腸管B細胞はNASH微生物群/抗原非依存的に代謝性T細胞活性化をライセンスし、IgA-FcRシグナルによって線維化に寄与する

腸管B細胞はNASH微生物群/抗原非依存的に代謝性T細胞活性化をライセンスし、IgA-FcRシグナルによって線維化に寄与する

https://www.journal-of-hepatology.eu/article/S0168-8278(23)00325-2/fulltext

エレナ・コツィリティ 2
バレンティーナ・レオーネ 2
スヴェーニャ・シュエレ 3
フランク・タッケ
クェンティン・M・アンスティ
マティアス・ハイケンヴァルダー（Mathias Heikenwalder
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オープンアクセス公開日：2023年5月22日DOI:https://doi.org/10.1016/j.jhep.2023.04.037
PlumX メトリクス
ハイライト

腸管B細胞はNASHマウスモデルで代謝的に活性化され、マウスおよびヒトNASHでは増加している

NASHの腸内B細胞は、腸内細菌叢とは無関係に活性化される

B細胞はTCRシグナルとは無関係に消化管内の代謝性T細胞活性化を促進する

MoMFs/SAMacsのIgA分泌とFcRγシグナルは、マウスおよびNASH患者の肝線維化を悪化させる

遺伝的および治療的なB細胞異常は、NASHにおけるT細胞駆動性の炎症および線維化を抑制した。
要旨
背景と目的
非アルコール性脂肪肝炎（NASH）から線維化、肝細胞癌（HCC）への進展は、自己攻撃性T細胞によって悪化する。腸-肝軸はNASHに寄与しているが、そのメカニズムやNASHによる線維化および肝癌への影響はまだ不明である。我々は、NASH、線維化、NASH誘発性肝細胞の発生における消化管B細胞の役割について調査した。
方法
C57BL/6J野生型（WT）マウス、B細胞欠損マウス、免疫グロブリン欠損マウス、トランスジェニックマウスに、異なるNASH食（例えば、コリン欠損高脂肪食、CD-HFD）またはチョウ食を6ヶ月または12ヶ月間与え、その後NASH、線維化、NASH誘発HCCの評価および分析を行った。特定の病原体を持たないWTマウスとμMTマウス（消化管にのみB細胞を含む）にCD-HFDを与え、抗CD20抗体で処理した後、NASHと線維化を評価した。NAFL、NASH、肝硬変の患者さんの組織生検サンプルを分析し、免疫グロブリンの分泌と臨床病理学的特徴との相関を調べました。マウスとヒトの免疫細胞について、肝臓と消化管組織でフローサイトメトリー、免疫組織化学、scRNA-Seq解析を実施した。
結果
活性化腸管B細胞はマウスおよびヒトのNASHサンプルで増加し、抗原特異性や腸内細菌叢とは無関係にNASHを誘導するために代謝性T細胞の活性化を許諾した。遺伝的あるいは治療的に全身あるいは胃腸のB細胞を減少させると、NASHと肝線維化を予防あるいは回復させることができた。IgAの分泌は、IgA-FcRシグナル軸を通じてCD11b+CCR2+F4/80+CD11c-FCGR1+肝ミエロイド細胞を活性化し、線維化の誘導に必要だった。同様に、NASH患者では、活性化腸管B細胞数が増加し、IgAレベルと活性化FcRγ+肝ミエロイド細胞、および肝線維化の程度に正の相関が見られた。
結論
腸管B細胞とIgA-FcRシグナル軸は、NASHを治療するための潜在的な治療標的である。
影響と意義
非アルコール性脂肪肝炎（NASH）は、慢性的な炎症性疾患であり、世界で3番目に多いがん関連死因である肝細胞がん（HCC）につながる可能性があります。現在、肝細胞癌の死亡リスクと相関し、大きな医療負担を伴うこの進行性疾患に対する有効な治療法はありません。現在、固形がんの中でも、特に肝細胞がんでは、発症率と死亡率がほぼ同じであることから、NASHのような腫瘍形成の素因となる慢性疾患に対する根治的な治療法を見つけることが重要となっています。
我々はこれまで、NASHがT細胞などによって悪化する自己増殖性疾患であることを明らかにしてきた。そのため、B細胞が疾患の誘発と進行に関与している可能性があると考えられました。今回の研究により、B細胞はNASHの病態において、自己攻撃的なT細胞の活性化と、分泌された免疫グロブリン（IgAなど）による単球由来マクロファージの活性化による線維化の進展に関与しており、2つの役割を担っていることが明らかになりました。さらに、B細胞の不在がHCC発症を予防することを示すことができた。
B細胞内在性シグナル伝達経路、分泌型免疫グロブリン、およびB細胞と他の免疫細胞との相互作用は、炎症と線維化に対するNASHのコンビナトリアル治療における潜在的ターゲットである。

図解抄録
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キーワード
NAFLD
NASH
肝細胞癌
線維化
B細胞
腸-肝臓軸
略号
αCD20
分化クラスタ20標的抗体
AID
活性化誘導型シチジンデアミナーゼ
ALD
アルコール性肝障害
ALT
アラニントランスアミナーゼ
BCR
B細胞受容体
BMDMs
骨髄由来マクロファージ
CCL2
ケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド2
CCl4
四塩化炭素（Carbon tetrachloride
CCR2
C-Cモチーフケモカイン受容体2
CD163
クラスター分化163
CD25
分化クラスタ25（Cluster of differentiation 25
CD3
分化クラスタ3(Cluster of differentiation 3)
CD36
分化クラスタ36（Cluster of differentiation 36
CD44
分化クラスタ44
CD45
分化クラスター45
CD69
分化クラスタ69
CD8
分化クラスタ8（Cluster of differentiation 8
CDA-HFD
コリン欠乏性アミノ酸特異的高脂肪食
CD11b
分化クラスタ11b
CD11c
分化クラスタ11c
CD-HFD
コリン欠乏性高脂肪食
コル-IV
コラーゲンタイプIV
CTLA4
細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（Cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4
CXCR6
C-X-Cモチーフケモカイン受容体4
CXCR6
C-X-Cモチーフケモカイン受容体6
DC
樹状細胞
EAE
実験的自己免疫性脳脊髄炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis
ELISA
酵素結合免疫吸着法（Enzyme-Linked immunosorbent assay
FACS
フローサイトメトリー活性化セルソーティング
FCER1G
Fcε受容体Ig、FcRgamma
FCGR1
Fcγレセプター1（Fc-gamma
FCS
子牛胎児血清（Fetal calf serum
GF
ジャームフリー
GP73
ゴルジ蛋白質73
HCC
肝細胞がん（Hepatocellular carcinoma
H&E
ヘマトキシリン＆エオシン
1H-NMR
プロトン核磁気共鳴
ICAM-1
細胞間接着分子1（Intercellular adhesion molecule 1
IHC
免疫組織化学（Immunohistochemistry
IL-1β
インターロイキン1β
IL-2
インターロイキン2（Interleukin 2
IL-6
インターロイキン6（Interleukin 6
IFNγ
インターフェロンγ
IgA
免疫グロブリンA
IgD
免疫グロブリンD
IgM
免疫グロブリンM
IgG
免疫グロブリンG
ILCs（アイエルシーエス
自然リンパ系細胞
KC
クッパー細胞
LFA-1
リンパ球機能関連抗原1（Lymphocyte function-associated antigen 1
Ly6C
リンパ球抗原6複合体、C1遺伝子座
Ly6G
リンパ球抗原6複合体、G遺伝子座
mAb
モノクローナル抗体
MCSF
マクロファージコロニー刺激因子1
MHCI
主要組織適合性複合体、クラスI
MHCII
主要組織適合性複合体、クラスII
MoMFs
モノサイトデリバリーマクロファージ（Monocyte-derived macrophage
NAFL
非アルコール性脂肪肝（Non-Alcoholic fatty liver
NAFLD
非アルコール性脂肪性肝疾患
NAS
NAFLDアクティビティスコア
NASH
非アルコール性脂肪性肝炎
ND
普通食
NKT
ナチュラルキラーT細胞
PD1
プログラム細胞死タンパク質1
PDGFRβ
血小板由来成長因子受容体β（Platelet-derived growth factor receptor beta
p-HCK
リン酸化HCK
p-SYK
リン酸化SYK
RT
室温
SAMacs
スカーアソシエーションマクロファージ
ScRNA-セック
シングルセルRNAシークエンス
SEM
平均値の標準誤差
SI
小腸
TMs
組織内単球
TNF
腫瘍壊死因子（Tumor necrosis factor
t-SNE
t分散型確率的近傍埋込法
UMAP
次元削減のための一様な多様体近似と投影法
WD
ウエスタンダイエット
WD-HTC
トランス脂肪酸を含む欧米食
WT
野生型
ファンディング
M.H. 欧州研究会議（ERC）コンソリデーター助成金（HepatoMetaboPath）、SFBTR179プロジェクトID 272983813、SFB/TR 209プロジェクトID 314905040、SFBTR1335プロジェクトID 360372040、SFB 1479（プロジェクトID．441891347）、Wilhelm Sander-Stiftung、Rainer Hoenig Stiftung、Horizon 2020助成（Hep-Car）、Research Foundation Flanders（FWO）助成30826052（EOS Convention MODEL-IDI）、 Deutsche Krebshilfeプロジェクト70113166および70113167、がん研究におけるドイツ・イスラエル協力（DKFZ-MOST）およびHelmholtz-Gemeinschaft、Zukunftsthema「免疫学と炎症」（ZT-0027）です。M.H.はA.W.とともに、HI-TRONからのシードファンディングの支援も受けた。E.K.は、GRK 1482の支援を受けた。V.L.はHorizon2020の助成金（Hep-Car）、ERC-CoG（HepatoMetaboPath）から資金を得た。D.P.とE.K.は、Helmholtz Future topic Inflammation and Immunologyの支援を受けました。S.S.は、ドイツ・イスラエル・ヘルムホルツ国際研究校の支援を受けた： Cancer-TRAX（HIRS-0003）は、ヘルムホルツ協会のイニシアティブ・ネットワーキング基金からの助成金です。Q.M.A.とOGは、LITMUS（Liver Investigation: Testing Marker Utility in Steatohepatitis）プロジェクトの支援を受けています。このプロジェクトは、欧州連合のInnovative Medicines Initiative（IMI2）プログラムから、グラント契約777377に基づいて資金を得ています。この共同事業は、欧州連合の研究・イノベーションプログラムHorizon 2020とEFPIAからの支援を受けています。QMAは、ニューカッスルNIHRバイオメディカル研究センターからも支援を受けています。N.C.H.は、Wellcome Trust Senior Research Fellowship in Clinical Science（参考文献：219542/Z/19/Z）の支援を受けています。A.W.は、DFGからCRC 1292を通じて資金援助を受けています。Z.A.は、ドイツ卓越戦略（EXC2151）390873048、SFB1454、SFBTR237、GRK2168のDFGから資金提供を受けた。A.D.Gは、European Respiratory Society/short term fellowship (to A.D.G)、Else Kröner Memorial Stipendium (to A.D.G), Werner Otto Stiftung (to A.D.G), Erich und Gertrud Roggenbuck Stiftung (to A.D.G), Hamburger Krebsgesellschaft Stiftung (to A.D.G) からサポートを受けた。E.E.はDayTwoとBiomXの科学的共同創設者であり、Hello Inside、Igen、Aposenseのアドバイザーとして、この仕事とは関係のないテーマで活躍しています。
利益相反
E.K.はSpringer Natureに雇用され、M.J.W.はRoche Diagnostics GmbHに雇用され、D.P.はNovo Nordiskに雇用されています。著者らは、この仕事に関連する利益相反を宣言していない。
詳細については、添付のICMJEディスクロージャーフォームをご参照ください。
著者貢献度
E.K & V.L.原稿執筆、実験構想・作業、S.S.生体内実験作業、O.G.実験作業、ヒト組織の組織学的解析、H.L. 実験作業マウス＆マイクロバイオーム解析、M.J.W. 実験作業生体内、 H.H. 実験作業、 S.B. 無胚葉マウスの実験、 J.H. 生物内実験及び免疫細胞解析、 D.I. 組織スライド3D画像、 L. Z.メタボローム解析、A.S-P.免疫細胞の解析とシングルセル解析、R.G.マウスデータのバイオインフォマティックシングルセル解析、T.OC.マウス実験と原稿執筆のサポート、A.G.かえでマウス実験とサンプル提供、A.S.実験とサンプル提供、Y.S.マウスデータのバイオインフォマティックシングルセル解析、M. G.B. 生体内実験およびフローサイトメトリー解析、C.R. t-SNE免疫細胞解析、D.P. 生体内実験およびフローサイトメトリー解析、R.O. バイオインフォーマティック解析および実験、P.R. 生体内実験およびフローサイトメトリー解析、M.R. 生体内実験およびフローサイトメトリー解析、N.R. 手術専門およびヒトサンプル供与、M.E.H.生体内実験、M. F.生体内実験作業、N.Y.生体内実験作業、J.J.生体内実験作業、I.S.生体内実験作業、C.F.生体内実験作業＆フローサイトメトリー解析、R.M. 実験作業＆試料提供、M.F. 実験作業＆試料提供、S.J.W. 実験作業 フローサイトメトリー解析、S.C. 実験作業＆ヒト試料転写物解析、J．ヒトサンプルのトランスクリプトーム解析、P.R. ヒトサンプルのトランスクリプトーム解析、C.K. マウスサンプルの組織学的解析、T.K. in vivo実験作業＆フローサイトメトリー解析、A.L.L. 実験作業、S.K. in vivo実験作業＆フローサイトメトリー解析、P.S.B. マイクロビホーム解析、 K.S. 組織学解析でサポートした、 M.H. t-sne 免疫細胞解析のサポートをした、 K.R. バイオインフォマティクス解析、H.Z.バイオインフォマティクス解析のサポート、A.W.実験作業、N.M.生体内実験作業、T.L.概念入力およびサンプル提供、M.V.生体内実験作業およびサンプル提供、H.A. 実験作業、R.F.概念入力・マイクロバイオームおよびIgA分析、O.P. 生体内実験作業、R.R. 生体内実験作業、N.H. 生体内およびフローサイトメーターによる実験、S． H.H.生体内実験、A.M.生体内実験サポート、P.C.概念入力・生体内実験サポート、M.C.バイオインフォマティクス解析、A.G.ヒトサンプル提供、C.T.メタボローム解析、E.E.概念入力・バイオインフォマティクス解析、A.E.概念入力・マウス提供・生体内外実験； Z.A. 概念的な入力、マウスの提供、in vivoおよびin vitroでの実験作業、D.H.概念的な入力、無菌マウスの提供、in vivoでの実験作業、F.T.概念的な入力、ミエロイド細胞の分析、in vivoでの実験作業のサポート、Q.A.ヒト組織および血清サンプルを用いた実験作業、ヒトNASHコホートの提供、M.H.概念的なサポートと入力、E.K.とV.Lとの原稿執筆および本スタディーを監督しました。
はじめに
世界的な肥満の増加により、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）が流行しています。この疾患は、メタボリックシンドロームと強く関連し、肝脂質の過剰蓄積、肝細胞障害、代謝異常によって特徴付けられる進行性の疾患です(
1
,
2
). NAFLDは、単純な脂肪症と、炎症性・自己増殖性の非アルコール性脂肪肝炎（NASH）に分類される( 3 )。
3
,
4
)であり、T細胞による壊死性炎症(
5
). NASHと同時に発症する線維症は、肝硬変へと進行し、肝不全や肝がんのリスクを高めることがあり、後者は世界でがん関連死の3番目に多い原因となっています(
6
). 肝細胞がんは、すべての原発性肝がんの中で最も頻度の高いがん種である(
7
は、NAFLDの病理学的背景と密接に関連している(
2
). したがって、線維化は、NASH患者における肝細胞癌死亡リスクの上昇と相関するため、疾患の転帰を予測する上で重要な因子となる(
8
,
9
). また、NASHによる肝細胞癌の患者の一部は、重度の線維化・肝硬変を伴わずに肝細胞癌を発症することが報告されている(
2
,
10
). そのため、肝細胞癌のサーベイランスを含め、NASHに起因する医療費負担は相当なものである(
11
,
12
,
13
).
