Toll様受容体を介する炎症は、B細胞を抗ウイルス性濾胞外防御反応へと導

哉百名


出版：2023年7月5日
Toll様受容体を介する炎症は、B細胞を抗ウイルス性濾胞外防御反応へと導く

https://www.nature.com/articles/s41467-023-39734-5

ジョナサン・H・ラム
ニコール・バウムガース
ネイチャー・コミュニケーションズ第14巻、論文番号：3979 (2023) この記事を引用する
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メトリクス詳細
要旨
濾胞外形質芽細胞応答（EFR）は、親和性の低い抗体を産生し、感染からほとんど身を守らないと考えられている。逆説的ではあるが、抗原-B細胞レセプターの高親和性関与が、EFRであれ、発育の遅い胚中心（GC）であれ、B細胞分化の主な原動力であると考えられている。ここで我々は、インフルエンザ感染によってEFRが急速に誘導され、B細胞内在性と外在性の両方のToll様受容体（TLR）仲介機構を介して防御抗体が産生されることを示す。B細胞内在性のTLRシグナルは、NF-kB c-Relの活性化を介したB細胞分化のマスターレギュレーターであるIRF4の誘導を介して、抗原刺激によるB細胞の生存、クローン拡大、およびB細胞の分化をサポートする。免疫後に持続的なTLR4刺激を与えることで、ウイルス特異的B細胞の運命がGCではなくEFRへとシフトし、迅速な抗体産生が促され、抗原／血清のみの投与よりも防御能が向上する。このように、炎症シグナルはB細胞の運命決定因子として作用し、抗ウイルス性の濾胞外応答を速やかに生じさせるのである。
はじめに
急性気道感染症は中和抗体応答を誘導するが、この応答は長期間の防御に不可欠である。胚中心（GC）応答は、抗原特異的GC B細胞が広範な体細胞超変異を受け、高親和性で強力な中和抗体を産生する長寿命の抗体分泌形質細胞（ASC）を生じることから、防御抗体の産生に最も効果的であると考えられている。しかし、インフルエンザウイルスの一次感染後、GCの出現は比較的遅く、ほとんどがウイルスの収縮後に成熟するため、ウイルスクリアランスに寄与する可能性は低い1。その代わり、初期抗体は、感染後間もなく、GC形成前に呼吸器から排出される縦隔リンパ節（medLN）の髄質および濾胞間領域2内に発生し局在する、濾胞外反応（EFR）の短命な形質芽細胞から産生される3。Gerhardらによる初期の研究では、BALB/cマウスにインフルエンザを接種すると、初期のヘマグルチニン(HA)特異的中和IgG抗体が急速に産生され、それは防御的で、反応の後半に誘導される抗体とは異なるレパートリーであった4。これには、鼻腔内（i.n.）インフルエンザ感染後にGCから排除された、プロトタイプのHA特異的C12アホタイプのB細胞からの変異していないIgGも含まれていた3。このように、EFRは生理的にGCとは異なるようであり、近交系マウスの制限的レパートリーから、生殖細胞系列にコードされた抗原特異的ASCを生成することができる。
免疫の迅速な誘導が生存の重要な決定因子である急性気道ウイルス感染症に対する体液性免疫に、このような異なるB細胞活性化の結果がどのように寄与しているかを解明することは、これらの感染症の病態とB細胞免疫の役割を理解する上で適切である。CD8T細胞は、一次感染時のインフルエンザウイルスの排除に最も重要であると信じられているが、それだけでは死亡率を防ぐことはできず5、非感染抗原提示細胞を排除してしまう可能性がある6。 さらに、B細胞の欠乏は、感染後10日目までにウイルス力価を約50倍に上昇させ7、急性気道感染に対する早期の抗体作製の重要性を示している。現在進行中のCOVID-19パンデミック時や季節性インフルエンザウイルス感染時のワクチン接種は、GCの誘導による長期的な免疫の獲得に加え、EFRを介したより迅速な免疫防御の誘導が可能であれば、より効果的であると考えられるからである。しかし、EFRの誘導に必要なシグナルはまだ解明されていない。実際、EFRの誘導は、これらの応答が短命で防御能力が低いと考えられているため、あまり意味がないと考えられてきた。
しかし、20年以上前のHengartnerグループによる画期的な研究により、水疱性口内炎ウイルスに対する抗体応答は、感染経過に伴うウイルス特異的血清抗体親和性の変化が驚くほど少ないことが示された。その代わりに、感染後早期でも後期でも、同族抗原に対して比較的高い親和性を持つ抗体が産生されることを示した8,9。このことは、ウイルス感染後、EFR抗体とGC抗体の両方が、全体として高い親和性を持つ抗体応答を産生する可能性を示唆している。これらのデータは、BCRトランスジェニックswHELモデルを用いて、抗原に対する強いBCR親和性がEFRにおける鶏卵リゾチーム（HEL）特異的B細胞の急速な増殖と分化を促し、親和性の低い相互作用が代わりにGC応答を強く誘導することを示したBrink研究室の報告とも一致している10。高親和性B細胞からのEFRの生成は、強いBCRシグナルが形質細胞の発達に重要な転写制御因子であるインターフェロン制御因子4（IRF4）のアップレギュレーションを促すという知見とも一致する11。このような親和性に基づく増殖と分化の誘導モデルは、EFRが高親和性抗体を産生する可能性と一致するだろう。
しかし、BCR-抗原相互作用だけでB細胞の運命決定がEFRに向かうのかどうかは、まだ不明である。さらに、EFRから高機能抗体が出現することを示す研究とは対照的に、他の研究では、サルモネラ・チフスムリウムやエールリヒア感染後に脾臓で発生するEFRは、主に非特異的な抗体を大量に生成することが示されており12,13、EFRはほとんど防御的な結果をもたらさないという考えを裏付けている。これらのデータを総合すると、感染によって誘発されるシグナルがEFRを形成していることがわかる。これらのシグナルが何であるのか、またEFR由来の抗体の機能性や防御能にどのような影響を及ぼすのかは未解決である。
免疫後のパターン認識受容体（PPR）シグナル伝達を調査した結果、B細胞に対する多くの作用が同定され、ある種のPAMPSがワクチン応答をサポートするアジュバントとして働くことがよく理解されている。例えば、ヒツジ赤血球のRNAは、RNAを感知するPPRミトコンドリア抗ウイルスシグナルタンパク質（MAVS）とTLR314を刺激し、より強固なB細胞応答をサポートした。また、TLR4リガンドである4'-モノホスホリルリピドAを含むナノ粒子を免疫したマウスは、抗原を単独で投与したマウスと比較して、より強固な抗原特異的ASC応答を誘導した。一方、TLR4とTLR7アゴニストの併用は、B細胞を早期記憶応答および胚中心応答へと運命づけ、迅速なEFRではなく、骨髄長寿命形質細胞からの持続的な抗体応答をもたらすことが報告されている15。B細胞内在性のMyD88シグナル伝達もまた、形質細胞の増殖と分化を亢進させ、ウイルス様粒子に対するBcl6+胚中心B細胞の増殖を誘導することが示された16。さらに、フレンドウイルス感染およびインフルエンザウイルス感染後、胚中心形成にはTLR7（TLR3ではない）のB細胞内在性発現が必要であることが示された17,18。対照的に、TLR9 リガンド CpG による刺激は、B 細胞の抗原取り込みとプロセシングに拮抗し、その結果、親和性成熟が阻害され、脾臓の初期形成抗原特異的形質細胞が減少し、長期間の抗原特異的血清 IgG 感受性が低下する19。TLR4 は syk20 のリン酸化を介して BCR シグナル伝達と統合することが示されている一方、TLR アダプター MyD88 は B 細胞生存受容体 TACI21 を介したシグナル伝達に重要であることが示されている。これらを総合すると、TLRおよび／またはMyD88を介したシグナル伝達がB細胞応答に影響を及ぼすことを示唆する証拠が存在するが、これらのシグナルがどのように統合されてB細胞応答を制御しているのかは、まだ未解決のままである。
