抗生物質カクテルが初期ブロイラー鶏の腸内細菌群集、バリア機能、免疫機能に及ぼす影響

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雑誌 抗生物質 第13巻 第5号 10.3390/antibiotics13050413
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抗生物質カクテルが初期ブロイラー鶏の腸内細菌群集、バリア機能、免疫機能に及ぼす影響

https://www.mdpi.com/2079-6382/13/5/413

著者：Waseem Abbas 1,Ruichen Bi 1,Muhammad Dilshad Hussain 2,3,Alia Tajdar 4,Fangshen Guo 1,Yuming Guo 1,andZhong Wang 1,*ORCID
1
中国農業大学畜産科学技術学院動物栄養国家重点実験室、北京100093、中国
2
中国農業大学植物防疫学院植物検疫病害虫監視管理研究室（MARA）、北京100193、中国
3
貴州大学農業学院農業微生物学重点実験室、貴陽550025、中国
4
中国農業大学植物防疫学院昆虫行動・無害化管理重点実験室、北京100193、中国
*
著者
Antibiotics 2024, 13(5), 413; https://doi.org/10.3390/antibiotics13050413
投稿受理：2024年3月23日 2024年3月23日／改訂：2024年4月23日／受理：2024年4月28日／発行：2024年4月30日
(この論文は特集「動物における抗生物質の使用と抗菌薬耐性」に属しています。）
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概要
本研究では、抗生物質カクテルが初期ブロイラーの腸内微生物組成、機械的バリア構造、および免疫機能に及ぼす影響について検討した。生後1日齢の健康な雄ブロイラー雛に、広域抗生物質カクテル（ABX；ネオマイシン、アンピシリン、メトロニダゾール、バンコマイシン、カナマイシン、各0.5 g/L）をそれぞれ7日間および14日間、飲料水に添加するかしないかを決定した。16S rRNAの塩基配列を決定した結果、ABX処理により盲腸では相対的なファーミキューテス属、分類不能のラクリスピラ科、分類不能のオシロスピラ科、ルミノコッカス属、分類不能のルミノコッカス科の存在量が有意に減少し、回腸では相対的なファーミキューテス属、ラクトバチルス属、バチルス属の存在量が有意に増加した、 しかし、14日間のABX投与により、回腸と盲腸の豊富度（Chao指数とACE指数）と相対的腸球菌数が有意に増加し、回腸のバクテロイデーテス属、プロテオバクテリア属、シアノバクテリア属、腸球菌レベルが相対的に濃縮された。また、14日間のABX投与は、小腸の絨毛の高さ（VH）と陰窩の深さ（CD）とともに、腸の重量と長さを有意に減少させ、血清のLPS、TNF-α、IFN-γ、IgGレベル、および腸粘膜のDAOとMPO活性を著しく上昇させた。さらに、ABXの長期使用は、回腸の杯細胞数とともに、オクルディン、ZO-1、ムチン2遺伝子の発現を有意に低下させた。さらに、14日間ABXを投与した鶏は、7日間ABXを投与した鶏や無処置の鶏に比べて盲腸内の酢酸、酪酸、イソ酪酸含量が低かった。スピアマンの相関分析によると、減少した潜在的善玉菌は腸の健康に関連する指標と正の相関があり、増加した潜在的病原株は腸の炎症や腸の傷害に関連するパラメータと正の相関があった。以上のことから、ABXの長期投与は、抗生物質耐性菌の増加を引き起こし、腸内細菌叢異常を誘発し、腸の形態学的発達を遅延させ、腸管バリア機能を破壊し、初期ニワトリの免疫反応を撹乱した。本研究は、無菌あるいは抗生物質処理したニワトリに糞便微生物叢を移植することにより、腸内の特定の有益な細菌の機能をさらに調べるための信頼性の高い下等細菌ニワトリモデルを提供するものである。
キーワード：抗生物質カクテル；初期ブロイラー鶏；腸内細菌叢；腸管バリア機能；免疫

  1. はじめに
    健康な寿命を維持するために、腸内微生物は代謝と免疫のホメオスタシスを維持し、病原体から身を守る上で重要な役割を果たしている [1,2,3]。微生物群集が宿主と共生することで、ホメオスタシスが維持され、免疫応答が制御される [4]。しかし、微生物の共生異常は、身体機能の調節障害や疾病を引き起こす可能性がある。ニワトリでは、複雑な腸内恒常性が腸内細菌叢によって制御されており、腸内組織の形態学的および免疫学的発達が同時に関与している [5]。さらに、抗生物質の成長促進剤は、食物の消化と動物の健康を改善し、同時に微生物疾患の抑制を助けるために、何十年もの間、飼料添加物として投与されてきた[6]。家禽飼料中の抗生物質は、飼料効率と成長成績を高め、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Clostridium perfringens）[7]、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）[8]、大腸菌（Escherichia coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）[9]などの腸内細菌感染レベルを最小限に抑えることが実証されている。しかし、AGPsや抗生物質の長期的かつ無差別的な使用は、いくつかの有害な健康影響や細菌の変化をもたらし、抗菌薬耐性の一因となり、常在菌や病原性細菌微生物にまで及ぶ可能性がある [10,11]。さらに、抗生物質カクテルは、クローディン、オクルディン、ZO（zonula occludens）などのタイトジャンクションタンパク質を破壊する。これにより腸管透過性が亢進し、「リーキーガット」とも呼ばれる。[12]. 別の研究では、マウスに抗生物質カクテルを補充すると、シグナル伝達経路のダウンレギュレーションによって腸内細菌叢と免疫関連遺伝子に悪影響を及ぼし、マウスの幼少期に自然リンパ球3（ILC3）に影響を及ぼし、炎症につながる[13]。AGPsを食事から補給すると、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）をはじめ、胃腸内の善玉菌の大部分を占める乳酸菌、ビフィズス菌、連鎖球菌などのグラム陽性菌の生息数が大幅に減少する一方 [14]、サルモネラ菌やカンピロバクターなどのグラム陰性菌の増殖は増加する。アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾールを含む抗生物質カクテルは、マイクロバイオームと代謝の変化を引き起こすため、広く用いられている。マウスモデルにおいて、抗生物質カクテルの投与は、盲腸における腸内細菌叢の構成（放線菌、バクテロイデーテス、疣贅菌に属する微生物の除去など）、炎症反応、短鎖脂肪酸（SCFA）を有意に変化させ、腸の成熟に悪影響を及ぼすことが示されている［13,17,18］。しかし、早期の予防的抗生物質カクテル投与が腸内細菌叢と疾病抵抗性に及ぼす影響については、ブロイラーにおいてさらなる調査が必要である。本研究では、抗生物質カクテル（ネオマイシン、アンピシリン、メトロニダゾール、バンコマイシン、カナマイシンを含む）の飲水投与期間がブロイラーの腸内細菌叢組成および免疫機能に及ぼす影響を評価することを目的とした。

  2. 結果
    2.1. 抗生物質カクテル処理が腸の長さ、体重および内臓指数に及ぼす影響
    表 1 に示すように、CC 群と比較して、ABX を 7 日間投与した AC 群および 14 日間投与した BC 群のブロイラーは、7 日齢の平均体重および 14 日齢の平均体重にほとんど有意差が認められなかった。さらに、ACおよびBCの臓器指数（肝臓、脾臓、囊胞）は14日目でも対照群と有意差を示さなかった。しかし、十二指腸の長さ（p = 0.001）と重さ（p < 0.001）、回腸の重さ（p < 0.001）、全小腸の長さと重さ（p < 0.001）は、7日間または14日間のABX投与によって有意に減少した。さらに、空腸重量および総小腸重量の顕著な減少は、7日間よりも14日間のABX投与後のニワトリで観察されたが、14日齢の空腸長および回腸長には有意差は認められなかった。
    表1. 抗生物質カクテル（ABX）投与がブロイラーの増体重、臓器指数、小腸の長さと重量に及ぼす影響（n = 6）。

2.2. 抗生物質カクテル投与期間が腸管形態学的構造に及ぼす影響
CC群のニワトリと比較して、ABXを7日間または14日間投与すると、14日目には十二指腸、空腸、回腸の絨毛の高さ（VH）（p < 0.001）およびVH/CD比が有意に減少し、空腸では陰窩の深さ（CD）が顕著に増加した（表2）。さらに、14日間ABXを投与したニワトリは、7日間ABXを投与したニワトリに比べて、さまざまな腸管セグメントで絨毛の高さ（VH）が低く（p < 0.001）、回腸のCDが高く（p < 0.001）、空腸と回腸でVH/CD比が低下した（p < 0.001）。
表2. 抗生物質カクテル（ABX）投与が初期ブロイラー（n = 6）の小腸の形態学的構造に及ぼす影響。

2.3. セカル短鎖脂肪酸に対する抗生物質カクテルの影響
14日目に、ABXで7日間および14日間処理したブロイラーの脂肪酸プロファイルへの影響を評価した（表3）。その結果、BC群の盲腸消化管内の酢酸、酪酸およびイソ酪酸の濃度は、対照のCC群およびAC群（ABXを7日間投与）に比べて有意に減少した（p＜0.001）。さらに、BC群のニワトリは盲腸内の酢酸、プロパン酸、酪酸、イソ酪酸およびイソ吉草酸含量が、ABXを7日間投与したニワトリ（AC群）よりも低かった。意外なことに、AC群の鶏は盲腸内の酢酸、プロパン酸、酪酸含量が対照のCC群より高かった（p < 0.001）。
表3. 抗生物質カクテル（ABX）投与がブロイラー（n = 6）の盲腸内容物の短鎖脂肪酸（SCFA）プロファイルに及ぼす影響。

2.4. 免疫機能に対する抗生物質カクテルの影響
表4に示すように、対照のCC群と比較して、ABXを14日間投与すると、血清中のTNF-α（p＝0.001）、IFN-γ（p＝0.033）およびIgGレベルが顕著に上昇し、IgA含量が減少（p＜0.01）したが、AC群の鶏は血清中のIgGレベルが上昇（p＝0.011）し、IgAレベルが減少（p＜0.01）した。さらに、14日目のTNF-α濃度はAC群に比べBC群で高い値（p < 0.001）が観察された。驚くべきことに、ABXを7日間または14日間投与すると、CC群と比較して腸管のTNF-α mRNAレベルが著しく低下した（p = 0.016）。さらに、回腸のIL-1β、IL-8およびIFN-r mRNA量は、対照群と比較して14日間のABX処理によって顕著に減少したが、7日間処理したABX群では有意差は認められなかった。
表4. 抗生物質カクテル（ABX）投与がブロイラー（n = 6）の全身および腸粘膜免疫機能に及ぼす影響。

2.5. 回腸透過性およびバリア関連遺伝子発現に対する抗生物質カクテルの影響
表5に示すように、14日目の血清リポ多糖濃度は、ABX投与群（AC群およびBC群）ではCC群と比較して有意に上昇していた（p = 0.002）。14日目におけるBC群の回腸粘膜のDAO活性は、AC群およびCC群よりも高かった（p = 0.006）。BC群はCC群よりもMPO活性が高く、AC群に比してMPO活性が上昇傾向を示した。
表5. 抗生物質カクテル（ABX）投与がブロイラーの回腸における腸管透過性およびバリア関連遺伝子発現に及ぼす影響（n = 6）。

RT-qPCRの結果、抗生物質カクテルを7日間または14日間飲水投与した場合、14日目のオクルディン、ZO-1およびムチン2の遺伝子発現は、コントロール群と比較していずれも有意に低下した（p＜0.05）。一方、クローディン1のmRNAレベルは、ABX投与14日後に有意に減少した（p < 0.05）が、AC群ではCC対照群と比較して有意差は認められなかった。回腸のFABP-2発現には、抗生物質カクテル投与7日後、14日後ともに有意な影響は認められなかった（p = 0.558）（表5）。
図1に示すように、ABXを7日間投与したニワトリは、14日目に回腸GC数の有意な減少を示し、回腸GC数はABXを14日間長期投与することにより、順次減少した。
抗生物質 13 00413 g001 図1. 抗生物質カクテル（ABX）投与による腸管粘液層および超微細構造への影響。対照群(CC)は、沸騰水のみの基本飼料を給与した場合(A)、ムチンを分泌する細胞で健康な粘液層を示した。一方、ACおよびBCは、それぞれABXを2.5 g/Lの割合で飲料水に添加した基本飼料を7日間および14日間給与した。AC群ではABXがムチンとムチン分泌細胞の超微細構造にわずかな影響を及ぼし（B）、BC群では14日間のABX投与がムチンとムチン分泌細胞の超微細構造の両方に有意な影響を及ぼした（C）。ABXの長期投与により、ムチン分泌細胞は逐次減少した（D）。
