肥満細胞の活性化は、生後早期のアレルギー性喘息における内皮細胞と周皮細胞の相互作用を破壊する

2024年5月17日 11:51

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研究論文炎症血管生物学オープンアクセス｜10.1172/JCI173676

肥満細胞の活性化は、生後早期のアレルギー性喘息における内皮細胞と周皮細胞の相互作用を破壊する

https://www.jci.org/articles/view/173676

Régis Joulia、1 Franz Puttur、1 Helen Stölting、1 William J. Traves、1 Lewis J. Entwistle、1 Anastasia Voitovich、1 Minerva Garcia Martín、1 May Al-Sahaf、1,2 Katie Bonner、1,3 Elizabeth Scotney、1,3 Philip L. Molyneaux、1,4 Richard J. Hewitt、1,4 Simone A. Walker、1 Laura Yates、1 Sejal Saglani、1,3 Clare M. Lloyd1
2024年3月15日発行 - 詳細はこちら

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要旨
アレルギー性喘息は一般に幼少期に発症し、実質的な組織リモデリングと肺機能障害に関連している。血管新生は障害された気道の特徴であるが、生後間もない時期のアレルギー性喘息が肺微小循環に及ぼす影響は不明である。ここでは、精密切断肺スライス（PCLS）を用いた定量的イメージングにより、新生児マウスをハウスダストマイト（HDM）エキスに暴露すると、外膜領域における内皮細胞とペリサイトの相互作用が破壊されることを報告する。血管構造の中心部では、トリプターゼのような肥満細胞（MC）プロテアーゼによって、ペリサイトの後退と重要な接着分子N-カドヘリンの喪失が誘導された。さらに、小児喘息性気管支内生検の空間トランスクリプトミクスは、血管が豊富な領域におけるMC活性化経路の発現増加と関連した、強い血管ストレスとリモデリングを示唆している。これらのデータは、長期にわたる血管障害の可能性を伴うアレルギー性喘息の病態生理について、これまで認識されていなかった知見を提供するものである。

グラフィカル抄録
グラフィカル抄録
はじめに
アレルギー性喘息は一般的に幼児期に発症する。罹患している小児の有病率を正確に定義することは困難であるが、現在では全小児の5％から20％が喘息に罹患していると推定されている（1, 2）。慢性炎症と組織リモデリングはアレルギー性喘息の中心的要素である。アレルギー反応が起こる免疫機構は、成人の病態ではよく特徴付けられているが（3、4）、生後間もない時期における調節不全の免疫反応の影響については、ようやく理解されつつある。気道過敏性（AHR）および上皮下基底膜の厚さの増加などの活発な組織リモデリングに加えて、血管リモデリングもアレルギー性喘息の重要な特徴である（5-7）。実際、病気が進行すると、新しく変化した組織は、リモデリングした上皮と隣接する領域を効率よく灌流するために、新しい血管の形成を必要とする(8)。後者はマウスモデルやヒトの生検で証明されており、上皮下領域で血管の増加が観察された(9, 10)。さらに、肺に存在する中〜大血管のほとんどは、気管支血管腔や外膜と呼ばれる大きな上皮領域に近接しており、喘息や蠕虫感染症などの複数の病態に関与している(11-14)。血管の維持に中心的な役割を果たしている(15-17)が、肺の病態における内皮細胞とそれに付随する壁細胞である周皮細胞との相互作用についてはほとんど知られていない(17-19)。周皮細胞は、血管新生メディエーターの分泌だけでなく、N-カドヘリンなどの接着分子を含む細胞間相互作用を通して、内皮細胞の体力を維持するユニークな能力を持っている(20)。

アレルギー性喘息の小児では肺機能が低下し始めるが、肺血管系はまだ成体に向かって発達中である。したがって、幼少期のリモデリングを防ぐことは、その後の障害を予防するための重要な機会である。しかしながら、アレルゲンに対する反応によって、大気道に近接する微小循環や中間血管が影響を受ける機序は、いまだ謎のままである。このような状況において、肥満細胞（MC）は、IgE/抗原を介した刺激または神経ペプチドを介した刺激に応答して、あらかじめ形成されたメディエーター（ヒスタミン、プロテアーゼなど）を放出することにより、アレルギー性喘息の発症を指揮する重要な役割を担っている（3, 21）。しかし、生後間もないアレルギー性喘息において、MCがどのように血管の炎症を制御しているのかは、まだ明らかにされていない。

ここでわれわれは、精密切断肺スライス（PCLS）法、革新的な画像定量法、機能的アッセイ、空間トランスクリプトミクスを用いて、生後早期のアレルギー性気道疾患（AAD）を背景に肺血管系を研究した。高次元解析により、アレルゲンに暴露された新生児マウスが、疾患進行中に血管リモデリングを示すことを発見した。血管リモデリングは、ペリサイト被覆の消失、赤血球密度の低下、低酸素領域の発生によって定義される。我々は、アレルゲン暴露後に高度に活性化される外膜結合組織MC（CTMCs）集団を同定した。In vitroでは、マウスとヒトのMC顆粒は、ペリサイトの引き込みとN-カドヘリンの発現低下を誘導することができた。後者はMCのプロテアーゼ活性、特にヒトMCではトリプターゼによって媒介された。最後に、小児の気管支内生検の空間的トランスクリプトームデータから、細胞ストレス、リモデリング、MC活性化に関連する血管の豊富な領域における遺伝的変化が指摘された。これらのデータを総合すると、早期喘息における肺血管機能の破綻に重要なMC/ペリサイトの新たな軸が明らかになり、長期的な影響を及ぼす可能性がある。

研究結果
新生児マウスの肺血管系を研究するための定量的イメージング・プラットフォームの開発。生後早期のアレルギー性気道疾患が血管系に及ぼす影響を明らかにするため、われわれはPCLSアプローチ（22）を拡張し、血管壁の異なる構成要素、すなわち内皮細胞とペリサイトを同時に解析した。周皮細胞は、臓器間でも臓器内でも異なる表現型マーカーを発現する不均一な細胞集団である(20, 23)。肺内皮細胞アトラス（Lung Endothelial Cell Atlas）（http://lungendothelialcellatlas.com/）のデータセットを探索して、肺ペリサイトの最も信頼できるマーカーを同定した（24）。PDGFRβとNG2（CSPG4）の遺伝子がマウスとヒトの周皮細胞で最も高発現しており、肺周皮細胞での発現レベルが高いことからPDGFRβに注目した（補足図1、AおよびB；本論文とともにオンラインで入手できる補足資料；https://doi.org/10.1172/JCI173676DS1）。新生児マウスの肺から採取したPCLS摘出物をCD31（内皮細胞）、α-SMA（平滑筋細胞[SMC]）、PDGFRβ（周皮細胞）で染色したところ、豊富で複雑な血管網が認められた。興味深いことに、周皮細胞はより太い血管に関連した外膜領域に非常に豊富であったが、実質全体にも存在した（図1Aおよび補足ビデオ1）。高倍率画像から、内皮細胞と周皮細胞との間の密接な細胞間相互作用が明らかになり、周皮細胞体から広範な突起が出現し、内皮細胞を取り囲んでいた（図1B）。さらに、PDGFRβ+細胞は、外膜および実質領域で神経／グリア抗原2（NG2）陽性であり、周皮細胞の表現型を確認した（補足図1B）。次にわれわれは、PCLSシステムを用いて血管の変化を解析する統合的なプラットフォームを開発した。このプラットフォームは、異なる肺領域（すなわち、気管支血管腔／肺実質および肺実質）を識別するためのタイルスキャンイメージングと、血管の3次元構造と空間構成を定義するための高解像度画像の使用に依存している。Imarisソフトウェアを用いて、細胞分割とボリューム解析により画像を処理した。(a)内皮細胞カバー率（すなわち、画像内の内皮細胞の体積）、(b)血管密度、(c)ペリサイト数、(d)ペリサイトカバレッジ（すなわち、内皮細胞を取り囲むペリサイトの体積）、(e)内皮細胞とペリサイト間の距離、(f)CD45+細胞の数である（図1C）。これらのパラメータを組み合わせることにより、肺血管構造と炎症への影響を正確に表現することができる。

アレルゲンによって誘発された炎症は、幼少期に血管のリモデリングを引き起こす。
アレルゲンによって誘発された炎症は、生後早期の血管リモデリングを引き起こす。(A）CD31（緑、内皮細胞）、α-SMA（シアン、SMC）、PDGFRβ（マゼンタ、周皮細胞）で染色した新生児肺（P28）のPCLS切片（厚さ200μm）の3Dレンダリング。黄色のボックス領域は、解析した外膜および実質領域を示す（補足ビデオ1参照）。スケールバー： 500 μm。4回の独立した実験の代表。(B）内皮細胞の周囲に突起を伸ばす周皮細胞（PDGFRβ+）の拡大像。スケールバー：7μm： 7μm。4つの独立した実験の代表。(C）細胞のセグメンテーションとボリューム解析の結果を示す画像解析パイプライン。スケールバー： 500μm（左）；30μm（右）。(D）7日齢のBALB/cマウスを、PBSまたはHDMに3週間断続的に経鼻曝露した（赤矢印）。肺はP21、P28、P35、P42で採取した。 E）HDMに曝露した新生児（P28）のPCLS切片で、外膜領域の血管系を示す。スケールバー：200μm（4つの独立した実験の代表）。(F）肺血管機能のPCA解析（補足図2参照、4つの独立した実験から得られたn＝44匹のマウス）。