ここで我々は、ミョウバン中のウイルス粒子による免疫ではなく、インフルエンザウイルス感染によって誘導される炎症シグナルが、TLRシグナル依存的にEFRの形成を介した防御抗体応答の迅速な生成を誘発することを証明した。TLRシグナルは、NFkB c-Relの活性化を介してIRF4を強力に誘導することにより、感染後のB細胞をEFR/形質細胞状態へと誘導した。同様に、LPSをウイルス／ミョウバン免疫と持続的に共投与することで、ワクチン接種後のEFR誘導が抑制され、致死的インフルエンザチャレンジに対する抗体を介した防御が改善した。
結果
インフルエンザ鼻腔内感染後、濾胞外B細胞応答は抗原特異的抗体を産生するが、末梢免疫後では産生されない。
インフルエンザ特異的ASCは、一次感染後7日以内（dpi）には主にmedLNに認められる。肺では、ウイルスが排除される14dpi3まで見られない。このことから、medLN EFRが初期抗原特異的抗体応答の主要な供給源であることが示唆されたので、この点について調べた。5 dpiでは、B細胞は主にナイーブで、CD19+/CD45R+とCD38+/CD24+であった（図1a、左）。7dpiまでには、活性化したプレGC/GC様（GC）B細胞が出現し、CD45Rhi/CD19hiおよびCD24hi/CD38medとして同定され、CD19lo/CD45Rlo CD24+ CD38loとして同定されたEFRの初期形成形質芽細胞（EF PBs）と共に出現した（図1a、右）。GC前駆細胞はまた、GCマーカーGL7を発現し、GCの極性化に関連する転写因子であるインターフェロン制御因子8（IRF8）を高発現していた22（図1b、左）。一方、EF PBはASC運命に関連するIRF4hiであり11,22、多くはASCの標準的マーカーであるCD138も発現していた（図1b、左）。EF PBとGCのB細胞はともに、7dpiまでに表面IgDを失い、ほとんどがIgMを失っていた（図1b、右）。medLNにおけるB細胞頻度は経過期間を通じて比較的一定であったが（図1c）、EFおよびGCコンパートメントでは劇的な変化が起こった。GC B細胞は9dpi後まで比較的少なかったが（図1d）、EF PBは5dpiの早い時期から見られ、7-10dpiでピークに達し、14dpiまでには縮小した（図1e）。
図1：一次インフルエンザ感染は、GC形成に先立ち、強力な初期EFRを誘導する。
a：まずCD19lo/CD45Rlo、次いでCD24+/CD38-、およびプレGC/GC B細胞をCD19+/CD45R+、次いでCD24hi/CD38loでゲーティングすることにより、濾胞外形質芽細胞（EF PB）を同定。5dpi（左）および7dpi（右）におけるCD19lo/CD45RloおよびCD24+/CD38-の集団の存在。 b GCの同一性を確認するために示したIRF8およびGL7の発現、およびEF PBの同一性を確認するために示したIRF4およびCD138の発現（左）、ならびにB細胞サブセットのIgMおよびIgDの発現（右）。c-e C57BL/6マウス（n = 3-4）を感染させ、指定された日にmedLNを採取し、全細胞のB細胞頻度（c）、B細胞のpre-GC/GC頻度（d）、およびB細胞のEF頻度（e）を測定した。c-e）のデータは、2回の独立した実験の平均±95％信頼区間（CI）を表す。統計的有意性は一元配置分散分析により決定した。****p < 0.0001. ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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フローサイトメトリーによって精製されたEF PBsのみが、7dpiの時点で病原体特異的抗体を分泌し、細胞上のELISPOTによってインフルエンザ結合型総IgおよびIgG2cとして検出された（図2a）。さらに、2種類の蛍光標識したA/PR8の組み換えヘマグルチニン(HA)を用いると、HA特異的(HA)B細胞が同定され(Fig. 2b)、GC B細胞応答よりもEF応答に優先的に関与することが明らかになった(Fig. 2c-e)。以前に示唆された23、インフルエンザ感染時のEFR形成とGCの独立性は、GCを形成できないMb-1-Cre Bcl6 f/f感染マウスにおけるEF B細胞の存在で確認された（補図1）。このように、EFRはインフルエンザ感染に対する最も早い抗原特異的抗体応答を担っており、GCとは無関係である。
図2：EFRはインフルエンザ特異的抗体分泌細胞を産生する。
a インフルエンザに感染したC57BL/6マウス(n = 6)から選別したEF PBsとプールした非EF細胞のインフルエンザ特異的ELISPOTSで、総Ig(左)とIgG2c(右)を測定した。 b 二重HA四量体染色を用いて同定したHA特異的B細胞のフロープロットと、それに続くFig. c-e C57BL/6マウス(n = 3-4)におけるインフルエンザ感染時のHA特異的B細胞サブセットの時間経過、HA特異的クローンの頻度(c)、HA特異的pre-GC/GCクローンの頻度(d)、およびHA特異的EF PBsの頻度(e)。(a, c-e)のデータは2つの独立した実験の平均±95% CIを表す。統計的有意性はWelchの補正を加えた両側Studentのt検定または一元配置分散分析により決定した。*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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ミョウバンアジュバント中のインフルエンザウイルスによる皮下（s.c.）免疫後、明瞭なB細胞応答が認められた。感染と比較して、免疫では3、7、10dpiの排液LNにおいて、最小限に誘導されたEFRよりもGC B細胞が豊富であった（図3a）。GC B細胞数は抗原量に依存して増加したが、EFRは増加しなかった（Fig.） さらに、免疫後にHA B細胞の拡大が見られたが、それらは主にGCの表現型を示し、EFRの表現型は示さなかった(Fig. 3c-e)。我々は、強固なEFRの生成には感染誘導シグナルが必要であると結論した。
図3：インフルエンザおよびミョウバンによる皮下免疫ではEFRは誘発されない。
a-e C57BL/6マウス（n = 4）に、ミョウバン中で1×107 PFUのインフルエンザA/PR8を皮下免疫し、鼠径LNを指定された日に分析した。 b マウス（n = 4）に、Complete Freund's adjuvant中で乳化したHAUスクロースグラジエント精製インフルエンザA/PR8ビリオンを皮下免疫し、7dpiで分析した。GC B細胞（左）とEF PB（右）の頻度を各抗原濃度で比較した。 c (a)の免疫後の特定のタイムポイントにおけるHA特異的B細胞のゲーティングを行った代表的なフロープロット。(a、b、d、e)のデータは2つの独立した実験の平均±95% CIを表す。統計的有意性は一元配置分散分析およびWelchの補正を加えた両側スチューデントのt検定により決定した。*p < 0.05. **p < 0.01. ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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MyD88/TRIFシグナル伝達のグローバルアブレーションは、インフルエンザに対するEFR動態を劇的に変化させる
