移動性遺伝要素による遺伝子の水平移動を介した微生物進化

2024年1月27日 18:37

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移動性遺伝要素による遺伝子の水平移動を介した微生物進化

https://ami-journals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1751-7915.14408

徳田真帆新谷正樹
初出：2024年1月16日
https://doi.org/10.1111/1751-7915.14408
本誌について
セクション

要旨
移動性遺伝要素（MGEs）は細菌の水平遺伝子転移（HGT）に不可欠であり、細菌の急速な進化と適応を促進する。MGEsには、プラスミド、統合エレメント、結合エレメント、トランスポゾン、挿入配列、バクテリオファージなどが含まれる。特に、公衆衛生に深刻な脅威をもたらす抗菌薬耐性遺伝子（ARG）の拡散は、主にMGEsを介したHGTに起因している。このミニレビューは、微生物においてMGEがHGTを媒介するメカニズムの概要を提供することを目的としている。具体的には、様々な環境や条件下における結合プラスミドの挙動について議論し、MGEsの動態を追跡するための最近の方法論について要約した。HGTの根底にあるメカニズムと、細菌の進化と適応におけるMGEの役割を包括的に理解することは、ARGの拡散に対抗する戦略を開発する上で重要である。

はじめに
水平遺伝子導入（HGT）は、細菌の急速な進化と適応において極めて重要な役割を果たしている。細菌は形質転換、トランスダクション、コンジュゲーションなど、様々なメカニズムを通じてHGTを受ける（Aminov, 2011; Arnold et al., 2022; Frost et al.）最近、外膜小胞を介したHGTが同定されたが（Abe et al., 2020; Domingues & Nielsen, 2017）、その他のHGTは、レプリコン間（細胞内移動性）または細菌細胞間（細胞間移動性）を移動できるDNA分子である移動性遺伝要素（MGE）によって媒介される。MGEには、共役性DNAエレメント（プラスミドや統合・共役エレメント[ICE]）、トランスポゾンDNAエレメント（トランスポゾンやインテグロン）、バクテリオファージなどが含まれる（図1）。MGEは、抗菌性遺伝子や金属耐性遺伝子、病原性遺伝子、異化遺伝子など、さまざまな遺伝子を持つ。近年、抗菌薬耐性（AMR）菌が公衆衛生に対する深刻な脅威となっている。抗菌薬耐性遺伝子（ARG）は、ARGに関連するMGEのHGTによって拡散する（Rodríguez-Beltránら、2021年）。さらに、MGEはAMR菌の多様化を促進する（Che et al.）したがって、さまざまな条件下で微生物がHGTを介して遺伝子を交換するメカニズムを理解することは、細菌の進化と適応、さらにはARGの蔓延の疫学的基盤に関する重要な知見を提供することになる。このミニレビューは、様々な環境下におけるHGTを介した微生物の進化について、MGEの特徴と最近の研究成果を包括的に要約することを目的とした。

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図1
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パワーポイント
キャプション
代表的なMGEの一般的特徴
環境中のMGEsを同定することは、異なる環境における異なる細菌間での拡散の可能性を理解する上で極めて重要である。さらに、MGEsの分類範囲を理解することは、その固有の特徴を推定するために不可欠である。このセクションでは、各MGEの特徴と、同定および分類のために採用されている現在の方法（またはツール）について簡単に説明します。

バクテリオファージ
バクテリオファージまたはファージは、細菌や古細菌に感染して複製する核酸（DNAまたはRNA）を包含するタンパク質カプシドから構成されています（Moineau, 2013）。ファージは地球上で最も豊富な生物体である（Comeau et al.）宿主ゲノム内での統合と切除の際、ファージDNAと宿主ゲノムは、隣接する細菌遺伝子の共存とともに交換される可能性があり、その結果、いくつかの遺伝子のHGTが起こり、ファージが微生物の進化を促進する上で重要な役割を果たしていることを示している（Aylward & Moniruzzaman, 2022; Balcázar, 2018; Brown-Jaque et al.）

発見後、ファージの同定と分類群への割り当ては、ファージの多様性を理解するための重要なステップである。正式な分類学は、ウイルスをいくつかの分類学的レベルで整理する国際ウイルス分類学委員会（International Committee on Taxonomy of Viruses）によって確立された（Adams et al. ファージは、核酸の組成（一本鎖または二本鎖DNAまたはRNA）、形態、カプシドタンパク質の有無とその構造、塩基配列の類似性、宿主範囲など、いくつかの特性に基づいて同定または分類される（Dion et al.）しかし、バクテリオファージのゲノム配列はいくつか決定されており、多くのファージはまだ同定・分類されていない。PHAST（ファージ検索ツール、2011年リリース）とその後継のPHASTER（ファージ検索ツール強化版、2016年リリース）は、細菌ゲノム中のプロファージを同定するために広く使われているウェブツールである（Arndt et al.）最近、PHASTとPHASTERの後継として「PHASTEST」がリリースされた（Wishart et al.）ゲノム配列に基づくファージの同定と分類のために、いくつかのツールが開発されている。普遍的なマーカー遺伝子がないことやファージのモザイク構造のために、ファージの包括的な系統樹を作成することは困難であるが、オーソログマーカーを用いた配列ベースの系統解析は、近縁のファージを分類するのに適している（Reyes et al.）さらに、ゲノムシグネチャーやファージプロテオミクスツリーもファージの分類に採用されているが、このアプローチは温帯ファージの改良過程のため適していない(Deschavanne et al., 2010; Vernikos et al., 2007)。さらに、タンパク質クラスターと二分割ネットワークベースの距離に基づくvConTACTは、dsDNAファージゲノムを分類群に割り当てるのに有用であるが、特定の共有遺伝子に関する情報が欠けている(Bin Jang et al., 2019; Bolduc et al., 2017)。さらに、隠れマルコフモデル（HMM）に基づく検索とクラスタリングは、タンパク質ファミリーや分類学的遺伝子を特徴付けるのに効率的であるが、十分に記述されたサンプルデータセットが必要であり、すべてのファージの多様性を捕捉できない可能性がある（Reyes et al.）全体として、それぞれの手法には利点と欠点があり、すべての未知または未発見のバクテリオファージを包括的に同定、配列決定、分類するためには継続的な努力が必要である。