次に、ハウスダストマイト（HDM）に曝露した新生児マウスの肺血管系を解析するために、我々のプラットフォームを採用した（25）。生後7日のBALB/cマウスを断続的にHDMに曝露し、疾患進行期（すなわちP21とP28）と曝露終了後の消失期（すなわちP35とP42）の異なる時期に肺葉を採取した（図1、DとE）。このモデルについて以前に報告したように、HDMは気道抵抗の増加、気道における好酸球、T細胞、自然リンパ球2（ILC2）の強い動員など、アレルギー性喘息のすべての特徴を誘導する(25)。我々は、肺の2つの領域（すなわち、外膜と実質）において、画像から抽出した6つの血管パラメータを組み合わせた教師なし主成分分析（PCA）を行った。外膜領域は、構造パラメータ（すなわち、大気道と中・大血管の存在）を用いて同定し、大気道と大血管から半径150μm以内の関連する微小血管系を解析した。実質は大気道から遠い肺胞構造を用いて定義した（図1A）。いくつかの個々のパラメータは群間で有意差はなかったが、独立したパラメータではなく、これらの12個のパラメータの主成分を調べたところ、全分散に影響が見られた。主成分分析では、HDM暴露後2週間（P21）で早くも血管構造の変化が明らかになった。これらの変化はアレルゲン暴露終了時（P28）にはさらに拡大し、主に微小循環の消失と関連していた。一部のマウスは消失期のP35でまだ同じ血管変化を示したが、ほとんどのマウスはP42で年齢をマッチさせたコントロールと同等の血管系を回復した（図1F；荷重、固有値、個々のデータポイントは補足図2、A-Kおよび補足図4Bに示す）。

まとめると、我々のデータは、HDM暴露が主に血管損失により、生後早期の血管リモデリングを誘導することを明確に示している。これらの変化は消失期にも維持されるが、時間とともにゆっくりと消失する。

HDMに暴露された新生児マウスでは、周皮細胞被覆の消失が早期に起こる。我々のPCA解析（図1F）において、血管リモデリングを決定する主要なパラメーターの一つは、肺外膜に近接した周皮細胞被覆率の変化であった。ペリサイトカバレッジ、すなわちペリサイト細胞の突出量は、ペリサイトが血液脳関門を形成している脳のように、内皮細胞のフィットネスと血管全体の構造を維持するために不可欠な因子である(15)。拡大画像を見ると、生後早期のAADでは、P28の時点で内皮細胞構造はまだ大きな気道の近くに存在していたものの、周皮細胞シグナルは大幅に減少していたことが明らかである（図2Aおよび補足動画2）。興味深いことに、画像解析の結果、ペリサイト細胞体はPBS群とHDM群にまだ存在していたが、ペリサイトの突出範囲はHDM曝露3週間後に著しく減少していた（図2A）。実際、定量分析により、外膜周皮細胞数はマウスの発生過程で有意な変化はなく、HDM曝露による影響もないことが確認された（図2B）。対照的に、ペリサイトカバレッジはアレルゲン暴露3週間後に減少し（すなわち約42％減少）、最終HDM吸入2週間後にはほぼ生理的レベルまで緩徐に回復した（図2C）。内皮細胞容積または血管密度は強い差を示さなかったが、HDM暴露終了時に内皮細胞容積のわずかな減少を検出し、この減少は消失期に入って1週間で有意になった（補足図2E）。後者は、ペリサイト被覆の減少が肺外膜領域の微小循環の減少につながることを示しているのかもしれない。最後に、我々は外膜血管の変化が機能的に及ぼす影響を評価した。この目的のために、血管系（すなわちCD31+領域）における赤血球の分布とHIF-1αの発現を分析した。3週間のHDM曝露後、外膜血管系は赤血球密度の減少（図2、DおよびE）とHIF-1αの発現の増加（図2、FおよびG）を示した。興味深いことに、HIF-1αは消失期には徐々に正常値に戻ったが（図2G）、赤血球密度の減少はチャレンジ終了2週間後も存在した（図2E）。生後早期のAADの長期的影響を調べるため、新生児をHDMで3週間処理し、最後のHDM曝露から2週間後のP42でマウスにアレルゲンまたはPBSを単回曝露した（補足図3A）。HDMで再曝露したマウスはコントロールと比較してペリサイト数の減少は認められなかったが、ペリサイト被覆率は有意に減少した（～26％減少、補足図3、B-D）。加えて、肺外膜の他の血管パラメーター（すなわち、内皮細胞／ペリサイト距離、内皮細胞量、血管密度）には変化が見られなかったが、酸素濃度の局所的変化を示すHIF-1αの発現が増加した（補足図3、E-I）。これらのデータは、幼少期のアレルゲン暴露が血管系に機能的な影響をもたらし、それが長期にわたる可能性があることを明確に示している。

HDM暴露を繰り返すとペリサイト突起が消失し、赤色blFigure 2が減少する。
HDM曝露を繰り返すと、ペリサイト突起の消失、赤血球の減少、低酸素領域が生じる。新生児マウスは図1Dに示すようにPBSまたはHDMで曝露された。(A）初回吸入から3週間後のPBSおよびHDM曝露マウスのPCLS切片の3Dレンダリングで、CD31（緑、内皮細胞）とPDGFRβ（マゼンタ、周皮細胞）を示す。下のパネルは、ペリサイト細胞体（赤い点）と突出部（マゼンタの表面）の解析結果を示す（補足ビデオ2参照）。スケールバー： 30 μm（4つの独立した実験の代表）。(BおよびC）肺外膜における1mm3あたりのPDGFRβ+ペリサイト数（B）およびカバー率（C、CD31+血管の総容積に対して正規化）。(D）微小循環（CD31、緑）における赤血球（Ter119+、紫）密度の減少を示す代表的なPCLS。スケールバー： 50 μm。3回の独立した実験の代表。(E)画像の全容積に対して正規化した血管内赤血球密度。3つの独立した実験から得られた1群あたりn=3-4マウス。(F）3週間HDMに曝露したマウスのPCLSで、血管系（CD31、緑色）に関連したHIF-1α（紫色）の増加を示す。スケールバー： 30 μm。4つの独立した実験の代表。(G)PBSおよびHDM曝露マウスにおける外膜領域のHIF-1αスポット数（各群n = 4匹）。データは平均値±SEMで表した。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001、2-way ANOVAにŠidákのpost hoc検定を加えた。

これらのデータを総合すると、われわれの知る限り初めて、生後間もない発育期にアレルゲンに繰り返し暴露されると、肺周囲突起と血管が失われ、肺微小循環に低酸素領域が生じることが示された。

肺外膜は免疫細胞の浸潤とMCの活性化によって特徴づけられる。肺外膜領域は、常在する免疫細胞の豊富な存在と、炎症時の様々な白血球の激しい動員によって特徴づけられる（14, 22, 26）。我々は、新生児マウスで観察されたHDM吸入後の血管リモデリングとペリサイト形態の変化には、局所的な免疫系の活性化が関与しているのではないかと考えた。そこで、われわれは画像解析プラットフォームを用いて、肺外膜と肺実質におけるHDM曝露後の免疫細胞の動員および活性化を解析した（図3A）。各HDM暴露後、外膜CD45+白血球数の有意な増加が観察され（すなわち、HDM暴露2週間後および3週間後にそれぞれ約36％および約40％増加）、その差は消失期に入って1週間後も存在し（すなわち、約60％増加）、アレルゲン暴露期間終了2週間後には生理的レベルに戻った（図3、AおよびB）。肺実質は白血球の有意な増加を示さなかったので、免疫細胞の動員は主に肺実質周囲に限定された（補足図4、AおよびB）。

早期のアレルゲン暴露は免疫細胞のリクルートとMCの活性化につながる図3
早期アレルゲン暴露は肺外膜における免疫細胞の動員およびMCの活性化を引き起こす。(A）P28におけるPBSマウスとHDMマウスにおける肺外膜のPCLSの3Dレンダリングで、CD31（緑、内皮細胞）、α-SMA（青、SMC）、CD45（マゼンタ、白血球）を示す。スケールバー：200μm。4つの独立した実験の代表。(B) CD45+細胞数。4つの独立した実験から得られた1群あたりn = 3-8マウス。(C）大きな気道と関連する血管系（CD31、緑色）周辺のCTMCs（アビジン、青色）の分布と、大きな気道と血管に隣接する脱顆粒したMCを示す画像を示す肺外膜の代表的な3D画像（補足動画3参照）。スケールバー： 150μm（左）；50μm（右）。4つの独立した実験の代表。(D）脱顆粒したMCの数。1群あたりn＝3-6マウス。(EおよびF）1mm3あたりの細胞外CTMC顆粒の数（E）および体積（F）。(G)血管関連HIF-1α+と脱顆粒CTMC顆粒数との相関。PBS投与マウス4匹およびHDM投与マウス4匹から得たn=23の画像。(H)ペリサイトカバレッジと細胞外CTMC顆粒の体積との相関。データは平均値±SEMで表した。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001、2-way ANOVAにŠidákのpost hoc検定（B、D、E）；Spearmanの順位相関検定（G、H）。