EFRをサポートするインフルエンザ感染誘導シグナルを同定するために、我々はまず、B細胞の分化とASCの維持に寄与すると以前に同定された炎症性サイトカインと、ストレスや死にかけの細胞によって産生され、インフルエンザ感染時に放出される損傷関連分子パターンタンパク質であるS100A9を検討した24。試験されたサイトカインのうち、IL-1、I型インターフェロン（IFN）、IL-6、TNFαは、インフルエンザ感染後早期に誘導され25,26,27、ASCをサポートする28,29,30。IL-12とそれをサポートするエフェクターサイトカインであるIFNγは、T細胞、NK細胞、ILC1によって産生され、ASCの維持をサポートすることが知られている23,31。これらの可溶性サイトカインまたはそのレセプターをそれぞれ欠損したマウスは、7dpiの時点で野生型（WT）対照と同様のEFRを示したが（補図2a）、TNFαシグナルを欠損したマウスは、GC反応が有意に増加した。B細胞はまた、Toll様受容体（TLR）を介して受け取る自然シグナルによっても重要な影響を受ける。インフルエンザ病原体関連分子パターン（PAMPs）はエンドソームのTLR332とTLR733を活性化し、TLR4は感染を介した病理学に関与している34。しかし、TLR3、TLR4、またはTLR7のいずれかを欠損したマウスは、WTコントロールと同様の総EF PBs頻度とCD138 + EF PBsを示した（補図2b）。実際、TLR7 KOのEFRはわずかではあるが有意に増加した。このように、個々のサイトカインや自然シグナル受容体は、EFRの発生には不要か、あるいは冗長であるように思われた。
EFRの制御に寄与する炎症性シグナルが重複している可能性については、TLRアダプターであるTRIF35と、IL-1やIL-18シグナルも伝達するMyD88の二重欠損マウス（DKO）を用いて検討した36。実際、DKOマウスは7dpiでEFRが強く減少した（図4a）。対照的に、TRIFシングルノックアウトのEFRはわずかであったが、MyD88シングルノックアウトのEFRは平均して減少していたが、有意ではなかった（図4a）。
図4：最適なEFR動態と防御抗体にはMyD88とTRIFが必要である。
ノックアウトマウスとWTマウス（n = 4-5）を10 PFU A/PR8で感染させ、感染後7日目（dpi）にmedLNを採取した。 a 7dpiにおけるTLR欠損マウスとWTマウスのB細胞サブセットの倍率差。b-dインフルエンザA/PR8の致死量（100PFU）を翌日に感染させる前に、ナイーブなWT、DKO、TKOマウス（n＝4）（b）、およびインフルエンザに感染させ、年齢/性別をマッチさせたWTおよびMyD88/TRIF欠損（DKO）マウス（n＝10）（c）、またはWTおよびTLR2/4/unc93b欠損（TKO）マウス（n＝10）（d）を10dpiからC57BL/6マウスに血清移入した。感染期間中の体重変化率を示す。(a-d)のデータは2回の独立した実験の平均±95％CIを表す。統計的有意性は、二元配置分散分析（ANOVA）と、ウェルチの補正を用いた両側スチューデントのt検定によって決定した。**p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001、****p < 0.00001または下図に示す。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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重要なことは、0dpiではなく10dpiのWTマウスの血清は、受動的移入後の致死的インフルエンザウイルスチャレンジに対して強固な防御能を示したことである。この時点では、すべてではないにしても、ほとんどの抗体がEFR由来であるのに対し、10dpiのDKOマウスから採取した血清抗体の機能的防御能は著しく低下していた（図4b、c）。驚くべきことに、TLR237、TLR438、およびUnc93b39のミスセンス変異の遺伝子を欠失させた別のTLRヌルモデル（TKO）の感染では、7dpiでCD138 + EF PBがわずかに減少したにもかかわらず（図4a）、WTコントロールと同様のEFRが認められ（図4d）、名目上の受動防御能も認められた（図4a）。
EFR誘導におけるTLRシグナル伝達の内在的影響と潜在的なB細胞外在的影響を区別するために、B細胞のみがMyD88＋TRIF（DKO BMC）またはすべてのTLR（TKO BMC）のいずれかを欠損している混合骨髄照射キメラ（BMC）をインフルエンザに感染させ、7dpiで分析した（図5a）。DKO BMCもTKO BMCも、WTキメラ対照と比較して、EFおよびGC反応の減少を示した（図5b）。このデータは、MyD88/TRIFおよび上流のTLRシグナル伝達が、全体的にB細胞応答を制御する上で、同様のB細胞固有の役割を果たすことを示唆した。しかし、10dpiにおけるウイルス力価は、コントロールとTLRヌルBMCの間で差がなかったが（補図3a）、グローバルDKOマウスとTKOマウスは、野生型と比較してウイルス制御の欠如を示した（補図3b）。これらの高いウイルス力価は、両タイプのTLR-nullマウスにおいて、後期の時点でコントロールと比較して有意に大きなEFRと相関していた（補図3c）。このように、B細胞内在性のTLRシグナル伝達は、初期のEFR形成に影響を及ぼすが、TLRのグローバルな欠如によるウイルス制御の欠如は、EFRの拡大と相関するが、著しく遅延する。
図5：TLRシグナルがない場合、BCRを介した生存と増殖は欠損する。
a 放射線照射したCD45.1 C57BL/6宿主マウスをμMTドナーBMとDKOまたはTKOのBMで再構成した混合骨髄キメラ（BMC）（n＝12）を樹立し、6週間後に10PFU A/PR8を感染させた。 b 7dpiにおけるB細胞サブセットについて、WT BMC対照と比較したDKOおよびTKO BMCの定量。c WT、DKO、またはTKOマウス（n = 2-3）から陰性濃縮（純度98%以上）してプールした脾臓およびLNのB細胞を、段階的レベルの抗IgMで3時間パルスした後、CD40LおよびBAFFで48時間刺激した。 e 5dpiからのキメラ（n = 5-7）におけるKi67+非EF/GC B細胞。b、d、e）のデータは、2回（d、e）または3回（b）の独立した実験の平均±95％CIを表す。(d)のデータは1群あたりn = 6の総レプリケートを含む。統計的有意性は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびウェルチの補正を用いた両側スチューデントのt検定によって決定された。*p < 0.05、***p < 0.001、***p < 0.0001、または下図に示す。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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B細胞内在性TLRはB細胞の増殖と生存をサポートする
B細胞の動態に対するTLRシグナルの直接的効果を評価するために、負に濃縮したナイーブな濾胞性B細胞を、抗IgM（Fab）2およびLPS、BCRおよびTLRアゴニストとそれぞれ培養した。抗IgMとLPSの共刺激は、LPS単独と比較して細胞の生存率をわずかに高めるだけであった（補図4a）が、Ki67発現の増加によって示されるように、どちらか一方の治療単独と比較してB細胞の増殖を強く支持した（補図4b）。共刺激はまた、IRF4の誘導とIRF8のより緩やかな誘導において、どちらか一方の刺激単独よりもかなりの相加効果を示し、どちらもB細胞運命の重要な転写制御因子であった（補図4c、d）。まとめると、内在性TLR刺激はBCRを介した活性化と増殖を促進する。