プラスミド
プラスミドは環状または直鎖状の染色体外レプリコンであり、コンジュゲーションによって伝播することができる（Coluzzi et al.）特に、様々な遺伝子が結合を介して細菌間で効果的に拡散することができ（Guglielmini et al. プラスミドの同定と分類は、その複製、維持、共役転移の特徴に基づいていくつか提案されている。非互換性（Inc）グループ分けは、2つの異なるプラスミドの宿主表現型に基づいている（Novick, 1987）。同じIncグループに属する異なるプラスミドは非互換性であり、同じ細胞株から受け継ぐことはできない。例えば、腸内細菌科、シュードモナス属、ブドウ球菌と腸球菌のプラスミドはそれぞれIncAからIncZ、IncP-1からP-14、Inc1からInc18を含む。複製システムとは別に、パーティションシステム、表面排除システム、入口排除システムなどの他の要因も、2つのプラスミドの適合性に影響を与えうることに注意すべきである（Garcillan-Barcia & de la Cruz, 2008; Novick, 1987）。配列決定技術の進歩とプラスミドゲノム情報の蓄積により、複製開始タンパク質（RIP）の遺伝子は、「レプリコンタイピング」として知られるプラスミド分類のための普遍的マーカーとして使用されている。GR」はアシネトバクター、特にアシネトバクター・バウマンニにおける、レプリコンタイピングに基づくプラスミドグループである。GR1からGR19は、RIPをコードする遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）タイピングに基づいて分類される（Bertini et al.）さらに、GR20からGR61は上記のタイピングスキームに従って提唱されており、少なくとも80％のヌクレオチドカバレッジと、同一グループ内のRIP遺伝子の少なくとも75％のヌクレオチド同一性を有する（Castro-Jayimesら、2022；Chenら、2022；Liら、2022）。注目すべきことに、アシネトバクターのプラスミド内のRIPとそれに隣接するDNA配列を包含する遺伝的内容は類似しており、プラスミドの一部が同じ不和合性グループ内にあることを示唆している（Salgado-Camargo et al.）別のレプリコンタイピング手法であるrep_clustersは、既知のレプリコンとのマッシュ距離メトリックを用いたクラスタリング解析により開発され、新規なプラスミド分類アプローチを提供している（Douarre et al., 2020; Robertson & Nash, 2018）。レプリコンタイピングはプラスミドの分類システムとして広く使われているが、複数のRIP遺伝子とoriV領域を持つ複数のレプリコンを分類するのは容易ではない。De la Cruz Barronら(2023)は、MOBファミリーおよびMPFファミリーをプラスミドの分類に使えると提案した(Garcillán-Barciaら, 2009; Smillieら, 2010)。特に、PlasmidFinderとMOB-suiteは、それぞれレプリコンタイピングとMOBおよびMPFタイピングに基づくプラスミド分類のために広く使用されているツールである（Carattoli et al.）これらのプラスミド分類システムは現在、新規データベースCOMPASS (Douarre et al., 2020)で統一されつつあるが、シュードモナスにおける不和合性グループ（IncP-1からIncP-14）の分類には重大な誤りが含まれていた（IncP-7とIncP-9プラスミドが「IncP」として不正確に記述されていた）。最近、プラスミド同定のために、プラスミド間の平均塩基配列同一性に基づくプラスミド分類単位（PTU）が提案された（Cuartas et al.） COPLAは、PTUに基づいてプラスミドを分類するためのウェブツールとして開発された（Redondo-Salvo et al.、2021）。しかし、いくつかのPTUは、プラスミド中の長いサイズのアクセサリー遺伝子の影響を受けるため、過去の分類とは異なる結果を示す。例えば、トルエン分解遺伝子（pWW0）やナフタレン分解遺伝子（NAH7）を含むIncP-9の代表的なプラスミドであるpWW0とNAH7は、同じPTUには分類されない。これらの分類は、未知のプラスミドの特徴を理解し、予測するのに有効である。

染色体に組み込まれたMGE
最近、ICEs、integrative mobilisable elements (IMEs)、cis-mobilisable elements (CIMEs)など、染色体上に統合されたMGEs (ciMGEs) がいくつか同定された (Botelho, 2023)。ICEは自己伝達可能な結合エレメントであり、通常は宿主染色体に組み込まれる（Delavat et al.） ICEの転移は、ドナーとレシピエントの細胞間でIV型分泌系を持つ交配ペアが形成され、その後にドナーからレシピエント細胞へ一本鎖DNA分子が転移するコンジュゲーションによって開始される。ICEは一旦移入されると、レシピエントの染色体に組み込まれ、そこで持続し、次世代で再び移入される。IMEはICEと似ていますが、IMEはそれ自体を転移させることはできません。IMEは宿主染色体に統合することができるが、結合に必要な遺伝子を持たないため、他の細菌細胞への動員や移行は、結合プラスミドやICEを含む他の結合エレメントの存在に依存する。CIMEは組換え部位（attLとattR）に挟まれており、それらはICEまたはIMEと結合しているインテグラーゼによって認識されるが、CIMEはコンジュゲーションや組換えに必要な遺伝子を持たない（Bellangerら、2014；Guédonら、2017）。プラスミドと同様に、これらのエレメントは病原性因子や代謝形質、ARGなどをコードする遺伝子を運ぶことができる。いくつかのICEがICEBerg (Bi et al., 2012; Liu et al., 2019)またはIntegrative and Conjugative Element Ontology (ICEO, https://ontobee.org/ontology/ICEO/) (Liu et al., 2022)データベースに寄託されている。現在、20,000以上の細菌および古細菌ゲノムにおいて13,000以上のciMGEが同定されており、IMEはICEよりも豊富である（Botelho, 2023）。

