠であると考えられる。
SACは、AAとACの両方の気道で好酸球と2型サイトカインレベルの増加をもたらすが（9）、今回の研究では、2型炎症に反応する組織の再プログラミングが喘息の特徴であることが明らかになった（図8に要約）。この発見は、気道に常駐する基底細胞および杯細胞で最も明確に観察される。喘息患者の基底上皮細胞と分泌上皮細胞は、SAC後に2型免疫細胞の走化性、粘液メタプラシア、ECMリモデリングに関わる遺伝子の発現を上昇させた。喘息患者の基底細胞は、アレルゲン負荷後にIL13RA1を発現し、IL-13に対するこれらの細胞の応答性が高まるメカニズムの可能性を示唆した。一方、アレルゲン負荷により、ACでは上皮の修復や細胞保護に関与する遺伝子が誘導された。このように、我々のデータは、喘息性気道上皮において、タイプ2プログラミングが保護および修復経路をオーバーライドすることを示唆している。このプログラミングが、持続的な2型気道炎症によって誘導されるのか、それともアレルギー性喘息におけるAECsの本質的な感受性に起因するのかは、まだ不明である。

図8.アレルギー性喘息の特徴として、2型気道炎症に応じた転写のリプログラミングがある。
SAC後、アレルギー性非喘息コントロールの気道景観は、組織修復に関連する成長因子を発現するマクロファージ様MCの濃縮と、基底細胞および杯細胞の抗酸化遺伝子のアップレギュレーションによって特徴付けられた。一方、喘息患者はこれらの経路をアップレギュレートできず、代わりにDC2（CD1C）、炎症性MC4（CCR2）、IL9を発現する病原性TH2細胞が濃縮されていた。TH2細胞によって産生されるタイプ2サイトカインやTNFファミリーメンバーを含む他のメディエーターは、プロレゾリューションマクロファージへのデフォルトのMC成熟シーケンスを中断することによって、喘息患者の病原性MC4表現型を促進すると考えられる。
これらのTH2メディエーターは、ACで観察される上皮傷害反応を上書きし、代わりに喘息におけるECM分解、上皮下線維化、粘液形質転換を促進すると考えられる。図はbiorender.comを使用して作成した。
タイプ2プログラミングは、SAC後に喘息患者の気道に採用されたMCの定義的特徴でもあった。特に、喘息患者には、IL-13で誘導される炎症性メディエーターとメタロプロテアーゼを上昇させる未熟なMC4（CCR2）が豊富に存在した。一方、アレルゲン暴露後24時間のACでは、マクロファージ様MC（MC1、MC2、MC3）が気道粘膜免疫景観を支配していた。ACのMCで観察されたプロレゾルビング表現型には、スカベンジャー受容体や食細胞機構をコードする遺伝子、上皮の修復を促進する栄養メディエーター、脂質代謝の調節因子などが含まれていた。単球は、炎症時に組織に集められ、環境シグナルに基づいて機能的役割を獲得する高度に可塑的な細胞である。マウスモデルでは、これらの細胞は一過性に炎症性であるが、その後、炎症を解決するマクロファージに分化することが示唆されている（48、59、62）。これと一致して、血液中の単球をAECと共培養すると、単球からマクロファージ様MCへの連続的な分化が予測された。これらの結果から、IL-13は、最近採用されたMC4（CCR2）を炎症性状態で停止させ、それによって気道の恒常性を回復させるマクロファージ様MCへの分化を妨げている可能性があることが示唆された。
また、本研究では、2型炎症を増幅させ、気道炎症と喘息で観察される構造的リモデリングを決定的に結びつける可能性のあるシグナル伝達経路を特定しました。IL9を発現する病原性TH2細胞は、アレルゲンチャレンジ後の喘息気道に非常に特異的であった。IL-9は、2型炎症を増幅し、肥満細胞の活性化と生存を促進し、組織病理を促進することが知られている（40-44）。IL-9を喘息に投与した過去の3つの小規模試験では、様々な結果が得られたが、それらは短期間で追跡した異種の喘息コホートであった（76、77）。我々の発見は、最近のマウス研究(78)と共に、IL-9がアレルゲンリコール反応に特異的である可能性を示唆しており、従って、対象となる患者のサブセットにおいて重要な疾患メディエーターとなる可能性を示している。喘息のマウスモデルは、アレルゲンチャレンジ後の抗原提示DCによるT細胞受容体の活性化がIL9の誘導に必要であることを示している（41）。気道粘膜DC2は、SAC後にAAに富み、アラキドン酸の代謝物を生成する2型サイトカインによって誘導されるリポキシゲナーゼであるALOX15を高発現した。これらの代謝物は、気道における病原性TH2エフェクター応答を駆動する脂質活性化転写因子であるPPARγに結合し、活性化することができる（79）。細胞間相互作用の解析により、DC2とTH2の相互作用がさらに強調され、喘息気道に特有の免疫誘導、DCの成熟、TH2コスト刺激のフィードフォワードループを構成していることがわかった。このことから、局所的なDC2-TH2クロストークは、気道におけるTH2滞留を確立し、病原性TH2表現型をライセンスし、PPARγ活性化を通じてIL-9の産生を促進することが示唆された。同様のDC2-TH2病原性回路が最近アトピー性皮膚炎で報告され、IL-4Rα遮断にもかかわらず持続していた(12)。したがって、気道粘膜のDC2およびTH2をリクルートし、活性化し、持続させる経路を標的とすることが、アレルギー性疾患の寛解を誘導するために必要であると考えられる。