2.6. セカル微生物組成に対する抗生物質カクテルの効果
7日目には、腸内細菌叢の操作分類単位（OUTs）、α多様性、β多様性、および組成に、対照群とABX投与群との間で有意差が観察された（図S1）。
14日目には、97％の配列類似性に基づき、3群のケカ内容物から合計4328のOTUが得られた。その中で、195 の共通コア OTU が 3 群で共有され、1011、868、2449 の OTU がそれぞれ CC14、AC14、BC14 群に固有であった（図 2A）。α多様性は7日間および14日間のABX処理によって有意な影響を受けた。ABX処理14日目（AC14およびBC14）のニワトリの盲腸では、Chao指数およびACE指数は対照と比較して有意に増加したが、Shannon指数およびSimpson指数は有意な影響を受けなかった（図2B）。主成分分析（PCoA）では、β多様性はブロイラーの盲腸において3群間で異なる微生物群集を示した（図2C）。さらに、門レベルでは、14日目において、BC14群ではCC14群およびAC14群に比べ、ファーミキューテス属の相対存在量が少ないことが示された（図2D、表S3）。属レベルでは、AC14およびCC14に比べ、BC14群で腸球菌の相対量が有意に増加した。しかし、分類されていないLachnospiraceae、Oscillospiraceae、Ruminococcus torques、および分類されていないRuminococcaceaeは、BC14群では14日目にAC14群およびCC14群と比較して相対存在量の顕著な減少を示した（図2E、表S3）。LEfSe分析によると、BC14群では腸球菌と腸球菌科が有意に濃縮され、AC14群ではオシロスピラレとオシロスピラ科が有意に濃縮された。CC14群では、クロストリジウムとファーミキューテスが豊富であった（図3A,B）。
抗生物質 13 00413 g002 図2. 図2 抗生物質カクテル（ABX）が14日間サンプリング後の糞便微生物叢の組成と機能に及ぼす影響。(A）97％の配列類似性に基づき、3つのグループが共有する操作上の分類単位（OTU）を示すベン図。(B）CE指数（すなわち、i.ACE指数、ii.チャオ指数、iii.シャノン指数、iv.シンプソン指数）で測定した3群間のα多様性。(C）主成分分析（PCoA）を用いて、全グループ（CC14、AC14、BC14）間で異なる微生物群集を測定したβ多様性。門レベル（D）と属レベル（E）の相対存在量は、微生物群集を脱皮している。
抗生物質 13 00413 図3. 抗生物質カクテル（ABX）が糞便微生物叢の細菌分類群に及ぼす影響。(A）LDAスコア（log 10）に基づくABX処理後の腸内細菌叢組成のLEfSe解析。(B）対照群（CC14）における細菌の差と抗生物質投与群（AC14およびBC14）における有意差を示すクラドグラム。
2.7. 回腸微生物組成に対する抗生物質カクテルの影響
生後7日目の時点で、OUTs、α多様性、β多様性、および腸内細菌叢の組成において、CC対照群とABX投与群の間で有意差が観察された（図S2）。14日目には、AI群、BI群、CI群の回腸でそれぞれ1365個、3566個、1308個のユニークなOTUが検出された。97％の配列類似性に基づき、164の共通コアOTUが3群に共有されていた（図4A）。BI群の回腸では、CI14およびAI14よりもChao指数およびACE指数が有意に高かった。しかし、シャノン指数やシンプソン指数には、グループ間で有意差は認められなかった（図4B）。PCoA解析の結果、BI14のβ多様性は他の2群、CI14およびAI14のそれとは異なっていた（図4C）。門レベルでは、ファーミキューテス、バクテロイデーテス、シアノバクテリア、アクチノバクテリア、プロテオバクテリアが優勢であった。14日目のBI14群の回腸では、AI14群およびCI14群と比較して、ファーミキューテス属の相対量が有意に減少し、バクテロイデーテス属、プロテオバクテリア属、シアノバクテリア属の相対量が顕著に増加していた（図4D、表S3）。14日目のクラスおよび属レベルの上位10種の相対存在量をみると、腸球菌はB14で有意に多く、乳酸桿菌およびバチルス属の存在量はAI14およびCI14に比べて有意に減少していた（図4E、表S3）。さらにLEfSE分析では、CI14ではf乳酸桿菌とg乳酸桿菌、AI14ではo桿菌、f桿菌、g桿菌、BI14ではg腸球菌とf腸球菌がより優勢であった（図5A,B）。
抗生物質 13 00413 図4. 図4 抗生物質カクテル（ABX）の14日間サンプリング後の回腸微生物叢（その組成および機能を含む）に対する影響。(A）97％の配列類似性に基づき、3つのグループが共有する操作上の分類単位（OTU）を示すベン図。(B）3群間のCE指数（ACE指数、チャオ指数、シャノン指数、シンプソン指数）によるα多様性。(C）主成分分析（PCoA）を用いた、全グループ（CC14、AC14、BC14）における異なる回腸微生物群集のβ多様性。門レベル（D）および属レベル（E）の相対存在量、微生物群集の門レベルおよび属レベルの上位10種を示す。
抗生物質 13 00413 g005図5. 図5. 抗生物質カクテル（ABX）が糞便微生物叢の異なる分類群に及ぼす影響。(A）LDAスコア（log 10）に基づく抗生物質カクテル投与14日後の回腸微生物叢組成のLEfSe分析。(B)対照群(CI14)における細菌の差異を示すクラドグラムで、抗生物質投与群(AI14およびBI14)では有意差が認められた。
スピアマンの相関係数から、乳酸菌の相対的存在量は小腸の全長および体重、SCFAと有意に正の相関があり、TNF-αと負の相関があることが示された（p < 0.05）。相対的なRuminococcus torquesの存在量は、小腸の全長、糞便中の酢酸、酪酸、絨毛の高さ、回腸の杯細胞数と正の相関（p < 0.05）を示した。未分類のRuminococcaceae、未分類のOscillospiraceae、および未分類のOscillospiraceaeの相対的な存在量は、血清LPS、IFN-γ、およびTNF-αと有意に（p＜0.05）負の相関を示し（p＜0.05）、回腸のZO-1、クローディン1、ムチン2、小腸重量、VH/CD、および杯細胞密度のmRNAレベルと正の相関を示した。腸球菌の相対量は、小腸の長さおよび重量、VH、杯細胞数、VH/CD、糞便SCFAs（酢酸、酪酸、イソ吉草酸、iso-酪酸）濃度、ならびにムチン2およびZO-1のmRNAレベルと有意な負の相関を示した（p < 0.05）。血清中のLPS、IFN-γおよびTNF-αは、腸球菌の相対量と有意な正の相関（p<0.05）を示した（図6）。