トランスポゾン
トランスポゾンは、トランスポザーゼ活性を介してレプリコン間を移動する遺伝要素である（Mahillon & Chandler, 1998）。トランスポゾンは細胞間移動はできないが、プラスミドやICEに組み込まれると、他の細胞に移動することができる(Frost et al., 2005)。トランスポゾンは通常、トランスポゾン転移を触媒するトランスポザーゼ酵素をコードする遺伝子を含んでいる。挿入配列（IS）は、末端反転反復配列（TIR）に挟まれた1つか2つのトランスポザーゼ遺伝子からなる最小トランスポゾンである（Mahillon & Chandler, 1998）。

トランスポザーゼはTIRを認識して結合し、二本鎖DNAを反復配列内の特定の位置で切断する。その後、DNA-トランスポザーゼ複合体は標的DNAに挿入することができる（Bordenstein & Reznikoff, 2005）。トランスポゾンの中には、ARGや他の形質の拡散に寄与する遺伝子を持つものもある。同じISエレメントが複数コピーされると、相同組換えを介してゲノムの再配列を促進する可能性がある(Mahillon & Chandler, 1998)。

トランスポゾンは、その転移機構（保存的または複製的）、そのTIR、またはDDE、DEDDまたはHUH（疎水性アミノ酸で区切られた2つのヒスチジン残基）モチーフとして知られるトランスポザーゼの保存アミノ酸配列に基づいて分類される（Partridge et al.）現在利用可能なトランスポゾンのデータベースには、TnCentral (https://tncentral.ncc.unesp.br/)とISfinder (http://www-is.biotoul.fr/ISfinder)があり、約400のトランスポゾンが適切に注釈付けされている。これらのデータベースは、様々なサンプルにおけるトランスポゾンの多様性を評価するための貴重なリソースとして機能するだけでなく、ゲノム配列中の特定のトランスポゾンを同定し、手動でアノテーションするためのダウンロード可能なソフトウェアも提供している。

インテグロン
インテグロンは、トランスポゾンやciMGEのようにトランスポーズやトランスファーされることはないが、細菌間のARGの拡散に重要な役割を果たす遺伝子エレメントである。全てのインテグロンは、intI1の内部領域にインテグラーゼ遺伝子（intI1）、組換え部位（attI）、プロモーター（Pc）を持つ（Escudero et al.） attI部位は、ARGや他の機能性遺伝子を含む小さなDNA断片である遺伝子カセットが挿入される場所である。IntI1は遺伝子カセット内のattI部位とattC部位を認識し、attI部位とattC部位間の部位特異的組換えを触媒し、その結果、カセットがインテグロン構造に挿入される。新たに獲得された遺伝子カセットはPcプロモーターから転写される。インテグロンは、1つの構造内に複数の遺伝子カセットを保有することで、様々なARGを急速に蓄積し、細菌集団に拡散させることができる。

インテグロンはintI1配列の違いからいくつかのカテゴリーに分類される（Deng et al.）現在、インテグラーゼ遺伝子を持つ1509のインテグロンがインテグロンデータベースINTEGRALL (http://integrall.bio.ua.pt/) に登録されている (Moura et al., 2009)。クラス1インテグロンが細菌間のARGの拡散において最も重要である(Gillings, 2017)。クラス1インテグロンがTn402様トランスポゾンに挿入されることで、Tn402クラス1インテグロンは共役プラスミドを含む様々なレプリコンをトランスポーズし、急速に拡散することが可能になる。INTEGRALLには、カルバペネマーゼ、blaVIM、blaGES、blaIMPをコードする遺伝子を含む、比較的新しいARGを持つクラス1インテグロンがいくつか含まれている（Kaderabkova et al.） IntegronFinderは、必須タンパク質の検出にはHMMプロファイルを、組換え部位の検出には共分散モデルを用いてDNA配列中のインテグロンを高精度に検出するツールであり、同時に遺伝子カセットのアノテーション機能も提供している（Cury et al.）最近、IntegronFinderは、特に大規模データセットに対する効率と使いやすさを改善するために更新された（Néron et al.） 20,000以上のゲノムのインテグロン分布を解析し、Klebsiella pneumoniaeゲノムに多様なインテグロンが存在し、そのいくつかは抗生物質耐性と関連していることが明らかになった（Néron et al.）