腸-肝臓軸はNAFLDの病態に重要な要素である(
14
). 動物実験では、腸内細菌叢の変化が脂肪症に直接関与することが示された(
15
)、NASH(16)、線維化(
17
)、肝臓がん(
18
). さらに、損傷関連分子パターンや代謝物関連分子パターンによって媒介される無菌性炎症(
19
,
20
)、NASHにおける肝障害の重要なドライバーと考えられている。さらに、マクロファージはNASHの肝障害と線維化に重要な役割を担っており、単球由来マクロファージ（MoMF）は、肝星状細胞を直接活性化できる炎症誘発性の表現型を示す(
21
).
また、二次リンパ系臓器の形質細胞から分泌される血清免疫グロブリンA（IgA）値は、NAFLD患者において上昇した(
22
,
23
)、線維化の進行の独立した予測因子となりうる(
22
). ヒトやマウスのNAFLDにおける慢性炎症と線維化は、肝臓に常在するIgA産生プログラムデスリガンド1陽性細胞によって、効率的な抗肝癌免疫応答が抑制されることを伴っていた(
24
). また、NASHのマウスモデルでは、腸由来の微生物因子によって活性化された肝内B細胞が肝炎や線維化に寄与していることが示された( 25 )。
25
一方、別のマウス研究では、肝内制御性B細胞が疾患発症に関与していることが明らかにされた(
26
). さらに、さらなる研究により、ALDやNAFLD/NASHなどの肝疾患におけるIgAの役割が示されている(
27
). しかし、NASHにおけるB細胞の正確な役割や起源、T細胞の活性化や線維化の開始・進展へのB細胞の関与は、依然として不明である。本稿では、マウスおよびヒトの腸管CD20+ B細胞およびその免疫グロブリン分泌特性がNASHの病態に関与していること、末梢性IgA+およびMoMFs-FcRγシグナルがNASHによる肝線維化に共に寄与することを報告する。
材料と方法
材料と方法は、補足情報および補足CTAT表でご覧いただけます。
データおよびコードの利用可能性
本論文で報告した選別された腸管マウスCD20+細胞およびCD19+細胞のバルクRNAシーケンスのアクセッションナンバーはGSE190691である。マウス肝臓および腸のscRNA-Seqの解析データは、それぞれGSE131834およびGSE190204で提出されています。ヒトのscRNA-Seqシーケンスのアクセッション番号は、GSE136103、GSE190487、GSM5724573です。さらに詳しい情報、リソースや試薬のリクエストは、リードコンタクトであるM. Heikenwälder教授にお願いします（対応します）。
研究成果
B細胞はマウスのNASHおよびNASH駆動型肝硬変に必要である。
NASHにおける全身B細胞の役割を調べるために、C57BL/6J野生型（WT）同腹子とB細胞欠損（JH-/-）マウス(
28
)に、NASHを誘発するコリン欠乏高脂肪食(CD-HFD)を6ヶ月または12ヶ月間摂取させた。既報の通り、WT CD-HFDマウスはNASH（約6ヶ月後 - 100％浸透率）とHCC（ダイエット開始後12ヶ月で約30％の発症）を発症し、ヒト疾患のいくつかの臨床特徴を再現した(
29
). JH-/- CD-HFDマウスは、生後約9ヶ月で正常なチャウを与えたコントロール（ND）よりも有意に体重が増加し、ダイエット開始後12ヶ月でWT CD-HFDマウスと同じ体重に達した（図S1B）。JH-/- CD-HFDマウスは肝脂肪症を欠き、6ヶ月後（図1A、1B、S1A）および12ヶ月の食餌後（図S1G、S1H）にNAFLD-活性スコア（NAS）が低くなりました。WT CD-HFDマウスで典型的に見られる高い血清アラニントランスアミナーゼ（ALT）値は、JH-/- CD-HFD血清では6ヶ月（図1CおよびS1A）および12ヶ月（図S1G）で低くなりました。血清コレステロールおよび肝トリグリセリドレベルは、両時点でWT CD-HFDマウスよりもJH-/-で低く（図S1AおよびS1G）、肝大脂肪滴が大幅に減少していた（図1D）。腹腔内糖負荷試験（IPGTT）では、WT CD-HFDとは逆に、JH-/- CD-HFDマウスのインスリン応答は正常であることがわかった（図S1C）。フローサイトメトリー解析では、JH-/- CD-HFDの肝臓ではWTに比べてCD3+およびCD8+ T細胞が著しく減少し（図S1E）、CD19+ B細胞が存在しないことが確認された（図S1F）。JH-/- CD-HFD肝臓切片の免疫組織化学分析（IHC）により、CD3+細胞の同様の減少が観察された（図S1D）。肝CD8+ CD62L-活性化T細胞TNFおよびIFNγ産生CD8+細胞は、F4/80+細胞およびMHCII+凝集体の染色によって見られるように、骨髄系細胞と同様に減少した（図1E〜G）（図S1D）。P62+、切断型カスパーゼ3+細胞、PD1+細胞は、WT CD-HFD肝臓ではWT NDと比較して増加したが、JH-/- CD-HFD肝臓では有意に低いままであった（図S1D）(
3
,
30
).
図1B-cellsはNASHとその後のHCC発症をサポートする。(A) 6ヶ月間飼育したWT ND、CD-HFDおよびJH-/- CD-HFD雄マウス由来の肝臓切片の代表的H&E染色。(B）NAFLDスコア（NAS）評価（n=8）。(C) 血清ALT値(n=9)。(D）6ヶ月間飼育した雄マウスの肝臓切片の代表的なスダンレッド分析。(E-G）6ヶ月間飼育した各遺伝子型／グループの肝臓由来の（E）肝CD8＋CD62L＋およびCD8＋CD62L-T細胞、（F）CD8＋TNF＋細胞、（G）CD8＋IFNγ＋細胞について、6ヶ月間飼育したオスマウス（n＝5）の肝臓フローサイトメトリー分析の総数（絶対数）の定量（数字は％表示）である。(H）B細胞枯渇抗体抗CD20（αCD20）で処理したWT CD-HFD雄マウスの処理スキーム。(I）肝臓CD19＋およびCD20＋細胞、ならびに（J）ラミナプロプリア小腸CD19＋およびCD20＋細胞のフローサイトメトリー解析の定量化、コントロールおよびWT CD-HFD αCD20処理雄性マウスの比較（n≧3）。全てのマウスは6ヶ月間飼育した。(K）肝臓切片の代表的なH&E染色。(L）マウスのNAS評価（n=5）。(M）雄マウス（n=5）の血清ALT値。(N）コントロールおよびWT CD-HFD αCD20処理雄マウスの肝臓切片の代表的なスダンレッド染色である。(O）雄マウスにおける肝トリグリセリドの解析（n≧3）。(P-S）コントロール処理およびWT CD-HFD αCD20処理雄マウス（n≧3）を比較したフローサイトメトリー解析の（P）肝CD8＋CD62L＋細胞およびCD8＋CD62L-細胞の定量化；（Q）肝CD8＋TNF＋細胞および（R）CD8＋IFNγ＋細胞の定量化。(S) WT CD-HFD腫瘍およびJH-/- CD-HFDの非罹患肝臓の代表的なH&E染色およびゴルジ蛋白73（GP73）、コラーゲン-IVおよびKi67のIHC染色；12ヶ月のCD-HFDマウスから。スケールバーは、H&E：500μm（左）および100μm（右）；GP73：100μm；コラーゲン-IV：100μm；Ki67：100μm（矢印で描かれた陽性肝細胞）を表す。(T) CD-HFDを12ヶ月間与えたWTマウスとJH-/-マウスの非腫瘍（NT）と腫瘍（T）をまとめたグラフ（記号は個々のマウスを表すため、マウス数を示す）、データはフィッシャーの正確検定で分析した。すべてのデータは、平均値±SEMで示される。統計解析は、非対称T-テストまたはANOVAを用いて行った。表示されたスケールバーは100μmを表す。
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NASHにおけるB細胞の重要性を評価するため、CD-HFDを4ヶ月間与えたNASHのWTマウスにおいて、抗CD20モノクローナル抗体（αCD20 mAb）を用いて治療的にB細胞を枯渇させた（図1H）。治療前に、同一のマウスコホートのマウスにおいて、食事開始後4ヶ月のNASHを確認した（図S1JおよびK）。CD-HFDマウスでB細胞枯渇を6週間行い、肝臓、小腸（パイエルパッチを除去）（図1I、J）、脾臓、血液（図S1N、S1O）で枯渇の効果を評価した。遺伝子モデルと一致して、WT CD-HFD αCD20 mAb処理マウスはNASHを欠き（図1K、LおよびS1I）、ALT血清レベルはコントロール（アイソタイプコントロール処理または未処理のWT CD-HFD マウス）と比較して著しく低下した（図1MおよびS1I）。WT CD-HFD αCD20 mAb処理マウスは、終点での体重が低く（図S1L）、肝大脂肪滴の強い減少を示した（図1N）。それに伴い、肝トリグリセリドおよび血清コレステロールが減少した（図1OおよびS1I）。IPGTTにより、αCD20 mAb処理マウスでは、WT CD-HFDと同様にインスリン応答が低下していることがわかった（図S1M）。B細胞枯渇により、肝細胞のCD3+、CD8+（図S1P、S1Q）、CD8+ CD62L-、CD8+ TNF+およびCD8+ IFNγ+細胞の集積が減少した（図1P-R）。IHCは、B220+細胞の効率的な枯渇を確認し、WT CD-HFD αCD20 mAb肝臓においてF4/80+細胞とMHCII+細胞凝集体の減少を示した（図S1Q）。
メタボローム解析により、B細胞非存在下のCD-HFD処理マウスの代謝肝プロファイル（例えば、トリグリセリド）が遺伝的および治療的に変化していることが判明した。NASH肝臓で通常見られる、いくつかの脂質およびコレステロール代謝遺伝子の肝機能低下(
3
,
20
,
29
)が、JH-/- CD-HFDマウスでは阻止された（図S1R）。また、プロトン核磁気共鳴（1H-NMR）分光分析により、B細胞の不在と相関する肝臓脂質の変化が確認された（図S1S）。
食事開始12ヶ月後のJH-/-CD-HFDマウス60匹のうち、肝がんを発症したマウスはいなかった。一方、WT CD-HFDマウスは肝細胞を30%(
20
,
29
)であった（図1S, T）。これらのデータから、NASHおよびNASH駆動型肝細胞癌の発症と維持に、全身性のB細胞応答が重要な役割を担っていることが示された。
小腸のB細胞応答は、マウスのNASHを誘発するのに十分である。
NASHおよび肝線維化における腸管B細胞の役割を調査し、さらに裏付けるために、B細胞上に膜結合型IgMを発現しない第2のB細胞欠損マウスモデル（μMTマウス）を利用した。 μMTマウスは、μ定常領域鎖ではなくα定常領域鎖を用いることでIgMまたはIgD重鎖を発現しないIgA+ B細胞を選択的に発現する（31）。
31
)、消化管にのみ発生する。CD-HFD μMTマウスはコントロールよりも有意に体重が増加し（図S2B）、ダイエット開始後6ヶ月（図2A、2B、S2A）および12ヶ月（図S2O、S2P）でWT CD-HFDと同等のNASHレベルを発現した。μMT CD-HFDマウスの血清ALTおよびコレステロールレベルは、6ヶ月および12ヶ月でWT CD-HFDと同様であった（図2C、S2A、S2O）。蓄積した肝脂質滴と肝トリグリセリドの増加は、両時点でμMT CD-HFDマウスに観察された（図2D、S2A、S2O）。μMTのCD-HFDマウスでは、TNF+およびIFNγ+の発現が上昇した活性化肝内CD8+T細胞の増加が認められ（図2E〜2G）、インスリン応答が損なわれた（図S2C）。濾胞性B細胞の欠如（図2H、IおよびS2F）のため、μMT CD-HFD脾臓は構造化された建築（例えば、胚中心）を欠いていた（図S2D）。μMT CD-HFDマウスの小腸のフローサイトメトリー分析では、JH-/- CD-HFDマウスとは逆に、IgA+ B細胞が確認された（図S1G）。WT CD-HFDマウスは、NDコントロールと比較して小腸の回腸でIgAレベルの増加を示した；μMT CD-HFDマウスは、IgAが検出されないCD-HFD JH-/-小腸とは逆に、小腸で低レベルのIgAを示した（図2J、2K）。μMTの糞便にはIgA+でコーティングされた細菌が多く、IgAの腸管への局所分泌を示す（図S2K）。WT-CD-HFDの小腸で見られたIgMおよびIgG2bの増加（図S2H）は、JH-/-マウスおよびμMTマウスの両方で検出されなかった。IHC分析では、μMT CD-HFDマウスでは肝内B細胞の欠如（図S2L）、JH-/- CD-HFDマウスとは逆にND（図S2L）と比較してF4/80+細胞およびMHCII+凝集体の増加（図S2L）が認められた。μMTのCD-HFDでは、WTのCD-HFDと同様に、P62+細胞と切断型カスパーゼ3+細胞が増加した（図S2L）。さらに、μMT CD-HFD肝臓の転写解析では、脂質およびコレステロール代謝に関与するいくつかの遺伝子の発現が変化していることが示された（Fig. S2N）。