さらに、我々のデータは、喘息における気道炎症と病的組織リモデリングとの関連において、TGFαおよびTNFファミリーメンバーが重要な役割を果たすことを強調している。TGFαはIL-13で誘導されるEGFRリガンドで、上皮ムチン産生を促進する（31、32）。TGFA-EGFRシグナルは、相互作用解析において喘息患者に特有であることが予測された。また、相互作用解析では、TNFファミリーメンバーのLIGHTとTRAILがMC4（CCR2）と相互作用して、喘息におけるMMP9の発現を誘導することが予測された。タイプ2サイトカインによって誘導されるMMP-12とともに、これらのMMPはコラーゲン合成を増加させ、ECMを分解し、TGFβを活性化する（80-83）。強力なエラスターゼであることに加え、MMP-12は、IL-13シグナルの増幅、好酸球とMNPの走化性の促進、B細胞の濾胞形成など、肺における重要な免疫調節の役割を担っている（80、84）。また、TNFファミリーメンバーのリンパ毒素は、粘膜部位での免疫細胞の凝集を誘導し、DCの成熟を促進し、局所炎症を増幅させる(63)。LTAは病原性TH2細胞に高度に濃縮され、喘息性気道におけるDC2の濃縮と関連していた。TGFα、LIGHT、MMP-12、LTαのBALタンパク質レベルは、SAC後に対照ではなく喘息患者で増加し、喘息におけるこれらの関連性をさらに支持した。これらのデータは、喘息発症の原因となるTH2-MNP-上皮細胞相互作用を明らかにし、これらの細胞タイプ間のクロストークを標的とすることが、疾患の寛解を誘導するために必要であることを示唆しています。
本研究では、アレルゲンによる炎症が起きている状態の軽症喘息患者に焦点を当て、組織採取は気道粘膜に限定して行った。
したがって、今回の結果は喘息の全領域に一般化できない可能性があり、他の喘息のエンドタイプや重症度、代替チャレンジモデルを含む追加研究が必要である。参加人数は限られていましたが、クラスターの存在量とDGEにグループ間で非常に有意な差が観察され、それはすべての参加者に共通しており、これらの知見がアレルギー性喘息と関連することを裏付けています。我々はこれまで、参加者の性別や投与したアレルゲンによるSACに対する気道反応の違いを観察したことはない。しかし、今回の知見の一部がこれらの要因に起因している可能性は否定できない。細胞の起源と機能は、遺伝子発現だけでは確定できないので、フォローアップ研究が必要である。最後に、アレルゲン暴露後の単一の時点では、気道の炎症と消失の完全な動態を調べることはできず、より遅い時点の分析により、喘息におけるさらなる病理学的プロセスが明らかになるかもしれない。
我々のデータは、2型サイトカインが、ACで観察される「デフォルト」の上皮傷害修復プログラムと解決促進マクロファージ成熟順序を上書きし、それによって喘息における気道炎症とリモデリングを増幅し結びつける病原性ニッチ回路をプログラミングする可能性を示す。また、TNFファミリーシグナル、細胞代謝の変化、抗酸化反応の失敗、成長因子シグナルの喪失、あるいはこれらのメカニズム間の複雑な相互作用など、2型炎症と協調して喘息を促進する新たな経路が関与していることも、我々の発見から裏付けられた。まとめると、我々は、アレルゲン誘発性炎症の文脈における気道細胞生態系の統合的解析を提示し、喘息に特有の細胞サブセットおよび転写エフェクタープログラムを同定することで、喘息発症の現在の理解を進め、持続的な治療効果を達成するための潜在的標的を特定する。
材料と方法
研究デザイン
参加者の募集と研究プロトコール
本研究は、AAとACのアレルゲンチャレンジに対する気道粘膜反応を比較することを主目的とした、非ランダム化、非盲検のメカニズム研究である。ボランティアは、完全な病歴、ベースラインのスパイロメトリーおよびメタコリンチャレンジ、アレルゲン皮膚テストにより適格性を審査された。詳細な参加資格と除外基準は、以前に発表されたように、Supplementary Methodsに記載されています（9）。簡単に説明すると、HDMおよび/または猫の毛に対するアレルギー性鼻炎および/または結膜炎の臨床歴があり、同じアレルゲンに対する皮膚プリックテストが陽性である18歳から50歳の男女の参加者が登録された。AAにはさらに、軽度の喘息の臨床歴があり、ベースラインのFEV1が予測値の75％以上であり、FEV1の20％低下を引き起こす挑発濃度（PC20）＜16mg/mlと定義されるメタコリンチャレンジテストが陽性であった。参加者は、試験前の6週間は全身性ステロイドを使用することができず、吸入コルチコステロイドは試験手順の2週間前に保持された。すべての参加者は、検査とサンプル採取の前に、書面によるインフォームドコンセントを提供した。試験プロトコルは、Massachusetts General Brigham Institutional Review Board（IRB# 2007P001050）の承認を受け、clinicaltrials.gov（NCT00595491）に登録されています。参加者の全リストは、データファイルS1にまとめられている。
アレルゲン皮膚試験
AAおよびACは、標準化されたHDM（Dermatophagoides pteronyssinus; Greer Laboratories, 10,000 allergy units (AU) per ml）および／または猫毛エキス（Felis catis; Greer Laboratories, 10,000 bioequivalent allergy units (BAU) per ml）にSPT陽性だった。アレルゲン感受性の閾値は、抽出物の連続3倍希釈液を用いた定量SPTにより決定した。皮膚プリックテスト陽性（膨疹径3mm）を誘発する抽出物の最低濃度を、SAC中に投与するアレルゲン量として使用した（9）。SPTとSACの両方に同じアレルゲンのストックを使用した。