クラス1インテグロンのカセットプロモーター領域(Pc)には、PcW(先祖伝来の最も弱い型)、PcH1(PcWより強いがPcH2より弱い)、PcH2(PcH1より強いがPcSより弱い)、PcS(最も強い型)の4つの主要な変異体があり、それぞれ転写の強さが異なる(Jové et al., 2010)。臨床分離株のクラス1インテグロンでは、IntI1のアミノ酸配列を変えないこれらのプロモーターバリアントの変異が同定されている。PcS、PcH1、PcH2はPcWよりも高い遺伝子カセット発現レベルを示し、臨床的インテグロンではよく見られるが、環境サンプルでは見られない（Ghaly et al.）クラス1インテグロンがほとんどの生態系で検出されることは、宿主株の進化と異なる環境への適応に広く貢献していることを示している。

MGEの宿主域
MGEの宿主範囲を包括的に理解することは、MGEがどのように異なる細菌間で拡散し、HGTを介して細菌の進化に寄与するかを解明する上で重要である。

バクテリオファージは一般的に宿主特異的で、ある種の数株のみに感染する（Koskella et al.）しかし、一部のバクテリオファージは宿主範囲が広く、複数種の細菌に感染したり、同一種の複数株に感染したりすることがある（Ross et al.）宿主範囲が広いバクテリオファージは、細菌の生態系や進化により大きな影響を与える可能性がある。バクテリオファージと宿主の関係はVirus-Host Database (https://www.genome.jp/virushostdb/note.html)に記載されており、数種類のウイルスが含まれている（Mihara et al., 2016）。

プラスミドの宿主範囲はバクテリオファージよりもかなり広い（de Jonge et al.）現在、プラスミドの宿主範囲の定義についてコンセンサスは得られていないが、異なる細菌綱または系統に属する異なる株で複製・維持できるプラスミドは広域宿主範囲プラスミドとして認識されており、一方、狭宿主範囲プラスミドは同属または同種でのみ複製・維持される（Thomas & Haines, 2004）。一般に、IncP/P-1、IncW、IncQプラスミドは広宿主域プラスミドに分類され、IncF、IncH、IncR、IncXは狭宿主域プラスミドと考えられている（Yano et al.） IncA、IncC、IncI、IncL、IncM、IncNおよびIncUは主にガンマプロテオバクテリア、特にエンテロバクター属に存在するため、広宿主域プラスミドではないが、必ずしも狭宿主域プラスミドでもない（Yano et al.）プラスミドの転移宿主範囲は、複製宿主範囲よりも広いことがある（Shintani et al.）したがって、自律複製システムはプラスミドの宿主範囲を決定する重要な因子である。宿主範囲の広いプラスミドは、その複製システムが異なる細菌で働くことができるため、系統学的に異なる分類群でも複製することができる。RIPおよび／またはプラスミドDNA領域（DnaAボックスを持つoriV）と、DnaA（DnaAボックス結合タンパク質）、DnaB（DNAヘリカーゼ）およびDNAポリメラーゼを含む宿主因子との相互作用は、広宿主範囲のIncP/P-1プラスミドの複製に重要である（Konieczny et al.）対照的に、IncQプラスミドは独自のDNAヘリカーゼとDNAプライマーゼをコードしている（Loftie-Eaton & Rawlings, 2012）。Suzukiら（2010）は、宿主範囲の狭いプラスミドとその宿主染色体のヌクレオチド組成は、宿主範囲の広いプラスミドとその宿主のそれよりも類似していると報告している。宿主特異的な変異の偏りは、プラスミドが長期間とどまる宿主染色体のヌクレオチド組成を均一化する可能性がある。最近、シュードモナス属で複製しないいくつかのIncP/P-1プラスミドが同定された（Brownら、2013；Hayakawaら、2022）。注目すべきことに、いくつかのIncP/P-1プラスミドは相互互換性を示し、宿主範囲を多様化している可能性が示唆された（Hayakawa et al.）

最近の比較研究によると、ICEはMPFT型の輸送チャネルを持つ共役プラスミドよりも、多様な分類群間でより頻繁に転移することが示され（Cury et al.、2018）、ICEがMPFT型プラスミドよりも広い宿主範囲を持つ可能性が示唆された。これはおそらく、ICEが染色体に組み込まれているため、遠方の宿主に共役する際に有利だからであろう。一方、分類学的に遠い宿主は、共役プラスミドの複製を許さない。しかし、共役プラスミドはICEに比べ、遺伝子構造に大きなばらつきがあり、DNAの繰り返しが多く、遺伝子交換の頻度が高い。全体として、ICEからプラスミドへの転換は可塑性を高めるが、プラスミドからICEへの転換はエレメントの宿主範囲を拡大する（Cury et al.）

インテグロンやトランスポゾンの宿主域は、単独では異なる細胞間を移動できないため、必ずしも定義されていない。クラス1インテグロンの起源はガンマプロテオバクテリア（旧ベータプロテオバクテリア）のバークホルデリア類と考えられているが（Gillings et al.、2008）、おそらくインテグロンの宿主範囲はプラスミドを含むビヒクルによって異なる。逆に、ある種のISは特定の属で頻繁に見られる。その一例がIS711で、ブルセラ属の細胞内病原性種にのみ存在し (Bounaadja et al., 2009)、同属のゲノム可塑性において重要な役割を果たしている (Aljanazreh et al., 2023)。もう1つの注目すべき例はIS1071であり、これはコピー＆ペースト型（複製型）トランスポゾンであり、相同組換えや、代謝遺伝子との複合トランスポゾンとしてのトランスポジションによって細菌の進化を媒介することが多い（Dunon et al.） IS1071の実験的トランスポジションは、コマモナスやデルフィアの株で観察されているが、アグロバクテリウム、エシェリヒア、シュードモナスでは観察されていない（Sota et al.