MCがアレルギー性喘息において重要な役割を担っていること、また最近、血管周囲CTMCsがペリサイトの機能を制御していることが証明されたことから（27）、我々は、MCが生後早期のAADにおけるペリサイトの変化を媒介する役割を担っている可能性があると仮定した。我々は、脱顆粒したCTMCsのプロフィールを解析するために蛍光アビジン染色を利用した。これは、細胞外CTMC顆粒の局在と細胞間相互作用を正確に測定できることを我々や他の研究者が実証しているからである（28-31）。HDMに曝露した新生児マウスではCTMCsの数は変化しなかったが（補足図4C）、マウスがアレルゲンに曝露されるたびに、脱顆粒したCTMCsの数が明らかに増加していることが観察された（図3、CおよびD、補足ビデオ3）。細胞外CTMC顆粒は肺外膜と実質内に豊富に存在したが、肺胸膜腔には存在しなかった（図3E）。これらの顆粒はMC体外でも大きな体積（すなわち約50μm3）を保持しており、外膜と実質のMC顆粒体積に差は観察されなかった（図3Fおよび補足ビデオ3）。興味深いことに、脱顆粒したCTMCの範囲とHIF-1αの発現との間に正の相関が観察された（r2 = 0.36、P = 0.002、図3G）。さらに、CTMC顆粒の体積は、ペリサイト被覆の減少と負の相関があり（r2 = 0.18、P = 0.007、図3H）、細胞外CTMC顆粒が大きい領域はペリサイト形態の変化と関連していることが示された。最後に、CTMC顆粒の存在は内皮細胞とペリサイト間の距離の増加と関連していた（補足図4D）。

要約すると、新生児マウスがアレルゲンに暴露されると、常在CTMCの活性化と脱顆粒に関連した強い外膜炎を発症することが示された。大きなCTMC顆粒を有する領域は、内皮細胞とペリサイトの相互作用の不安定化と関連しており、血管系を破壊し、低酸素領域をもたらしている可能性が高い。

CTMCの脱顆粒はペリサイトの後退とN-カドヘリンの消失を誘導する。CTMCの脱顆粒が肺ペリサイトに及ぼす機能的影響を解析するために、我々は初代肺MCとペリサイトのin vitro共培養モデルを開発した。ナイーブマウスの肺から肺細胞を精製し、2〜4週間培養した結果、両細胞集団とも高い純度が検出され、特徴的なマーカーが発現した：ペリサイトはNG2+/PDGFRβ+、MCはFcεRI+/ST2+/CD117+であった（補足図5A）。加えて、肺MCはアビジンシグナル陽性であり、in vitroで作製したMCが確かにCTMCsであったことを示している（補足図5A）。抗ジニトロフェニル（抗DNP）IgE感作肺MCを、蛍光標識した周皮細胞（CMTMR+）の層に加え、DPN-BSAの濃度を上げて刺激し、FcεRIの架橋と脱顆粒を誘導した（図4A）。脱顆粒した肺MCは、細胞外アビジン染色を用いて同定し、周囲環境に外在化した顆粒が存在するか、まだMCの表面に結合していることを明らかにした（図4B）。脱顆粒したMCの頻度はDNP-BSAの濃度に比例して増加したが（図4C）、ペリサイトの数はMCの活性化状態に影響されなかった（図4、BおよびD）。しかしながら、in vivoで観察されたように、周皮細胞の体積は刺激後24時間で有意に減少した（100 ng/ml DNP-BSAで約30％減少；図4、BおよびE）。次に、体積の減少がMC顆粒と直接接触しているペリサイトでより顕著であるかどうかを調べた。最大のペリサイト（すなわち、45000μm3以上）のアビジンMFIは、最小のペリサイト（すなわち、17000μm3以下）と比較して低いアビジンシグナルを示し、これは最小のペリサイトが、その収縮を誘導しうるMC顆粒をより多く表面に持っていることを示している（図4F）。さらに、周皮細胞後退の主な結果の一つは、F-アクチンの分極化である(32)。実際、ペリサイト体積が減少すると同時に、脱顆粒したMCの数が増加し、ペリサイト内の単位体積あたりの細胞内F-アクチンシグナルが増加した（図4、GおよびH）。興味深いことに、内皮細胞とペリサイトの相互作用に関与する主要なカドヘリンの一つであるN-カドヘリンの発現は、MC顆粒との接触後に減少した（100 ng/ml DNP-BSAで約20％減少、図4I）。まとめると、MC顆粒は用量依存的に周皮細胞後退を効率的に誘導し、N-カドヘリン発現の減少を促進することができる。

MC顆粒はペリサイトの後退と表面N-カドヘリンの切断を誘導する。
MC顆粒はペリサイトの後退と表面N-カドヘリンの切断を誘導する。MCを抗DNP IgEで一晩感作した後、周皮細胞層（CMTMRで染色）上に置き、濃度を増加させたDNP-BSAで24時間刺激した。(A）マウス初代肺MCとペリサイトの共培養実験を示す模式図。(B）DAPI（黄色）、CMTMR（紫色）、PDGFRβ（青色）、アビジン（緑色、MC顆粒）で染色した未刺激または刺激（100 ng/ml DNP-BSA）した周皮細胞／MC共培養の画像。白いボックスは、静止または脱顆粒したMCの例を示す拡大した領域を示す。スケールバー： 15 μm。3回の独立した実験の代表。(C）脱顆粒したMCの頻度。3つの独立した実験から得られたn＝6-8画像。(D）視野あたりのペリサイトの数。(E）細胞トレーサーCMTMRを用いて測定したペリサイト体積。(F）小周皮細胞（＜17,000μm3）および大周皮細胞（＞45,000μm3）上のアビジンシグナルは、小周皮細胞がその表面により多くのMC顆粒染色を示すことを示す。(G）脱顆粒したMCまたはコントロールの存在下でのF-アクチン（緑）およびN-カドヘリン（マゼンタ）のペリサイト発現の代表的画像。スケールバー： 50 μm。3つの独立した実験の代表。(H-I）周皮細胞上のF-アクチン（H、n＝98-144）および表面N-カドヘリン（I、n＝98-144）のMFI。3回の独立実験。データは平均値±SEMで表した。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001、1-way ANOVAとTukeyのポストホックテスト（C、D、E、H、I）；両側Studentのt検定（F）。

ペリサイトの後退とN-カドヘリンの喪失は、MCプロテアーゼによって媒介される。MCの脱顆粒後、ペリサイトの容積とN-カドヘリン発現が減少することが観察されたので、次にMC誘導性ペリサイト後退の分子機序を調べた。MCには膨大なプロテアーゼのレパートリーがあり、毒や寄生虫に対する防御免疫に関与しているが、喘息のような炎症性病態では有害な場合もある（34, 35）。我々は、MC由来のプロテアーゼがペリサイトの収縮に関与している可能性があると仮定した。実際、HDMに曝露した新生児（P28）のPCLSから、m-MCP6（MCトリプターゼ）などのプロテアーゼがCTMC顆粒に存在することが示された（図5A）。さらに、詳細な共局在化解析により、最後のHDMチャレンジから24時間後の細胞内および細胞外のMC顆粒にm-MCP6が存在することが、アビジン+領域との重なりによって示された（図5B）。後者は、m-MCP6が効率的に貯蔵され活性化されるためには、CTMC顆粒マトリックスと会合していることが必要であることと一致する（35, 36）。次に、一般的なプロテアーゼ阻害剤が、脱顆粒したMCの存在下でペリサイトの突出消失を防ぐことができるかどうかを検討した。興味深いことに、MCの脱顆粒はプロテアーゼ阻害剤の影響を受けなかったが（図5、CとD）、ペリサイトの体積とN-カドヘリン表面発現は維持された（図5、EとF）。この観察結果をさらに確認するために、肺のペリサイトを組換えm-MCP6に直接暴露したところ、ペリサイト体積が約62％減少することが観察され、高濃度のm-MCP6がペリサイトの退縮を誘導するのに十分であることが示された（図5G）。これらのデータを総合すると、MCプロテアーゼはペリサイトの後退と表面N-カドヘリンの消失を効率的に誘導し、内皮細胞とペリサイトの相互作用の喪失につながる可能性があることが示された。