セグメント別アレルゲン負荷
簡単に説明すると、ベースラインのBALサンプルは、120mlの通常生理食塩水を舌膜に投与することによって得られた。内腔内容物を除去した後、ベースラインの気管支内ブラッシングを、直視下で4mmの滅菌ナイロン細胞学ブラシを使用して舌膜から採取した（85）。その後、希釈液（2 ml）を右上葉（RUL）の前区画に、アレルゲン（2 ml）を右中葉（RML）の側部に投与した。24時間後、BALおよび気管支内ブラシサンプルを、希釈液およびアレルゲンを投与した分節気道から同様の方法で採取した。
細胞胞子
BALの細胞鑑別数は、細胞遠心分離機による調製物上の好酸球を列挙することで決定した（9）。
フローサイトメトリー
気管支内ブラッシングを上記のように入手し、死細胞排除のために4′,6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）で、Fc受容体遮断後はCD326、CD45、CD3、CD19、HLA-DR、CD1cに対して蛍光結合した抗体で染色をした。
フローサイトメトリー染色に使用した抗体に関する詳細情報は、表S1に記載されている。サンプルは、BD FACSAria Fusionフローサイトメーター（BD Biosciences）で実行し、FlowJo v10.7（Tree Star）を用いて分析した。
サイトカイン定量化
サイトカインは、30 倍濃縮 BAL 上清を用い、MilliplexMAP キット（EMD Millipore）により分析した（9）。BALはAmicon Ultra-15遠心フィルターユニット（EMD Millipore、カタログ番号UFC9100）またはSartorius Vivaspin 15R遠心濃縮機（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号14-558-499）で製造者の指示に従い濃縮した。サイトカインはLuminex 200で測定し、xPONENT v3.1 (Luminex Corp.)を用いて解析した。
ヒト古典単球の精製
全血を健康なボランティア（IRB# 2002P001658）から採取し、末梢血単核細胞（PBMC）をFicoll gradient遠心分離を用いて分離した。CD14+古典的単球は、磁気ビーズ分離（Miltenyi Biotec、カタログ番号130-117-337）を用いて、製造者のプロトコールに従ってPBMCから分離された。過剰な細胞はCryoStor CS10（BioLife Solutions、カタログ番号210102）で凍結し、後に解凍してリン酸緩衝生理食塩水（PBS）+2mM EDTA+0.5% 牛血清アルブミン（BSA）溶液で連続的に希釈した。死んだ細胞を磁気的に除去し（BioLegend、カタログ番号480159）、残りの細胞を10X Chromium装置（10X Genomics）でのロードに備えて、1000細胞/μlの濃度で再懸濁した。
ヒト単球と気道上皮の共培養とscRNA-seq
ヒト初代小型AEC（Lonza、カタログ番号CC-2547）を、ラミニンでコートしたTranswellインサート（Corning、カタログ番号3470）上でPneumaCult Ex-Plusに続いてALI培地（STEMCELL Technologies、カタログ番号05040および05001）を用いて既出のようにALIで培養した（86）。CD14+古典単球は、無傷のALIが形成された後、9×104細胞/cm2の密度でアピカルチャンバーに添加した。scRNA-seq のために 4 日目および 21 日目に共培養を解離する前に、PBS 中 75 μl の 10 mM ジチオスレイトール (MilliporeSigma, カタログ番号 43819) をアピカルチャンバーに 5 分間添加し、PBS 洗浄 (×2) により過剰粘液を除去した。その後、TrypLE Select（Gibco、カタログ番号12563011）を用いて15分間、共培養を解離させた。磁気CD45+濃縮（STEMCELL Technologies、カタログ番号1000105）を用いて、解離した共培養物から回収したMNPの割合を増やした。すべてのサンプルは、磁気デッドセル除去（BioLegend、カタログ番号480159）を行い、10X Chromium装置（10X Genomics）でのロードに備えて、1000細胞/μlの目標濃度で再懸濁した。
免疫蛍光染色
免疫蛍光染色に使用した抗体に関する詳細な情報は、表S1に記載されている。MERTKの染色は、まずFc受容体遮断を1時間行った後、抗ヒトCD45および抗ヒトMERTKを37℃で2時間添加することにより、生細胞で実施した。他のすべての共培養染色は、4％パラホルムアルデヒド（PFA）を用いて固定した後に実施した。細胞を0.1% Triton X-100で透過させ、1% BSA-0.3% Triton X-100でブロッキングした。細胞を、マウス抗ヒトCD45（37℃で2時間）、ラット抗ヒトC1q（4℃で一晩）、およびウサギ抗ヒトp63（4℃で一晩）で染めた。二次抗体は、Hoechst 33258とともに37℃で2時間添加した。蛍光画像は、倒立型Zeiss LSM780共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて得た。