特定のISと既知のARGとの関連を総合的に解析した結果、IS6、Tn3、IS4、IS1（およびそれらの誘導体）は多様なARGと強く関連しているだけでなく、病原体において非常に豊富であることが示された（Razavi et al.）さらに、IS26とIS6100を含むIS6ファミリートランスポゾンは複製性トランスポゾンであり（Varaniら、2021）、通常サルモネラ属、クレブシエラ属、エシェリヒア属、シュードモナス属、アシネトバクター属、エンテロバクター属に存在する（Razaviら、2020）。これらのトランスポゾンは、共役プラスミド中でARGとともに見出されるため、ARGの拡散に重要である（Che et al.、2021）。IS6100はもともと複合トランスポゾンTn610の構成要素として単離されたもので、このトランスポゾンはマイコバクテリウムにスルホンアミド耐性を付与する（Martinら、1990）。さらに、IS6100はフラボバクテリウム（Katoら、1994）およびスフィンゴモナス（Nagataら、2019）から単離されたプラスミドでも同定されている。これらの知見を総合すると、IS6100は広い宿主範囲を持つ可能性が示唆される。

上述したように、MGEの宿主範囲の決定は、どのMGEが特定の宿主に存在するかを詳述した報告と、これらの要素を宿すのに適した細菌を調査した実験の結果に依存している。この調査により、細菌は制限修飾系（Luria, 1953; Luria & Human, 1952）、クラスター化規則的間隔短縮回文反復（CRISPR）（Barrangou et al. さらに、細菌は表面受容体の変異を通じてバクテリオファージの感染を阻害することができ（Gurneyら、2019）、バクテリオファージで観察される宿主特異性を解明している（Koskellaら、2022）。逆に、MGEは宿主の防御に対抗するための対抗システムを進化させてきたことも発見されている。バクテリオファージは宿主の防御に対応して進化した可能性があり、変異によって回避が可能になったり、付着のための受容体結合タンパク質が変化したりしている（Broniewski et al.）注目すべきは、CRISPR-Casシステムを直接阻害できる抗CRISPRタンパク質が、多くのMGEで同定されていることである（Camara-Wilpert et al., 2023; Pinilla-Redondo et al., 2020; Sontheimer & Davidson, 2017; Trasanidou et al.）このようなシステムの調査は、MGEの宿主範囲とその行動を理解する上で極めて重要である。

自然環境におけるMGEの行動
前節で強調したように、MGEsの宿主範囲に関する洞察を得ることは、環境におけるMGEsの行動を理解する上で極めて重要である。新世代のシークエンシング技術により、自然環境におけるバクテリオファージの挙動を予測することができる。微生物ゲノム配列の利用可能性が拡大したため、バクテリオファージと宿主の相互作用に関する包括的な研究が行われている（Shaidullina & Harms, 2022）。さらに、細胞外ウイルス粒子は微生物細胞から分離することが可能であり、環境中のバクテリオファージのゲノム配列を包括的に決定し、ウイルスDNAのカタログ化を可能にする取り組みが行われてきた（Kleiner et al. さらに、ウイルスDNAの包括的なカタログは、メタゲノムデータ中のファージ配列を予測するために重要である（Hasiów-Jaroszewska et al., 2021; Knipe et al.）

ウイルスとは対照的に、DNA断片がプラスミドに由来するのか染色体に由来するのかを判断することが難しいため、メタゲノミックデータは自然環境におけるプラスミドの挙動を正確に予測することができない（Smalla et al.）プラスミドDNAは通常、宿主の染色体DNAとは物理的に分離しているため、メタゲノム解析データからプラスミドを検出するのは特に困難である。トランスポゾンやインテグロンが共役プラスミドと一緒に移動する可能性があることを考えると、微生物の進化や生態学においてこれらのMGEが果たす重要な役割を理解するためには、環境中でのプラスミドの挙動を理解することが重要である。そこで本セクションでは、トランスポゾンとインテグロンを含むプラスミドの自然環境における挙動に焦点を当てる（図2）。表S1にこのテーマに関するいくつかの研究リストを示す。

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図2
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環境中のプラスミドの挙動を理解するためには、それぞれの環境に存在するプラスミドを同定することが重要である。1990年代までは、表現型を利用して環境から細菌を収集・培養することが、プラスミドを含む新しいMGEを探索する古典的な方法であった。Sobeckyら(1998)は、分離された海洋細菌から様々なプラスミドを同定したが、そのほとんどは既存の腸内細菌由来プラスミドのInc群とは異なっていた。しかし、環境中のほとんどの細菌が培養できないことを考えると、培養に依存した方法ではプラスミドを検出する能力に限界がある。現在、既知のプラスミド（およびその他のMGE）の特異的DNA配列から設計したプライマーを用いたPCR法が、環境中のプラスミドを同定する最も簡単な方法である。全DNAを標的環境から直接抽出し、PCRの鋳型として使用し、増幅に基づいてプラスミドの有無を検出することができる。マルチプレックスPCRを可能にするいくつかのプライマー配列が、ARGの拡散において特に重要なプラスミドを検出するために使用されてきた（Carattoli, 2009; Carattoli et al., 2005, 2014; Carloni et al., 2017; Castro-Jaimes et al., 2022; Chen et al., 2022; Clewell, 2007; Li et al.）プラスミド配列に特異的なプライマーやプローブを用いたPCR-サザンブロットや定量的PCR解析は、様々な環境サンプルにおける特定のプラスミドの存在量やその時間的変化を検出するために用いられてきた（Blau et al.）しかし、これらの方法の限界は、既知のプラスミドプライマーやプローブしか使えないことである。