カノニカルTLRシグナルはBCR20,40やTNFスーパーファミリーレセプター21と統合することが知られており、TLRシグナル欠損B細胞はTLRアゴニストに対する反応だけでなく、BCRを介して、あるいはCD40やBAFFRを介した共刺激によって誘導されるシグナルに対しても変化することが示唆される。実際、抗IgM(Fab)2で3時間パルスし、CD40LとBAFFで48時間インキュベートしたナイーブな濾胞性DKOおよびTKO B細胞（図5c）を刺激すると（図5d、上）、WTコントロールと比較して、生存率が低下し（図5d、下）、Ki67染色で測定すると、細胞周期に入ることがほとんどできなくなった（図5d、下）。MyD88とTRIFの単独KO B細胞は、生存率（図5a）と増殖率（図5b）において、WT B細胞とDKO B細胞の約半分の頻度で、互いに類似した減少を示したことから、TRIFはMyD88とともに、BCRを介した活性化シグナルを非冗長な相加的様式で支持していることが示された。同様の結果がBCR刺激単独でも得られ（補図5c、d）、抗原を介した活性化にTLRシグナル軸が関与していることが示された。これらのデータと一致するように、インフルエンザに感染したDKOおよびTKO B細胞キメラの非EF/GC B細胞を分析すると、急激な形質芽細胞の膨張が始まる直前の5dpi（図5e）において、生体外でのKi67の発現が対照と比較して有意に低下していた（図1e）。このように、統合TLRシグナル伝達の欠如は、以前の報告20と一致して、B細胞の生存と細胞周期への進入を有意に減少させた。
機能的TLRシグナル伝達の欠如は、BCR複合体の動態異常と転写制御につながる
BCR架橋の即時読み出しであるBCR媒介カルシウムフラックスは、WT、DKO、TKOのB細胞間で全体的に同等であり（補図6a）、TLRヌルB細胞は単に全体的に欠陥があるだけではないことを示している。BCRの下流にあるエフェクタータンパク質のリン酸化は、処理前ではわずかな差異しか示さなかった（補図6b）。しかし、TLR-null B細胞では一般的にBCRを介した経路活性化が増加し、抗IgM処理30分後のすべての濃度において、MyD88を欠くB細胞では炎症促進因子NFkB141と成長促進因子mTOR42のリン酸化が増加した(補図6c、d)。さらに、いくつかのBCRを介するシグナル伝達経路43の主要な活性化ノードであるSykリン酸化は、すべてのTLRシグナル伝達欠損B細胞において、BCR刺激の最高濃度で増加した（補図6e）一方、分裂促進経路MAPK p3844には株間でほとんど差がなかった（補図6f）。これらのデータを総合すると、TLRシグナル伝達の欠損は、IgM-BCRを介する多くの重要なシグナル伝達経路の誘導に有害な影響を与えないことを示している。
IRF4はBCRシグナル伝達の強さに比例してアップレギュレートされる11。これと一致して、7dpiにおけるEF形質芽細胞のex vivo解析では、非EFR B細胞と比較して、IRF4の発現が明らかに高く、IRF8の発現が中程度であることが示された（図6a、左）。DKOキメラとTKOキメラの非分化B細胞は、5dpiの時点でWTに比べてIRF4とIRF8の発現が有意に少なく（図6a、右）、新生EFRが形成され始めると同時にIRF4のアップレギュレーションに欠陥があることを示している。In vitroでは、IgM-BCR刺激は、CD40LとBAFFの存在下で、抗IgM用量依存的にWTマウスのB細胞におけるIRF4とIRF8の発現を増加させた（図6b、右、図6c）。驚くべきことに、DKOマウスとTKOマウスのB細胞は、これらの条件下でIRF4の発現を上昇させることができず（図6b、右、図6c）、IRF8の発現はどの系統でもほぼ同様であった（図6b、右、図6d）。したがって、このデータは、TLR非存在下でBCRを介したIRF4誘導に欠陥があることを示している。
図6：機能的なTLRシグナル伝達の欠如は、BCR複合体の動態を変化させ、IRF4のアップレギュレーションを失敗させる。
a 感染マウスにおけるIRF4とIRF8の発現を示す代表的なフロープロット。5dpiにおけるキメラ（n = 5-7）の非EF/GC B細胞のIRF4とIRF8におけるWTコントロールと比較した倍率差（右）。 b 各系統のB細胞におけるIRF4とIRF8の濃縮前のベースライン（左）、および指示した抗IgM濃度で刺激した細胞からの代表的なIRF4対IRF8のフロープロット（右）。c-d図5cで概説した処理後のIRF4（c）およびIRF8発現（d）の非刺激WT B細胞と比較した倍率差。e 30分間の抗IgMまたはLPS処理後、フローサイトメトリーで測定した細胞質c-Relの非刺激WT B細胞に対するノックアウト細胞のFold-difference（n = 3） f 3時間の抗IgMパルスと完全培地のみでの48時間培養後、全c-Rel発現の非刺激WT B細胞に対するFold-difference（n = 3）。(a,c-f)のデータは、2回の独立した実験の平均±95% CIを表す。(c, d)のデータは、各群につきn = 6の総レプリケートを含む。統計的有意性は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびウェルチの補正を用いた両側スチューデントのt検定によって決定された。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。(g, h)の星印はそれぞれのWTコントロールとのStudent's t-test比較。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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NF-kB c-Relは核局在化するとIRF4の発現を促進することが知られており、BCRとTLR445の両方の下流に存在する。c-Relの核への転座を推測させる、細胞質c-Relの強い、BCR用量依存的な刺激誘発性の減少が、WTでは見られたが、TLRシグナル欠損B細胞では、刺激後30分という早い段階で、フローサイトメトリーによりかなり減少した（図6e、補図7a）。この結果と一致して、DKOおよびTKOのB細胞は、単離した核画分に対するELISAで評価したところ、抗IgMおよびLPS刺激後1時間でc-Relの核内蓄積の有意な減少を示したが(補図7b)、2時間後には正常化し(補図7c)、これは全c-Rel発現の有意な増加と同時であった(補図7d)。しかし、このBCR誘導c-Rel発現の正常化の遅れは短期間で、B細胞分化プログラム46の初期化に関連する持続的c-Rel発現は、抗IgMパルス48時間後、TLRシグナルを欠くB細胞では、WT B細胞よりも劇的に低いままであった（図6f）。したがって、TLRアゴニストを意図的に添加しなくても、B細胞はc-Rel回路を適切に活性化し、抗原媒介刺激に応答してc-Rel発現を長期的に維持するために、TLRの存在を必要とする。
LPSアジュバントによるインフルエンザ免疫時のEFRの再構成
B細胞内在性TLRシグナルと外来性TLRシグナルの両方がEFRの大きさと動態に影響を及ぼすので、MyD88とTRIFシグナルの両方を開始するTLR4アゴニストであるLPSが、ミョウバン中でインフルエンザウイルスをs.c.免疫した後のEFR誘導の欠如を克服できるかどうかを試験した（図3）。実際、ミョウバン＋LPSでインフルエンザを接種し、その後LPSブーストを繰り返したC57BL/6マウス(Ag+LPS; Fig. 7a)は、ミョウバンだけでインフルエンザを接種したマウス(Ag Only)と比較して、総B細胞、GC B細胞、EF PBが増加した(Fig. 7b)。重要なことは、HA結合B細胞数が抗原/ミョウバン単独投与マウスより2倍多く（Fig. 7c）、GCコンパートメントではなくEFRコンパートメントでHA B細胞が数倍増加したことである（Fig.）
図7：持続するTLR介在性炎症は、免疫後、排出LNに強いEFRを生成する。