MC由来プロテアーゼはペリサイトの後退とN-カドヘリンの切断を誘導する。
MC由来プロテアーゼは周皮細胞の後退とN-カドヘリンの切断を誘導する。(AおよびB）新生児マウスをHDMに3週間暴露した。(A）HDMに曝露したマウスの肺外膜のPCLS切片の3Dレンダリング。DAPI（青）、m-MCP6（マウストリプターゼ、マゼンタ）、MC（アビジン、緑）を示す；下パネルは白枠領域の拡大画像と細胞外MC顆粒中のm-MCP6シグナルを示す。スケールバー： 30μm（上のパネル）；10μm（下のパネル）。(B）細胞内および細胞外MC顆粒（アビジン＋）とm-MCP6との共局在解析で、m-MCP6＋顆粒の頻度を示す。各ドットは3匹の独立したマウスの画像を示す。(C-F）MCを抗DNP IgEで一晩感作した後、周皮細胞層（CMTMRで染色）上に置き、プロテアーゼ阻害剤カクテルまたはビヒクルコントロール（DMSO）存在下、濃度を増加させたDNP-BSAで24時間刺激した。(C）DAPI（黄色）、F-アクチン（緑色）、MC顆粒（アビジン、マゼンタ色）で染色した未刺激または刺激（100 ng/ml DNP-BSA）されたペリサイト/MC共培養の画像。スケールバー： 50 μm。3回の独立した実験の代表。(D）脱顆粒したMCの数をMCの総数で正規化したもの。各ドットは3つの独立した実験からの画像を表す。(E）ペリサイト体積と（F）ペリサイト上の細胞表面N-カドヘリンMFI。各ドットは3つの独立した実験から得られた個々のペリサイトを表す。(G)組換えm-MCP6曝露24時間後の肺ペリサイト体積。各ドットは3人の独立したドナーの個々のペリサイトを表す。データは平均値±SEMで表した。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001, 2-tailedスチューデントのt検定(B); 1-wayANOVAとTukeyのポストホック検定(D, E, F, and G)。

空間トランスクリプトーム解析は、喘息児の血管が豊富な領域における細胞ストレスを示唆し、ヒト肺周皮細胞はMCの脱顆粒後に退縮した。次に、NanoString GeoMx Cancer Transcriptome Atlas（CTA、約1,800遺伝子）を用いたデジタル空間プロファイリングを用いて、重症喘息児4人（9歳から17歳；補足表1）と対照2人（8歳から11歳；補足表1）の血管リモデリングとMC活性化を解析した。気管支内生検から得られたホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）切片をDNA、ビメンチン、CD45、α-SMAで染色し、4種類の領域、すなわち上皮（形態とDNA染色を用いて定義）、免疫細胞浸潤（CD45+に富む）、平滑筋、線維芽細胞に富む領域を決定した（図6A）（37）。

喘息児の転写シグネチャーは血管ストレスを示唆している。
喘息児の転写シグネチャーは血管ストレスを示唆し、ヒトMCはトリプターゼ依存性のペリサイト退縮を誘導する。(A）DNA（Syto83、緑）、ビメンチン（紫）、CD45（青）、α-SMA（黄）を染色した気管支内生検の免疫蛍光画像。スケールバー： 100 μm。(B）喘息児と対照群の内皮細胞に富む領域におけるパスウェイ濃縮解析。対照群2例と喘息児2例から得た各群4-9個のROI。P値は補足表4にある。(C-FおよびI-K）ヒトMCを抗DNP IgEで一晩感作した後、ペリサイト上に置き、増加濃度のDNP-BSAで24時間刺激した；（I-K）APC366（トリプターゼ阻害剤）またはビヒクルコントロールを刺激時に添加した。(C）脱顆粒したMCの数をMCの総数で正規化した。(D）ペリサイト数。3つの独立した実験からのn = 3ペリサイトドナー。(E）ペリサイト体積。3つの独立した実験からのn = 3ペリサイトドナー。(F）小周皮細胞（＜500μm3）および大周皮細胞（＞9,000μm3）上のアビジンシグナル。(G）脱顆粒したMCのフローサイトメトリープロファイルおよび細胞外MC顆粒の教師なし解析。2つの独立した実験の代表。(H) 示したマーカーに対して陽性であるアビジン+顆粒の頻度。(I）DAPI（黄色）、F-アクチン（緑色）、MC顆粒（アビジン、青色）で染色したペリサイト/MC共培養の画像。スケールバー： 50 μm。3回の独立した実験の代表。(J）脱顆粒したMCの数をMCの総数に対して正規化した。(K）ペリサイト体積。3つの独立した実験から得られたn＝6ペリサイトドナー。データは平均値±SEMで表した。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001, 2-tailed Mann-Whitney検定(B); 1-way ANOVAとTukeyのポストホック検定(C-E); 2-tailed Studentのt検定(F); 2-way ANOVAとŠidákのポストホック検定(JとK)。

40の関心領域（ROI）を分析し（補足表2）、まず、単一細胞RNA-Seq（scRNA-Seq）細胞タイプシグネチャー（38）を用いた内皮細胞とペリサイト細胞のデコンボリューションを用いて、血管の密度が最も高い領域を定義した（採用した遺伝子は補足表3に示す）。線維芽細胞および免疫細胞浸潤領域において、内皮細胞シグネチャーの高い（すなわち、濃縮スコア＞0.15）対照2例および喘息患者2例から16個のROIを選択した（補足図6A）。ペリサイト濃縮スコアは4種類の領域間で統計学的な差はなかったが（補足図6B）、内皮細胞シグネチャーの高い領域とペリサイトシグネチャーの高い領域の間に相関が観察され、これらの領域が微小血管に濃縮されていることが示唆された（補足図6C）。内皮細胞シグネチャーの高さは、同定された16のROIにおける主要な血管遺伝子（すなわち、CDH5、PECAM1、PDGFRB）の高発現によってさらに示唆された（補足図6D）。遺伝子セット濃縮解析（GSEA）を用いて、内皮細胞に富む領域における対照ROIと喘息ROIの間で制御の異なる経路を解析した。この解析は利用可能なROIの数によって制限されるが、喘息患者では細胞ストレスと低酸素に関連するパスウェイのシグナルが増加し、細胞外マトリックス組織とPDGFシグナル伝達に関連するパスウェイのシグナルが減少していた（図6B；補正前および補正後のP値は補足表4に示されている）。重要な経路（例えば、化学的ストレスに対する細胞応答、低酸素に対する細胞応答、PDGFによるシグナル伝達、細胞外マトリックス組織化）の個々の遺伝子値を補足図6Eに示す。注目すべきことに、この予備的解析では、対照ROIと喘息ROIの間で内皮細胞およびペリサイトの濃縮に差はないことが示唆された（補足図6F）。興味深いことに、FcεRI活性化経路のようなMC活性化遺伝子は、喘息患者の内皮細胞領域で特に濃縮されていた（図6B）。細胞デコンボリューション解析では、線維芽細胞およびCD45に富む領域にMCの割合が高いことが示唆され（補足図6G）、これは内皮細胞濃縮スコアと相関していた（補足図6H）。内皮細胞に富む領域におけるMCの割合の増加は、トリプターゼ遺伝子（すなわちTPSAB1、補足図6I）の発現の増加によってさらに示唆され、内皮細胞に富む領域における存在量の患者群間の差は観察されなかった（補足図6J）。

最後に、健康な肺組織からヒト周皮細胞とMCを分離し、共培養実験を行った。単離および培養法により、両細胞型とも95％以上の純度が得られた（補足図5B）。肺ペリサイトをIgE感作MCと高濃度のDNP-BSAに24時間暴露したところ、ペリサイトの生存率に影響を与えることなくMCの脱顆粒が起こった（図6、CおよびD）。マウス細胞で観察されたように、ヒトの周皮細胞はMCの活性化後に収縮し（図6E）、体積減少はMC顆粒と密接に接触している細胞で増強された（図6F）。MC依存性周皮細胞後退の分子機構をより深く理解するために、フローサイトメトリーで細胞外MC顆粒の含量を分析した。IgEを介した30分間の刺激後、3つの独立した刺激肺MCドナーをプールして、膜結合MC顆粒（すなわち、アビジン＋MC；文献31）の教師なし解析（すなわち、t-distributed stochastic neighbor embedding [t-SNE]）を行った（図6G）。その結果、細胞外MC顆粒にはIL-6やTNFなどのサイトカインが存在し、細胞外MC顆粒の約61.6%にトリプターゼが豊富に存在するなど、細胞外MC顆粒のプロフィールに強い不均一性があることがわかった（図6H）。トリプターゼは細胞外MC顆粒に高発現していることから、このプロテアーゼが直接ペリサイトの退縮を誘導する可能性が考えられた。そこで、特異的なトリプターゼ阻害剤（すなわちAPC-366）の存在下で、活性化MCとペリサイトの共培養実験を行った（31, 39）。APC-366はMCの脱顆粒には影響を与えなかったが（図6、IおよびJ）、ペリサイトの体積は阻害剤の存在下で維持された（図6、IおよびK）。全体として、我々のデータは、ヒトMCから放出されたトリプターゼがペリサイト突起の消失を誘導することを示している。