環境中で活発に増殖しているプラスミドを同定するために、外因性プラスミド捕捉法は環境サンプルから共役プラスミドを単離するのに有用である。この方法では、使用するレシピエント株と動員可能なプラスミドのタイプが、得られるプラスミドに影響を与える可能性がある。交配法には二親交配と三親交配がある。両親交配法では、培養可能なレシピエント株を用いて、抗菌剤耐性、重金属耐性、代謝遺伝子など、特定のアクセサリー遺伝子を持つ共役プラスミドを収集する（Blauら、2020；Smallaら、2015）。三親交配法では、動員可能なプラスミドを持つ中間ドナーを用いる（図3）。この方法は、自己伝達性プラスミドが準備された動員可能プラスミドを動員する能力に依存しており、プラスミド中にマーカー遺伝子を必要としないため、環境から共役プラスミドを収集するのに効率的である。これらの方法の利点は、環境中の元の宿主細菌の培養可能性に依存することなく、共役プラスミドを直接獲得できることである。これらの方法を用いて、PromAグループプラスミド、新規IncP/P-1サブグループプラスミド、未分類の共役プラスミドなど、これまで知られていなかったいくつかの共役プラスミドが同定されている（Blau et al., 2018; González-Plaza et al., 2019; Hayakawa et al., 2022; Li et al., 2014; Oliveira et al., 2013; Smalla et al., 2000; Werner et al., 2020; Wolters et al., 2014; Yanagiya et al., 2018）。これらの方法の欠点としては、環境サンプル中の元の宿主細菌を同定できないこと、レシピエント細胞内で複製可能な結合性（または動員可能）プラスミドしか収集できないことなどが挙げられる。三者間法では、得られるプラスミドの種類は、使用される動員可能プラスミドの種類によって偏る。

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図3
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キャプション
どのプラスミドが微生物群集に移入されるのか（「プラスミドの移入先」）を同定するために、GFP、DsRed、mCherry、GusA、LuxABなどの蛍光タンパク質とフローサイトメトリーが、共役プラスミドを獲得できる細菌株を同定するために用いられてきた（Amann & Fuchs, 2008; Sørensen et al.）研究者らは、MGE中のlac修飾プロモーターの下流にある蛍光タンパク質を、供与細菌の染色体DNA中の阻害因子LacIを発現する遺伝子に挿入するシステムを構築し、様々な環境においてMGEを受け取った細胞を単細胞レベルで検出できるようにした（Christensenら、1998；Geisenbergerら、1999；Haagensenら、2002；Mølbakら、2003；Normanderら、1998）。

さらに、環境中のどの細菌が特定のプラスミド（遺伝子）を持っているかを理解することも重要である。この問題に取り組むために、様々な方法が用いられてきた。細菌の16S rRNA遺伝子配列を標的とする蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）や、機能性遺伝子を検出するin situ PCRは、プラスミドを含む細胞を単一細胞レベルで検出・同定することができる（Laflammeら、2009；Maら、2013；Shintaniら、2014）。最近では、フルオロクロム標識ポリヌクレオチド遺伝子プローブを用いて標的遺伝子の「所有者」を同定するために、特定の遺伝子やrRNA遺伝子を検出するdirect-geneFISHが開発された（Barrero-Canosaら、2017）。

微生物群集中のプラスミドを検出するための他の方法には、エマルジョン、ペアアイソレーション、コンカチネーションPCR（epicPCR）があり、これは標的配列を担体の16S rRNA遺伝子断片に連結する融合PCRの一種である。担体は分類学的に割り当てることができる（Romanら、2021；Spencerら、2016）。さらに、液滴デジタルPCR（ddPCR）は、水-油エマルション液滴システムを用いたデジタルPCRに基づいて開発されたもので、1本のチューブで数百万のPCR反応を同時に生成することができる（Hindson et al.） ddPCRは標的遺伝子の正確なコピー数を定量できるため、微生物群集中の標的細菌を検出するのに用いられる（Aung et al.）ハイスループット染色体コンフォメーションキャプチャー（Hi-C）は、ARGやプラスミド特異的遺伝子を含む標的遺伝子を持つ細菌を同定するために使用されるもう一つの方法である。全体として、これらの培養に依存しない方法は、微生物群集におけるMGEの挙動に関する将来の研究を促進する可能性を秘めています。

epicPCRは、廃水処理プラントの流入および流出水の細菌群集におけるARG保有細菌の同定に使用されている（Hultman et al.）さらに、epicPCRは、合成細菌群集における共役プラスミドRP4の宿主細胞の割り当てにも使用されています（Heßら、2021）。De la Cruz Barronら（2023）は、多重ddPCRを用いて複数の標的遺伝子を検出できると報告している。Stalderら（2019）は、ARG、プラスミド、インテグロンの宿主範囲を同定し、このアプローチを検証し、IncQプラスミドとクラス1インテグロンが、調査した廃水コミュニティにおいて最も広い宿主範囲を持つことを実証した。

これらの研究の重要な発見のひとつは、環境中にこれまで知られていなかったプラスミドが大量に存在することを明らかにしたことであり、プラスミドが微生物群集において重要な役割を果たしている可能性を示唆している。さらに、最近のシングルセル解析によって、結合性プラスミドの移行範囲が特定された。この発見は、既存の仮定を覆すものであり、細菌細胞間の遺伝物質の移動は、これまで考えられていたよりも広範囲で複雑であることを示している。さらに、これらの知見は、共役プラスミドが異なる環境において多様な遺伝子を獲得する驚くべき能力を示すことを示している。全体として、これらの発見は微生物遺伝学の理解に貢献し、バイオテクノロジー、生態学、医学の分野での応用が期待される。