a マウス(n = 7-12)にミョウバン中のインフルエンザ、およびLPSを含むか含まないかでs.c.免疫し、指定された日にLPSまたはPBSでブーストした後、排液LNを分析した。d 各レジメンのHA特異的B細胞の増殖と形質細胞分化（左）とIRF4対IRF8シグネチャー（右、HA-sp.は赤で強調表示）のフロープロット。 e HA特異的EF PB、増殖、IRF4の相対発現の定量化。(a, c-e)のデータは2回（e[右]）または3回（b, c, e[左, 中央]）の独立した実験の平均±95% CIを表す。統計的有意性は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびWelchの補正を用いた両側スチューデントのt検定によって決定された。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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このデータは、TLR活性化が抗原特異的B細胞の増殖を増加させるだけでなく、優先的にEFRの運命に向かわせることを示している。Ag+LPSマウスのHA B細胞はほとんどがKi67/CD138陽性で、IRF4hi IRF8int.であり、インフルエンザ感染マウスのEF PBと同様であった(Fig. 7d, e)。このレベルのEFR分極化は、Ag Onlyマウスでは見られなかった（図7d, e）。このように、抗原の存在下でTLRを介した炎症が持続すると、抗原特異的B細胞がより大きく増殖し、EFRの運命に偏向する。
最近の報告では、抗原価47 と抗原の利用可能性48 が増加すると、B細胞は形質芽細胞運命に偏ることが示唆されている。以上の結果を踏まえて、B細胞の運命動態とEFR由来の抗体機能が、TLRアゴニストの投与の有無に関わらず、抗原曝露の繰り返しによってどのような影響を受けるかを検討した。そのために、すべてのマウスをインフルエンザとLPSでプライミングし、LN活性化49 を同等に開始させた後、コントロールとして抗原単独（Ag Boosted）、抗原＋LPS（Ag+LPS Boosted）またはLPS単独（LPS Boosted）で2回の追加ブーストを行った（図8a）。Ag BoostedマウスもAg+LPS Boostedマウスも、排出LN中のHA B細胞の頻度は同様であり（Fig. 8b）、Ki67+細胞の頻度もほぼ同様であった（Fig.） しかしAg BoostedマウスのHA B細胞はGC運命に有意に偏極した（Fig. 8d）のに対し、Ag+LPS BoostedマウスのHA B細胞はEFRに有意に偏極した（Fig. Ag+LPS Boostedマウスでは、Ag Boostedマウスと比較して、14dpiの時点でGCの減少は見られなかったことから（補図8）、EFRへの早期偏極にもかかわらず、TLRシグナル伝達は潜在性GC反応に有害ではなかったことが示唆される。
図8：抗原に繰り返し暴露されるだけで、抗原特異的B細胞はGC運命に偏るが、EF運命に偏極するには持続的なLPS暴露が必要である。
a C57BL/6マウス(n = 7)をミョウバン中でインフルエンザとLPSでs.c.免疫し、その後指定した日に抗原単独または抗原とLPSおよびLPS単独でブーストし、その後排液LNを分析した。 b-e 全HA B細胞(b)、Ki67+ HA B細胞(c)、HA GC B細胞(d)およびHA EF PB(e)の定量。f プライム後10日目のインフルエンザ特異的血清IgG濃度（n = 10-12）は相対単位（左）および抗原のみ投与群に対する倍数差（右）で表した。 g, h プライム後10日目のプライムマウス／ブーストマウス（n = 10）およびナイーブマウス（n = 6）の血清を、翌日致死量（100 PFU）のインフルエンザA/PR8に感染させる前に、ナイーブC57BL/6マウスに移植した。生存確率（g）および体重変化率（h）を、感染期間中の平均値（上）および個体別（下）に示した。b-f、h）のデータは、2回（b-e、g、h）または3回（d）の独立した実験の平均±95％信頼区間を表す。統計的有意性は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびウェルチの補正を用いた両側スチューデントのt検定によって決定した。*p < 0.05, **p < 0.01 ***p < 0.001, ****p < 0.0001。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
フルサイズ画像
Ag + LPS Boostedマウスは、血清中の抗インフルエンザ抗体のレベルが最も高く（図8f）、プライム後10日目におけるGCに偏った応答と比較して、EFRの増加が抗原特異的抗体応答の増強と相関していることが示された。IgGレベルの上昇が血清受動防御能の上昇と相関しているかどうかを調べるため、各ブースト群からプールした血清をナイーブ動物に移し、その後致死量のインフルエンザにチャレンジさせた。Ag+LPSブースト血清を投与されたマウスは、Agブースト血清またはLPSブースト血清を投与されたマウスとは対照的に、死亡率を示さなかった（図8g）。さらに、Ag+LPS Boostedマウスの血清を投与されたマウスは、Ag Boostedマウスの血清を投与されたマウスに比べて、全体的に体重減少が有意に少なかった（図8h）。これらのデータを総合すると、持続的なTLR介在性炎症が抗原特異的B細胞をEFRに偏向させ、抗原特異的血清抗体をより早く、より強く増加させることが証明された。
考察
これらの研究は、TLRを介した炎症シグナルが、EFRを介して抗原特異的B細胞をASCsの形成に向かわせることを示している。重要なことは、インフルエンザ感染後およびLPSブースト免疫後に誘導されたEFR由来の抗体は、機能的に防御的であったことである。このように、炎症刺激によって誘発され支持されたEFRは、GCに必要な時間の何分の一かの時間で防御抗体応答を提供することができ、GCの形成に先立つインフルエンザ感染後6-10日の間に、活発に分泌するヘマグルチニン特異的形質芽細胞を形成し、この動態はウイルスクリアランスと相関する。
EFRの発達は、ナイーブなレパートリーを含め、感染時にすでにレパートリーに存在する特異性によって推進されるようである8,9,10。BCRとその同族抗原との親和性の高い相互作用はB細胞エフェクターの運命を駆動し、親和性の低い相互作用はGCの素因を与える10。しかし、高親和性B細胞の存在だけでは、B細胞の運命決定は説明できそうにない。同じ近交系マウスにおいて、インフルエンザ免疫に対する初期のB細胞応答はGC形成が支配的であったが、インフルエンザ感染後の応答はEFRが支配的であったことを、ここで示した。抗原-BCR親和性だけで、ASC運命への偏極が促進されるのであれば、抗原の運搬や安定性などが最適であると仮定した場合、抗原の存在だけで、感染後に見られたようなEFRへの高親和性クローンの顕著な拡大が起こるはずである。
ここに示したデータを総合すると、EFRの発達に重要な正の制御因子として、感染によって誘発される炎症が必要であることがわかる。MyD88/TRIFまたはTLR2/4/Unc93bを介した機能的なToll様受容体（TLR）シグナル軸が、NF-kB c-Rel:IRF4経路の最適な活性化を誘導したためである（図9上）。加えて、TLRが介在する炎症が、おそらくLN間質コンパートメントの変化を通じて、GCよりもEFRへの抗原特異的B細胞の拡大を促すという、外因的な方法でも作用するようであった（補足図9、下）49。グローバルTLR欠損マウスとB細胞特異的TLR欠損キメラマウスとの間のウイルスクリアランスの違いは、TLRシグナルの外因的および内因的寄与を強調している。GC応答はグローバルTLRノックアウトマウスでは影響を受けなかったが、B細胞特異的ノックアウトマウスでは影響を受けなかったことは興味深い。推測の域を出ないが、このデータは、特定の非B細胞集団におけるTLRシグナル伝達の欠如が、GC B細胞のレスキューにはつながったが、EF PBsのレスキューにはつながらなかったことを示唆しているのかもしれない。DCにおけるTLRシグナル伝達はTh1分極化を増加させる50 ので、TLRシグナル伝達の完全欠損は、より多くのCD4 T細胞をTfh表現型へと分極化させ、TLRを介した活性化における GC B細胞固有の欠損を補ったのかもしれない。これらの所見を探るには、さらなる研究が必要である。