図2腸管B細胞はNASHを引き起こすのに十分である。(A) 6ヶ月間飼育したWT ND、WTおよびμMT CD-HFD雄マウスの肝臓切片の代表的H&E染色。(B）NAS雄性マウス（n=6）。(C）雄マウスの血清ALT値（n≧6）。(D) 肝臓切片の代表的なスダンレッド染色。(E）肝CD8+CD62L+およびCD8+CD62L-T細胞、（F）CD8+TNF+細胞および（G）CD8+IFNγ+細胞のフローサイトメトリーの絶対定量（n＝4）。(H）雄マウス（n＝3）の脾臓CD19＋、B220＋およびIgA＋細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーにより評価した。(I）腸間膜リンパ節雄性マウス（n=3）のCD19+、B220+およびIgA+細胞の割合、フローサイトメトリーにより評価した。(J）雄マウス（n≧3）の小腸組織のIgAレベル、ELISAにより測定した。(K）6ヶ月の雄マウスの小腸切片の代表的なIgA染色（上段：スケールバー200μm、下段スケールバー：100μm）。(L）6ヶ月のμMT CD-HFDおよびμMT CD-HFD αCD20処理雄マウスの肝臓切片の代表的なH＆E染色である。(M）雄マウスの肝臓切片の代表的なスダンレッド染色である。(N）雄マウスのNAS評価（n＝4）。(O）雄マウスのALT値（n=4）。(P）ラミナプロプリアCD20+IgA+細胞のフローサイトメトリー分析定量化。(Q）肝CD8+CD62L+細胞およびCD8+CD62L-細胞および（n=4）の絶対定量化。(R）肝CD8＋TNF＋細胞および（S）CD8＋IFNγ＋細胞、WT ND、μMT CD-HFDおよびμMT CD-HFD αCD20処理雄マウスの比較（n＝4）。(T）WTおよびμMT CD-HFD腫瘍（12ヶ月食下）におけるゴルジタンパク質73（GP73）およびKi67の代表的なH＆EおよびIHC染色である。スケールバー H/E：500μm（左）および100μm（右）；GP73：100μm；Ki67：100μm（矢頭で描かれた陽性肝細胞）。(U）CD-HFDを12ヶ月間与えたWTおよびμMTマウス（n≧60）の非腫瘍（NT）および腫瘍（T）を要約したグラフ。記号は個々のマウスを表す。データはフィッシャーの正確検定で解析した。(V）12ヶ月のWTおよびμMT CD-HFDマウス（n≧3）における結節のサイズの定量化。すべてのデータは、平均±SEMとして示される。統計解析は、不対T-testを用いて行った。スケールバーは100μmを表す。
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μMTマウスの肝臓炎症に対する感受性が腸内のB細胞に起因するかどうかを調べるために、NASHが確立したマウスにCD-HFDを4ヶ月間与えて後者を枯渇させた（図S2Q、S2R）。 αCD20-抗体処理はμMT CD-HFDマウスのNASHを逆転し（図2L、2N、S2S）、対照- IgG処理マウスよりも終点の重量がわずかに低い（図S2T）ことが示された。血清ALTおよびコレステロール値は有意に低下し（図2OおよびS2S）、大きな脂質滴は強く減少し（図2M）、肝トリグリセリドおよび血清コレステロールは、αCD20抗体処理マウスにおいて有意に低下した（図S2S）。CD-HFDμMTマウスの小腸のフローサイトメトリー解析では、μMT ND飼育マウスと比較してCD20+ IgA+ B細胞が有意に増加し、NASHによる消化管B細胞蓄積を強調したが、これはαCD20抗体処理により減少した（図2P、S2U）。さらに、フローサイトメトリー分析により、αCD20処理したμMT CD-HFD飼育マウスにおいて、肝CD3+、CD8+（図S2W）、CD8+ CD62L-、およびCD8+ TNF+およびCD8+ IFNγ+細胞の強い減少が認められた（図2Qから2S）。この観察は、IHC（図S2V）によっても裏付けられ、コントロールと比較して、αCD20処理したμMT CD-HFDマウスにおけるF4／80＋細胞およびMHCII＋凝集体の減少を明らかにした。
注目すべきは、CD-HFDを12ヶ月間与えた60匹のμMTマウスのうち、図1S（同じコントロールコホート）にも記載されているように、WT CD-HFDマウスとは逆に肝臓腫瘍（HCCではない；発生率は5％以下）を示し、WTよりも小さい結節サイズを持つマウスは3匹だけだった（図2T〜2V）。したがって、食事誘発性NASHの発症には腸管B細胞で十分であり、しかも腫瘍の発生は強く抑制されると結論づけられる。
腸管B細胞とCD8+T細胞との相互作用
我々は、パイエル板を除去した小腸のマルチパラメーターフローサイトメトリー解析を行い、NASHと相関する腸管B細胞集団を同定した。以前のデータと同様に、NDと比較してWT CD-HFDではB細胞の増加が見られた。特に、μMT CD-HFDマウスの小腸では、B細胞（CD45+細胞の約10%）がCD19+の発現を低下させ、CD20+の発現は維持していた（図3A、図3B）。さらに、WT CD-HFDではNDと比較して、より多くのIgMhighIgDhighおよびIgMlowIgDhigh B細胞が確認された。予想通り、μMT CD-HFDマウスはIgMおよび/またはIgDを発現するB細胞を欠いた（図3C）。CD20+MHCII+およびCD20+IgA+のB細胞は、NDと比較してWT CD-HFDマウスでより多く認められたが、μΤCD-HFDでは後者は増加しなかった（図3D、3E）。
図3B-細胞は代謝的に活性化され、NASHマウスの固有層でT細胞とクラスターを形成する。データはすべて小腸を表す。(A-J) WT ND、WT CD-HFDおよびμMT CD-HFD雄マウス（≧4）の小腸ラミナプロプリアを比較したフローサイトメトリー解析の代表的疑似カラープロットおよび定量化である： (B）CD20+CD19+、CD20+CD19-、CD20-CD19-細胞、（C）IgD+IgM+、IgD+IgM-、IgD-IgM+細胞、（D）CD20+MHCII+細胞、（E）CD20+IgA+細胞、（F）CD20+IgA+MHCII+細胞、のパーセンテージ、 (G）IgA+細胞とCXCR4+細胞の代表的な疑似カラープロット、（H）CD20-IgA+CXCR4+細胞の割合、（I）IgA+B220-CD20-細胞、（J）IgA+B220-CD20-CXCR4+細胞．(K) B細胞を表示する雄マウス（n=9）のフローサイトメトリー解析から得られたT-distributed stochastic neighbour embedding（opt-SNE）グラフの自動最適化されたパラメータ。左側のopt-SNEプロットは、CD20、B220およびIgAのスケーリングされた発現を示す。(L）T細胞を表示する雄マウス（n＝9）のフローサイトメトリー解析からのOpt-SNEグラフ、CD8α、CD44およびPD1のスケールされた発現を示す。(M）B220＋細胞およびCD8＋細胞の小腸ラミナプロプリア染色の代表的な高解像度共焦点顕微鏡および3D再構成画像（黄色の部分は、B220＋細胞およびCD8＋細胞の接触点を示す）、および（N）WT NDおよびWT CD-HFD におけるB220＋／CD8＋相互作用細胞のクラスター（視野、FOVあたりの相互作用細胞の数）の定量化（n＝3、各マウスのN＝8 FOV）。(O、P）WTおよびμMT CD-HFDから分離した小腸ラミナプロプリアFACSソートした（O）CD20+細胞または（P）B220+細胞とWT NDとで有意に異なる免疫系関連遺伝子および代謝プロセス関連遺伝子のヒートマップをzスケール値で示す。(Q）雄マウス（食餌6ヶ月）由来の小腸から単離された全生存B細胞のフローサイトメトリー定量化（n＝4）。(R）紫色光の照射により緑色から赤色に変化する光変換性蛍光Kaedeタンパク質を有するトランスジェニックマウスモデルKaedeマウスを用いて行ったフローサイトメトリーの説明図：赤色に染色された免疫細胞は小腸から肝臓への移動を示し、代わりに緑色に染色された細胞は他の器官からの移動免疫細胞。(S) 左側は、フローサイトメトリー解析による肝臓CD3+CD19-細胞（n≧5）の頻度。右側は、ND、CD-HFDおよびWD-HTCマウス（n≧5）におけるKaede赤または緑の肝臓B220＋CD19＋細胞のフローサイトメトリー分析からの幾何学的平均蛍光強度（gMFI）である。(T）CD44＋CD8＋細胞からの脾臓CD8＋CD69＋、CD8＋CD25＋、CD8＋PD1＋、CD8＋CXCR6＋およびCD8＋CTL4＋細胞のフローサイトメトリー解析のパーセンテージ；健康マウスから単離した脾臓T細胞、Dynabeads（抗CD3／CD28）で刺激し、WT NTまたはWT CD-HFDから分離した腸B細胞と24または48時間共培養をした。追加の処理として、DynabeadsとLFA-1ブロッカー、またはICAM-1ブロッカー、またはMHC-Iブロッカーを加えた（n=4）。すべてのデータは、平均値±SEMで示される。統計解析は、対にならないT-testを使用して行われた。
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CD20+IgA+MHCII+細胞は、WT CD-HFD小腸で有意に増加し（図3F）、これらの細胞の活性化が潜在的に促進されていることを示唆した。CD20+IgA+CXCR4+細胞もWT CD-HFD小腸で上昇したが、μMT CD-HFDマウスでは検出されなかった（図3G、HおよびS3A）。CXCR4発現は長期プラズマ細胞の生存を促進するので、μMTマウスの小腸のB細胞はプラズマ芽細胞やプラズマ細胞ではないことがほとんどである(
32
). フローサイトメトリーでは、WT CD-HFD小腸ではIgA+およびIgA+B220-CD20-細胞の増加が認められたが、μMT CD-HFDでは、この集団はWT NDと同じレベルにとどまった（図3Iおよび図S3B）。IgA+B220-CD20-CXCR4+ は、WT CD-HFDでは有意に増加したが、μMT CD-HFDでは有意に少なかった（図3J、S3C）。
フローサイトメトリーt-distributed stochastic neighbour embedding（t-SNE）データ解析により、調査した3つのグループ間でB細胞集団の多様性が認められた（図3K）。我々は以前、CD8+ T細胞がNASHおよびNASH-HCCの重要なメディエーターであることを明らかにした（3, 4）。そこで、この細胞集団に対する腸管B細胞の影響の可能性を検討した。フローサイトメトリー解析により、μMT CD-HFD小腸ではWT CD-HFDおよびNDコントロールと比較してより多くのCD8+ T細胞が同定され（図S3F）、WTおよびμMT CD-HFD小腸ではCD8+ CD44+およびCD8+ PD1+細胞の増加が認められた（図S3DとS3E）。さらに、サイトメトリーt-SNE解析では、3群間でCD8+、CD44+、PD1+のT細胞集団のクラスタリングに多様性が見られた（図3L）。
WT NDおよびCD-HFD飼育マウスの小腸におけるB-T細胞相互作用の3D高解像度解析では、B220+ B細胞がCD8+ T細胞と共局在していた。NDコントロールと比較して、WT CD-HFD腸では有意に多くの相互作用する細胞クラスター（黄色）が観察された（図3Mおよび3Q）。また、WT CD-HFDマウスの絨毛内部では、B220+細胞とCD8+細胞の相互作用の上昇が観察され、これらの細胞の移動性表現型が示唆された（図S3IおよびS3J）。STRING(ストリング)
33
)パスウェイの濃縮とImmuNET(
34
) による機能的関係ネットワークの解析により、WT ND、WT CD-HFD、μMT CD-HFD小腸のCD20+およびB220+選別細胞から取得したRNA-Seqデータから、抗原提示とBCRシグナル、IgA産生とB細胞の活性化と分化、脂質代謝に関する遺伝子の発現がND対照と比較してWTおよびμMT CD-HFDともに増加していることがわかった（図3O、3P、S3K、S3L.