プラスミドと宿主の共進化
プラスミドは遺伝子を伝達するだけでなく、プラスミドと宿主の相互作用の適応を促進することによって宿主の進化を加速する。微生物学における主要な問題は、プラスミドを含むMGEが宿主の中でどのように共存し、進化していくかということである。このセクションでは、プラスミドを中心に、MGEが宿主とどのように共存進化してきたかについての研究報告を要約する。

代償変異は「プラスミドのパラドックス」を解決できる
このセクションでは、「プラスミドのパラドックス」の問題に焦点を当てる。ある環境下では宿主のフィットネスが向上するが、必要な遺伝子が染色体に組み込まれると、微生物進化の長い過程でプラスミドは選択によって排除される。しかし、アクセサリー遺伝子を持たないプラスミド（クリプトプラスミド）も含め、いくつかのプラスミドが同定されており、なぜプラスミドがいまだに逆説的に存在しているのかを説明するのは難しい。最近の総説では、実験データやプラスミドと宿主の生態学的・進化的共存メカニズムに関する理論に基づいて、このパラドックスがどのように解決されるのかがまとめられている（Brockhurst & Harrison, 2022; Rodríguez-Beltrán et al.）プラスミドのキャリッジによるフィットネスコストは、プラスミドや宿主染色体の遺伝子の変異によって改善されることがあり、これは「代償変異」として知られている。これまでの研究で、pPS10のプラスミド複製開始タンパク質（RepA）またはその宿主DNA複製開始タンパク質（DnaA）の変異がプラスミドの持続性を高め、その宿主範囲を変えることが示されている（Fernández-Tresguerresら、1995；Maestroら、2002、2003）。IncP/P-1プラスミドの複製開始タンパク質TrfAと宿主ヘリカーゼDnaBとの相互作用は、IncP/P-1プラスミドにとって不適切な宿主であるシュウェネラの適合性を低下させる（Yano et al.） TrfAには2つの型がある： TrfA44（大きい方）とTrfA33（小さい方）であり、初期コドンの位置が異なる（Pansegrau et al.） TrfA44に変異があると、DnaBとの相互作用が阻害され、結果としてフィットネスコストが軽減される（Yano et al.）いくつかの研究は、代償変異がシュードモナス属におけるプラスミドpQBR103のキャリッジのコストを改善できることを示しており、実験室条件下だけでなく（Harrisonら、2015、2016）、根圏においても同様である（Birdら、2023）。宿主染色体上にコードされるGacA/GacSシステムの変異は、プラスミドキャリッジのフィットネスコストを減少させることができる（Harrisonら、2015）。San Millanら（2018）は、緑膿菌と異なるプラスミドとの相互作用を調査し、プラスミドの獲得によって遺伝子発現が変化し、宿主のフィットネスが低下することを発見した。小型プラスミドpNUK73のプラスミド複製遺伝子の発現を減少させる変異は、フィットネスコストを回復させる（San Millan et al.）このように宿主に課されるフィットネスコストは、プラスミドと宿主の組み合わせに依存し、プラスミドまたは染色体遺伝子のどちらかの代償変異によって改善することができる。

プラスミドの適合コストとARGの拡散
プラスミドのフィットネスコストは、ARGを含む様々なアクセサリー遺伝子がプラスミドを介してどのように広がっていくかを理解する上で重要な要素である。プラスミドキャリッジによるフィットネスコストは、プラスミドと宿主染色体間の特異的な遺伝的相互作用に依存して、宿主種によって異なる（Kottara et al.）このように、プラスミドとその宿主種との間には最適な組み合わせがあり、これがアクセサリー遺伝子の拡散における重要な要因であると考えられる。プラスミドのキャリッジに加えて、ARGのキャリッジも宿主のフィットネスを低下させる可能性がある。Yangら（2021）は、コリスチン耐性遺伝子であるmcr-1が1コピーでも宿主である大腸菌にフィットネスコストを与えること、そしてmcr-1を持つプラスミドのコピー数制御がこの遺伝子の持続に重要であることを示した。さらに、IncX4プラスミドの新規活性化因子PixRは、大腸菌におけるmcr-1のフィットネスコストを軽減した（Yiら、2022年）。さらに、mcr-1はtrfA2のみを持つIncP/P-1プラスミドでも同定されている（Hayakawa et al.） TrfA1はTrfA2よりもプラスミドの持続性に有害である（Yano et al.）これは、TrfA1が宿主ヘリカーゼDnaBを活性化し、プラスミドのコピー数を増加させるためであり、これはIncP/P-1プラスミドのプロミスキューティにとって重要であるが、一部の細菌にとってはフィットネスコストにとって有利ではない（Yano et al.）一方、TrfA2のみを持つIncP/P-1（狭宿主域型IncP/P-1プラスミド）は、TrfA1を持つものよりも低いフィットネスコストを示す。このことは、宿主細胞にとってのフィットネスコストが低い狭宿主域型IncP/P-1プラスミドのみがコリスチン耐性遺伝子を持つことの説明となりうる（Hayakawa et al.、2022）。