考察
AADは、肺がまだ構造的に発達段階にある小児に不釣り合いに影響を及ぼす。成人免疫反応と新生児免疫反応の違いについての理解が進んでいるにもかかわらず（25, 40, 41）、アレルギー性喘息のような呼吸器疾患が肺血管系に及ぼす影響については、いまだ解明されていない。網状基底膜の厚さの増加やコラーゲンの沈着といった組織のリモデリングは慢性炎症の主要な特徴であり、血管新生は古典的にこの現象と関連している(7, 25, 42)。実際、気道に隣接する組織が拡大するにつれて、必要な栄養を供給するために新しく発達した気管支血管が必要となる。逆説的ではあるが、外膜領域に元々あった肺微小循環が、新しく発達した組織にどのように適応するのかは、現在のところ不明である。ここでわれわれは、幼少期にHDMのような吸入アレルゲンに肺がさらされると、肺外膜と気管支血管腔の血管に重要な変化が起こることを証明した。初めてと思われることであるが、我々は、肺の特定領域における低酸素領域の増加に伴う赤血球密度の減少に伴う周皮細胞被覆の減少から始まる、血管リモデリングにつながる事象のカスケードの正確な特徴付けを行った。我々は、ペリサイト表面からの突起の消失が、MCの脱顆粒後に放出されるプロテアーゼによって引き起こされることを示した。最後に、空間トランスクリプトミクス解析により、喘息児の肺の血管が豊富な領域における強いリモデリングシグネチャーが、ヒトの周皮細胞退縮を誘導しうるMC活性化の増加と関連していることが指摘された。

内皮細胞とペリサイトの相互作用は、血管の安定性に不可欠な要素であるが、炎症時にこの相互作用が調節されなくなるメカニズムは、まだよくわかっていない(43)。ここで我々は、周皮細胞の数は生後の肺の発育やアレルゲンへの曝露後を通して劇的に変化することはないものの、周皮細胞の被覆率の低下はAADの発症中に血管系で観察される最も早い出来事の一つであることを示した。肺生物学におけるペリサイトの役割はまだ十分に理解されていない。運命マッピングと枯渇モデルにより、肺高血圧症や肺線維症などの肺病態にペリサイトが関与していることを示す最初の証拠が得られた（44, 45）。我々のデータは、成体マウスにおいてPDGFβ/PDGFRβ軸の破壊が気道過敏性などの肺機能を悪化させることを示した以前の研究と一致している（18）。ペリサイトカバレッジの減少は、アルツハイマー病や脳卒中の後遺症など、他の病態を想起させる。脳梗塞は特定の部位の血流を減少させ、脳機能の低下につながる(46, 47)。メカニズム的には、マウスとヒトの三菱商事由来の顆粒がペリサイトの収縮を誘導することを示している。ペリサイトは、活性酸素、プロスタグランジンE2、TNFなどの様々な炎症刺激に応答する(43)が、我々の知る限り、ペリサイト被覆に対するMCの影響についてはこれまで報告されたことがなかった。我々は、トリプターゼのようなMC由来のプロテアーゼが、ペリサイトの後退とN-カドヘリンの消失を誘導することを示した。N-カドヘリンは内皮細胞とペリサイトの相互作用を仲介する重要な接合分子であり(48)、MCプロテアーゼがどのようにしてN-カドヘリンを切断するのか、さらなる研究が必要である。加えて、好中球細胞外トラップ（NET）に存在する好中球由来のプロテアーゼ（49）など、他のプロテアーゼもペリサイトの損傷に関与している可能性があるが、これについてはまだ研究が必要である。ペリサイトの後退が起こる生理学的関連性とそのメカニズムはまだ完全には解明されていない。この現象の性質をin vivoで解析することは困難であり、in vitroでの実験はin vivoでの周皮細胞の収縮の仕方を正確に表していない可能性がある。ペリサイトのよりよいマーカーを提供する最近の開発(50)とin vitroモデルの改良は、この謎めいた細胞についての理解を深めるであろう。

肺外膜領域は最近大きな関心を集めており、空間解析によってその特殊な免疫制御機構が明らかにされ始めている（13, 14）。このような背景から、我々は、肺外膜領域が生後早期のAADにおける炎症反応とリモデリング反応の中心であることを示した。実際、観察された血管の変化と炎症細胞の動員はほとんどこの領域に限られており、肺の免疫反応を解析する上で空間的アプローチが重要な役割を果たすことが確認された。しかしながら、肺外膜の限界、これらの領域におけるペリサイトの同定、そして発生過程で活動するペリサイトのサブクラスが存在し、そのサブクラスが炎症に対してより感受性が高いかどうかについては、まだ明らかにされていない(51)。さらに、ヒトの気道の複雑さはマウスモデルには完全には反映されておらず、ヒトの外膜領域の特徴をより明確にするためにはさらなる研究が必要である。

我々は、新生児発育中の肺において、気道と大血管の周囲に存在するCTMCsの集団を同定した。このことは、出生後7日目からMC数が増加することを示した先行研究と一致している(40)。われわれのデータは、MCの細胞位置を決定することによってこの観察を拡張し、AAD中のMCの機能的関与を探るものである。生後早期のこれらの領域におけるMCの特異的な分布はまだ不明であるが、血管平滑筋やペリサイトのサブタイプのような壁細胞の存在が、MCの発達につながる可能性がある(52)。さらに、IL-33は、MCの脱顆粒の程度とケモカインの産生を調節できる強力なMC活性化因子である(53)。しかし、マウスとヒトではIL-33の放出メカニズムが異なるという証拠があるにもかかわらず、IL-33が生後間もない間の免疫反応に重要であることが立証されている(42, 54)。IL-33が生後早期のMC活性化に及ぼす正確な影響については、まだ解明されていない。ここでは、IgEを介したMC刺激を用いて、MCプロテアーゼがin vitroでペリサイトに与える影響を解析した。サブスタンスPのような他のMC刺激の関与を否定することはできないが、HDMで処理した新生児マウスは、3週間のアレルゲン暴露後に効率的なIgE応答を示すことから（54, 55）、われわれのin vitroアプローチの妥当性が証明された。

興味深いことに、喘息児から採取した気管支内生検の予備的な空間トランスクリプトーム解析から、生後発達の過程で組織動態が変化することが示唆された。これらの違いは、健康時と疾患時の細胞の位置に関する局所的情報の重要性を強調している(51)。このようなクラスターがアレルゲンに対する免疫反応によって引き起こされるのか、また成人期まで維持されるのかについては、未解決の重要な問題が残っている。ヒトの初期生活におけるすべての研究と同様、ここでは健常対照がなく、疾患対照の被験者に限定されているため、限界がある(56)。しかし、パスウェイ解析から何らかの違いが存在することは示唆されたものの、これらのパスウェイに存在する遺伝子は一般に公開されている遺伝子リストからのものであるため、完全に正確な反映が得られない可能性があるため、この知見にはさらなる解析が必要である。将来的には、これらの知見を検証するために、さらなる空間的scRNA-Seq研究が必要になるだろう。

要約すると、我々の研究は、吸入アレルゲンによって誘導される組織リモデリングが、他の構造的変化に先行して肺微小循環の減少を伴う生後早期の血管構成に影響を及ぼすことを示している。このような特定部位の血管の減少はガス交換に悪影響を及ぼす可能性がある。組織の膨張による酸素供給量の増加の必要性と、肺血管系の同時減少により、肺と血管の機能全体がより早く悪化することになる。さらにわれわれの研究は、肺病変時の時間的・局所的反応についての基本的理解を深めるものである。最後に、我々はMCと周皮細胞が関与するアレルギー性炎症時の組織リモデリングの制御軸を明らかにしたが、これは呼吸器疾患時のさらなる探求が必要である（図7）。

図7：MCの活性化が肺血管系に及ぼす影響のモデル。
MCの活性化が肺血管系に及ぼす影響のモデル。生後早期のAADにおけるMCの脱顆粒は、ペリサイトの損傷とそれに伴う肺外膜の血管リモデリングを引き起こす。

方法
生物学的変数としての性別。新生児マウスは雌雄どちらか一方とし、産仔を対照群と実験群に無作為に割り付けた。雌雄ともに同様の所見が報告されている。

抗体抗マウスCD140b抗体（カタログ136002、RRID：AB_1953332）、APC抗マウスCD140b抗体（カタログ136008、RRID：AB_2268091）、Alexa Fluor 647抗ヒトCD31抗体（カタログ303111、RRID： AB_493077）、Alexa Fluor 488抗ヒトCD31抗体（カタログ303109、RRID:AB_493075）、APC抗ヒトCD140b（PDGFRβ）抗体（カタログ323608、RRID:AB_2162787）、Brilliant Violet 421抗マウスCD45抗体（カタログ103133、RRID： AB_10001045）、BV421抗ヒトCD117（C-kit）抗体（カタログ313215、RRID:AB_10896056）、BV421抗マウスCD117（カタログ560557、RRID:AB_1645258）、PE/Cy5抗ヒトCD45（カタログ304010、RRID:AB_314398）、APC抗マウスFCεRIα（カタログ134316、RRID： AB_10640121）、Brilliant Violet 711抗ヒトTNF-α抗体（カタログ502940、RRID AB_2563885）、APC抗マウスTER-119/赤血球抗体（カタログ116212、RRID AB_313713）はBioLegendから入手した。マウス/ラットCD31/PECAM-1抗体（カタログAF3628、RRID:AB_2161028）、マウス肥満細胞プロテアーゼ-6/Mcpt6抗体（カタログMAB3736、RRID:AB_2240825）、およびBV510抗ヒトFCεRIα（カタログ334626、RRID:AB_2564291）は、R&D Systemsから入手した。