肺組織は、喘息の臨床歴を有する患者の肺葉切除標本から採取した（IRB# 2013P002332）。組織はPFAで一晩固定し、3回洗浄し、30％ショ糖で脱水し、最適切断温度（OCT）（サクラ）で包埋し、凍結融解させた。スライドをサイトケラチン13（KRT13）およびアセチル化チューブリンに対する抗体で染色し、カバースリップをDAPIを含むアンチフェードメディウムでマウントした。画像は、ZEISS Axio Imager M2 広視野蛍光顕微鏡で得た。すべての画像は、FijiまたはZen Blue（Zeiss）を用いて処理した。
単細胞RNA配列決定および計算機によるデータ解析
気管支内ブラッシングから単細胞懸濁液を調製する。
気管支内ブラシサンプルは、氷上で2％ヒトAB血清とROCK阻害剤（Y-27632、Tocris Bioscience、カタログ番号1254）を含むフェノールフリーRPMI1640（Thermo Fisher Scientific）中に集め、収集から60分以内に処理した。細胞は細胞診ブラシから静かに取り除き、フェノールフリーのRPMI1640に再懸濁した。単細胞懸濁液は、アネキシンV結合ビーズ（STEMCELL Technologies、カタログ番号17899）を用いて死細胞を除去し、グリコフォリンA（STEMCELL Technologies、カタログ番号18170）に対する抗体を用いて赤血球を減少させた。細胞生存率は、トリパンブルー（0.4％）染色と、赤血球および死細胞の除去前と除去後の両方で、血球計数器を用いた手動による細胞計数により評価し、死細胞除去後の生存率を95％以上とした。
10X Chromium コントローラー装置（10X Genomics）へのロードに備えて、生存可能な細胞を800～1000細胞/μlの濃度で再懸濁した。
シングルセルRNA配列決定
各10Xチャンネルに約12,000個のシングルセルが6000個のシングルセルの回収目標でロードされた。細胞懸濁液は、逆転写酵素試薬、3′ゲルビーズ、乳化油とともに10X Single Cell B Chipの別々のチャンネルにロードされ、10X Chromium装置にロードされてエマルションを生成しました。エマルジョンをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）ストリップチューブに移し、直ちに処理し逆転写した。ライブラリー調製は、製造元の推奨に従って行われた。発現ライブラリーは、Chromium Single Cell 3′V3 chemistry (10X Genomics PN-120262; endobronchial brush samples) または Next GEM Single Cell 3′V3.1 chemistry (10X Genomics PN-1000268; coculture samples) を用いて作成しました。DNA とライブラリーの品質は Agilent 2100 Bioanalyzer で評価し、濃度は Qubit dsDNA high-sensitivity reagents (Thermo Fisher Scientific) を使って定量した。遺伝子発現ライブラリーは、Illumina NextSeq装置で配列決定した。気管支内ブラシサンプルは、Illumina NextSeq 500/550システムで、以下のシングルインデックスシーケンス構成を使用してシーケンスした：リード1＝28塩基対（bp）［セルバーコード、ユニーク分子識別子（UMI）］、リード2＝56bp（挿入物）、インデックス1＝8bp（サンプルインデックス）、インデックス2＝0 bp。コカルチャーサンプルは、以下のデュアルインデックスシーケンス構成を使用してIllumina NextSeq 2000システムでシーケンスした：リード1＝28bp（細胞バーコード、UMI）、リード2＝96bp（インサート）、インデックス1＝10bp（サンプルインデックス）、およびインデックス2＝10bp（サンプルインデックス）。すべての配列決定統計はデータファイルS2にまとめられている。リードのアライメントと定量化、細胞のクラスタリング、マーカー遺伝子の同定、DGE解析、および他のすべての下流計算解析の詳細な方法は、Supplementary Methodsに記載されています。
統計解析
scRNA-seqデータの計算機による解析のための統計的アプローチは、Supplementary Methodsに詳述されている。反復測定による混合効果モデリングは、特に指定がない限り、細胞割合およびタンパク質レベルの中央値の差をグループ間で比較するために使用され、実験条件および疾患グループは固定効果とみなされ、各参加者はランダム効果として扱われた。多重比較の調整は、Šidákの補正を用いて行われた。両側P < 0.05を有意とみなした。
謝辞
Massachusetts General Hospital Pulmonary Special Procedures Unit and Translational and Clinical Research Centersのスタッフ、臨床研究コーディネーター（M. Kone, N. Yang, A. N. Dartley, C. Fromson, G. Lopes, and E. White）, D. L. Hamilos, and C. Learyに感謝します。