再編成と欠失
プラスミドと宿主染色体のDNA領域の再編成は、通常、宿主細胞が特定の条件下でプラスミドに適応する過程で観察される。pCAR1はIncP-7プラスミドであり、カルバゾールのアントラニル酸を介したカテコールへの生体変換に関与する分解遺伝子（carオペロンとantオペロン）を持つため、宿主のシュードモナス株にカルバゾール代謝を付与する（Nojiri, 2012）。しかし、pCAR1の宿主のひとつであるシュードモナス・フルオレッセンスPf0-1(pCAR1)は、他のシュードモナス宿主株に比べて増殖速度が著しく遅かった(Takahashi et al., 2009)。これは、宿主Pf0-1(pCAR1)が、宿主染色体上にコードされた酵素によって代謝される細胞にとって有毒な化合物であるカテコールを蓄積するためである。注目すべきことに、Pf0-1(pCAR1)の増殖末期の優性株は、カルバゾール分解オペロンを欠いたpCAR1を保有していた（Takahashi et al.）これらの遺伝子を欠失させると、優性株はカルバゾールやアントラニル酸の代謝ができなくなり、カテコールの蓄積も抑制された。これらのDNA領域の欠損は、ISPre1の4コピーのうち2コピーの相同組換えによって媒介される（Shintani, Horisaki, et al.）このようなDNA再配列は、多剤耐性IncHI2プラスミドpJXP9でも報告されている（Zhangら、2022年）。プラスミドの特定のDNA領域の欠失は、宿主のフィットネスコストを補うことができ、染色体遺伝子の変異やmRNA発現の変化の適応進化は、宿主の生理学的機能の変化と相関している（Zhang et al.）

展望
シーケンス技術の革新と細菌細胞レベルでの分析手法の進歩により、細菌の進化と適応における MGE のメカニズムに対する理解が深まり、MGE の意義に対する理解も深まりました。

MGEsと宿主の同定
今後の課題は、メタゲノムデータから様々なMGE配列とそれに対応する宿主を容易に同定する手法の開発である。MGEのインシリコ同定は開発されていますが、最近、ファージサテライト、ファージプラスミド、タイケポゾンなど、新しいタイプのMGEが同定されました（Hackl et al.）包括的な解析は今のところ行われていないが、これらの要素を無視すべきではない。さらに、バクテリオファージやプラスミドの宿主情報は特に不十分である。プラスミドとその宿主の間の配列情報の非類似性を分析することによって宿主を予測する試みがいくつかなされている（Suzuki et al., 2008, 2010; Tokuda et al.）最近では、プラスミドの宿主を配列に基づいて予測するPlasmidHostFinderなどの機械学習ベースのツールが開発されている（Aytan-Aktug et al.）このような開発により、MGEと宿主細菌との複雑な関係に対する我々の理解とのギャップが埋まりつつある。

MGEのアノテーションと分類の標準化
もう一つの課題は、特にプラスミドに関する MGE のアノテーションと分類の統一である。様々な研究者がプラスミドの参照データベースを開発しようと努力しているにもかかわらず、現在のところ、プラスミドの分類と遺伝子名の統一的なインデックスは存在しない。プラスミド研究の初期段階で分類されたプラスミドの「分類法」と、塩基配列に基づく分類法との間の不一致は、いくつかの混乱を引き起こしてきた（新谷ら、2022；新谷、鈴木ら、2023）。このような混乱を避けるためには、プラスミドのアノテーション（Thomas et al.、2017）と分類（Garcillán-Barcia et al.、2023）の統一が重要である。さらに、各プラスミドの特性と分類をまとめた包括的なデータベースを定期的に更新することが不可欠である。

シングルセルゲノミクスの活用
さらに、環境細菌のシングルセルゲノミクスは、貴重な情報を提供する可能性を秘めている（Hosokawa et al.）このような方法は時間がかかるが、MGEの宿主の誤同定やゲノム配列の誤組立てを防ぐのに役立つ。このような技術や方法を取り入れて活用することで、近い将来、MGEによる細菌の進化をリアルタイムでモニタリングすることが容易になるかもしれない。

DNAシーケンスがますます利用しやすくなるにつれて、メタゲノムシーケンスから得られる情報は急速に蓄積されている。さらに、時系列解析によるサンプルの解読も容易になっている。しかし、プラスミドやトランスポゾンを含むMGEの存在や分布に関する情報は限られている。この乏しさは、前述のブレークスルーの要件が満たされていないことに起因する。これらの進歩が実現すれば、塩基配列情報に基づいて、特定の環境に存在するMGEの種類を識別し、その中で増殖している微生物を特定することが可能になる。このことは、カスタニェーダ・バーバら（2024年）が提唱した生態進化的プラスミド軌跡の理解や、遺伝子伝播と微生物進化のメカニズムの解明につながる。

著者貢献
徳田真帆：執筆-原案（賛助）、執筆-校閲・編集（賛助）。新谷正樹：構想（リード）、資金獲得（リード）、監修（リード）、執筆-原案（リード）、執筆-校閲・編集（リード）。

謝辞
英文校正はエディテージ（www.editage.jp）に感謝する。本研究は、文部科学省科学研究費補助金（JP19H02869, JP19H05686, JP23H02124 to M. Shintani; JP22J12723 to M. Tokuda）、日本医療研究開発機構（AMED）科学研究費補助金（JP21wm0325022, JP21wm0225008 to M. Shintani）、M. M.Shintaniへの助成金（大隅フロンティア科学振興財団微生物機能探索コンソーシアム、日本、大阪発酵研究所（IFO）、日本、L-2023-1-002）；国立大学法人静岡大学緑の科学技術研究所研究プロジェクト支援費（2023-RIGST-23104）；M.Shintaniへの助成金（国立大学法人静岡大学緑の科学技術研究所研究プロジェクト支援費（2023-RIGST-23104））。

資金提供情報
資金提供情報はありません。

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著者らは利益相反がないことを宣言する。

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