抗生物質 13 00413 図6. 糞便微生物叢の相関分析。表現型変数と有意差のある微生物群集の相対存在量との間のスピアマン相関分析（属レベル、n = 6/群）。色とドットの大きさは行内の相関係数を表す。* p < 0.05、** p < 0.01。
3. 考察
抗生物質は、家畜・家禽の病気を予防し成長を促進するために、飼料補助剤や抗感染症薬として畜産業で広く使用されている。しかし、抗生物質カクテルの投与期間が腸の発育、初期鶏のマイクロバイオームと免疫機能に及ぼす影響については不明であった。本研究では主に、抗生物質カクテルを飲料水中に投与し、2週間にわたって初期ブロイラー鶏の腸内細菌叢組成と免疫機能に及ぼす影響を調査した。
その結果、抗生物質カクテルはブロイラー鶏の体重増加や臓器指数（肝臓、脾臓、滑液包）に影響を及ぼさなかった。このことは、抗生物質カクテルを 5 週間投与しても、産卵鶏の産卵率、飼料要求率、平均卵重、卵質に影響を与えなかったと報告した Li ら [19] の先行研究と一致しており、抗生物質カクテル投与が成長成績に有意な影響を与えず、ABX 長期投与でもブロイラーのこれらの臓器に観察可能な変化を誘発しなかったことを示唆している。興味深いことに、ABXを7日間または14日間投与した鶏の小腸では、小腸の長さと重量、絨毛の高さ、VH/CD比がCC対照と比較して有意に減少し、CDは顕著に増加した。さらに、14日間のABX投与では、7日間のABX投与と比較して臓器指数が有意に低下した。同様に、抗生物質カクテルまたは抗生物質成長促進剤投与が腸の長さと重量を顕著に減少させ、ニワトリとマウスの形態をさらに損なう（VHとVH/CD比の低下）ことを示す過去の知見がある[20,21,22,23]。したがって、我々の観察から、ABX投与は腸の形態学的発達を阻害／低下させる可能性があり、腸の発達に対するこれらの阻害作用は、抗生物質カクテルの長期使用によってより深刻になることが示唆された。
血清サイトカインおよび免疫グロブリンレベルは、ブロイラーの全身性免疫応答に関与している。血中のLPS濃度とDAO活性、腸粘膜のMPO活性は、腸管バリア機能を評価する重要な指標であり、動物や家禽の腸管メカニカルバリアの完全性と損傷度を反映することができる。本研究では、ABX添加水を14日間飲用すると、血清中の炎症性サイトカインTNF-αおよびIFN-γ濃度が有意に上昇し、サイトカイン（IL-1β、IL-8、TNF-αおよびIFN-γ）のmRNA量がダウンレギュレートした、 NF-κB、IL-1β、IFN-γ、IL-4、および産卵鶏の回腸におけるIFN-γとIL-4および/またはIL-10の比、あるいはブロイラー鶏の気道（気管および肺）におけるIFN-α、IFN-βおよびIL-22の比が、産卵鶏[19]またはブロイラー鶏の抗生物質カクテル処理後に有意にダウンレギュレートされたことを報告した先行研究者の結果と同様であった[23,24,25]。同時に、ABXを7日間または14日間投与すると、血清中のLPSおよびIgG濃度が著しく上昇し、血清中のIgA含量が低下した。ABXを長期間投与すると、腸粘膜のDAOおよびMPO活性がさらに上昇した。われわれの結果と一致している。[24]は、抗生物質（0.25 g/Lアンピシリンと0.5 g/Lネオマイシン）を飲料水に経口投与すると、抗生物質を含まない対照と比較して、抗体反応（IgM、IgA、IgG）が2～3倍上昇することを観察した。血清中のDAO活性とIgG含量の上昇とともに、炎症性サイトカインであるTNF-αとIFN-γの濃度が上昇したが、これはおそらく免疫系の過剰刺激と高濃度のLPSに起因するもので、血中LPSはABXによって炎症が誘発された腸内のグラム陰性菌に由来するものであった。血清IgAは主に腸に由来し、B細胞を含む腸管免疫系は腸内常在菌や腸内細菌叢由来の代謝産物によって刺激される。通常、炎症を起こした腸は健康な腸よりもIgAの産生が少ないため、血清IgAレベルの低下は、ABXの長期投与によって誘発された腸内常在菌の枯渇や腸粘膜免疫系の損傷によるものかもしれない。したがって、今回の所見から、ABXの長期投与は腸管透過性を亢進させ、腸管粘膜免疫機能を弱め、その結果、全身性の炎症を引き起こす可能性が示唆された。
腸管上皮タイトジャンクション（TJ）バリアとその関連タンパク質（クローディン1、ZO-1、オクルディンなど）は、上皮バリアの損傷を評価するために常に使用されるが、栄養吸収を調節し、腸の完全性と透過性を保護する上で重要な役割を果たしている、 ムチン2は、腸の健康を維持する腸粘膜上皮の保護と潤滑に重要な役割を果たしている [28]。腸内の有益な細菌はムチン2の分泌を促進し、ムチン層を厚くするが、有害な腸内細菌はムチン層を破壊し、腸の透過性を高め、バリア機能を損傷する[28,29]。FABP-2は、腸管バリア上皮細胞の完全性を低下させるバイオマーカーとして機能し、腸管バリア機能の損傷を示している［30］。本研究では、抗生物質カクテルを7日間または14日間飲水投与すると、回腸GC細胞数、オクルディン、ZO-1、ムチン2の遺伝子発現がともに有意に低下した。さらに、クローディン1のmRNAレベルは、ABXを14日間飲用した後に有意に減少したことから、抗生物質カクテルの長期投与は、初期ニワトリにおいて腸のタイトジャンクションバリア機能障害を誘発することが示唆された。我々の知見と同様に、Fengら（2019）[12]は、アンピシリン（1 g/L）、硫酸ネオマイシン（1 g/L）、メトロニダゾール（1 g/L）、およびバンコマイシン（0. 5 g/L）を飲料水に添加したところ、マウスの腸のタイトジャンクションバリアが有意に破壊され、FITC-デキストランに対する腸の透過性の増加、タイトジャンクションタンパク質の発現の減少、ZO-1の形態の変化により実証された。さらに、抗生物質への暴露は、腸内細菌叢の破壊やその他のメカニズムによって、腸のバリア機能に影響を与えた。全身性の炎症は、腸管上皮バリアの完全性や粘液層の厚さと密接な関係がある。我々の知見に基づくと、ABXに長期間暴露されると、保護粘液層が薄くなり、腸管バリア機能が破壊され、腸管透過性が亢進する。これは、おそらく腸内常在細菌叢の剥奪もしくは枯渇（消失）、またはABXによって誘発された腸内細菌叢の生態系の調節不全もしくは腸内細菌叢の乱れが原因であることが示唆される［35、 36] 、それによって腸粘膜免疫が損なわれて腸管感染症にかかりやすくなるか、あるいは腸内エンドトキシンが血流に入るのを促進し、全身性の炎症反応を引き起こす [37] 。抗生物質カクテルは、ブロイラー鶏の腸管上皮バリア機能を破壊し、腸管上皮透過性を増加させる可能性がある。言い換えれば、抗生物質への早期曝露や飲料水中の抗生物質の長期使用は、腸内細菌叢の生態系を乱し、腸粘膜免疫防御機能を低下させ、腸管バリア機能を損ない、腸管透過性を増加させることにより、ブロイラー鶏の様々な疾患のリスクをさらに高める可能性がある。