資金提供本研究の資金は、NIHグラント5KL2TR002542-04（J.A.へ）、T32HL116275（J.A.とT.K.）、T32AR007258（K.Sへ）、K08HL140173（R.A.R）、R01AI040618 and R01AI168131（A.D.L.）、DP2CA247831（A.- へ）によって供給されています。C.V.）、UH2AI44434-01（J.L.C.）、Massachusetts General Hospital Transformative Scholar in Medicine Award（A.-C.V.); Department of Defense PR150903/W81XWH-16-1-0493（B.D.M.); and Sanofi iAward (to B.D.M.).ここに示したデータの一部は、アイオワ大学カーバー医科大学から一部支援を受けているIowa Institute of Human Geneticsのバイオインフォマティクス部門にて得られたものである。この研究は、Harvard Catalyst｜the Harvard Clinical and Translational Science Center（National Center for Advancing Translational Sciences、NIH Award grants KL2TR002542 and UL1TR002541）からの支援（KL2、Harvard Catalyst Clinical Research Center）によって行われました。内容はあくまで著者の責任であり、必ずしもHarvard Catalyst、ハーバード大学およびその関連学術医療センター、またはNIHの公式見解を示すものではない。これらの資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版決定、原稿作成に関与していない。
著者の貢献J.A.、A.D.L.、A.-C.V.、J.L.C.、B.D.M.が研究をデザインした。J.A.、T.K.、R.A.R.、L.P.H.、J.L.C.、B.D.Mは試験手順と試料採取を行った。J.A.、T.K.、R.A.R.、N.D.N.、A.M.H.、F.L.G.がサンプル処理を行い、K.MとJ.TがscRNA-secqデータを作成した。データ解析と解釈はJ.A.とN.P.S.が行い、K.S., I.J.K., J.D., H.L.K., A.-C.V., J.L.C., B.D.M. が大幅に貢献した。 A.-C.V. は scRNA-seq データの生成と解析について管理、監督を行った。J.A.、N.P.S.、J.L.C.、B.D.M.は原稿を執筆し、K.S.、R.A.R、 S.L.S., R.J.X., A.D.L., およびA-C-Vが大幅に修正。すべての著者は原稿に目を通しコメントを提供しました。
競合する利益：L.P.H.
は、ベーリンガーインゲルハイムから助成金を受け、ベーリンガーインゲルハイム、Pliant Therapeutics、Biogen Idec、Bioclinicaから個人コンサルティング料を受け取っています。R.J.X.は、Celsius TherapeuticsおよびJnana Therapeuticsの共同設立者、MoonLake Immunotherapeuticsのディレクター、Nestleの科学諮問委員会メンバーです。B.D.M.はSanofiとRegeneronから研究資金を受け、コンサルタントを務めています。他の著者は、競合する利害関係がないことを宣言している。
データおよび資料の入手：scRNA-seqカウントマトリックスおよび関連データはGEOデータベース（アクセッション番号GSE193816）に寄託されており、生のヒトシーケンスデータはアクセス制御リポジトリdbGaP（www.ncbi.nlm.nih.gov/gap/）でアクセッション番号phs003101.v1.p1として入手できる。各主要図のデータ解析のソースコードはGitHub (https://github.com/villani-lab/airway_allergic_asthma) で公開されており、Zenodo (https://zenodo.org/badge/latestdoi/412260708) にアーカイブされています。本原稿で作成したシングルセルデータを閲覧するために、ユーザーフレンドリーなポータルが用意されています。ユーザーは、シングルセルクラスタリングソリューションのクエリ、遺伝子発現の可視化、および遺伝子の差分発現のブラウズを行うことができます。ポータルサイトは、https://villani.mgh.harvard.edu/allergy-asthma にアクセスすることで閲覧できます。
補足資料
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補足方法
図S1〜図S6
表S1
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I.このような状況下において、本講演では、研究者・技術者・研究者間の情報交換の場を提供することを目的とし、研究者・技術者間の情報交換の場を提供する。Loh、S. Raychaudhuri、Harmonyによるシングルセルデータの高速、高感度、高精度な統合。Nat.Methods 16, 1289-1296 (2019).