TLR刺激は複数の遺伝子プログラムの活性化につながるが、BCR刺激後のNF-kB c-Rel核局在化および発現上昇の欠損は、DKOおよびTKO B細胞で特異的に観察された。さらに、TLRアダプターであるTRIFは、抗IgM処理後のB細胞の生存と増殖に、MyD88と同等かつ非連続的に寄与することが示された。活性化されたB細胞様リンパ腫細胞におけるTLR9-MyD88-BCR複合体の増強の証拠から、TLRは下流のTLR標的がBCRとそのエフェクター経路を通して活性化されるための基盤を提供する可能性が示唆される51。その結果、統合されたTLR経路の活性化が、BCRを介したIRF4誘導の重要な源となる。
TLRヌルB細胞で観察されたIRF4アップレギュレーションの欠損は、TLR4とBCR活性化の両方が起こった後、IRF4誘導がc-Rel核転位に依存することを示した以前の研究と一致している45。TLRヌルB細胞では、BCRを介したc-Rel局在の正常化が、最初の刺激から2時間後に遅れて起こった。c-Relには複数のc末端リン酸化部位があることから52 、IkBからのc-Relの遊離に加えて、最適なリン酸化シグネチャーにはTLR成分が必要かもしれない。実際、c末端を切断したc-Relの制御活性は、機能的な二量体化、核局在化、DNA結合にもかかわらず、著しく変化していることが観察された53。したがって、機能的なTLR軸の切断は、局在化の可能性を維持しながら、c-Relの核内活性を決定する可能性がある。TLRがc-Relのc末端トランス活性化ドメインのリン酸化にどのような影響を与えるのか、またTLRが存在しない場合、特異的な遺伝子制御がどのように変化するのかについては、さらなる研究が必要である。加えて、TLR-null B細胞では48時間後にc-Relの総レベルが上昇したが、測定された抗IgM刺激のどの用量においても、それぞれのWTコントロールで観察されたレベルより有意に低かった。このように、IRF4とc-Relの発現は相関している。B細胞におけるIRF4の最適な誘導には、ある閾値のc-Relが必要なようである。実際、c-Relは抗原による活性化後のB細胞のNF-kBプログラムを支配し46、活性化されたクローンを数ラウンド増殖させ、形質細胞への最終分化に関連する遺伝子へのアクセスを可能にする。
ミョウバン中の抗原を用いたワクチン接種は、プライム、ブーストを問わず、主にGCコンパートメント内で抗原特異的クローンの増殖を引き起こし、抗原＋TLRアゴニストによるブースティングで生じたEFR優位の応答と比較して、免疫後早期には防御能の低い、長期にわたる血清抗体応答を生じた。このことは、抗原の価47 および／または量48 を増加させるだけでは、B細胞をワクチン接種後の早期形質芽細胞応答に向かわせる能力が限定的であることを示唆している。データから示唆されるように、これは、TLR活性化条件下で機能的防御能を有する抗インフルエンザ抗体が全体的に増加するためかもしれないが（図7f）、ユニークなエピトープやより多くのエピトープを標的とする抗体レパートリーの違いによる可能性もある。TLR活性化によりB細胞はIRF4発現を増加させるため、BCRとの相互作用が比較的弱いクローンでも、必要なIRF4の閾値に達することで抗体分泌に参加できるようになる可能性がある。このように、宿主が高度に制限されたBCRレパートリーを持っている場合でも、TLR活性化によって、親和性の低いBCRを発現するB細胞が免疫防御に貢献できるようになる。
TLRアゴニストの種類、すなわちMyD88やTRIFのみを活性化するものが、EFRの動態に異なる影響を与えるかどうかは不明である。TLR4（MyD88とTRIF）およびTLR7（MyD88のみ）アゴニストをアジュバントとして使用した場合、どちらか一方のみを使用した場合と比較して、免疫後の初期抗体反応に差がなかったという報告もある15。さらに、CpG による TLR9 活性化は力価を上昇させるが、GC を介したハプテンへの親和性成熟が欠如するため、抗原特異的抗体応答の質を悪化させた19。ハプテンに対する親和性は、GCが成熟して親和性成熟が起こるにつれて経時的に上昇する54 。このことは、抗原に対する親和性が低い抗ハプテンクローンが、TLRの活性化によって分化に「引っ張られ」、応答の全体的な親和性を低下させている可能性を示している。
インフルエンザウイルスにPAMPsが存在することを考えると、B細胞によるウイルス認識と取り込みに伴うTLR/BCRの相乗作用の特徴づけ、そしてこのことが抗体応答の質にどのように寄与するのかが注目される。水疱性口内炎ウイルスの感染後、血清抗体親和性の経時的上昇が観察されなかったことや8,9、ヘマグルチニンに対する高親和性生殖細胞コード化抗体がインフルエンザ接種後早期に誘導されたことは注目に値する4。このように、EFRに由来する抗体活性のレベルは文脈に左右され、宿主の感染前レパートリーに内在する特異性と、ある抗原上のエピトープの価数の両方に依存している一方、EFRの開始、動態、および大きさは、TLRを介した炎症シグナルに依存している。このデータは、再活性化されたメモリーB細胞は、異型反応中であっても、GCに入るよりもEFRを優先的に形成するという知見と一致している55。急性感染症ではTLRを介した炎症シグナルが優勢であることから、抗原特異的B細胞はEFRに移行し、感染に対する防御抗体を迅速に産生することができる。このデータはまた、EFRと重篤なCOVID-19感染56との関連や、慢性炎症に伴うEFR由来の自己抗体産生の増加についても、メカニズム的な説明を与えている。この場合、正のフィード・フォワード・ループが抗体を介した病態を誘導し、炎症を促進し、その結果、進行中のEFRがさらに支持されることになるのかもしれない。ワクチン接種に関しては、EFRを標的とし活性化することで、ナイーブB細胞からであれ、メモリーB細胞からであれ、防御抗体の迅速な産生が可能になる。われわれは、B細胞応答の運命は、抗原との遭遇時に、生得的な炎症環境によって決定的に制御されていると結論づけた。
方法
マウス
雌雄8～12週齢のC57BL/6（WT; CD45.2 #000664 ）、B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ（CD45. 1、#002014）、B細胞欠損（μMT）マウス（#002288）、ならびにTNFAR1/2 KO（#005540）、IFN-γ KO（#002287）、IL-12R KO（#003248）、IL-1R KO（#028398）、TLR3 KO（#005217）、TLR4 KO（#029015）、TLR7 KO（#008380）は、市販のものを入手した（The Jackson Laboratories）。MyD88/TRIF DKOおよびTLR2/4/unc93b TKOマウス系統の繁殖ペアは、Barton博士（UC Berkeley）から贈られた。S100A9 KOマウスの繁殖ペアは、Rafatellu博士（カリフォルニア大学サンディエゴ校）のご厚意によるものである。CD19-Cre IFNAR KOマウスの繁殖ペアはJason Cyster博士（UCSF）からいただいた。すべてのマウスは、換気フィルター付きSPFケージで飼育し、餌と水を自由に与えた。安楽死は、マウスをC02にさらすことによって行われた。マウスを用いたすべての研究は、UC Davis Institutional Animal Care and Use Committeeによるプロトコルの承認を得て、厳密に遵守して実施された。
混合骨髄（BM）キメラは、sIgM欠損（CD45.2、75％）とC57BL/6（WT；CD45.2）、MyD88/TRIFダブルノックアウト（CD45. 2）、またはTLR4/TLR2/Unc93bトリプルノックアウト（CD45.2）のBM（25％）を、5～6週齢のB6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ（CD45.1）マウスに移植し、移植24時間前にガンマ線照射源に曝露して致死的に照射した。キメラは感染と解析の前に少なくとも6週間休ませた。