様々な研究から、腸内細菌叢は腸管上皮バリアの改善、栄養吸収の最適化、病原体のコロニー形成防止および腸内恒常性の維持を通じて、免疫系の発達に重要な役割を果たしていることが示されている[38,39]。成長促進剤として抗生物質を使用すると、特定の微生物種の増殖を促進または抑制することにより、腸内細菌叢の組成が変化することが広く受け入れられているが [14,40]、抗生物質の混合がニワトリ腸内微生物群集の豊かさ（異なる細菌種の数）と均等性（これらの種の分布）に及ぼす影響に関する情報は著しく不足している。本研究では、16S rRNA配列決定により、ABX投与が回腸および盲腸マイクロバイオームのα多様性指数（豊富度）に顕著な影響を及ぼすことが明らかになった、 この結果は、ニワトリにおける過去の知見 [15,23,41,42]とは異なるものであったが、他の研究 [43,44,45]では、抗生物質の補給が、糞便または回腸マイクロバイオームのα多様性指数に顕著な影響を及ぼすことが明らかにされている。相反するデータは、使用された抗生物質の種類と特徴、使用された抗生物質カクテルの組成、抗生物質の添加量と期間、異なる腸管セグメントとサンプリング時点、鶏の年齢、飼料など、いくつかの要因に起因する可能性がある。[14]. ABXの長期投与後に回腸と盲腸の微生物叢の種濃度が増加したのは、抗生物質の長期使用後に回腸と盲腸で抗生物質耐性種が出現したためと考えられる[14,46]。β-ダイバーシティ解析によると、ABXを7日間および14日間投与した場合、回腸および盲腸の群集組成は対照と比較して有意な差を示し、これは抗生物質成長促進剤を投与したブロイラー鶏の結果と一致した [15]。この結果は、抗生物質による成長促進剤を投与したブロイラー鶏の結果と一致している[15]。われわれのデータは、初期鶏に投与したABXカクテルが腸内細菌叢の多様性（構造）を有意に変化させ、この変化はABXの長期使用に伴ってより顕著になることを示していた。
我々の研究では、ABXの長期投与は盲腸において、ファーミキューテス属、分類されていないラクリスピラ科、分類されていないオシロスピラ科、ルミノコッカス・トークス群および分類されていないルミノコッカス科の相対量を有意に低下させたが、エンテロコッカス属の相対量は増加させた。一方、ABXを14日間投与した後の回腸では、ファーミキューテス属、ラクトバチルス属、バチルス属の相対量が有意に減少し、バクテロイデーテス属、プロテオバクテリア属、シノバクテリア属、エンテロコッカス属の相対量が顕著に増加した。我々の観察と同様に、モネンシン、モネンシン-バージニアマイシン、モネンシン-タイロシンで処理したブロイラー鶏は、7日齢、14日齢、35日齢の盲腸で桿菌の減少を示した[43]。飼料中抗生物質とコクシジオスタットコンプレックスは、ブロイラー鶏の盲腸内のルミノコッカス科と乳酸桿菌科の相対的存在量を減少させた [15]。同様に、サリノマイシン（SA）、バシトラシンメチレンジサリチル酸塩（BMD）などの抗生物質処理後にも、ニワトリの盲腸内マイクロバイオームにおける乳酸桿菌属の顕著な減少や低下が観察された[47]、 またはアンピシリンとネオマイシン [24]、バシトラシンメチレンジサリシレート、タイロシンとバージニアマイシン、モネンシンやサリノマイシンなどのイオノフォア [45]、または抗生物質カクテル [23]などの抗生物質投与後にも観察された。さらに、サリノマイシンを補充すると、ガンマプロテオバクテリア属 [48] や腸内細菌科 [15,40,49] などの病原性細菌が増加することが示されている。また、産卵鶏では、抗生物質カクテル処理により、総菌数、Romboutsia、Enterococcus、Aeriscardovia、乳酸菌（回腸チャイム中のLactobacillus delbrueckii、Lactobacillus aviarius、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus agilis）が有意に減少した[19]。対照的に、抗生物質カクテル（1000 IU/mg、ネオマイシン0.5 g/kgおよび1500 IU/mgアンピシリン1 g/kg）投与は、ファーミキューテス門、ルミノコックス科およびラクノスピラ科の相対存在量を増加させ、リケネル科および腸内細菌科を導入した[36]。Adewoleらは、BMDで処理した鳥類はOscillospiralesの存在量が高いことを示した [50]。このような観察結果のばらつきは、おそらく使用した抗生物質カクテルの組成、抗生物質の添加量と期間、サンプリング時点、鶏の年齢、飼料などの違いに起因している。
研究によると、ファーミキューテス門のある種は多糖類の分解と酪酸の生産に関連し、バクテロイデーテス門の種は複雑な炭水化物の分解とコハク酸経路を介したプロピオン酸の合成を担っていることが示されている[51]。ファーミキューテス門は、ニワトリの初期段階において、腸内細胞の成長を促進し、動物のエネルギー収集効率を向上させるために特に重要である [52]。クラスClostridiaに属するRuminococcaceaeは、セルロースとデンプンを分解し、抗炎症特性を持つ酪酸を産生することで知られており、腸の発達、TJタンパク質の発現をアップレギュレートすることによる腸バリア保護、鶏の飼料変換率の向上に寄与する[53,54]。分類されていないOscillospiraceaeとLachnospiraceaeは、腸の健康、生産性、SCFA合成に重要である[55,56]。Lachnospiraceae は、鳥類の成長成績および飼料効率の改善と正の相関があることが確認されている [54]。