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科学免疫学
第8巻｜第83号
2023年5月
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Massachusetts General Hospital Pulmonary Special Procedures Unit and Translational and Clinical Research Centersのスタッフ、臨床研究コーディネーター（M. Kone, N. Yang, A. N. Dartley, C. Fromson, G. Lopes, and E. White）, D. L. Hamilos, and C. Learyに感謝します。
資金提供本研究の資金は、NIHグラント5KL2TR002542-04（J.A.へ）、T32HL116275（J.A.とT.K.）、T32AR007258（K.Sへ）、K08HL140173（R.A.R）、R01AI040618 and R01AI168131（A.D.L.）、DP2CA247831（A.- へ）によって供給されています。C.V.）、UH2AI44434-01（J.L.C.）、Massachusetts General Hospital Transformative Scholar in Medicine Award（A.-C.V.); Department of Defense PR150903/W81XWH-16-1-0493（B.D.M.); and Sanofi iAward (to B.D.M.).ここに示したデータの一部は、アイオワ大学カーバー医科大学から一部支援を受けているIowa Institute of Human Geneticsのバイオインフォマティクス部門で得られたものである。この研究は、Harvard Catalyst｜the Harvard Clinical and Translational Science Center（National Center for Advancing Translational Sciences、NIH Award grants KL2TR002542 and UL1TR002541）からの支援（KL2、Harvard Catalyst Clinical Research Center）によって行われました。内容はあくまで著者の責任であり、必ずしもHarvard Catalyst、ハーバード大学およびその関連学術医療センター、またはNIHの公式見解を示すものではない。これらの資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、発表の決定、原稿の作成に関与していない。
著者の貢献J.A.、A.D.L.、A.-C.V.、J.L.C.、および B.D.M.
が研究をデザインした。J.A.、T.K.、R.A.R.、L.P.H.、J.L.C.、B.D.Mが試験手順および試料採取を実施した。J.A.、T.K.、R.A.R.、N.D.N.、A.M.H.、F.L.G.がサンプル処理を行い、K.MとJ.TがscRNA-secqデータを作成した。データ解析と解釈はJ.A.とN.P.S.が行い、K.S., I.J.K., J.D., H.L.K., A.-C.V., J.L.C., B.D.M. が大幅に貢献した。 A.-C.V. は scRNA-seq データの生成と解析について管理、監督を行った。J.A.、N.P.S.、J.L.C.、B.D.M.は原稿を執筆し、K.S.、R.A.R、 S.L.S., R.J.X., A.D.L., およびA-C-Vが大幅に修正。すべての著者は原稿に目を通しコメントを提供しました。
競合する利益：L.P.H.は、ベーリンガーインゲルハイムから助成金を受け、ベーリンガーインゲルハイム、Pliant Therapeutics、Biogen Idec、Bioclinicaから個人コンサルティング料を受け取っています。R.J.X.は、Celsius TherapeuticsおよびJnana Therapeuticsの共同設立者、MoonLake Immunotherapeuticsのディレクター、Nestleの科学諮問委員会メンバーです。B.D.M.はSanofiとRegeneronから研究資金を受け、コンサルタントを務めている。他の著者は、競合する利害関係がないことを宣言している。
データおよび資料の入手：scRNA-seqカウントマトリックスおよび関連データはGEOデータベース（アクセッション番号GSE193816）に寄託されており、生のヒトシーケンスデータはアクセス制御リポジトリdbGaP（www.ncbi.nlm.nih.gov/gap/）でアクセッション番号phs003101.v1.p1として入手できる。各主要図のデータ解析のソースコードはGitHub (https://github.com/villani-lab/airway_allergic_asthma) で公開されており、Zenodo (https://zenodo.org/badge/latestdoi/412260708) にアーカイブされています。本原稿で作成したシングルセルデータを閲覧するために、ユーザーフレンドリーなポータルが用意されています。ユーザーは、シングルセルクラスタリングソリューションのクエリ、遺伝子発現の可視化、および遺伝子の差分発現のブラウズを行うことができます。ポータルサイトは、https://villani.mgh.harvard.edu/allergy-asthma にアクセスしてください。
所属団体
Jehan Alladina† https://orcid.org/0000-0003-0136-6859
マサチューセッツ総合病院およびハーバード・メディカル・スクール（米国マサチューセッツ州ボストン）肺およびクリティカルケア医学部門。
免疫・炎症疾患センター、マサチューセッツ総合病院およびハーバード・メディカル・スクール、ボストン、マサチューセッツ州、USA.