NASH時に腸管B細胞およびT細胞が腸から肝臓に移動するかどうかを調べるために、Kaedeトランスジェニックマウス(
35
)に、CD-HFDとWD-HTFの2種類のNASH食を摂取させ、全細胞で光変換性蛍光タンパク質を構成的に発現させた(
36
)を6ヶ月間摂取させた。6ヶ月後、かえでマウスの消化管組織を光変換して細胞を緑から赤に標識し、消化管から他の組織への細胞の直接追跡を可能にした（図3R）。肝臓組織のフローサイトメトリー解析により、肝臓に移動する腸管B細胞が明らかになり、NDコントロールと比較して、NASH罹患肝臓（赤い細胞）ではB220+ CD19+ MHCII+ B細胞が少なかった（図3S）。注目すべきは、腸から移動する肝臓のCD3+細胞（赤い細胞）がND対照と比較して有意に増加したことである（図3S）。これは、NASH時に腸から肝臓に多くのT細胞が移動することを示唆している。
次に、NASH罹患マウス由来の腸管B細胞がCD8+ T細胞の活性化を促進するかどうかを評価することを目的としました。それを評価するために、NDマウスまたはCD-HFDマウス由来の腸管B細胞をNDマウス由来の脾臓CD44+ CD8+ T細胞と共培養し、抗CD3/CD28抗体を用いてTCR活性化をトリガーした。CD-HFD腸のB細胞と培養したCD8+ T細胞は、活性化マーカーCD25とCD69がNDマウスのB細胞と培養したものより24時間後に有意に高いレベルを示し、48時間後には増加した。同様に、これらの細胞は、ND由来のB細胞と培養したT細胞と比較して、自己攻撃性T細胞の特徴であるCXCR6、PD1、CTLA4の高い発現量を示した（図3T）。
B細胞による自己攻撃性がTCR-MHC-Iまたは細胞間相互作用を必要とするかどうかを調べるために、MHCIまたはLFA-1およびICAM-1をブロックした。実際、MHC-Iではなく、ICAM-1またはLFA-1をブロックすると、生体外でB細胞によるT細胞活性化が抑制された（図3-T）。観察されたB細胞誘導性T細胞活性化が抗原依存的であるかどうかを調べるために、オバルブミン由来の抗原のみを認識するトランスジェニックTCRを保有するOT1 T細胞を用いた。OT1 T細胞は、NASHマウスの消化管由来のB細胞によって活性化され、抗原に依存しない代謝活性化の概念を支持した（図3M）。これらの結果を総合すると、NASH条件下では、腸管B細胞はICAM-1、LFA-1を介してCD8+ T細胞の過活性化を誘導するが、TCR:MHCIは誘導せず、抗原に依存しない活性化機構であることが示された。
これらのデータは、NASH罹患マウスの小腸における代謝および活性化B細胞プロファイルの変化を示唆するものである。さらに、NASH感染マウスの小腸のB細胞は、CD8+ T細胞との直接的な細胞間相互作用を通じて、抗原に依存せず、共刺激分子LFA-1とICAM1を介して安定化したB-T細胞相互作用を必要とするクラスターを形成することが示唆されました。最後に、我々のデータは、腸内B細胞およびT細胞がNASH罹患マウスの腸から肝臓に効率的に移動できることを示す。
免疫グロブリンAはマウスのNASHを誘発するのに十分である
免疫グロブリンの分泌がNASH発症に必要であるかどうかを調べるために、正常なB細胞の発達を示しながら分泌型免疫グロブリンを欠くマウス（IgMiマウス(
37
,
38
))にCD-HFDを6ヶ月間摂取させた。まず、これらのマウスが多発性硬化症モデルマウスなどで正常な免疫反応を起こすことができるかどうかを検証した。その結果、IgMiマウスを実験的アレルギー性自己免疫性脳脊髄炎にかけると、WTと同等の重症度で神経障害を発症し（図S4A）、ミエリン・オリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）ペプチドにさらされるとIgMi T細胞がWT T細胞と同じレベルのIL-2を生成した(
39
)を産生した(Fig. S4B)。このように、これらのマウスにおける適応的な免疫応答は、ほぼ無傷である。WTのCD-HFDマウスと比較して、肥満の発生は同様であるにもかかわらず、IgMiはCD-HFD時にNASHの兆候を欠いた（図4A-CおよびS4C）。血清ALTおよびコレステロール、肝脂質沈着および肝トリグリセリドは、IgMi CD-HFDマウスにおいて有意に減少した（図4D、4E、およびS4C）。B220+細胞およびCD19+細胞の数は変化しなかったが（図4I、S4D）、CD3+、CD8+ F4/80+、およびMHCII+細胞はIgMi CD-HFD肝臓で有意に減少した（図S4DおよびS4E）。さらに、P62+および切断型カスパーゼ3+細胞は、WT CD-HFDと比較して、IgMi CD-HFDマウスで減少した（図S4D）。さらに、CD8+、CD8+CD62L+、CD8+CD62L-細胞、およびCD8+TNF+およびCD8+IFNγ+細胞は、IgMi CD-HFDマウスにおいて著しく少なかった（図4F〜H）。注目すべきは、小腸のフローサイトメトリー解析により、IgMiおよびWT CD-HFDマウスでは、コントロールと比較してCD20+、CD20+MHCII+およびCD8+細胞が同様に増加し、IgMiマウスはCD20+IgA+細胞の欠損レベルを示した(
37
,
38
)、予想通りであった(図4L)。重要なことは、WT ND、WT CD-HFD、IgMi CD-HFDマウスの小腸におけるB細胞およびT細胞の免疫細胞相互作用の3D高解像度化（黄色）により、IgMiマウスではB220+細胞とCD8+細胞間の相互作用が欠如していたことである（図4J、4K）。WT CD-HFD腸の絨毛内部で観察されたB220+とCD8+の相互作用の上昇は-NDコントロールと比較した場合-IgMi CD-HFD腸では観察されませんでした（図S4F）。驚くべきことに、IgMiマウスは、CD-HFDのWTまたはμMTマウスとは逆に、小腸の免疫細胞において、免疫細胞活性化の下流のシグナル伝達（特にBCRシグナル）を仲介する非受容体チロシンキナーゼであるリン酸化SYK（p-SYK）の減少を示した（図S4G）。
図4B細胞による免疫グロブリン分泌はNASH発症に必須である。(A）6ヶ月間飼育したWT ND、WT CD-HFDおよびIgMi CD-HFDマウスの肝臓切片の代表的なH&E染色像である。(B）食餌開始後6ヶ月の雄マウスのNASおよび（C）体重測定（n≧5）。(D)血清学的ALT雄性マウス(n≧5)。(E)肝臓切片の代表的なスーダンレッド。(F-I）雄マウス（n≧4）の（F）肝総CD8＋CD62L＋およびCD8＋CD62L-細胞、（G）総CD8＋TNF＋細胞、（H）総CD8＋IFNγ＋細胞、（I）総CD19＋細胞についてのフローサイトメトリによる定量化である。(J）雄マウスにおけるB220+/CD8+相互作用細胞の肝クラスターの定量化（WTコントロールはn=3、IgMi CD-HFDマウスはn=2、各マウスのFOVはn=8）。(K）B220+細胞およびCD8+細胞の小腸ラミナプロプリア染色の代表的な高解像度共焦点顕微鏡および3D再構成画像（黄色の部分はB220+細胞とCD8+細胞の細胞間コンタクトを示す）。(L）小腸CD20+細胞、IgA+細胞、MHCII+細胞、CD8+細胞のフローサイトメトリー解析の定量化である。すべてのデータは、平均値±SEMで示した。統計解析は対にならないT-testで行った。スケールバーは100μmを表し、または指示通りである。
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全体として、これらの観察結果は、IgAとIgMの分泌が、代謝的に活性化したB細胞によるT細胞の活性化をサポートするために重要であり、NASH誘導に重要な役割を果たすことを示唆しています。腸管膜結合型IgAは、NASH罹患マウスの小腸におけるB-T細胞相互作用の強度と質に影響を与えるかもしれない。
NASHによる線維化はIgAとFc受容体のシグナル伝達に依存する
NASHのレベルはWTマウスとμMT CD-HFDマウスの両方で同じであったが、腫瘍の発生率はμMTマウスで著しく低かった（図2参照）。そこで、腫瘍の発生に先行して線維化が進行している可能性があることから、これらのマウスで線維化の進行状況を調査した。さらに、別のマウス系統であるAIDg23s(
40
)と呼ばれる体細胞超変異が減少したマウスを用いた。肝切片のシリウスレッド、コラーゲンIV、PDGFRβ染色（図5A、5B、S5A-C）、異なるモデルマウスの肝臓から得られた線維化遺伝子の転写解析（図S5G）、血清ヒドロキシプロリン濃度（図S5H）から、線維化はWTおよびAIDg23s CD-HFD マウスのみで認められたが、JH-/-, μMT, IgMi, IgA-/-では認められなかった (
41
)（分泌型IgAを欠く）、AID-/-(41)（分泌型IgAを欠く）、AID-/-(
42
)（クラススイッチングを欠く）CD-HFDマウスや、αCD20抗体で治療したWT CD-HFDマウスでは認められなかった。
B細胞の存在と末梢への免疫グロブリン分泌機能（例えば、IgA）と線維化との間に正の相関があることを立証した（図5MおよびS5E、S5F）ので、NASH関連線維化（例えば、WT CD-HFD）に関連する肝免疫細胞区画を特定しようと考えた。フローサイトメトリーによるいくつかの肝ミエロイド集団のスクリーニングにより、CD45+Ly6G-CD11c-F4/80+CD11b+Ly6C+細胞が同定され、単球由来マクロファージ（MoMF）として分類された(
21
)が、WT線維化NASH罹患マウスでは増加した（図5C）。MoMFsとNASHによる線維化が他のNASHモデルでも相関しているかどうかを調べるため、ウェスタンダイエット（WD）およびコリン欠乏性アミノ酸特異的高脂肪食（CDA-HFD）でも肝免疫細胞集団のシングルセルRNA-Seq (scRNA-Seq) 分析を実施(
43
)モデルでも解析した。調査した異なるNASH食は、肝線維化重症度の異なるスペクトルを表していた（図5D、S5C）。ScRNA-Seq解析により、他の免疫細胞集団の中でも、線維化の程度と数や性質が関連するMoMFsが特定されました（図5E、5F、S5T）。MoMFsクラスター1、3および6は、NASHをきっかけとする線維化の文脈でWDまたはCDA-HFDにおいて有意に増加した（図5G、5HおよびS5U）。MoMFsクラスターで観察されたシフトは、2つの食餌間の線維化の程度を反映して、食餌に依存した（図S5S）。注目すべきは、他の免疫細胞集団ではなく、MoMFsが、すべてのNASH食においてFcR遺伝子およびFcRシグナル活性化に関与する遺伝子を強く発現し、Fcgr1、およびFos遺伝子の転写が増加し、特に重度の線維化マウスグループCDA-HFD由来のMoMFsで増加した（図5IおよびS5U）。この観察は、肝臓切片のFCGR1 IHCによるタンパク質発現によって裏付けられた（図5N、5O）。
図5IgAを介してマクロファージで活性化されたFcRシグナルは、NASHの肝線維化を促進する。(A) WT NDおよびWT、JH-/-、WT αCD20処理、μMT、IgMi、AIDg23sマウス（いずれも6ヶ月間CD-HFD下）の肝臓からのシリウスレッド染色代表画像。(B）上記マウス群における線維化の程度（軽度0.5〜2％；中等度2〜5％；重度5％以上）で分けた線維化発生率の割合である。(C）CD-HFD下のWT NDおよびWT、JH-/-、WT αCD20処理、μMT、IgMiマウスの総CD45+Ly6G-Cd11c-F4/80+CD11b+Ly6C+細胞の肝臓フローサイトメーター分析の定量化（n≥3）。(D）4ヶ月のWT ND、WT CD-HFD、WT WD-HTFまたはCDA-HFDからの肝臓のシリウスレッド定量化（n≥4）。(E）4ヶ月ND、WD-HTF及びCDA-HFD（全てWT）飼育マウスの肝臓からCD45＋細胞を選別し、10倍シングルセルRNA-seq実験を行った（n≧2）；4ヶ月ND、WD-HTF及びCDA-HFDの肝臓からシングルセルRNA配列したCD45＋細胞を可視化した代表的な均一多様体近似及び投影（UMAP）プロットは、3グループ間で個々の細胞の空間位置を青い色で示す。(F) FACSで選別されたCD45+の免疫細胞集団を可視化したUMAPプロット。表示された同定免疫細胞集団は、単球由来マクロファージ（MoMF）/単球、クッパー細胞（KC）、樹状細胞（DC）、好中球、T細胞、B細胞、プラズマB細胞、ダイビング細胞、NKT細胞、自然リンパ球（ILC）（G）すべてのマウスグループの単一細胞RNA配列CD45+細胞の細胞クラスター（括弧内の細胞数を報告する伝説）を可視化するUMAPプロット。(H）4ヶ月のND、WD-HTFおよびCDA-HFDマウス（n≧2）の食事実験条件（1、3、6）下で主に分化したMoMFsクラスターの相対パーセンテージを示す存在量プロットである。(I）NDマウス（n≧2）に対するCDA-HFDまたはWDを比較した、最も関連するMoMFsクラスターにおけるFcgr1のmRNA発現を示すダブルバイオリンプロットである。(J）CD-HFDを与えた6ヶ月のWTおよびFcRγ-/-雄マウスの肝臓切片の代表的なH＆E染色である。(K）CD-HFDを与えた6ヶ月のWTおよびFcRγ-/-雄マウスの肝臓切片の代表的なシリウスレッド染色と定量化（n＝4）。(L）CD-HFDを摂取させたWTおよびFcRγ-/-雄マウスの総CD45+Ly6G-Cd11c-F4/80+CD11b+Ly6C+細胞の肝臓フローサイトメーター解析の数値化（n=4）。(M）CD-HFD雄マウスにおける血清学的IgAおよびシリウスレッド陽性を示す相関図（n≧3）。(N）肝臓切片のFCGR1染色の代表的なIHC画像、および（O）FCGR1+凝集体（mm2あたり）（n≧3）およびリンホHCK（mm2あたり）（n≧3）の定量化。(P）1mm2あたりのFCGR1+凝集体とシリウスレッド陽性、1mm2あたりのp-HCK+細胞とシリウスレッド陽性を示す相関プロット（n≧3）。(Q）12週齢のWTまたはFcRγ-/-BMDMから、WT ND、WT CD-HFDまたはμMT CD-HFDの6ヶ月食下（n≧2）の血清で、IgA単独またはFc-ブロッカーとの組み合わせで刺激後、qRT-PCRで測定した主要プロファイブロジック遺伝子の相対mRNA発現量。補体タンパク質は、56℃で30分間の血清前処理で不活性化した。すべてのデータは、平均値±SEMで示した。統計解析は、不対T-testを用いて行った。スケールバーは100μmを表す。
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FcγRの活性化により、マクロファージの貪食が誘導される(
44
). 感染時には、感染性抗原を取り囲むIgA分子によって、これらのプロセスが制御される。これらの複合体は、主にヒトマクロファージのFcαR（CD89）により認識される(
45
)、マウスではFcγRI (FCGR1), FcγRIIIa (FCGR3), FcεRI (FCER1G) によって認識され、共通してFcγRの膜内部分を持ち、下流のシグナルを活性化する(
46
). 線維化の程度は、分析したNASHモデルの血清学的IgAレベルと相関しており、免疫グロブリンレベルとFcレセプター活性化の関連性を示唆している。機能的なFCGR1、FCGR3、FCER1Gの活性を阻害するFcγRの発現の欠如が、NASHにおけるマクロファージの活性化と線維化を抑制できるかどうかを機能的に評価するため、FcRγ-/-マウスに6ヶ月間CD-HFDを摂取させました。これらのマウスは、WTコントロールと比較して、本格的なNASH、脂肪症、肝臓損傷（図5JおよびS5I、S5J）、および同様の肝臓炎症プロファイルを発症したが（図S5K、S5L）、FcRγ-/-、マウスは、血清IgAレベルの低下および肝MoMFの数（図5LおよびS5M）と正の相関を示す線維化（図5K）を強く抑制した。予想通り、FcRγ-/-マウスは、線維化を有するマウスと比較して、FCRG1の発現およびFcRシグナルの下流メディエーターであるリン酸化HCK（p-HCK）の減少によって決定されるように、FcR下流シグナルを欠いていた（図5N-5P）。
CD-HFDを与えたFcRγ-/-マウスの生体内で観察される表現型が、骨髄細胞の輸送の変化ではなく、主にFcRγシグナルの欠如に依存しているかどうかを調べるために、FcRγ+/+およびFcRγ-/-骨髄細胞の移動能力を生体内および試験管内で評価しました。CCl4（四塩化炭素）短期注射済みのFcRγ-/-マウスおよびコントロールマウスの骨髄由来マクロファージ（BMDM）を用いて、その遊走能を解析した（図S5P）。CCL2勾配は、移動アッセイとその後のフローサイトメトリーによって調査されたように、FcRγ+/+およびFcRγ-/- BMDMsの同様の移動効力を誘導した（図S5q）。四塩化炭素（CCl4）処理マウスの肝臓において、肝MoMFは、未処理の対応するものと比較して、両方のマウスグループで同様に増加した（図S5R）。次に、NASH食を与えた複数のマウスモデルにおいて、一般的なMoMFsマーカーであるLy6CとプロフィブロジェニックマクロファージマーカーであるS100A4のレベルを評価した。Ly6C+細胞の増加は、線維化を示したマウス-WTおよびAIDg23s CD-HFDマウス-で見られたが、CD-HFD上の他のマウスモデルでは見られなかった（図S5N）(
47
). WT ND、およびWT、μMT、WT αCD20、IgMi、AIDg23sマウス-すべてCD-HFD上-の肝Ly6C+/CD11b+/FCER1G+細胞の定量化は、WTおよびAIDg23s CD-HFDなどの線維化肝臓が有意により多くのLy6C+/CD11b+/FCER1G+細胞を示すことを示した（図 S5VおよびW）。