OscillospiraleとOscillospiraceaeは、酪酸、プロピオン酸、粘液産生に正の相関を示し [57]、Streptococcusを含む病原性細菌の集団には負の相関を示した [50]。バクテロイデスは正常な腸内細菌叢で、SCFAの産生に重要であり、複合糖質の分解や腸炎症の抑制に関与している。プロテオバクテリア門には、潜在的に病原性を持つグラム陰性菌が含まれ、ニワトリの炎症性サイトカインプロフィールと関連している [56] 。腸内細菌科は健康な腸内細菌叢の1％未満である。腸内細菌の存在は腸内の免疫系のバランスを保つために重要であるが、このファミリーの個体数が増加すると、粘膜潰瘍を含む腸疾患により大きな経済的損失につながる可能性がある [49]。シアノバクテリア門は多数の抗生物質耐性遺伝子を持ち、炎症と老化に密接に関係していた [59] 。家禽の二次疾患である腸球菌症の主原因である腸球菌は、世界的な課題となっており、腸の炎症や腸疾患の潜在的なバイオマーカーとして同定されている[60,61,62]が、抗生物質耐性株は鶏の消化管内で頻繁に見つかっている[63,64]。プロバイオティクス乳酸菌種は、腸内病原体の競合的排除 [65,66]、粘膜IgA抗体産生の増強、あるいは局所細胞媒介免疫の活性化と増強 [67]を介して、腸管防御機能を促進する可能性がある。従って、我々の結果は、初期鶏におけるABXの長期投与が有益菌種の増殖を阻害し、病原性細菌、特に潜在的な病原性抗生物質耐性株の増殖を促し、腸内細菌叢のディスバイオシスをもたらしたことを反映している。同時に、潜在的な有益菌の減少は腸の健康に関連する指標と正の相関があり、潜在的な病原性株の増加は腸の炎症や腸の傷害に関連するパラメータと正の相関があることも示された。全体として、早期鶏におけるABXの長期介入は腸の健康に有害であり、これはおそらくABX給餌後の早期鶏の腸における損傷した腸バリア機能と低下した免疫機能に対する合理的な説明を提供する。
腸内細菌叢が宿主に与える大きな影響は、腸内細菌叢の代謝産物や、SCFAs、胆汁酸、アミノ酸、ビタミンなどの微生物叢由来の代謝産物と強く関連している。SCFAは主に腸内細菌による発酵によって産生され、腸細胞の重要なエネルギー源となるほか、腸内病原菌の増殖を抑制し[68,69]、腸の炎症を抑え、TJ形成を変化させることでバリア機能を高める[70,71,72,73,74]など、腸の健康に不可欠な物質である。本研究の結果、ABXで処理したニワトリの糞便内容物中のSCFA、特に酢酸と酪酸の濃度が有意に減少した。同様に、抗生物質カクテルに長期間暴露されるとSCFA産生が減少することが以前の研究で示されている [75]。これはABXによる早期介入によってSCFA産生微生物叢が減少または枯渇し、腸内細菌叢が異常になったためと考えられる[76]。一方、腸球菌の相対的存在量は、糞便中のSCFAs濃度および腸の健康関連指標と有意な負の相関を示したが、腸の炎症および腸の傷害関連パラメータとは正の相関を示した [77]。したがって、ABXによる早期介入は、ブロイラー鶏の糞便内容物中のSCFAs濃度の低下による酸性腸内環境の悪化によって、いくつかの病原性抗生物質耐性菌のコロニー形成を増加させる可能性があることが示唆される。潜在的に有益な腸内菌株の消失と腸内SCFA濃度の低下は、抗生物質カクテルを投与した初期の鶏で観察されたVHおよびVH/CDの減少、回腸GC細胞数の減少、オクルディン、ZO-1およびムチン2 mRNA量の減少、腸管バリア完全性の損傷、腸管透過性の増加および全身性炎症、ならびに腸管粘膜免疫応答の低下について、合理的な説明を提供するかもしれない。
4. 材料と方法
4.1. 倫理声明
本研究に含まれるすべての動物実験は、中国農業大学動物飼育使用委員会（China Agricultural University Animal Care and Use Committee, Beijing, China）の承認を得た（承認AW51112202-1-2）。
4.2. 実験デザイン
商業孵化場（Beijing Arbor Acres Poultry Breeding Company、北京、中国）から合計 90 羽の健康な 1 日齢雄ブロイラーヒナを入手した。これらのひなの体重を測定し、3つの処理区に無作為に割り付けた。各処置群には30羽が含まれ、環境制御された実験動物用アイソレーターに収容された。治療群は以下の通り：無処置の陰性対照群（CC）；1日目から7日目までの1週間、飲料水に抗生物質カクテルを添加した1週間抗生物質投与群（AC）；1日目から14日目までの2週間、飲料水に抗生物質カクテルを添加した2週間連続抗生物質投与群（BC）。室温は孵化後3日間は32～34℃に維持され、徐々に22～24℃に低下した。すべての鳥は最初の24時間は一定の光にさらされ、その後は23時間明期／1時間暗期のスケジュールで飼育された。さらに、ブロイラーの雛は実験7日目にワクチン接種を受けた。 試験期間中、すべての鳥は餌と水に自由にアクセスできた。割り当てられた処置に応じて、鶏は抗生物質不使用またはコクシジウムスタット不使用のペレット状の飼料を与えられた。これらの基礎飼料は、1994年に米国学術会議（National Research Council）が定めた栄養所要量を満たすか、それを上回るように設計されている。基礎飼料の組成と栄養含量の詳細は表S1に示す。
4.3. 抗生物質カクテルの調製
ネオマイシン0.5 g/L（N6386, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA）、アンピシリン0.5 g/L（A5354, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA）、メトロニダゾール0. 5 g/L（M3761, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA）、バンコマイシン0.5 g/L（SBR00001, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA）、カナマイシン0.5 g/L（Beyotine, Shanghai, China）を調製し、飲料水に添加した。
4.4. サンプル採取
サンプリング前に、実験7日目と14日目に体重を記録した。その後、7 日目と 14 日目に、各処置群から 6 羽のブロイラーを無作為に選び、体重を測定し、頸椎脱臼により安楽死させた。翼静脈から採血し、4℃で遠心分離（3000×g、10分間）した後、血清を採取し、分析まで-20℃で保存した。