役割概念化、データキュレーション、形式分析、資金獲得、調査、方法論、プロジェクト管理、リソース、監督、検証、視覚化、執筆-原案、執筆-レビュー＆編集。
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Neal P. Smith† https://orcid.org/0000-0003-1394-3158
マサチューセッツ総合病院・ハーバード大学医学部免疫学・炎症性疾患センター（米国マサチューセッツ州ボストン）。
マサチューセッツ工科大学およびハーバード大学のブロード研究所（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）。
マサチューセッツ総合病院がんセンター、ボストン、マサチューセッツ州、米国。
役割概念化、データキュレーション、形式分析、方法論、リソース、ソフトウェア、視覚化、執筆（原案）、執筆（レビュー＆編集）。
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トリスタン・クーイストラ https://orcid.org/0000-0001-7843-0631
マサチューセッツ総合病院およびハーバード大学医学部、米国マサチューセッツ州ボストン、呼吸器・重症患者医療部門。
免疫・炎症疾患センター、マサチューセッツ総合病院およびハーバード・メディカル・スクール、ボストン、マサチューセッツ州、USA.
役割概念化、調査、方法論、リソース。
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カミル・スロニコフスキー https://orcid.org/0000-0002-2843-6370
マサチューセッツ総合病院・ハーバード大学医学部免疫学・炎症性疾患センター（米国マサチューセッツ州ボストン）。
マサチューセッツ工科大学およびハーバード大学のブロード研究所（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）。
マサチューセッツ総合病院がんセンター、ボストン、マサチューセッツ州、米国。
役割分担形式解析、ソフトウェア、可視化。
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イザベラ・J・カーニン https://orcid.org/0000-0002-2579-7445
マサチューセッツ総合病院・ハーバード大学医学部免疫学・炎症性疾患センター（米国マサチューセッツ州ボストン）。
マサチューセッツ工科大学およびハーバード大学のブロード研究所（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）。
マサチューセッツ総合病院がんセンター、ボストン、マサチューセッツ州、米国。
役割分担データキュレーション、形式的解析、ソフトウェア、可視化。
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Jacques Deguine https://orcid.org/0000-0001-9218-3040
マサチューセッツ工科大学・ハーバード大学ブロード研究所（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）。
役割分担：データキュレーション、形式的解析。
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ヘンリー・L・キーン
アイオワ人類遺伝学研究所、アイオワ大学カーバー医科大学、アイオワシティ、アイア州、米国。
役割分担：形式的解析、ソフトウェア。
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カシデット・マナコン・トリーチープ
マサチューセッツ総合病院・ハーバード大学医学部免疫学・炎症性疾患センター（米国マサチューセッツ州ボストン）。
マサチューセッツ工科大学およびハーバード大学のブロード研究所（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）。
マサチューセッツ総合病院がんセンター、ボストン、マサチューセッツ州、米国。
役割分担データキュレーション、形式的解析、調査、方法論、ソフトウェア。
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Jessica Tantivit https://orcid.org/0000-0002-2179-0377
マサチューセッツ総合病院・ハーバード大学医学部免疫学・炎症性疾患センター（米国マサチューセッツ州ボストン）。
マサチューセッツ工科大学およびハーバード大学のブロード研究所（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）。
マサチューセッツ総合病院がんセンター、ボストン、マサチューセッツ州、USA。
役割：調査。
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ロッド・A・ラヒミ https://orcid.org/0000-0002-7929-2899
マサチューセッツ総合病院およびハーバード大学医学部、米国マサチューセッツ州ボストン、肺およびクリティカルケア医学部門。
免疫・炎症疾患センター、マサチューセッツ総合病院およびハーバード・メディカル・スクール、ボストン、マサチューセッツ州、USA.
役割調査、リソース、執筆-レビュー＆編集。
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Susan L. Sheng https://orcid.org/0009-0004-0756-2097
米国マサチューセッツ州ボストンのマサチューセッツ総合病院およびハーバード大学医学部呼吸器・クリティカルケア医学部門。
役割分担：ビジュアライゼーションとライティング-レビューと編集。
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Nhan D. Nguyen https://orcid.org/0000-0001-9869-1687
マサチューセッツ総合病院およびハーバード大学医学部、米国マサチューセッツ州ボストン、肺およびクリティカルケア医学部門。
免疫・炎症性疾患センター、マサチューセッツ総合病院およびハーバード・メディカル・スクール、ボストン、マサチューセッツ州、USA。
役割：調査。
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アレクシス・M・ヘリング https://orcid.org/0000-0001-5505-5728
マサチューセッツ総合病院およびハーバード大学医学部、米国マサチューセッツ州ボストン、呼吸器・重症患者医療部門。
免疫・炎症疾患センター、マサチューセッツ総合病院およびハーバード・メディカル・スクール、ボストン、マサチューセッツ州、USA.