線維形成促進マクロファージの活性化におけるIgAおよびFcRγシグナルの役割の可能性を、BMDMsによるIL-1β、IL-6およびTNFなどの選択された線維形成促進／活性化遺伝子の発現をex vivoで測定することによって調査した。12週齢のWTマウスまたはFcRγ-/-マウスのBMDMを、まず、健康なWT NDマウスまたは線維化WT CD-HFDマウス（いずれも6ヶ月間食餌）由来の血清でインビトロ処理した（図S5O）。線維化WT CD-HFD由来の血清は、ND血清と比較して、プロフィブロジェニック遺伝子の発現を増加させた（図5Q）。NASHを有するが全身性のIgA-分泌と線維化がないμMT CD-HFDマウスの血清で処理したWT-BMDMは、プロフィブロジェニック／活性化遺伝子を誘導できなかった（図5Q）。一方、WT NDマウスまたはμMT CD-HFDマウス由来の血清に精製IgAを添加すると、BMDMsにおいてIL-6、IL-1βおよびTNFの発現が強く誘導されたが、これはFcブロッカーの添加によって抑制された（図5Q）。驚くべきことに、線維化したWT CD-HFDマウス由来の血清にFc-ブロッカーを添加すると、BMDMsにおけるIL-6、IL-1βおよびTNFの誘導が阻止された（図5Q）。これらのデータは、NASHマウス由来の血清中に循環する免疫グロブリン（例えば、IgA）が、BMDM-活性化を直接誘発する可能性があることを示している。追加のコントロールとして、FcRγ-/--BMDMを線維化CD-HFDマウスの血清で処理したが、これはBMBMにおけるIL-6、IL-1βおよびTNFの発現を誘導できず、FcRγ-シグナルが免疫グロブリンを介した伝達過程に関与することが再び強調された（図5Q）。
全体として、これらのデータは、主にMoMFにおけるFcRγ-シグナルが、NASHにおける肝線維症の発症に重要な役割を持ち、分泌された免疫グロブリンがこのシグナルを活性化するのに重要な因子であることを示している。
図6Aは、これまでに発表された最も重要なデータをまとめたものである。すなわち、(i)肝臓でのT細胞の活性化と移動を促進する濾胞外、腸管メカニズム、(ii)肝臓でMoMFの活性化を促進し線維化の開始を促進する免疫グロブリン、最も可能性の高いIgAの分泌を含むメカニズム（図6B）である。
図6NASH食の無菌マウスを含むモデルの概要（A）この研究調査で適用したすべてのマウスモデルのNASH表現型、B細胞/免疫グロブリン型、線維化、B-T細胞相互作用、HCCを示す表である。(B）NASHの文脈におけるラミナプロプリアCD20+IgA+B細胞の役割を示すグラフの要約。後者は、門脈を経由して、前膜から肝臓に移動することがある。二次リンパ器官（脾臓など）由来のIgA+B細胞は、単球由来マクロファージ（FCGR1、S100a4、Ly6C、CD11b、F4/80陽性）におけるFcRγシグナルの活性化を通じてIgA+を介して肝臓線維症に寄与しています。(C) 6ヶ月間飼育したGF WT NDおよびGF WT CD-HFD雄マウス由来の肝臓切片の代表的なH&E染色像である。(D）GF雄マウス（CD-HFDを6ヶ月間投与）由来の肝臓切片の代表的なスダンレッド染色である。(E）総CD8＋細胞、CD8＋CD62L＋およびCD8＋CD62L-細胞、CD8＋TNF＋細胞、およびCD8＋perforinhigh細胞について6ヶ月間のGF ND、およびGF CD-HFDを比較した肝臓フローサイトメーター分析の定量値（n＝4）。(F) GF NDおよびGF CD-HFDマウスのB220、CD3、F4/80およびMHCII染色についての肝臓切片の代表的なIHC画像および(G) mm2あたりの定量（n=5)。(H）GF雄マウス（n＝4）のCD20＋CD19＋、CD20＋CD19-およびCD20-CD19＋細胞の小腸フローサイトメトリー解析の定量化である。(I）GF雄マウス（n＝3、各マウスn≧4FOV）のB220＋細胞およびCD8＋細胞の小腸ラミナプロプリア染色（黄色の部分はB220＋細胞とCD8＋細胞の接触点を示す）、および（J）B220＋／CD8＋相互作用細胞のクラスターの定量化、についての代表的高解像度共焦点顕微鏡および3D再構成画像である。すべてのデータは、平均値±SEMで表示されている。統計解析は、対にならないT-testを用いて行った。スケールバーは100μmを表す。
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NASH発症に腸内細菌叢は必要ない
腸内細菌叢は、腸内B細胞のホメオスタシスにおいて重要な役割を担っている(
48
,
49
). これまで、無菌（GF）マウスは肥満になりにくいという研究結果が出ている(
50
)食餌の種類に依存している(
51
,
52
)、NAFLD/NASH発症(
53
,
54
,
55
). しかし、欧米食を16週間与えたGFマウスは、肥満を発症し、代謝機能不全を示した(
56
)であり、微生物叢の欠如がメタボリックシンドロームを引き起こす可能性があることを示している。
この概念をNASHと関連するB細胞機能の文脈で調べるために、GFマウスにCD-HFDを6ヶ月間摂取させた。CD-HFDマウスは有意に体重を増やし（図S6A）、本格的なNASHとグルコース反応障害を示し（図6C〜6D；S6A、B；S6G）、TNFとパーフォリンを発現する肝T細胞、B細胞、活性化CD8+T細胞（図6E）、F4/80+細胞とMHCII+凝集体が多く見られた（図6F、6G）。小腸では、CD-HFDマウスはB細胞頻度の増加を示し（図6H）、また、特に腸絨毛に沿ってクラスター（黄色）を形成するB220+/CD8+細胞が見られた（図6I、6J）。
GF条件下でのNASH発症におけるB細胞の重要性は、CD-HFD上のマウスがすでにNASHと肝障害を発症している時期であるCD-HFD4ヶ月目から、αCD20抗体を6週間投与することで検証した（図S6DおよびS6E）。B細胞枯渇の有効性は、異なる組織（脾臓、肝臓、小腸）において証明された（図S6K）。
抗CD20抗体処理GF CD-HFDマウスは肥満で、NASHは救済されたが、脂肪症は救済されず、血清ALTおよびコレステロール値は変化しなかった（図S6G-S6J）。さらに、αCD20抗体で処理したGF CD-HFDの肝臓は炎症を起こさず、活性化CD8+ TおよびF4/80+細胞の数が著しく少なかったが（図S6K、S6L）、MHCII+凝集体は未処理のコントロールと比較して同じレベルにとどまっていた（図S6L）。
これらのデータは、腸内細菌叢が肥満とNASHの誘発に必要ないことを示唆しており、免疫細胞の無菌的な代謝活性化がNASHの推進に十分であることを提案している（3、4、29）。さらに、B細胞は腸内細菌叢とは無関係に作用してNASH発症に寄与し、小腸のT細胞と相互作用する可能性がある。
NASHおよび肝硬変患者における消化管CD20+ B細胞の増加、IgA高値、FcRγ+骨髄系細胞の増加
次に、私たちのマウスNASHモデルで得られたデータをNASH患者さんで比較しました。我々のマウスNASHモデルと同様に、NASH患者の肥満手術由来の消化管組織（空腸など）では、単純性脂肪症（NAFL）患者と比較して、CD20+ B細胞の増加が見られた（図7A、7B）。さらに、NASH患者の空腸免疫細胞（CD20+ B細胞を含む）において、単純性脂肪症に対してp-SYK+が増加しており（図7C、およびS7A、S7J）、B細胞の活性化を示唆することが分かった。
図7NAFLD罹患患者における腸管B細胞と肝ミエロイド細胞 (A) NAFLおよびNASH罹患患者のCD20染色空腸の代表サンプル。(B）NAFL、およびNASH患者の空腸におけるCD20+細胞の定量化、mm2あたり（n≧4）。(C）NAFLおよびNASH患者のjejunaにおける免疫細胞（B細胞またはミエロイド細胞）のPhospho-SYK定量化（n≧5）。(D）線維化スコア（Brunt/Kleinerスコア）に基づき2つのサブグループ（F0-F2およびF3-F4）に分けられたNAFLD患者におけるIgAレベルの血清測定（n≧233各群、合計n＝639）。(E）639人のNAFLD患者コホートにおけるIgA血清レベルと線維化ステージの相関プロット。(F）肝門部炎症の有無により2つのサブグループに分けられたNAFLD患者におけるIgAレベルの血清測定（n≧233各グループ、合計n=639）。(G）639人のNAFLD患者コホートにおけるIgA血清レベルと門脈炎症スコアの相関図。(H）NAFLD患者およびNAFL患者に対して線維化の程度が異なる患者（合計n=206）から得られた、単球由来マクロファージの表現型、FcRγシグナルおよび線維形成に関与する選択遺伝子のトランスクリプトミクス解析によるlog2倍変化値を示すヒートマップである。(I-K）線維化ステージと門脈または実質の（I）FCER1G+細胞/mm2、（J）CCR2+細胞/mm2、（K）S10014+細胞/mm2の相関プロット（n=31）．(L）NAFLD患者における、線維化なし/非常に低い線維化（F0/F1）および線維化高い（F3）のFCER1G、CCR2およびS100A4のIHC代表画像と、門脈および実質の定量化染色細胞について2つの線維化サブグループにおけるそれらの定量値（M）（n≧11）。(N）健康なドナーおよびNAFLD-肝硬変患者からの、組織単球（TM）、クッパー細胞（KC）、および瘢痕関連マクロファージ（SAMac）に分けられた、肝臓CD45+ FACS選別細胞およびその後のシングルセル10X RNA配列決定、および以下の各ミエロイド下位集団の割合を示すUMAPプロット（n≥5）。(O）SAMac集団における健常ドナーおよび肝硬変患者の間で最も変動が大きい遺伝子上位100個を示すヒートマップ（n=5）。(P）健常者ドナーおよびNAFLD・肝硬変患者SAMAc集団におけるFCGR1A遺伝子のmRNA発現スコアを示すUMAPプロット、および以下の統計解析結果（n≧5）。(Q）健常者ドナー肝臓およびNAFLD/ALD肝硬変SAMAc患者集団における活性化FcRγシグネチャー（Reactome）の発現スコア、および以下の統計解析（n≧5）。すべてのデータは、平均値±SEMで表示されている。統計解析は、不対T-testを用いて行った。IHCのスケールバーは100μm、免疫蛍光のスケールバーは50μmを表す。
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我々は、2つの異なるNAFLD患者コホートにおいて、血清IgAレベルの上昇が線維化の程度と正の相関を示す、以前に発表されたデータを裏付けることができた（図7D、7E、S2B）(
22
). さらに、IgAレベルの上昇は、肝門部炎症の存在と有意に相関していた（図7F、7G）。注目すべきは、線維化ステージが高いほどIgGレベルではなく、IgMレベルが上昇していたことである（図S7B）。興味深いことに、モノクローナルαCD20抗体で治療したNAFLDと関節リウマチの患者は、血清ALT値の低下を示し（図S7E）、B細胞の枯渇がNASH患者の肝臓障害を改善するかもしれないという考えを支持している。血清IgAの高値は、NASH患者の実質および門脈のPD1+細胞と関連していたが、CD8+T細胞とは関連していなかったことから、IgAの分泌、線維化、PD1+細胞の間の可能性が示された（図S7FおよびS7G）。
上記のマウスデータから、MoMFは線維化と強い相関があることが示唆された(
57
,
58
). 線維化の程度が異なる患者を含む大規模なNAFLD患者コホートにおいて、MoMFs、FcRγシグナルおよび線維形成に選択された遺伝子の全肝トランスクリプトーム解析を実施した。その結果、CCR2、ITGAM、CX3CR1（MoMFs表現型を示す）、FOSとFCGR1A（FcRγシグナル）、SPP1、TREM2、THBS1、CCL2、S100A4などのプロフィブロジェニック遺伝子など、これらのカテゴリーの多くの関連遺伝子が、マウス解析と同様に線維化の程度に直接相関していた（図7H）。また、ケモカイン受容体CCR2およびS100AとFCER1Gとの間には、トランスクリプトームレベルで強い相関があることがわかった（図S7H）。
ヒトNAFLD肝では、門脈および実質におけるFCER1G+、CCR2+およびS100A4+細胞の数は、線維化の程度と相関していた（図7I-7K）。主に、線維化領域には浸潤したS100A4+FCER1G+CCR2+細胞が密集しており、線維化ステージに基づきNAFLD患者を層別化すると、進行NAFLDで有意に増加した（図7L、7M、およびS7H、S7I）。一方、異なる線維化ステージ間でCD163+FCER1G+細胞の密度に差は認められず、線維化におけるKCsの役割はわずかであることが示された（データ示さず）。
さらに、線維化および肝硬変を促進する骨髄系細胞集団が、我々のマウスNASHモデルで同定された経路と同様の経路で活性化されるかどうかを分析した。健康な肝臓組織（移植ドナー）とNAFLD肝硬変肝臓由来のCD45+細胞のScRNA-Seq解析から、肝硬変患者では、瘢痕関連マクロファージ（SAMacs）と呼ばれる骨髄系細胞の亜集団の区画が増加していた（図7N、7OおよびS7K）(
59
). 特に、FCGR1A遺伝子の発現は、健常人と比較して肝硬変患者で有意に増加し（図7P）、FcRγシグナルシグネチャーは、健常人と比較して肝硬変患者で有意に増加し、特にSAMac細胞区画に濃縮されていることがわかった（図7Q）。マウスとヒトのNASH肝臓におけるFcRγシグナル伝達経路の転写解析と比較から、FcRγシグナル伝達成分および下流標的の制御には密接な類似性があることが明らかになった（図S7L.）
まとめると、NASH患者から得られたデータは、NASHマウスモデルから得られたデータと一致し、線維症や肝硬変の発症においてMoMFs/SAMacs上の分泌型IgAとFcRγシグナルが重要な役割を果たすことを示唆しています。
考察
我々は、消化管における代謝性T細胞活性化とNASHにおける肝線維化の促進をもたらす、2つの異なるB細胞依存性メカニズムについて述べた（図6A、B）。我々は以前、自己攻撃性T細胞がNASHの進行性肝疾患を悪化させ、HCC発症につながることを明らかにした(
3
,
4
). 我々は、B細胞の遺伝的枯渇（JH-/-マウス）により、T細胞の活性化、肝炎、NASH、線維化、肝腫瘍形成がin vivoで抑制されることを報告した。また、NASH/線維症のマウスでB細胞を治療的に枯渇させると、T細胞主導の炎症と線維症が減少/逆転した。1H-NMRおよび質量分析により、B細胞がNASHの病態を特徴づける肝代謝の変化に寄与していることが示された。
腸-肝軸はNAFLDの病態生理における重要な因子として同定されていることから(
14
)、我々は消化管B細胞(μMTマウス)の役割を評価した。この評価により、消化管IgA+ B細胞は、T細胞主導の炎症と肝臓の代謝変化に寄与するが、末梢に免疫グロブリンを分泌できないため、線維化を促進できないことが明らかになった。これらの消化管B細胞は、T細胞非依存的に前膜で発生した(
60
)は、数は少ないものの、NASHの状況下で強く活性化された。μMTマウスは、WT CD-HFDマウスと比較して、NASHの質やレベルが同等であるにもかかわらず、NASHによる肝細胞増殖が有意に低く、これはμMT CD-HFDマウスに肝繊維化がないことに起因する可能性がある。μMTマウスの消化管B細胞の治療的枯渇は、in vivoでのT細胞炎症を減少させ、NASHを回復させた。
NASH食を与えたWTマウスでさらに解析したところ、消化管B細胞は数が増加し、代謝的に活性化し、活性化したBCRシグナルを示すことがわかった。また、NASH患者のヒト腸管組織を解析したところ、罹患していない患者や単純性脂肪症（NAFL）の患者と比較して、B細胞数の増加が確認されました。
NASHマウスの小腸固有層では、B細胞とCD8+ T細胞が細胞間相互作用を伴うクラスターを形成しており、これらのクラスター内でB細胞がCD8+ T細胞を活性化できることが示唆された。しかし、これらのクラスターはND飼料を与えたマウスでは見つからなかった。このデータは、NASHにおける消化管B細胞によるCD8+ T細胞の活性化亢進は、細胞間の直接的な相互作用を必要とするライセンス段階を経て達成されることを示す。
重要なことは、NASHマウスの小腸由来のB細胞が、MHC-Iではなく、LFA-1とICAM-1を必要とする、抗原特異的な独立した方法で、生体外でCD8+ T細胞を直接活性化できることを証明できたことです。一方、ND飼育マウスの腸管B細胞は、生体外でT細胞を活性化することはできなかった。このデータは、NASHにおける消化管B細胞を介したCD8+ T細胞の自己攻撃と過活性化は、細胞間の直接的な相互作用を必要とするライセンスステップによって達成されることを示している。LFA1-ICAM軸の干渉は、生体外でのT細胞の過活性化を阻害した。さらに、CD8+ T細胞の活性化はTCRに依存せず、消化管B細胞はOT1-CD8+ T細胞も活性化した。CD8+T細胞と消化管B細胞との相互作用は、TCR-ダウンストリームシグナルの増幅器として機能し、MHC-Iを遮断してもB細胞による抗原特異的提示は阻害されなかったことから、B細胞による自己攻撃は起こらない。
代謝の再プログラミングの他に、NASH消化管B細胞の活性化やBCRシグナルの増幅は、SYK(61)のリン酸化によって表される可能性がある。
61
,
62
,
63
,
64
,
65
). 後者は、NASHから保護され、小腸にB-T細胞クラスターを持たないIgMiマウスのB細胞には存在しなかった。注目すべきは、リンパ腫の場合のように、過活性化したB細胞では、SYK阻害剤が治療的に利用されていることである(
65
).