感染と免疫
マウスをイソフルランで麻酔し、PBS中40μl容量の亜致死量（10PFU/ml）のインフルエンザA/プエルトリコ/8/34（A/PR8）を経鼻感染させた。ウイルスは以前に概説したように鶏卵中で増殖させ57、各ウイルスバッチは使用前にマウスへの影響を滴定した。具体的には、20%以上の体重減少が生じない亜致死感染量を選択した。免疫のために、ミョウバンとPBSの50:50混合液に1×107 PFU A/PR8をマウス皮下に接種した。いくつかの実験では、免疫に3μgのLPSを添加し、あるいはマウスに1×106 PFU A/PR8と3μgのLPSをPBS中またはPBS単独で繰り返し添加した。
受動的防御のための養子血清移植
指定された系統のマウスを10 PFU A/PR8で感染させた。10dpiで麻酔をかけたマウスから心臓穿刺で血液を採取し、血清分離のためにスピンダウンした。各系統の血清をプールし、その後、ナイーブC57BL/6マウスにプールした血清50μlと1×PBS150μlの混合液をi.v.注射した。これらのマウスに1日後に100 PFU A/PR8をi.n.接種し、体重減少を測定した。
磁気B細胞濃縮
脾臓B細胞をFcブロック（抗マウスCD16/32、クローン2.4.G2）で処理し、ビオチン化Abs（抗CD90.2（30-H12）、抗CD4（GK1.5）、抗CD8a（53-6. 7）、抗Gr-1（RB6-8C5）、抗CD11b（M1/70）、抗NK1.1（PK136）、抗F4/80（BM8）、抗CD5（53-7.3）、抗CD9（MZ3）、抗CD138（281-2）および抗ビオチンMicroBeads（Miltenyi Biotec）を混合した。ナイロンフィルターで染色した脾臓細胞をautoMACS（Miltenyi Biotec）を用いて分離した。濃縮されたマウスB細胞の純度は、その後のFACS分析により98%以上であった。
フローサイトメトリーおよびホスホフロー
縦隔リンパ節（medLN）から単細胞懸濁液を調製し、先に概説したように表現型分類のために標識した57。簡単に説明すると、抗CD16/32（5mg/ml、氷上で20分間）とLive/dead Fixable Aqua（Thermo Fisher、L34957）を用いてFc受容体をブロックした後、細胞を以下の抗体-フルオロフォア結合体で、製造業者/供給者に従った温度と時間で染色した。すべての試薬は使用前に滴定し、マウスの脾臓、骨髄、腹膜腔洗浄細胞を用いて、陰性細胞画分と陽性細胞画分の間で蛍光強度の差が最も大きくなる希釈液を同定した。希釈率は試薬や試薬ロットによって異なるが、通常1:25から1:400の間である。より高濃度の試薬（主に自社製）は、使用時に1:200希釈が可能な濃度であらかじめ希釈しておいた。HA-PEおよびHA-APCオリゴマー（Dr. Frances Lund, UAB）、BV786抗CD19（1D3）（BD Bioscience, 563333）、APC-eFluor780抗CD45R（RA3-6B2）（Thermo Fisher, 47-0452-82）、PE-Dazzle 594抗CD38（90）（Thermo Fisher, 741748）、BV711抗CD24（M1/69）（BD Bioscience, 563450）、BV605抗CD138（281-2）（BD Bioscience, 563147）、 eFluor450抗GL-7（GL7）（Thermo Fisher、48-5902-82）、PEまたはPE／Cy7抗IRF4（3E4）（Thermo Fisher、12-9858-82、25-9858-82）、PerCP-eFluor710抗IRF8（V3GYWCH）（Thermo Fisher、 46-9852-82）、eFluor450抗Ki67（SolA15）（Thermo Fisher、48-5698-82）、FITC抗IgM（331）（自社）、およびBV650抗IgD（11-26c. 2 a）（Biolegend、405721）。非B細胞の「ダンプ」には、AlexaFluor 700上の以下の抗体を用いた：抗CD90.2（Thy1.2）（Biolegend、105320）、抗CD4（GK1.5）（Thermo Fisher、56-0041-82）、抗CD8a（53-6. 7）（サーモフィッシャー、56-0081-82）、抗Gr-1（サーモフィッシャー、56-5931-82）、抗CD11b（M1/70）（サーモフィッシャー、56-0112-82）、抗NK1.1（サーモフィッシャー、56-5941-82）、抗F4/80（BM8）（サーモフィッシャー、56-4801-82）。Foxp3 Staining Buffer Set（Thermo Fisher社製）は、製造元のプロトコールに従って、転写因子の染色用の細胞の固定と透過に使用した。細胞質のみの染色には、Cytofix/cytoperm buffer set（BD Biosciences）をメーカーのプロトコールに従って使用した。リン酸化フローには、APC抗p-Syk（moch1ct）（Thermo Fisher, 17-9014-41）、PerCP-eFluor710抗p-p38（4NIT4KK）（Thermo Fisher, 17-9078-42）、PE/Cy7抗p-mTOR（MRRBY）（Thermo Fisher, 25-9718-41）、PE抗p-p65（B33B4WP）（Thermo Fisher, 46-9863-42）を製造業者のプロトコールに従って染色した。7dpiのmedLNからのB細胞は、ダンプチャンネル、抗CD19、抗CD45R、抗CD24、および抗CD38のプールされた抗体を用いて、ELISPOTのためにフローサイトメトリーにより選別した。選別された細胞の純度は直後に評価された（96％以上）。データはBD LSR II Fortessa、BD LSR Symphony、BD FACS Ariaサイトメーターを用い、BD FACSDivaソフトウェアを用いて収集し、その後FlowJo v10ソフトウェアを用いて解析した。
In vitro B細胞培養
磁気濃縮したB細胞を5×106cells/ml、37℃で培養した。細胞は、培養液中、抗IgM（Fab）2および／またはLPSとともに、指示された濃度で、30分、1時間、2時間、および3時間インキュベートされた。3時間抗IgMパルスを受けたB細胞をPBSで2回洗浄し、200ng/mlCD40L（Peprotech社製）と5ng/ml BAFF（R＆D Systems社製）を含む培地中で、96ウェル丸底プレートを用いて5％CO2、48時間培養した。その後のフローサイトメトリー解析は、Fcブロック、Live/dead Fixable Aqua、PE抗c-Rel（1RELAH5）（Thermo Fisher、12-6111-80）、BV786抗CD19、eFluor450抗Ki67、PE/Cy7抗IRF4、PerCP-eFluor710抗IRF8を用いて行った。
ELISPOT
A/PR8特異的Ig分泌細胞を測定した。FACSで選別したEF PBおよびプールした非EF B細胞の連続希釈液を37℃で一晩インキュベートした。Ab分泌細胞（ASC）は、ヤギ抗マウスIgM、IgG-ビオチン（Southern Biotech）、続いてSA-HRP（Vector Laboratories）および3-アミノ-9-エチルカルバゾール（Sigma-Aldrich）を用いて明らかにした。ELISPOT 画像は AID Elispot Reader を用いて収集し、AID Elispot 7.0 を用いて定量した。
核画分ELISA