小腸（十二指腸、空腸、回腸）の重量と長さを記録し、Mahdzvi and Torki (2009) [78]による先行研究に基づき、生体重に対するパーセンテージ（cm/kg）で示した。肝臓、脾臓、ファブリキウス囊の重量を測定し、生体重に対するパーセンテージ（g kg）で表した。その後、回腸の近位端を液体窒素でスナップ凍結し、mRNA 解析のために -80 ℃で保存した。また、十二指腸ループの終点とメッケル憩室の中間地点で採取した、長さ約2cmの十二指腸、空腸、回腸サンプルを採取し、10％中性緩衝ホルマリン溶液で洗浄後、組織学的検査用に10％中性緩衝ホルマリン溶液で一晩固定した。回腸および大腸内容物は無菌的に採取し、マイクロバイオーム解析のために直ちに凍結した。
4.5. 腸管組織形態学的分析
腸管組織形態学（絨毛の高さ（VH）および陰窩の深さ（CD））および杯細胞解析は、前述 [79]と同様に実施した。アルシアンブルー（AB）染色および過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色により、腸内の杯細胞および酸性シアル化ムチンを産生する杯細胞の密度を測定した。各絨毛の杯細胞数を測定し、杯細胞密度を絨毛の高さ1マイクロメートルあたりの杯細胞数として算出した。
4.6. 血清中の免疫グロブリン、サイトカインおよびLPS、ならびに回腸中のDAOおよびMPO活性の測定
血清中の免疫グロブリン（免疫グロブリンG（IgG）およびIgA）、インターロイキン（IL-2、IL-4、IL-6、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターフェロンγ（IFN-γ）などのサイトカインおよびリポ多糖（LPS）のレベルは、ニワトリ専用の酵素結合免疫吸着測定（ELISA）キット（Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co、 Ltd.）を用い、製造者の指示に従った。回腸粘膜のジアミンオキシダーゼ（DAO）およびミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性は、市販のキットを用い、提供者の指示に従って測定した（南京建成生物工程研究所、中国南京市）。
4.7. 定量的リアルタイムPCR
Trizol 剤（Tiangen Biotech Co., Ltd., Beijing, China）を用い、製造者の指示に従っ て回腸組織（50-100 mg）から全RNAを抽出した。NanoDrop 2000 spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて、total RNAの濃度と純度を測定した。その後、PrimeScriptTM RT試薬キットとgDNA Eraser（perfect real time）キット（Takara Biotechnology Co.） 定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）アッセイは、SYBR Premix Ex-Taq診断キット（Takara Biotechnology Co. β-アクチン遺伝子は、OCLN、ZO-1、MUC-2、CLDN-1、FABP-2、IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-8を含む標的遺伝子のmRNAレベルを標準化するための参照遺伝子として機能した。この解析のためのプライマー配列は表S2に示した。各標的遺伝子の発現レベルは、比較サイクル閾値（CT）2-ΔΔCT法 [80]によって正規化した。
4.8. 糞便内容物中の短鎖脂肪酸測定
各レプリケートの凍結糞便消化物サンプル（100 mg）を氷冷滅菌超純水 1.5 mL に溶解・ホモジナイズし、12,000×g、4 °C で 10 分間遠心した。その後、上清1mLをクロトン酸を含む25%(w/v)メタリン酸溶液0.2mLで注意深く希釈した。この混合物を-20℃で24時間インキュベートし、再び4℃で10,000×g、10分間遠心分離してタンパク質の沈殿を除去した。得られた溶液を0.22μmのシリンジフィルターでろ過して精製した。短鎖脂肪酸（SCFA）の分析は、キャピラリーカラム（30m×0.25mm×0.5μm）を装備した島津GC-2014 ATFガスクロマトグラフを用いて行った。キャリアガスにはN2を用いた（12.5 Mpa、18,562 mL/min）。インジェクターと検出器の温度は180℃に維持し、カラム温度は80℃から170℃まで5℃/分の速度で徐々に上昇させた。SCFA濃度は消化物1kg当たりミリグラムで表記した。
4.9. 微生物 DNA 抽出および 16S rRNA シークエンシングと解析
すべての実験グループから採取した糞便消化物サンプル約 250 mg を用いて、EZNA® Soil DNA Kit（Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA）を用い、製造者の指示に従って微生物ゲノム DNA を単離した。全 DNA 濃度とその純度は NanoDrop 2000 spectrophotometer（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて評価し、DNA の完全性は 1%アガロースゲル電気泳動で 5 V/cm の電圧を 20 分間印加して評価した。細菌16S rDNA配列のV3-V4領域は、以前に記載された方法[81]に従って、338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）および806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）プライマー対を用いて増幅した。その後、PCR産物をAxyPrep-DNAゲル抽出キット（Axygen, Union City, CA, USA）を用いて精製し、定量、ホモジナイズし、MiSeqライブラリーの構築に用いた。このライブラリーは、Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, ChinaのMiSeq試薬キットを用いて、Illumina MiSeqプラットフォーム（Illumina, Santa Clara, CA, USA）で配列決定した。