我々は、細胞を局所的に活性化させることができるKaedeマウスを用い、NASHの状況下で、消化管から肝臓までのB細胞およびT細胞の追跡を可能にした。代謝によって活性化された消化管B細胞およびT細胞は、消化管から肝臓に移動することが示唆され、代謝によって活性化されたT細胞は小腸で発生し、肝臓に移動して維持される可能性があることが示されました。
NASHの発症において消化管B細胞が中心的な役割を果たすことを踏まえ、我々は微生物叢(
15
,
16
,
17
)を我々の疾患モデルに組み込んだ。我々は、NASH食モデル（CD-HFD）において、NASHの発症が腸内細菌叢を介さずに起こることを示した。また、NASHを発症した無菌マウスでB細胞を治療的に枯渇させると、肝臓の炎症と線維化が回復したことから、B細胞がT細胞の活性化とNASHにつながること-腸内細菌叢とは無関係に-が示されました。
NAFLD患者では血清免疫グロブリンA（IgA）レベルが上昇していることが示されている(22)。我々のin vivoおよびin vitroのNASH研究では、IgAの分泌がCD11b+CCR2+F4/80+CD11c-FCGR1+単球由来マクロファージにおけるFcRγシグナルの活性化により線維化に寄与することが示された(
66
). しかし、Fc受容体を発現する他の細胞種（例えば、肝細胞）もこの表現型に寄与している可能性を排除できない。注目すべきは、NASH患者の分子解析で、血清IgA値と線維化の重症度、および肝臓のFcRγ活性化瘢痕関連マクロファージとが相関していることである。
このように、NASHと線維化を促進する他の既知の免疫細胞メカニズム以外にも(
67
)、B細胞とIgA分泌がNAFLD/線維症/肝硬変の病態形成に重要な役割を果たすことは明らかである。肝脂質蓄積と代謝異常におけるB細胞の役割をさらに解明することは、興味深いことである。NASHの新しい治療法として、抗ステトーシス薬、抗炎症薬、抗線維化薬の併用療法が効果的であることが示唆されている(
68
).
我々の研究は、消化管B細胞が、ライセンス代謝T細胞活性化と線維化のメディエーターとして同定されたことから、このようなコンビナトリアルな治療アプローチのターゲットとなりうることを示した。今後、特に消化管におけるB細胞とT細胞の相互作用を阻害し、肝臓におけるFcRシグナルを標的とした研究が進めば、NASHおよびNASH関連線維症に対する新しい治療法が明らかになるかもしれません。
謝辞
Danijela Heide, Florian Müller, Enrico Focaccia, Mohammad Ahmed, Sabrina Schumacher, Jenny Hetzer, Corinna Leuchtenberger, Tim Machauerの技術協力に感謝します。さらに、ミュンヘン工科大学（TUM）の比較実験病理学研究室による支援に感謝する。
付録A. 補足データ
本論文の補足データを以下に示す：
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参考文献
太字の著者名は、共同筆頭著者であることを示す。
Huang D.Q.
El-Serag H.B.
Loomba R.
NAFLD関連HCCの世界疫学：傾向、予測、危険因子、予防。
Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2021; 18: 223-238
記事で見る
スコープス(523)
パブコメ
クロスフィルム
グーグル奨学生
アンスティQ.M.
リーブスH.L.
コツィリティE.
Govaere O.
ハイケンワルダーM.
NASHからHCCへ：現在の概念と将来の課題。
Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2019; 16: 411-428
記事で見る
スコープス(618)
パブコメ
クロスレフ
グーグル奨学生
フィスターD.
ヌニェスN.G.
ピニョールR.
ゴベールO.
ピンター M.
シドロフスカM.
他。
NASHは免疫療法を受けたHCCにおける抗腫瘍監視を制限する。
Nature. 2021; 592: 450-456
記事で見る
スコープス(369)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
ドゥデク M.
フィスターD.
ドナコンダS.
フィルペP.
シュナイダーA.
ラッシンガーM．
ら。
自己攻撃的なCXCR6。
Nature. 2021; 592: 444-449
記事で見る
スコープス (0)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
リンゲルハン M.
フィスターD.
オコナーT.
ピカルスキーE.
ハイケンワルダーM.
肝細胞癌の免疫学。
Nat Immunol. 2018; 19: 222-232
記事で見る
スコープス(521)
パブコメ
クロスフィルム
グーグル奨学生
W.H.O. Cancer: Key facts. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer. 2020.
記事で見る
グーグル・スカラー
Llovet J.M.
ケリーR.K.
ビラヌエバ A.
シンガルA.G.
ピカルスキーE.
ロアヤイエS．
ら。
肝細胞がん。
Nat Rev Dis Primers. 2021; 7: 6
記事で見る
スコープス (1518)
パブコメ
クロスフィルム
グーグル奨学生
シュルツ M.
Tacke F.
高リスクのNASH患者を特定する： What We Know so Far.
Hepat Med. 2020; 12: 125-138
記事で見る
パブコメ
クロスフィルム
グーグル奨学生
サンヤル A.J.
ヴァン・ナッタM.L.
クラークJ.
ノイシュワンダー＝テトリ B.A.
Diehl A.
ダサラシーS．
他
非アルコール性脂肪性肝疾患の成人における転帰の前向き研究。
N Engl J Med. 2021; 385: 1559-1569
記事で見る
スコープス(189)
パブコメ
クロスフィルム
グーグル奨学生
ピスカリアF.
スヴェグリアティ・バローニG.
バルケッティA.
ペコレッリA.
マリネッリS.
ティリベッリC.
他
非アルコール性脂肪性肝疾患における肝細胞癌の臨床的パターン： 多施設共同前向き研究。
Hepatology. 2016; 63: 827-838
記事で見る
スコープス(380)
パブコメ
クロスフィルム
グーグル奨学生
アビー E．
ファンJ.
チュオンE.
グロッツ J.
サーブ S.
非アルコール性脂肪肝炎肝硬変患者における肝細胞癌のスクリーニングが不十分である。
J Clin Gastroenterol. 2019; 53: 142-146
記事で見る
スコープス(15)
パブメド
クロスレフ
グーグル奨学生
オハラ・J.
フィネガンA.
Dhillon H.
ルイズ＝カサスL.
ペドラG.
フランクスB.
et al.
欧州と米国における非アルコール性脂肪肝炎のコスト：GAIN研究。
JHEP Rep. 2020; 2100142
記事で見る
PubMed
グーグル奨学生
ラザルス J.V.
マークH.E.
アンスティQ.M.
アラブJ.P.
バタラムR.L.
カステラL．
他
NAFLDに関するグローバルな公衆衛生アジェンダの推進：コンセンサスステートメント。
Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2021;
記事で見る
Google Scholar
デ・ムンク TJI
シュー・P.
Verwijs H.J.A.
マスクリーA.A.M.
ヨンカーズD.
フェルビークJ．
他
ヒトの非アルコール性脂肪性肝疾患における腸管透過性： システマティックレビューとメタアナリシス。
Liver Int. 2020; 40: 2906-2916
記事で見る
スコープス(50)
パブコメ
クロスフィルム
グーグル奨学生
ルロワ T．
ルロピスM.
ルパージュP.
ブリュノー A.
ラボーS.
ベヴィラクア C．
et al.
腸内細菌叢はマウスの非アルコール性脂肪性肝疾患の発症を決定する。
Gut. 2013; 62: 1787-1794
記事で見る
スコープス (622)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
ヘナオ・メヒアJ.
エリナブ E.
ジンC.
ハオ・L.
メハルW.Z.
ストローウィグ T．
et al.
インフラムソームを介したディスバイオシスがNAFLDと肥満の進行を制御している。
Nature. 2012; 482: 179-185
記事で見る
スコープス (1741)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
デ・ミニシスS.
リヒリッキC.
アゴスチネリL.
サッコマンノS.
キャンデラレシC.
トロッツィ・L．
et al.
マウスの慢性肝障害の経過における線維形成に寄与するディスバイオシス。
Hepatology. 2014; 59: 1738-1749
記事で見る
スコープス (204)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
ヨシモト・S．
ルー・T.M.
アタラシ K.
神田裕之
佐藤 聡
オヤドマリS.
et al.
肥満による腸内細菌の代謝産物は、老化セクレトームを通じて肝臓がんを促進する。
Nature. 2013; 499: 97-101
記事で見る
スコープス (1448)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
クベス P．
メハルW.Z.
肝臓の不妊症性炎症
Gastroenterology. 2012; 143: 1158-1172
記事で見る
スコープス (488)
PubMed
要旨
全文
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グーグル・スカラー
マレハミルM.
フィスターD.
ガラージS.
シドロフスカM.
インベルソD.
コツィリチE.
et al.
血小板GPIbαは、NASHとそれに続く肝臓癌のメディエーターであり、潜在的な介入ターゲットである。
Nat Med. 2019; 25: 641-655
記事で見る
スコープス(188)
パブコメ
クロスレフ
グーグル奨学生
ウェン Y.
ラムレヒトJ.
Ju C.
Tacke F.
肝ホメオスタシスと疾患における肝マクロファージ-多様性、可塑性、治療の可能性。
Cell Mol Immunol. 2021; 18: 45-56
記事で見る
スコープス (156)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
マクファーソン S．
ヘンダーソンE.
バートA.D.
デイC.P.
アンスティQ.M.
血清免疫グロブリン値は非アルコール性脂肪性肝疾患患者における線維化を予測する。
J Hepatol. 2014; 60: 1055-1062
記事で見る
スコープス (0)
パブコメ
要旨
全文
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グーグル奨学生
モウザキ M.
ブラムラージK.
Arce-Clachar A.C.
Xanthakos S.A.
血清免疫グロブリンAレベルは、小児非アルコール性脂肪性肝疾患における肝疾患の重症度と相関しない。
J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2018; 67: 631-634
記事で見る
スコープス(1)
パブコメ
クロスレフ
グーグル奨学生
シャラプール S．
リン X.J.
バスティアンI.N.
ブレイン J.
バートA.D.
アクセノフA.A.
ら。
炎症誘発性IgA+細胞は、抗肝臓がん免疫を解体する。
Nature. 2017; 551: 340-345
記事で見る
スコープス(284)
パブコメ
クロスフィルム
グーグル奨学生
バロー F．
カーンS.
フレドリクソンG.
Wang H.
ディエッチェK.
パルチバンP．
ら。
肝内B細胞の微生物叢主導の活性化は、自然および適応的なシグナル伝達を通じてNASHを悪化させる。
Hepatology. 2021; 74: 704-722
記事で見る
スコープス (49)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
カール・M．
ハッセルワンダーS.
Zhou Y.
ライフェンベルグG.
キム・Y.O.
パーク K.S.
他。
食事誘発性非アルコール性脂肪性肝疾患のマウスモデルにおけるBリンパ球の二重の役割。
Hepatology. 2022;
記事で見る
スコープス (8)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
イナミネ T.
シュナーブルB.
免疫グロブリンAと肝疾患．
J Gastroenterol. 2018; 53: 691-700
記事で見る
スコープス(27)
パブコメ
クロスレフ
グーグル奨学生
チェン J.
トローンスティーンM.
アルト F.W.
ヤング F．
クラハラC.
ローリング J.F.
他
JH遺伝子座の標的欠失により作製されたB細胞欠損マウスにおける免疫グロブリン遺伝子の再配列.
Int Immunol. 1993; 5: 647-656
記事で見る
スコープス (350)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
ウルフ M.J.
アディリA.
ピオトロウィッツK.
アブドゥラZ.
ボーゲ Y．
シュテマー K．
他
肝内CD8+T細胞およびNKT細胞の代謝活性化は、肝細胞とのクロストークを介して非アルコール性脂肪肝炎および肝癌を引き起こす。
Cancer Cell. 2014; 26: 549-564
記事で見る
PubMed
アブストラクト
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グーグル奨学生
小松真一
和栗 聡
小池真理子
ソウ Y.S.
上野 崇
原 亨．
他
オートファジー欠損マウスにおける細胞質封入体形成はp62の恒常性レベルで制御されている。
Cell. 2007; 131: 1149-1163
記事で見る
スコープス (1731)
PubMed
要旨
全文
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グーグル・スカラー
マクファーソン A.J.
ラマールA.
マッコイK.
ハリマンG.R.
オーデルマットB.
ドウガンG．
ら。
発育中のB細胞では、ミュー鎖やデルタ鎖の発現がなくてもIgAが産生される。
Nat Immunol. 2001; 2: 625-631
記事で見る
スコープス (201)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
コダダディ・L．
チェンQ.
ラドブルフA.
ヒエップF.
記憶プラズマ細胞の維持
Front Immunol. 2019; 10: 721
記事で見る
パブメド
クロスレフ
グーグル・スカラー
シュクラルチクD．
ゲーブルA.L.
リオンD．
ユンゲA.
ワイダー S．
フエルタ-セパスJ．
他
STRING v11：カバレッジを高めたタンパク質-タンパク質関連ネットワークで、ゲノムワイドな実験データセットでの機能発見をサポート。
ヌクレイック・アシッズ・レズ(Nucleic Acids Res.) 2019; 47: D607-D613
記事で見る
スコープス(8201)
パブコメ
クロスレフ
グーグル奨学生
ゴレンシュテインD.
ザスラフスキーE.
フリブールM.
パークC.Y.
ウォン・A.K.