c-Relの核内局在を測定した。簡単に説明すると、核および細胞質タンパク質画分を、NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction（Thermo Fisher社製）を用いて、培養、精製したB細胞から製造業者のプロトコールに従って抽出した。ELISAプレートをポリクローナル抗c-Rel（Thermo Fisher）の4μg/ml希釈液で一晩コートし、非特異的結合のために1時間ブロックした。結合したc-Relは4μg/mlのモノクローナル抗c-Rel（1RELAH5）を用いて検出した。結合はSA-HRP（Vector Laboratories）で明らかにした。データはMolecular Devices SpectraMax M5を用いて収集し、Softmax Pro 7を用いて定量した。
ウイルス負荷rtPCR
感染マウスを安楽死させ、肺組織を抽出し、1mlのPBS中でGentle Macs（Miltenyi）を用いてホモジナイズした。組織をペレット化し、上清を分取して凍結した。QIAamp viral RNA mini-kit (Qiagen)を用いてアリコートからウイルスRNAを精製した。インフルエンザの存在は、rtPCRを用いたインフルエンザM遺伝子の増幅により検出した。使用したプライマーは、AM-151（5′-CATGCAATGGCTAAAGACAAGACC-3′）およびAM-397（5′-AAGTGCACCAGCAGAATAACTGAG-3′）およびプライマー／プローブAM-245（6FAM-5′-CTGCAGCGTAGAGCTTTGTCCAAAATG-3′-TAMRA）であった。逆転写および増幅は、TaqPath Multiplex Master Mix（Thermo Fisher）を用いて行った。サンプルはA/PR8ウイルスストックを標準として定量した。Applied Biosystems QuantStudio 6 Flexを用いてデータを収集し、QuantStudio Realtime PCRを用いて定量した。
カルシウムフラックスアッセイ
細胞カルシウム濃度の変化を測定するため、B細胞を製造業者のプロトコールに従って2μMの細胞透過性Fluor-3および4μMのFuraRed（いずれもThermo Fisher）で染色し、フローサイトメトリーによる解析の前に10μg/mlの抗IgM(fab)2断片で刺激した。カルシウム励起性色素（Fluor3）とカルシウム消光性色素（FuraRed）の比率を計算し、遊離細胞内濃度を決定した。
統計と再現性
すべての統計解析はGraphPad Prism v8を用いて行った。2群間の比較は、Welchの補正を加えた両側Studentのt検定を用いて行った。2群以上の場合は、一元配置分散分析を行った後、各群間でWelchの補正を加えた両側Studentのt検定を行った。時間経過は、二元配置分散分析（way-way ANOVA）を用いて分析し、その後、各タイムポイントについて、2群を比較するWelchの補正を加えた両側Studentのt検定を行った。p < 0.05を統計的に有意とみなした。
各実験群／条件における正確なサンプルサイズ（n）は、各図の凡例に記載されている。サンプルサイズは、表現型の違いが再現可能で統計的に有意であることを確認するために、各群（例えばWT対KO）でn = 2-4の最初の実験を繰り返し、決定した。解析から除外されたデータはない。ほとんどの実験は少なくとも2回繰り返された。c-Relの核局在を含む実験は、さらに2つの異なる測定法（フローサイトメトリーとELISA）を用いて再現された。ある種のB細胞培養実験（補足図5）は、明確に反復された実験（図5）の部分的反復であったため、それ以上反復されなかった。共変量（例えば、性別、動物の年齢、培養中の細胞濃度）は実験群と対照群の間で明示的に一致させたので、無作為化は本研究とは無関係である。異なる株や治療を比較する解析は、各実験の一方的なカットオフ値（フローサイトメトリーゲートなど）を用いて行われるか、機械／コンピューターから生成された明確な値（細胞数、ELISA ODs）を用いて行われたため、盲検化は本研究とは無関係であった。
報告概要
研究デザインに関する詳細は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの入手可能性
本研究の結果を裏付ける全てのデータは、論文、その補足情報、ソースデータファイルで入手可能である。追加情報があれば、リクエストに応じて提供する。ソースデータは本論文とともに提供される。
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謝辞
本研究は、NIH/NIAIDからの研究助成金、R01AI117890、R01AI085568およびU19AI109962、ならびにNIH/NHLBIからの機関NIHトレーニング助成金、T-32 HL007013の支援を受けて行われた。Zheng Luo博士とJacqueline Dieter博士の専門的技術サポート、Gregory Barton博士（UC Berkeley）、Manuela Raffatellu博士（UC San Diego）およびJason Cyster博士（UCSF）のマウス提供、Frances Lund博士（UAB）のHAベイトに感謝する。さらに、フローサイトメトリーの技術支援をしてくれたCalifornia National Primate Research Center (UC Davis)のTracy Rourkeと、動物の世話と飼育をしてくれたUC DavisのTRACSスタッフに感謝する。
著者情報
著者メモ
ニコール・バウムガース
現職： Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, W. Harry Feinstone Molecular Microbiology and Immunology, 615 N Wolfe St, E4135, Baltimore, MD, 21205, USA.
著者および所属
カリフォルニア大学デービス校（米国）免疫学大学院グループ
ジョナサン・ラム（Jonathan H. Lam）、ニコール・バウムガース（Nicole Baumgarth
カリフォルニア大学デービス校免疫学・感染症センター（米国・デービス
ジョナサン・H・ラム＆ニコール・バウムガース
米国・カリフォルニア大学デービス校・病理学・微生物学・免疫学教室
ジョナサン・H・ラム & ニコル・バウムガース
貢献
J.H.L.は実験の計画と実施、データ解析、原稿執筆を行った。N.B.は資金獲得、実験計画・監督、データ解析、原稿執筆。
コレスポンディング・オーサー
Nicole Baumgarthまで。
倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature Communications誌は、Martha Alexander-Miller氏、および匿名の他の査読者の方々の本研究の査読への貢献に感謝いたします。査読ファイルはこちら。
追加情報
出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
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転載と許可
この記事について
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Toll様受容体を介した炎症は、B細胞を保護的な抗ウイルス濾胞外応答へと導く。Nat Commun 14, 3979 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39734-5
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2022年11月01日受領
2023年6月27日受理
2023年7月5日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-023-39734-5
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