動物 WT BALB/cマウス（ストック番号000651）は、最初にCharles Riverから入手し、社内繁殖により維持した。各母マウスとその子マウスは別々に飼育された。マウスは病原体のない特定の環境で飼育され、餌と水は自由に与えられた。個々の実験では、すべてのマウスは年齢と背景系統を一致させた。

ヒトドナー本研究プロジェクトで使用したヒト成体サンプルは、Imperial College Healthcare Tissue Bank（ICHTB）から入手した。ICHTBは、インペリアル・カレッジ・ヘルスケアNHSトラストおよびインペリアル・カレッジ・ロンドンを拠点とする国立保健研究所（NIHR）生物医学研究センターの支援を受けている。ICHTBはウェールズREC3から研究用ヒト由来試料（17/WA/0161）の提供を承認されており、このプロジェクト（R22006）の試料はサブコレクション参照番号ICB_NC_21_017から提供された。臨床的に気管支鏡検査が適応とされた学齢期の小児（8～17歳）を募集した。ドナーの臨床データは補足表1にある。

新生児AAD。新生児マウスをP7からHDM（Greer Lot 360923）またはPBSに繰り返し経鼻曝露した。生後2週間の間、10μgのHDMエキスを10μlのPBSに溶解したものを週3回マウスに投与した。3週目からは、15μgのHDMを15μlのPBSに混ぜてマウスに投与した。出力はすべてアレルゲン負荷24時間後に評価した(57)。

PCLS。PCLSは、肺微小環境内の血管リモデリングを画像化するための3D細胞培養モデルであり、以前に記載されたプロトコール（22, 58）を応用した。マウスのPLCSでは、肺をPBS中の2％低融点アガロース（Thermo Fisher Scientific）0.4mlでその場で膨張させた。膨張後、肺を注意深く切り離し、4%パラホルムアルデヒド（PFA）（Electron Microscopy Sciences）中で4℃で一晩固定した。ヒト肺組織は、Hammersmith Hospitals NHS TrustsとRoyal Brompton Hospitals NHS Trustsの匿名ドナーから採取し、直ちに4％PFAで4℃、一晩固定した。固定後、Compresstome VF-300 Vibrating Microtome（Precisionary Instruments）を用いて100-200μmの横断切片を作成した。

PCLSは、0.5％Triton（MilliporeSigma）を補ったPBSで室温で1時間透過処理した後、アニマルフリーブロッカー（2BScientific Ltd.）で1時間ブロックした。スライスを、PBS中の25% animal-free blocker中、4℃で一晩、指示した一次抗体とインキュベートし、必要に応じてPCLSを、PBS中の25% animal-free blocker中、室温で5時間、二次抗体とインキュベートした。肺スライスを顕微鏡用スライド（Thermo Fisher）にマウントし、ProLong Diamond（Thermo Fisher）に浸し、画像取得まで4℃で保存した。

画像取得。画像はLeica SP4またはSP8を用い、20倍対物レンズ（SP4およびSP8ではそれぞれNA 0.7および0.75）または10倍対物レンズ（SP4およびSP8ではNA 0.4）を用いて、512×512または1024×1024ピクセルの解像度で取得した。顕微鏡の電動ステージをタイルスキャン撮影に使用し、Leica built-in software, version 5.1.0 (LAS)を用いて10%のオーバーラップ閾値でマージした。外膜領域（気管支血管領域）は、大きな気道（すなわち、明瞭な層状上皮）と中・大血管が存在する肺領域と定義した。外膜領域に関連する血管系は、主気道／大血管から半径150μm以内で解析した。実質領域は、大きな気道から300μm以上離れた肺胞構造に基づいて形態学的に同定した。

画像解析。画像解析とレンダリングはImaris 8.1または9.3（Bitplane）を用いて行った。LIFファイルは、Imaris Converterソフトウェア、バージョン9.9.1（Bitplane）を用いてImaris.imsファイルに変換した。細胞、HIF-1α、アビジン+顆粒、およびm-MCP6+スポット数は、半自動スポット機能を用いて解析し（白血球および周皮細胞はそれぞれ細胞直径10および15μm、小胞および顆粒はスポットサイズ1～5μm）、体積（すなわちEC/周皮細胞のカバー率）は表面機能を用いて決定した。細胞数は画像の総体積に対して正規化した。PCLS切片の細胞体積解析の閾値は、正確な比較を行うために、実験条件間で維持した。周皮細胞および内皮細胞の体積はImarisの細胞機能を用いて決定し、細胞質の閾値はCMTMR染色またはF-アクチンのいずれかを用いて、すべての実験条件で同様に使用した。画像解析はすべて、蛍光修飾のない生画像で行った。

細胞の精製。肺組織をはさみで静かに小断片（長さ1～5mm）に解離し、6ウェルプレート（Corning）に入れた。ペリサイトを作製するために、マウスとヒトの肺サンプルを、若干の修正を加えた既述の方法で分化させた(59)。簡単に述べると、細胞は10％FCS、100U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン（すべてThermo Fisher Scientific）、および100pM色素上皮由来因子（PEDF）（Sigma-Aldrich）を補充したDMEM中で増殖させた。培養15～22日後、トリプシン（Thermo Fisher）を用いて細胞を剥離し、EasySep APC Positive Selection Kit II（STEMCELL Technologies）を用いて製造者の指示に従って単離した。磁気細胞選別にはAPC結合抗PDGFRβを用いた。細胞の純度（PDGFRβ+NG2-）はフローサイトメトリーで評価した。なお、ヒト周皮細胞はマウス周皮細胞に比べて小さかった。

マウス肺MCは、10％FCS、100U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、およびマウス幹細胞因子（SCF）を分泌する4％CHOトランスフェクタント（P. Dubreuil, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille [CRCM], CNRS, INSERM, Aix-Marseille Univ, Institut Paoli-Calmettes,Marseille,Franceからの寄贈；4％は約50ng/ml SCFに相当）を添加したOPTI-MEM中で6～8週間増殖させた。ヒト肺MCは、2.5％BSA、100U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、およびマウスSCFを分泌する4％CHOトランスフェクタントを添加したOPTI-MEM中で約8週間増殖させた。MCの純度はフローサイトメトリーで評価した（CD117+/FcεRI+）。

機能アッセイ。マウスまたはヒト周皮細胞（約10,000個）をμ-Slide 8 Well High ibiTreat、組織培養処理（Ibidi）に播種し、24時間静置した。CellTracker Orange CMTMR Dye（Thermo Fisher社製）を用いて、製造者の指示に従って細胞を染色した。約5,000個の抗DNP IgE感作肺MC（1μg/mlで一晩、クローンSPE-7、Merck）をTyrode緩衝液（Merck）で洗浄し、37℃で約15分間、周皮細胞の上に置いた。DNP-BSA（Merck）の濃度を増加させながら添加し、細胞を37℃で24時間放置した。いくつかの実験では、プロテアーゼ阻害剤カクテル（メルク社製）を製造者の指示に従って使用するか、ペリサイトを組換えm-MCP6（R&Dシステムズ社製、製造者の指示に従って成熟させたもの）に直接暴露するか、ヒトトリプターゼを阻害するために10μMのAPC-366（トリプターゼ阻害剤、メルク社製）を使用した。インキュベーション後、細胞を氷上に置き、表面マーカーを30分間染色した後、洗浄し、37℃で4％PFAを用いて約15分間固定した。必要に応じて、固定した細胞を透過化バッファー（Thermo Fisher）を用いて透過化し、フルオロクロム標識抗体またはF-アクチン（Alexa Fluor 488 phalloidin、Thermo Fisher）を用いて室温で30分間染色した。細胞は画像取得前にPBS中に保存した。MC脱顆粒フローサイトメトリーアッセイは、以前に記載されたように行った（31）。簡単に述べると、約10,000個のIgE感作肺MCをTyrode buffer（Merck）で洗浄し、37℃で96ウェルU底プレートに入れた。細胞をDNP-BSA（Merck社製）の濃度を増加させながら37℃で30分間刺激し、回収し、フローサイトメトリー用に処理した。

フローサイトメトリー。細胞を再懸濁し、PBS＋0.5％BSA＋0.1mM EDTAで洗浄した。一次抗体を4℃で約30分間インキュベートし、2回洗浄した後、必要に応じて二次抗体とともに4℃でさらに30分間インキュベートした。データはBD LSR FortessaでFACSDivaソフトウェア（いずれもBD Biosciences製）を用いて取得し、FlowJoソフトウェア（バージョン10）を用いて解析した。

scRNA-Seq解析。マウスおよびヒトのペリサイトマーカー解析は、一般に公開されているデータマイニングサイトLung Endothelial Cell Atlas（24）を用いて行った。multigeneクエリーオプションを用いてデータを可視化し、マウスとヒトのscRNA-Seqデータセット（5コホートから3万個の細胞を結合）において、ペリサイトのベスト8マーカーの発現を解析した。