タディック A．
他
ヒトの免疫経路と疾患の解明に向けた対話型ビッグデータリソース。
Immunity. 2015; 43: 605-614
記事で見る
PubMed
アブストラクト
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グーグル奨学生
戸村真一
吉田直樹
田中淳一
唐澤 聡
三輪由紀子
宮脇 昭．
他
光電変換蛍光タンパク質 "Kaede "トランスジェニックマウスを用いた生体内における細胞運動のモニタリング
Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105: 10871-10876
記事で見る
スコープス (272)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
クラッパーJ.R.
ヘンドリックスM.D.
グーG.
ウィットマーC.
ドルマンC.S.
ヘリッチJ．
et al.
脂肪性肝疾患および非アルコール性脂肪肝炎の食事誘発マウスモデルは、臨床的な疾患進行と評価方法を反映している。
Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2013; 305: G483-G495
記事で見る
スコープス(177)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
ワイズマンA．
クラウスM.
セガールJ.
ゴーシュS.
メラメドD.
ソング・J．
他
IgG1 B細胞受容体シグナルはCD22によって阻害され、Igα/βへの生存依存度が低いB細胞の発生を促進する。
J Exp Med. 2007; 204: 747-758
記事で見る
スコープス (99)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
ウェイスマンA．
クロックスフォードA.L.
Demircik F.
サイトメガロウイルス感染症におけるB細胞の役割を研究するための新しいツール。
Med Microbiol Immunol. 2008; 197: 145-149
記事で見る
スコープス (17)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
ペシュル P．
ブラドルM.
ヘフトベルガーR.
ベルガーT.
Reindl M.
ミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質： 炎症性脱髄疾患における標的を解読する。
Front Immunol. 2017; 8: 529
記事で見る
スコープス(147)
パブコメ
クロスフィルム
グーグル奨学生
ウェイ M.
新倉理恵子
土井康弘
丸谷真一
ファガラサンS.
本庄 崇
体細胞超変異をもたらすAicdaのノックイン変異を持つマウスは、腸のホメオスタシスが損なわれ、粘膜防御が低下している。
Nat Immunol. 2011; 12: 264-270
記事で見る
スコープス (195)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
ハリマンG.
ボーグM.
ロジャースP.
ファインゴールドM.
パチェコS.
ブラッドリーA．
et al.
マウスにおけるIgA定数領域の標的化欠失は、他のIgアイソタイプの発現に変化を伴うIgA欠損をもたらす。
J Immunology. 1999; 162: 2521-2529
記事で見る
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
村松 幹雄
木下和彦
ファガラサンS.
山田 聡
新海祐子
本庄 哲也
クラススイッチの組換えと超変異には、潜在的なRNA編集酵素である活性化誘導型シチジンデアミナーゼ(AID)が必要である。
Cell. 2000; 102: 553-563
記事で見る
PubMed
概要
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グーグル奨学生
松本真一
羽田直樹
坂巻康弘
宇野晃一郎
志賀 毅
田中千晶．
他
非アルコール性脂肪肝炎の線維化を急速に進行させる改良型マウスモデル。
Int J Exp Pathol. 2013; 94: 93-103
記事で見る
スコープス (252)
パブコメ
クロスフィルム
グーグル奨学生
ニンマーヤーンF.
ラベッチJ.V.
免疫応答の制御因子としてのFcγ受容体。
Nat Rev Immunol. 2008; 8: 34-47
記事で見る
スコープス (2089)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
ハンセン I.S.
ホーペルW.
ザート S.A.J.
バエテン D.L.P.
デン・ダネン J.
血清IgA免疫複合体は、FcαRI-TLRクロストークを介してヒトマクロファージ、単球、クッパー細胞による炎症性サイトカイン産生を促進する。
J Immunol. 2017; 199: 4124-4131
記事で見る
スコープス(37)
パブコメ
クロスフィルム
グーグル奨学生
ハンセン I.S.
バーテンD.L.P.
デン・ダネンJ.
ヒトIgAの炎症機能。
セルモル・ライフサイ. 2019; 76: 1041-1055
記事で見る
スコープス(64)
パブコメ
クロスレフ
グーグル奨学生
チェン L.
Li J.
Zhang J.
Dai C.
Liu X.
Wang J.
ら。
S100A4は肝星状細胞の活性化を介して肝線維化を促進する。
J Hepatol. 2015; 62: 156-164
記事で見る
スコープス(99)
PubMed
アブストラクト
全文
全文PDF
グーグル奨学生
Zheng D.
リウィンスキーT.
エリナブ E.
健康・疾患における微生物叢と免疫の相互作用。
細胞研究 2020; 30: 492-506
記事で見る
スコープス (987)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
マクファーソン A.J.
ハイケンワルダーM.
ガナル・ヴォナルバーグ S.C.
宿主と微生物の相互作用のネクサスにおける肝臓。
Cell Host Microbe. 2016; 20: 561-571
記事で見る
スコープス (0)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル・スカラー
ブーテル・K.E.
ファン・ラールテD.H.
グルンA.K.
Nieuwdorp M.
肥満および肥満に関連する代謝異常の病態における腸内細菌叢の役割。
Gastroenterology. 2017; 152: 1671-1678
記事で見る
スコープス(263)
PubMed
アブストラクト
全文
全文PDF
Google Scholar
キューベック R.
ボネ・リポールC.
ホフマンC.
ウォーカーA.
ミュラーV.M.
シュッペルV.L.
et al.
食餌性脂肪と腸内細菌叢の相互作用がマウスの食餌性肥満を決定する。
Mol Metab. 2016; 5: 1162-1174
記事で見る
スコープス (0)
パブコメ
クロスフィルム
グーグル奨学生
フライスナーC.K.
ヒューベルN.
アブド・エル・バリーM.M.
Loh G.
クラウス S．
ブラウト M.
腸内細菌叢の欠如は、食事誘発性肥満からマウスを保護しない。
Br J Nutr. 2010; 104: 919-929
記事で見る
スコープス (332)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
コロジエジツク A.A.
鄭D.
シボレットO.
エリナブ E．
NAFLDとNASHにおけるマイクロバイオームの役割。
EMBO Mol Med. 2019; 11
記事で見る
スコープス(272)
パブコメ
クロスレフ
グーグル奨学生
ベックヘド F．
マンチェスターJ.K.
セメンコビッチC.F.
ゴードン・J.I.
無菌マウスの食事誘発性肥満に対する抵抗性を支えるメカニズム。
Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104: 979-984
記事で見る
スコープス (1960)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
ラボー S．
メンブレスM.
ブリュノー A.
ジェラールP.
ハラハ T.
モーザーM.
ら。
胚性C57BL/6Jマウスは高脂肪食によるインスリン抵抗性に抵抗性があり、コレステロール代謝が変化している。
FASEB J. 2010; 24: 4948-4959
記事で見る
スコープス (474)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
モレッティ C.H.
シファーT.A.
リー X.
ワイツバーグE.
カールストレム M.
Lundberg J.O.
無菌マウスは食事で誘発される肥満と代謝機能障害から保護されない。
Acta Physiol (Oxf). 2021; 231e13581
論文で見る
スコープス (11)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
Tacke F.
肝疾患を治療するために肝マクロファージを標的とする。
J Hepatol. 2017; 66: 1300-1312
記事で見る
スコープス(525)
PubMed
アブストラクト
全文
全文PDF
Google Scholar
タッケ F．
ツィンマーマンH.W.
肝障害と線維化におけるマクロファージの不均一性。
J Hepatol. 2014; 60: 1090-1096
記事で見る
スコープス(645)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
Google Scholar
ラマチャンドランP.
ドビーR.
ウィルソン-金森J.R.
ドーラ E.F.
ヘンダーソンB.E.P.
ルウ N.T.
他
ヒト肝硬変の線維性ニッチを単一細胞レベルで解明する。
Nature. 2019; 575: 512-518
記事で見る
スコープス (549)
パブコメ
クロスレフ
グーグル奨学生
スペンサー J．
ソリッドL.M.
ヒト腸管B細胞反応。
Mucosal Immunol. 2016; 9: 1113-1124
記事で見る
スコープス (0)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ローリ V.
ガルウィッツM.
ヴォスニング T.
フレミング A.
シャメルW.W.
ズールンC．
ら。
Syk/ITAM正帰還ループによるB細胞抗原受容体シグナリングの増幅。
Mol Cell. 2002; 10: 1057-1069
記事で見る
スコープス (0)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ステパネク O.
ドラバーP.
ドロベック A.
ホレイシV.
Brdicka T.
B細胞抗原受容体シグナルの開始におけるSrcファミリーキナーゼとSykの重複しない役割。
J Immunol. 2013; 190: 1807-1818
記事で見る
スコープス (24)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
ワン・W.H.
クリセンコ M.O.
ヒギンズR.L.
モーマンR.E.（Morman R.E.
ゲアレンR.L.
化学遺伝学によるSYK機能研究のためのマウスモデルは、TLR4ではなくB細胞受容体を介したSYK依存的なシグナル伝達を実証している。
Immunohorizons. 2019; 3: 254-261
記事で見る
スコープス (0)
パブコメ
クロスフィルム
グーグル奨学生
ハイズマンB.
レスM.
Infantino S.
Sykは、B細胞抗原受容体からのシグナル出力を自己制御する二重特異性キナーゼである。
Proc Natl Acad Sci U S A. 2010; 107: 18563-18568
記事で見る
スコープス (39)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
ゴベッシ S.
ラウレンティL.
ロンゴ P.G.
カルセッティL.
ベルノ V．
シーカ S．
他
慢性リンパ性白血病B細胞における構成的およびBCR誘導性のSyk活性化阻害は、Mcl-1をダウンレギュレートし、アポトーシスを誘導する。
Leukemia. 2009; 23: 686-697
記事で見る
スコープス (0)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
フリードマンS.L.
ラッツィウV.
ハリソンS.A.
アブデルマレクM.F.
アイタルG.P.
カバレリアJ．
他
線維化を伴う非アルコール性脂肪肝炎の治療に対するセニクリビロクの無作為化プラセボ対照試験。
Hepatology. 2018; 67: 1754-1767
記事で見る
スコープス(456)
パブコメ
クロスレフ
グーグル奨学生
マルティネス-チャンター M.L.
デルガド T.C.
ベラザ N.
非アルコール性脂肪性肝疾患におけるナチュラルキラー細胞の役割の再検討。
Front Immunol. 2021; 12640869
記事で見る
スコープス (12)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
デュフールJ.F.
コーシーC.
Loomba R.
非アルコール性脂肪肝炎に対する併用療法：理論的根拠、機会、課題。
Gut. 2020; 69: 1877-1884
記事で見る
スコープス(83)
パブコメ
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記事情報
掲載履歴
受理されました： 2023年4月11日
改訂版受理 2023年4月5日
受理された： 2023年2月2日
出版段階
インプレスジャーナル プレプルーフ
同一性確認
DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhep.2023.04.037
著作権について
© 2023 The Author(s). Elsevier B.V. on behalf of European Association for the Study of the Liverによって発行されました。
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図1B-cellはNASHとその後のHCC発症をサポートする。(A）6ヶ月間飼育したWT ND、CD-HFDおよびJH-/- CD-HFD雄マウス由来の肝臓切片の代表的H&E染色。(B）NAFLDスコア（NAS）評価（n=8）。(C) 血清ALT値(n=9)。(D）6ヶ月間飼育した雄マウスの肝臓切片の代表的なスダンレッド分析。(E-G）6ヶ月間飼育した各遺伝子型／グループの肝臓由来の（E）肝CD8＋CD62L＋およびCD8＋CD62L-T細胞、（F）CD8＋TNF＋細胞、（G）CD8＋IFNγ＋細胞について、6ヶ月間飼育したオスマウス（n＝5）の肝臓フローサイトメトリー分析の総数（絶対数）の定量（数字は％表示）である。(H）B細胞枯渇抗体抗CD20（αCD20）で処理したWT CD-HFD雄マウスの処理スキーム。(I）肝臓CD19＋およびCD20＋細胞、ならびに（J）ラミナプロプリア小腸CD19＋およびCD20＋細胞のフローサイトメトリー解析の定量化、コントロールおよびWT CD-HFD αCD20処理雄性マウスの比較（n≧3）。全てのマウスは6ヶ月間飼育した。(K）肝臓切片の代表的なH&E染色。(L）マウスのNAS評価（n=5）。(M）雄マウス（n=5）の血清ALT値。(N）コントロールおよびWT CD-HFD αCD20処理雄マウスの肝臓切片の代表的なスダンレッド染色である。(O）雄マウスにおける肝トリグリセリドの解析（n≧3）。(P-S）コントロール処理およびWT CD-HFD αCD20処理雄マウス（n≧3）を比較したフローサイトメトリー解析の（P）肝CD8＋CD62L＋細胞およびCD8＋CD62L-細胞の定量化；（Q）肝CD8＋TNF＋細胞および（R）CD8＋IFNγ＋細胞の定量化。(S) WT CD-HFD腫瘍およびJH-/- CD-HFDの非罹患肝臓の代表的なH&E染色およびゴルジ蛋白73（GP73）、コラーゲン-IVおよびKi67のIHC染色；12ヶ月のCD-HFDマウスから。スケールバーは、H&E：500μm（左）および100μm（右）；GP73：100μm；コラーゲン-IV：100μm；Ki67：100μm（矢印で描かれた陽性肝細胞）を表す。(T) CD-HFDを12ヶ月間与えたWTマウスとJH-/-マウスの非腫瘍（NT）と腫瘍（T）をまとめたグラフ（記号は個々のマウスを表すため、マウス数を示す）、データはフィッシャーの正確検定で分析した。すべてのデータは、平均値±SEMで示される。統計解析は、非対称T-テストまたはANOVAを用いて行った。表示されたスケールバーは100μmを表す。