役割分担：調査および検証。
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フランチェスカ・L・ジアコナ
マサチューセッツ総合病院およびハーバード大学医学部、米国マサチューセッツ州ボストン、呼吸器・重症患者医療部門。
免疫・炎症疾患センター、マサチューセッツ総合病院およびハーバード・メディカル・スクール、ボストン、マサチューセッツ州、USA.
役割役割：概念化、データキュレーション、形式分析、調査、方法論、リソース、および検証。
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リダ・P・ハリリ
マサチューセッツ総合病院およびハーバード大学医学部、米国マサチューセッツ州ボストン、肺およびクリティカルケア医学部門。
病理部、マサチューセッツ総合病院、ボストン、マサチューセッツ州、USA。
役割分担調査、方法論、リソース、執筆-レビューと編集。
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ラムニック・J・ザビエル
マサチューセッツ工科大学およびハーバード大学のブロード研究所（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）。
計算統合生物学センター、マサチューセッツ総合病院およびハーバード・メディカル・スクール、ボストン、マサチューセッツ州、USA。
消化器内科、マサチューセッツ総合病院およびハーバード・メディカル・スクール、ボストン、マサチューセッツ州、USA.
役割概念化、形式的解析、資源、ソフトウェア、監督、執筆-レビューと編集。
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Andrew D. Luster https://orcid.org/0000-0001-9679-7912
マサチューセッツ総合病院・ハーバード大学医学部免疫学・炎症性疾患センター（米国マサチューセッツ州ボストン）。
マサチューセッツ工科大学およびハーバード大学のブロード研究所（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）。
マサチューセッツ総合病院・ハーバード大学医学部リウマチ・アレルギー・免疫部門（米国マサチューセッツ州ボストン）。
役割概念化、方法論、監修、執筆-レビュー＆編集。
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Alexandra-Chloé Villani*,‡ https://orcid.org/0000-0001-7461-0408 avillani@mgh.harvard.edu
マサチューセッツ総合病院・ハーバード大学医学部免疫学・炎症性疾患センター（米国マサチューセッツ州ボストン）。
マサチューセッツ工科大学およびハーバード大学のブロード研究所（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）。
マサチューセッツ総合病院がんセンター、ボストン、マサチューセッツ州、米国。
役割概念化、データキュレーション、形式分析、資金獲得、調査、方法論、プロジェクト管理、資源、ソフトウェア、監督、検証、視覚化、執筆-レビューと編集。
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Josalyn L. Cho*,‡ https://orcid.org/0000-0002-0367-4495 avillani@mgh.harvard.edu
米国アイオワ州アイオワシティ、アイオワ大学カーバー医科大学、呼吸器・クリティカルケア・職業医学部門。
役割概念化、形式分析、資金獲得、調査、方法論、プロジェクト管理、リソース、監督、視覚化、執筆（原案）、執筆（レビュー＆編集）。
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ベンジャミン・D・メドフ‡ https://orcid.
org/0000-0002-2558-0449
マサチューセッツ総合病院およびハーバード大学医学部、米国マサチューセッツ州ボストン、呼吸器・重症患者医療部門。
免疫・炎症疾患センター、マサチューセッツ総合病院およびハーバード・メディカル・スクール、ボストン、マサチューセッツ州、USA.
役割概念化、データキュレーション、形式分析、資金獲得、調査、方法論、プロジェクト管理、リソース、監督、検証、視覚化、執筆-原案、執筆-レビュー・編集。
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資金調達情報
米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）：NIH T32HL116275
米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)NIH T32AR007258
米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）：NIH K08HL140173
米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）：NIH R01AI040618
米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）：NIH DP2CA247831
米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）：NIH UH2AI44434-01
米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）：NIH 5KL2TR002542-04
アイオワ大学ロイ・J・アンド・ルシール・A・カーバー医科大学
米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）：NIH UL1TR002541
米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)R01AI168131
米国国防総省DOD PR150903/W81XWH-16-1-0493
サノフィ・オーストラリア：iAward
米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）：NIH T32HL116275
マサチューセッツ総合病院トランスフォーマティブ・スカラー賞
備考
*
コレスポンディングオーサー。電子メール： avillani@mgh.harvard.edu (A.-C.V.); josalyn-cho@uiowa.edu (J.L.C.)
†
これらの著者は本作品に等しく貢献した。
‡
これらの著者は、この作品に等しく貢献した。
指標と引用文献
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引用情報は、Crossref Cited-byサービスから引用しています。

アルトメトリクス
引用元
Jehan Alladina et al. ,A human model of asthma exacerbation reveals transcriptional programs and cell circuits specific to allergic asthma.Sci. Immunol.8,eabq6352(2023).DOI:10.1126/sciimmunol.abq6352
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引用元
Aurore C. A. Gay,Martijn C. Nawijn,See no allergen, hear no allergen, speak no allergen!, Science Immunology, 8, 83, (2023).
/doi/10.1126/sciimmunol.adh0597
ABSTRACT
引用情報は、Crossref Cited-byサービスから引用しています。

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