空間トランスクリプトミクス。以前に記載された実験方法（NanoString）に従った（37）。簡単に説明すると、FFPEヒト肺サンプルを37℃で一晩ベークし、その後65℃で3時間ベークし、Leica Bond RX Fully Automated Research Stainerにロードしてその後の処理ステップに移した。処理プロトコールには3つの主要ステップが含まれる： (a)スライドのベーキング、(b)100℃で20分間の抗原回収、(c)プロテイナーゼK（1×PBS中1.0μg/mL）での15分間の処理。これらの工程の後、スライドをLeica Bond RXから取り出し、GeoMx CTAプローブ（約1,800遺伝子の別々の標的に特異的）のカクテルを各スライドに塗布し、湿度チェンバー内で37℃で一晩ハイブリダイズさせた。翌日、スライドを洗浄、ブロッキングし、Alexa Fluor 488標識抗α-SMA抗体（Invitrogen/Thermo製品53-9760-82；クローン1A4）、Alexa Fluor 594標識抗ビメンチン抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc、 sc-373717 AF594; clone E-5）、Alexa Fluor 647標識抗CD45抗体（Cell Signaling Technology 13917BF; clone D9M8I）、およびSyto83核酸染色。スライドは室温、恒湿槽で1時間染色した。その後、スライドを洗浄し、GeoMx装置にセットした。GeoMx装置でスライドを蛍光スキャンし、平滑筋、上皮、線維芽細胞（血管リッチ）、免疫リッチの各領域からROIを収集した。GeoMx装置はROIに385nmの光（UV）を照射し、インデックスオリゴを放出させた。インデキシングオリゴはマイクロキャピラリーで回収され、96ウェルプレートに注入された。サンプルは一晩乾燥させた後、10μLのDEPC処理水に懸濁した。各サンプル4μLを用いてPCRを行い、各ROIからのオリゴを独自のi5およびi7デュアルインデキシングシステム（イルミナ）を用いてインデックスした。PCR反応はAMPure XPビーズ（Beckman Coulter Inc.）を用い、メーカーのプロトコールに従って2回精製した。精製したライブラリーはIllumina NovaSeq 6000でシーケンスした。データ解析は記載（37）に従って行った。一貫して定量限界以下のターゲット（すなわち、<5,000 raw reads）およびネガティブプローブを除去した後、遺伝子が検出されたと呼ばれる検出限界は、ネガティブプローブの幾何平均より2 SD上と定義した。データセットは上四分位(Q3)正規化を用いて正規化した。データ解析はDSPプラットフォームとRソフトウェアを用いて行った。細胞のデコンボリューション解析は、以下のRパッケージを用いて行った： GSVA, Stringr, Dplyr (60)。細胞デコンボリューション用のオリジナルのscRNA-SeqデータはDeprezら（38）から入手した。

統計。新生児マウスを無作為にコントロール群と実験群に割り付けた。異なる実験手法ごとに解析したマウスの数を各図に示す。PCAを含むほとんどの統計解析は、Prismソフトウェア（GraphPad、バージョン9.4.1）を用いて行った。t-SNE解析はFlowJoソフトウェア（バージョン10.8.1）のビルドイン関数を用いて行い、反復回数は1,000、perplexityは30、学習率は22に固定した。データは平均値±SEMで表され、各データセットのnは図の凡例に記載されている。2群間の比較は、対または非対StudentまたはMann-Whitney t検定を用いて行った。一元配置分散分析（One-way ANOVA）後にTukeyのポストホック検定を行い、多群間比較を行った。統計学的有意性はP＜0.05と定義した。

研究の承認すべてのin vivo実験は、動物実験に関する英国法（PPL P996A24E1 and PP8328343）に基づき、英国内務省動物科学的手続き法（ASPA）およびインペリアル・カレッジ（Imperial College London）の動物福祉・倫理審査機関（AWERB）に従って承認された、インペリアル・カレッジ・ロンドン（Imperial College London）のNHLIで実施された。ヒトを対象とした研究は、施設内の倫理委員会により承認され、インフォームド・コンセントに基づく保護者の同意書および児童の同意書を得た。

データとコードの利用可能性グラフの全データポイントの値は、Supporting Data Valuesファイルに報告されている。空間トランスクリプトームデータはSupplemental Data Set 1, 2, 3として入手可能。報告されたデータの再解析に必要な追加情報（本論文の元画像など）は、リクエストに応じて入手可能である。本論文ではオリジナルのコードは報告していない。

著者の貢献
RJ、FP、CMLがプロジェクトを発案。RJとFPは実験解析の方法論を作成した。RJ、FP、HS、AV、MGM、LJEが実験を行った。WJT、MA、KB、ES、PLM、RJH、SAW、LY、SSはリソースを提供した。RJ、FP、AVが正式な解析を行った。RJはすべての図を作成した。原稿はRJが執筆。RJ、FP、HS、WJT、AV、LJE、MGM、MA、KB、ES、PLM、RJH、SAW、LY、SS、CMLが校閲・編集。RJとCMLがプロジェクトを監督した。

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謝辞
本研究は、Wellcome Trust（107059/Z/15/Zおよび220254/Z/20/Z）からCMLへの資金援助を受けている。RJは、British Heart Foundation Imperial College Centre for Research Excellence (RE/18/4/34215)およびACTERIA EFIS Foundation Allergology 2023からのフェローシップの支援を受けている。インペリアル・カレッジ・ロンドンのFILM（Facility for Imaging by Light Microscopy）は、Wellcome Trustからの資金援助（助成金104931/Z/14/Z）を一部受けている。このプロジェクトは、NIHR Imperial Biomedical Research Centre（BRC）から一部支援を受けた。表明された見解は著者らのものであり、必ずしもNHS、NIHR、または保健社会福祉省のものではない。

宛先 Régis Joulia or Clare M. Lloyd, Sir Alexander Fleming, Level 3, National Heart and Lung Institute (NHLI), Imperial College London, SW7 2AZ London, United Kingdom. 電話 44.20.7594.2151; Email: r.joulia@imperial.ac.uk (RJ); 44.207.594.3102; Email: c.lloyd@imperial.ac.uk (CML).

脚注
利益相反： LJEは現在GSKの社員である。

参考情報 J Clin Invest. 2024;134(6):e173676.https://doi.org/10.1172/JCI173676.