図2腸管B細胞はNASHを引き起こすのに十分である。(A) 6ヶ月間飼育したWT ND、WTおよびμMT CD-HFD雄マウスの肝臓切片の代表的H&E染色。(B）NAS雄性マウス（n=6）。(C）雄マウスの血清ALT値（n≧6）。(D) 肝臓切片の代表的なスダンレッド染色。(E）肝CD8+CD62L+およびCD8+CD62L-T細胞、（F）CD8+TNF+細胞および（G）CD8+IFNγ+細胞のフローサイトメトリーの絶対定量（n＝4）。(H）雄マウス（n＝3）の脾臓CD19＋、B220＋およびIgA＋細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーにより評価した。(I）腸間膜リンパ節雄性マウス（n=3）のCD19+、B220+およびIgA+細胞の割合、フローサイトメトリーにより評価した。(J）雄マウス（n≧3）の小腸組織のIgAレベル、ELISAにより測定した。(K）6ヶ月の雄マウスの小腸切片の代表的なIgA染色（上段：スケールバー200μm、下段スケールバー：100μm）。(L）6ヶ月のμMT CD-HFDおよびμMT CD-HFD αCD20処理雄マウスの肝臓切片の代表的なH＆E染色である。(M）雄マウスの肝臓切片の代表的なスダンレッド染色である。(N）雄マウスのNAS評価（n＝4）。(O）雄マウスのALT値（n=4）。(P）ラミナプロプリアCD20+IgA+細胞のフローサイトメトリー分析定量化。(Q）肝CD8+CD62L+細胞およびCD8+CD62L-細胞および（n=4）の絶対定量化。(R）肝CD8＋TNF＋細胞および（S）CD8＋IFNγ＋細胞、WT ND、μMT CD-HFDおよびμMT CD-HFD αCD20処理雄マウスの比較（n＝4）。(T）WTおよびμMT CD-HFD腫瘍（12ヶ月食下）におけるゴルジタンパク質73（GP73）およびKi67の代表的なH＆EおよびIHC染色である。スケールバー H/E：500μm（左）および100μm（右）；GP73：100μm；Ki67：100μm（矢頭で描かれた陽性肝細胞）。(U）CD-HFDを12ヶ月間与えたWTおよびμMTマウス（n≧60）の非腫瘍（NT）および腫瘍（T）を要約したグラフ。記号は個々のマウスを表す。データはフィッシャーの正確検定で解析した。(V）12ヶ月のWTおよびμMT CD-HFDマウス（n≧3）における結節のサイズの定量化。すべてのデータは、平均±SEMとして示される。統計解析は、不対T-testを用いて行った。スケールバーは100μmを表す。
図3B-細胞は代謝的に活性化し、NASHマウスの固有層でT細胞とともにクラスターを形成する。データはすべて小腸を表す。(A-J) WT ND、WT CD-HFDおよびμMT CD-HFD雄マウス（≧4）の小腸ラミナプロプリアを比較したフローサイトメトリー解析の代表的疑似カラープロットおよび定量化である： (B）CD20+CD19+、CD20+CD19-、CD20-CD19-細胞、（C）IgD+IgM+、IgD+IgM-、IgD-IgM+細胞、（D）CD20+MHCII+細胞、（E）CD20+IgA+細胞、（F）CD20+IgA+MHCII+細胞、のパーセンテージ、 (G）IgA+細胞とCXCR4+細胞の代表的な疑似カラープロット、（H）CD20-IgA+CXCR4+細胞のパーセント、（I）IgA+B220-CD20-細胞、（J）IgA+B220-CD20-CXCR4+細胞。(K) B細胞を表示する雄マウス（n=9）のフローサイトメトリー解析から得られたT-distributed stochastic neighbour embedding（opt-SNE）グラフの自動最適化されたパラメータ。左側のopt-SNEプロットは、CD20、B220およびIgAのスケーリングされた発現を示す。(L）T細胞を表示する雄マウス（n＝9）のフローサイトメトリー解析からのOpt-SNEグラフ、CD8α、CD44およびPD1のスケールされた発現を示す。(M）B220＋細胞およびCD8＋細胞の小腸ラミナプロプリア染色の代表的な高解像度共焦点顕微鏡および3D再構成画像（黄色の部分は、B220＋細胞およびCD8＋細胞の接触点を示す）、および（N）WT NDおよびWT CD-HFD におけるB220＋／CD8＋相互作用細胞のクラスター（視野、FOVあたりの相互作用細胞の数）の定量化（n＝3、各マウスのN＝8 FOV）。(O、P）WTおよびμMT CD-HFDから分離した小腸ラミナプロプリアFACSソートした（O）CD20+細胞または（P）B220+細胞とWT NDとで有意に異なる免疫系関連遺伝子および代謝プロセス関連遺伝子のヒートマップをzスケール値で示す。(Q）雄マウス（食餌6ヶ月）由来の小腸から単離された全生存B細胞のフローサイトメトリー定量化（n＝4）。(R）紫色光の照射により緑色から赤色に変化する光変換性蛍光Kaedeタンパク質を有するトランスジェニックマウスモデルKaedeマウスを用いて行ったフローサイトメトリーの説明図：赤色に染色された免疫細胞は小腸から肝臓への移動を示し、代わりに緑色に染色された細胞は他の器官からの移動免疫細胞。(S) 左側は、フローサイトメトリー解析による肝臓CD3+CD19-細胞（n≧5）の頻度。右側は、ND、CD-HFDおよびWD-HTCマウス（n≧5）におけるKaede赤または緑の肝臓B220＋CD19＋細胞のフローサイトメトリー分析からの幾何学的平均蛍光強度（gMFI）である。(T）CD44＋CD8＋細胞からの脾臓CD8＋CD69＋、CD8＋CD25＋、CD8＋PD1＋、CD8＋CXCR6＋およびCD8＋CTL4＋細胞のフローサイトメトリー解析のパーセンテージ；健康マウスから単離した脾臓T細胞、Dynabeads（抗CD3／CD28）で刺激し、WT NTまたはWT CD-HFDから分離した腸B細胞と24または48時間共培養をした。追加の処理として、DynabeadsとLFA-1ブロッカー、またはICAM-1ブロッカー、またはMHC-Iブロッカーを加えた（n=4）。すべてのデータは、平均値±SEMで示される。統計解析は、対にならないT-testを使用して行われた。
図4B細胞によるイムノグロブリン分泌はNASH発症に必須である。(A）6ヶ月間飼育したWT ND、WT CD-HFDおよびIgMi CD-HFDマウスの肝臓切片の代表的なH&E染色。(B）食餌開始後6ヶ月の雄マウスのNASおよび（C）体重測定（n≧5）。(D)血清学的ALT雄性マウス(n≧5)。(E)肝臓切片の代表的なスーダンレッド。(F-I）雄マウス（n≧4）の（F）肝総CD8＋CD62L＋およびCD8＋CD62L-細胞、（G）総CD8＋TNF＋細胞、（H）総CD8＋IFNγ＋細胞、（I）総CD19＋細胞についてのフローサイトメトリによる定量化である。(J）雄マウスにおけるB220+/CD8+相互作用細胞の肝クラスターの定量化（WTコントロールはn=3、IgMi CD-HFDマウスはn=2、各マウスのFOVはn=8）。(K）B220+細胞およびCD8+細胞の小腸ラミナプロプリア染色の代表的な高解像度共焦点顕微鏡および3D再構成画像（黄色の部分はB220+細胞とCD8+細胞の細胞間コンタクトを示す）。(L）小腸CD20+細胞、IgA+細胞、MHCII+細胞、CD8+細胞のフローサイトメトリー解析の定量化である。すべてのデータは、平均値±SEMで示した。統計解析は対にならないT-testで行った。スケールバーは100μmを表す、または指示通り。
図5IgAを介してマクロファージで活性化されたFcRシグナルがNASHの肝線維化を促進する。(A) WT NDおよびWT、JH-/-、WT αCD20処理、μMT、IgMi、AIDg23sマウス（いずれも6ヶ月間CD-HFD下）の肝臓からのシリウスレッド染色代表画像。(B）上記マウス群における線維化の程度（軽度0.5〜2％；中等度2〜5％；重度5％以上）で分けた線維化発生率の割合である。(C）CD-HFD下のWT NDおよびWT、JH-/-、WTαCD20処理、μMT、IgMiマウスの総CD45+Ly6G-Cd11c-F4/80+CD11b+Ly6C+細胞の肝フローサイトメトリー分析の定量化（n≥3）。(D）4ヶ月のWT ND、WT CD-HFD、WT WD-HTFまたはCDA-HFDからの肝臓のシリウスレッド定量化（n≥4）。(E）4ヶ月ND、WD-HTF及びCDA-HFD（全てWT）飼育マウスの肝臓からCD45＋細胞を選別し、10倍シングルセルRNA-seq実験を行った（n≧2）；4ヶ月ND、WD-HTF及びCDA-HFDの肝臓からシングルセルRNA配列したCD45＋細胞を可視化した代表的な均一多様体近似及び投影（UMAP）プロットは、3グループ間で個々の細胞の空間位置を青い色で示す。(F) FACSで選別されたCD45+の免疫細胞集団を可視化したUMAPプロット。表示された同定免疫細胞集団は、単球由来マクロファージ（MoMF）/単球、クッパー細胞（KC）、樹状細胞（DC）、好中球、T細胞、B細胞、プラズマB細胞、ダイビング細胞、NKT細胞、自然リンパ球（ILC）（G）すべてのマウスグループの単一細胞RNA配列CD45+細胞の細胞クラスター（括弧内の細胞数を報告する伝説）を可視化するUMAPプロット。(H）4ヶ月のND、WD-HTFおよびCDA-HFDマウス（n≧2）の食事実験条件（1、3、6）下で主に分化したMoMFsクラスターの相対パーセンテージを示す存在量プロットである。(I）NDマウス（n≧2）に対するCDA-HFDまたはWDを比較した、最も関連するMoMFsクラスターにおけるFcgr1のmRNA発現を示すダブルバイオリンプロットである。(J）CD-HFDを与えた6ヶ月のWTおよびFcRγ-/-雄マウスの肝臓切片の代表的なH＆E染色である。(K）CD-HFDを与えた6ヶ月のWTおよびFcRγ-/-雄マウスの肝臓切片の代表的なシリウスレッド染色と定量化（n＝4）。(L）CD-HFDを摂取させたWTおよびFcRγ-/-雄マウスの総CD45+Ly6G-Cd11c-F4/80+CD11b+Ly6C+細胞の肝臓フローサイトメーター解析の数値化（n=4）。(M）CD-HFD雄マウスにおける血清学的IgAおよびシリウスレッド陽性を示す相関図（n≧3）。(N）肝臓切片のFCGR1染色の代表的なIHC画像、および（O）FCGR1+凝集体（mm2あたり）（n≧3）およびリンホHCK（mm2あたり）（n≧3）の定量化。(P）1mm2あたりのFCGR1+凝集体とシリウスレッド陽性、1mm2あたりのp-HCK+細胞とシリウスレッド陽性を示す相関プロット（n≧3）。(Q）12週齢のWTまたはFcRγ-/-BMDMから、WT ND、WT CD-HFDまたはμMT CD-HFDの6ヶ月食下（n≧2）の血清で、IgA単独またはFc-ブロッカーとの組み合わせで刺激後、qRT-PCRで測定した主要プロファイブロジック遺伝子の相対mRNA発現量。補体タンパク質は、56℃で30分間の血清前処理で不活性化した。すべてのデータは、平均値±SEMで示した。統計解析は、不対T-testを用いて行った。スケールバーは100μmを表す。
図6NASH食の無菌マウスを含むモデルの概要（A）この研究調査で適用したすべてのマウスモデルにおけるNASH表現型、B細胞／免疫グロブリン型、線維化、B-T細胞相互作用およびHCCを示す表である。(B）NASHの文脈におけるラミナプロプリアCD20+IgA+B細胞の役割を示すグラフの要約。後者は、門脈を経由して、前膜から肝臓に移動することがある。二次リンパ器官（脾臓など）由来のIgA+B細胞は、単球由来マクロファージ（FCGR1、S100a4、Ly6C、CD11b、F4/80陽性）におけるFcRγシグナルの活性化を通じてIgA+を介して肝臓線維症に寄与しています。(C) 6ヶ月間飼育したGF WT NDおよびGF WT CD-HFD雄マウス由来の肝臓切片の代表的なH&E染色像である。(D）GF雄マウス（CD-HFDを6ヶ月間投与）由来の肝臓切片の代表的なスダンレッド染色である。(E）総CD8＋細胞、CD8＋CD62L＋およびCD8＋CD62L-細胞、CD8＋TNF＋細胞、およびCD8＋perforinhigh細胞について6ヶ月間のGF ND、およびGF CD-HFDを比較した肝臓フローサイトメーター分析の定量値（n＝4）。(F) GF NDおよびGF CD-HFDマウスのB220、CD3、F4/80およびMHCII染色についての肝臓切片の代表的なIHC画像および(G) mm2あたりの定量（n=5)。(H）GF雄マウス（n＝4）のCD20＋CD19＋、CD20＋CD19-およびCD20-CD19＋細胞の小腸フローサイトメトリー解析の定量化である。(I）GF雄マウス（n＝3、各マウスn≧4FOV）のB220＋細胞およびCD8＋細胞の小腸ラミナプロプリア染色（黄色の部分はB220＋細胞とCD8＋細胞の接触点を示す）、および（J）B220＋／CD8＋相互作用細胞のクラスターの定量化、についての代表的高解像度共焦点顕微鏡および3D再構成画像である。すべてのデータは、平均値±SEMで表示されている。統計解析は、対にならないT-testを用いて行った。スケールバーは100μmを表す。
図7NAFLD罹患患者における腸管B細胞と肝ミエロイド細胞 (A) NAFLおよびNASH罹患患者のCD20染色空腸の代表サンプル。(B）NAFL、およびNASH患者の空腸におけるCD20+細胞の定量化、mm2あたり（n≧4）。(C）NAFLおよびNASH患者のjejunaにおける免疫細胞（B細胞またはミエロイド細胞）のPhospho-SYK定量化（n≧5）。(D）線維化スコア（Brunt/Kleinerスコア）に基づき2つのサブグループ（F0-F2およびF3-F4）に分けられたNAFLD患者におけるIgAレベルの血清測定（n≧233各群、合計n＝639）。(E）639人のNAFLD患者コホートにおけるIgA血清レベルと線維化ステージの相関プロット。(F）肝門部炎症の有無により2つのサブグループに分けられたNAFLD患者におけるIgAレベルの血清測定（n≧233各グループ、合計n=639）。(G）639人のNAFLD患者コホートにおけるIgA血清レベルと門脈炎症スコアの相関図。(H）NAFLD患者およびNAFL患者に対して線維化の程度が異なる患者（合計n=206）から得られた、単球由来マクロファージの表現型、FcRγシグナルおよび線維形成に関与する選択遺伝子のトランスクリプトミクス解析によるlog2倍変化値を示すヒートマップである。(I-K）線維化ステージと門脈または実質の（I）FCER1G+細胞/mm2、（J）CCR2+細胞/mm2、（K）S10014+細胞/mm2の相関プロット（n=31）．(L）NAFLD患者における、線維化なし/非常に低い線維化（F0/F1）および線維化高い（F3）のFCER1G、CCR2およびS100A4のIHC代表画像と、門脈および実質の定量化染色細胞について2つの線維化サブグループにおけるそれらの定量値（M）（n≧11）。(N）健康なドナーおよびNAFLD-肝硬変患者からの、組織単球（TM）、クッパー細胞（KC）、および瘢痕関連マクロファージ（SAMac）に分けられた、肝臓CD45+ FACS選別細胞およびその後のシングルセル10X RNA配列決定、および以下の各ミエロイド下位集団の割合を示すUMAPプロット（n≥5）。(O）SAMac集団における健常ドナーおよび肝硬変患者の間で最も変動が大きい遺伝子上位100個を示すヒートマップ（n=5）。(P）健常者ドナーおよびNAFLD・肝硬変患者SAMAc集団におけるFCGR1A遺伝子のmRNA発現スコアを示すUMAPプロット、および以下の統計解析結果（n≧5）。(Q）健常者ドナー肝臓およびNAFLD/ALD肝硬変SAMAc患者集団における活性化FcRγシグネチャー（Reactome）の発現スコア、および以下の統計解析（n≧5）。すべてのデータは、平均値±SEMで表示されている。統計解析は、不対T-testを用いて行った。IHCのスケールバーは100μm、免疫蛍光のスケールバーは50μmを表す。
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