未加工のペアエンド配列は、QIIME（Quantitative insights into microbial ecology、V1.17）ソフトウェア[82]を用いて、デマルチプレックスと品質フィルタリングを行った。有効なリードは、類似度97%の操作的分類単位（OTU）にグループ化された。様々な分類レベルでのOTU分類はGreengenesデータベースを利用した。QIIMEソフトウェア[83]を用いて、希少化曲線とα多様性（Chao 1 index、Simpson index、Ace index、Shannon indexを含む）の解析を行った。さらに、主座標分析（PCoA）と部分最小二乗判別分析によりβ多様性を評価し、結果はRパッケージの "vegan "と "ggplot2"（R-V3.4.4）を用いて可視化した。グループ間の微生物群集の差異は、"vegan "Rパッケージで実装されたANOSIMを用いて調べた[84]。グループ間の門レベルから属レベルまでの細菌存在量の差の影響は、線形判別分析効果量（LefSe）分析を用いて決定した（LDAスコア＞4.0、p＜0.05）。ノンパラメトリック因子の統計解析は、クラスカル・ワリス順位和検定 [85] を用いて実施した。
4.10. データ解析
SPSS（バージョン21.0、米国イリノイ州シカゴ）を用いて、一元配置分散分析（ANOVA）に続いてダンカンの多重比較検定を行い、成長成績、腸管形態、遺伝子発現、SCFA含量を分析した。p＜0.05を有意、0.05≦p＜0.10を傾向とみなした。結果は平均値とプールしたSEMで表した。相関はヒートマップパッケージを用いたスピアマンの相関を用いて解析し、p値が0.05未満を有意とみなした。
5. 結論
このことは、腸内細菌叢のα多様性が増加し、ラクトバチルス属やバチルス属のような潜在的に有益な菌株の増殖が阻害される一方で、エンテロコッカス属のような抗生物質耐性の病原菌の増殖が促進されることから明らかである。この変化はSCFAの生成を抑制する結果となり、最終的には腸の形態学的発達の遅れ、腸管バリア機能の破壊、免疫反応の乱れにつながった。さらに、抗生物質カクテルの長期使用は、短期使用よりも腸の健康に有害であった。本研究は、無菌ニワトリまたは抗生物質処理ニワトリに糞便微生物叢を移植することにより、腸内の特定の有益な細菌の機能をさらに研究するための信頼性の高い下等細菌ニワトリモデルを提供する。
補足資料
https://www.mdpi.com/article/10.3390/antibiotics13050413/s1、表S1：実験用基礎飼料の組成と栄養素レベル；表S2：定量的リアルタイムPCRに使用したオリゴヌクレオチドプライマーの配列；表S3： 表S3：抗生物質カクテル（ABX）投与14日後のブロイラーの盲腸および回腸における門および属レベルの細菌群集の相対存在量；図S1：7日間サンプリング後の盲腸微生物叢の組成および機能に影響を及ぼす抗生物質カクテル；図S2：7日間サンプリング後の回腸微生物叢の組成および機能に影響を及ぼす抗生物質カクテル。
著者貢献
構想、Z.W.、W.A.、M.D.H.およびA.T.、方法論、W.A.、M.D.H.およびR.B.、調査、W.A.、A.T.、F.G.およびZ.W.、データキュレーション、W.A.、Z.W.、M.D.H.およびA.T.、執筆-原案作成、W.A、 執筆-原案作成：W.A.、M.D.H.およびA.T.、執筆-査読および編集：W.A.、Z.W.、M.D.H.およびA.T.、可視化：M.D.H.およびR.B.、監修：Z.W.、プロジェクト管理：Z.W.およびY.G.。
資金提供
本研究は、中国国家自然科学基金（32172774）の助成を受けた。
施設審査委員会声明
中国農業大学動物飼育使用委員会、北京、中国（承認AW51112202-1-2）。
インフォームド・コンセント
該当なし。
データ利用声明
本研究で発表された原著論文はNCBIリポジトリで一般公開されている（アクセッション番号 PRJNA1083794）。
謝辞
著者らは、本実験のための優れた研究プラットフォームを提供してくれた中国農業大学畜産生物工学学院郭玉銘家禽科学研究チームに謝意を表する。また、動物管理について有限責任瀘州家禽実験基地に感謝する。
利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。
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著者による© 2024。ライセンシー MDPI, Basel, Switzerland. 本論文は、クリエイティブ・コモンズ 表示（CC BY）ライセンス（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）の条項および条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。
共有と引用

MDPIおよびACSスタイル
Abbas、W.; Bi、R.; Hussain、M.D.; Tajdar、A.; Guo、F.; Guo、Y.; Wang、Z. 初期ブロイラー鶏における腸内細菌群集、バリア機能、免疫機能に対する抗生物質カクテルの影響。Antibiotics 2024, 13, 413. https://doi.org/10.3390/antibiotics13050413.

AMAスタイル
アッバスW、ビR、フサインMD、タジダーA、グオF、グオY、ワンZ.抗生物質カクテルの早期ブロイラー鶏における腸内細菌群集、バリア機能、免疫機能への影響。Antibiotics. 2024; 13(5):413. https://doi.org/10.3390/antibiotics13050413

シカゴ/チュラビアンスタイル
アッバス、ワシーム、ビ・ルイチェン、ムハンマド・ディルシャド・フセイン、アリア・タジダー、グオ・ファンシェン、グオ・ユーミン、ワン・ジョン。2024. 「抗生物質カクテルがブロイラー初期鶏の腸内細菌群集、バリア機能、免疫機能に及ぼす影響」Antibiotics 13, no. 5: 413. https://doi.org/10.3390/antibiotics13050413

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