参考文献
Dharmage SC, et al. 小児および成人における喘息の疫学. Front Pediatr. 2019;7:246.
この記事を経由して見る CrossRef PubMed Google Scholar
Mukherjee M, et al. The epidemiology, healthcare and societal burden and costs of asthma in the UK and its member nations: analyses of standalone and linked national databases. BMC Med. 2016;14(1):113.
この記事を経由して表示します： CrossRef PubMed Google Scholar
Hammad H, Lambrecht BN. 喘息の基礎免疫学。Cell. 2021;184(9):2521–2522.
この記事を見るクロスリーフ PubMed Google Scholar
ロイドCM、サグラニS：免疫機会の窓を開く：小児喘息の治療。Trends Immunol. 2019;40(9):786-798.
経由でこの記事を表示します： CrossRef PubMed Google Scholar
Augusto LS, et al.喘息小児および青年における血管機能。Respir Res. 2017;18(1):17.
経由でこの記事を表示します： CrossRef PubMed Google Scholar
喘息は気道疾患であると同時に血管疾患でもある。Pharmacol Ther. 2015;148:17-33.
経由でこの記事を表示します： CrossRef PubMed Google Scholar
パピAら、喘息。Lancet. 2018;391(10122):783–800.
経由でこの記事を表示します： CrossRef PubMed Google Scholar
マクドナルドDM. 慢性炎症における気道血管系の血管新生とリモデリング。Am J Respir Crit Care Med. 2001;164(10 pt 2):S39-S45.
この記事を経由して表示します：クロスリーフ PubMed Google Scholar
喘息患者および非喘息患者の気管支生検標本における血管床の定量的および形態学的解析。Thorax. 2001;56(12):902-906.
この記事を見る CrossRef PubMed Google Scholar
多発性喘鳴を伴う非喘息児の気道病理はアトピー性喘息に匹敵する。Am J Respir Crit Care Med. 2008;178(5):476-482.
この記事を見る CrossRef PubMed Google Scholar
Stenmark KR, et al. 外膜：肺血管のリモデリングにおける重要な役割。2011;1(1):141-161。
この記事を経由して表示します： PubMed CrossRef Google Scholar
Turner DL, et al. アレルギー性喘息の発症における肺組織常在記憶CD4 T細胞の偏った生成とその場での活性化。J Immunol. 2018;200(5):1561–1569.
この記事を経由して見る CrossRef PubMed Google Scholar
Cautivo KM, et al. インターフェロンγは混合性炎症時に2型リンパ球ニッチ境界を拘束する。Immunity. 2022;55(2):254-271.
この記事を見るクロスリーフ PubMed Google Scholar
間質細胞は2型自然リンパ球組織ニッチを規定する。Immunity. 2019;50(3):707-722.
経由でこの記事を見る： CrossRef PubMed Google Scholar
ペリサイトは血液脳関門を制御する。Nature. 2010;468(7323):557–561.
この記事を経由して表示します：クロスリーフ PubMed Google Scholar
ペリサイトとは何か？J Cereb Blood Flow Metab. 2016;36(2):451-455.
この記事を経由して表示します： CrossRef PubMed Google Scholar
肺血管生理と病態生理における肺ペリサイト。Compr Physiol.
この記事を見る論文リスト:CrossRef PubMed Google Scholar
慢性アレルギー性喘息モデルマウスにおける気道リモデリングへの周皮細胞の関与。Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.
この記事を経由して見る CrossRef PubMed Google Scholar
Rowley JE, Johnson JR. 慢性肺疾患における周皮細胞。Int Arch Allergy Immunol. 2014;164(3):178-188.
この記事を経由して表示します： CrossRef PubMed Google Scholar
ペリサイト：発生、生理学的、病理学的視点、問題点、そして将来性。Dev Cell. 2011;21(2):193-215.
この記事を見るクロスリーフ PubMed Google Scholar
喘息におけるマスト細胞の現状と課題。Clin Exp Allergy. 2016;46(2):194-263.
この記事を経由して表示します： CrossRef PubMed Google Scholar
肺環境はマウスとヒトの2群自然リンパ球の動態を駆動する。Sci Immunol. 2019;4(36):eaav7638.
経由でこの記事を見る： CrossRef PubMed Google Scholar
Hung CF, et al. 肺のペリサイト。Adv Exp Med Biol.
経由でこの記事を表示します： CrossRef PubMed Google Scholar
Schupp JC, et al.ヒト肺の内皮細胞の統合単一細胞アトラス。Circulation. 2021;144(4):286-302.
この論文を見る CrossRef PubMed Google Scholar
Saglani S, et al. 早期アレルゲン誘発性気道過敏症の発症はIL-13+CD4+T細胞に依存している。Sci Immunol. 2018;3(27):eaan4128.
この記事を経由して見る CrossRef PubMed Google Scholar
Cautivo KM, et al. 外膜における免疫前哨基地：海に一足、岸に一足。Curr Opin Immunol. 2020;64:34-41.
この論文を見る CrossRef PubMed Google Scholar
Joulia R, et al. 好中球がダイアペディシスの際に血管のペリサイト層を破るには、肥満細胞由来のIL-17Aが必要である。Nat Commun. 2022;13(1):7029.
この論文を見る CrossRef PubMed Google Scholar
Dudeck J, et al. 皮膚炎症における肥満細胞分泌顆粒の飲み込みは、樹状細胞の遊走とプライミング効率を高める。J Allergy Clin Immunol. 2019;143(5):1849–1864.
この記事を経由して見る CrossRef PubMed Google Scholar
Dudeck J, et al. 腫瘍壊死因子の血管内への方向性肥満細胞脱顆粒は好中球の血管外遊出を促進する。Immunity. 2021;54(3):468-483.
この記事を見る CrossRef PubMed Google Scholar
異なる活性化シグナルは異なる肥満細胞脱顆粒戦略を誘導する。J Clin Invest. 2016;126(10):3981–3998.
この記事を見る JCI CrossRef PubMed Google Scholar
肥満細胞は抗体依存性の脱顆粒シナプスを形成し、専用の分泌と防御を行う。Nat Commun. 2015;6:6174.
この論文を見る CrossRef PubMed Google Scholar
網膜毛細血管におけるF-アクチン重合はペリサイトの収縮性に寄与する。Exp Neurol. 2020;332:113392.
この論文を見る CrossRef PubMed Google Scholar
認知症における脳周皮細胞と内皮細胞の相互作用。Am J Pathol. 2021;191(11):1917–1931.
この記事を見る CrossRef PubMed Google Scholar
Pejler G. The emerging role of mast cell proteases in asthma. Eur Respir J. 2019;54(4):1900685.
経由でこの記事を表示します： CrossRef PubMed Google Scholar
マスト細胞プロテアーゼ：炎症性疾患の多面的制御因子。血液。2010;115(24):4981–4990.
経由でこの記事を表示します： CrossRef PubMed Google Scholar
セルグリシンプロテオグリカンはTrichinella spiralis感染マウスの腸症を制限する。BMC Immunol. 2016;17(1):15.
この記事を見るクロスリーフ PubMed Google Scholar
Zimmerman SM, et al. Digital Spatial Profilingを用いたヒトおよびマウス組織の空間分解全トランスクリプトームプロファイリング。ゲノム研究(Genome Res.) 2022;32(10):1892-1905.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
ヒトの健康な気道の単一細胞アトラス。Am J Respir Crit Care Med. 2020;202(12):1636–1645.
この記事を見るクロスリーフ PubMed Google Scholar
ヒト肥満細胞の活性化におけるトリプターゼの役割：トリプターゼおよびトリプターゼ阻害剤によるヒスタミン放出の調節。J Pharmacol Exp Ther. 1998;286(1):289-297.
この記事を経由して表示します： PubMed Google Scholar
de Kleer IM, et al. インターロイキン-33経路の周産期活性化は発達中の肺における2型免疫を促進する。Immunity. 2016;45(6):1285–1298.
この論文を見る CrossRef PubMed Google Scholar
Saluzzo S, et al. 初呼吸で誘導される2型経路が肺の免疫環境を形成する。Cell Rep. 2017;18(8):1893-1905.
この記事を見る CrossRef PubMed Google Scholar
Saglani S, et al. IL-33は重症ステロイド抵抗性喘息の小児患者において気道リモデリングを促進する。J Allergy Clin Immunol. 2013;132(3):676-685.
この記事を経由して表示します：クロスリーフ PubMed Google Scholar
Barkaway A, et al. 免疫-血管壁細胞相互作用：免疫細胞輸送、脳血流、血液脳関門への影響。Neurophotonics. 2022;9(3):031914.
この記事を見る CrossRef PubMed Google Scholar
Bordenave J, et al. 系統追跡から肺高血圧症における血管リモデリングへの周皮細胞の動的寄与が明らかになった。Arterioscler Thromb Vasc Biol.
この記事を見るクロスリーフ PubMed Google Scholar
肺ペリサイト様細胞切除のブレオマイシン傷害・修復モデルに対する効果。Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.
この記事を見る CrossRef PubMed Google Scholar
周皮細胞喪失による循環不全と神経細胞喪失を引き起こすpleiotrophinの枯渇。Nat Neurosci. 2019;22(7):1089–1098.
この記事を見る CrossRef PubMed Google Scholar
アミロイドβオリゴマーは、周皮細胞へのシグナル伝達を介してアルツハイマー病におけるヒト毛細血管を収縮させる。Science. 2019;365(6450):eaav9518.
この記事を経由して表示します： CrossRef PubMed Google Scholar
Kruse K, et al. Trioを介したN-カドヘリンシグナル伝達は、内皮透過性を制限するためにアドヘレンズジャンクションを集合させる。J Cell Biol. 2018;218(1):299-316.
この記事を見る CrossRef PubMed Google Scholar
Kang L, et al. 好中球が放出する細胞外トラップは脳卒中後の再灌流と血管リモデリングを障害する。Nat Commun. 2020;11(1):2488.
この論文を見る CrossRef PubMed Google Scholar
郭Xら、Atp13a5マーカーによるマウスの中枢神経系周皮細胞[preprint]. bioRxivに2021年7月10日掲載。https://doi.org/10.1101/2021.07.09.451694。
ヒト肺の空間分解アトラスは、腺関連免疫ニッチを特徴付けている。Nat Genet. 2023;55(1):66-77.
この記事を見るクロスリーフ PubMed Google Scholar
Kaltenbachら：遅いインテグリン依存性移動が組織常在マスト細胞のネットワークを組織化する。Nat Immunol. 2023;24(6):915-924.
この記事を見る CrossRef PubMed Google Scholar
IL-33は肥満細胞の脱顆粒とケモカイン産生を単一細胞レベルで微調整する。J Allergy Clin Immunol. 2017;140(2):497-509.
この記事を見る CrossRef PubMed Google Scholar
真菌感作を伴う小児重症喘息はステロイド抵抗性IL-33が介在する。J Allergy Clin Immunol. 2015;136(2):312-322.
この記事を経由して表示します： CrossRef PubMed Google Scholar
Saglani S, et al.ハウスダストマイト曝露新生児マウスでは喘息の病態生理学的特徴が並行して発症する。2009;41(3):281-289。
この記事を見るクロスリーフ PubMed Google Scholar
小児重症喘息における肺2型自然リンパ球：表現型とステロイドに対する反応。Eur Respir J. 2019;54(2):1801809.
この記事を経由して表示します： CrossRef PubMed Google Scholar
Gregory LG, et al.吸入ハウスダストマイトは肺Tヘルパー2サイトカイン産生を誘導する。Clin Exp Allergy. 2009;39(10):1597–1610.
この論文を見る CrossRef PubMed Google Scholar
生体外肺組織の多次元免疫標識と4Dタイムラプスイメージング。Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.
経由でこの記事を見る： CrossRef PubMed Google Scholar
Girbl T, et al. ケモカインCXCL1、CXCL2および非定型受容体ACKR1の区別されたコンパートメント化は、好中球ディアペデシスの個別の段階を決定する。Immunity. 2018;49(6):1062–1076.
この記事を見る CrossRef PubMed Google Scholar
Hänzelmann S, et al. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 2013;14(1):7.
この記事を見るクロスリーフ PubMed Google Scholar
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