プレボテラ・コプリはNF-κBシグナル伝達経路の活性化を介してリポ多糖を介して血管石灰化を促進する

2024年5月12日 14:54

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腸内微生物
第16巻 2024年 - 第1号
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研究論文
プレボテラ・コプリはNF-κBシグナル伝達経路の活性化を介してリポ多糖を介して血管石灰化を促進する

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19490976.2024.2351532

Qing-Yun Hao,Jing Yan,Jin-Tao Wei,Yu-Hong Zeng,Li-Yun Feng,Dong-Dong Que, すべて表示
論文 2351532｜2023年10月23日受領、2024年5月1日受理、オンライン公開：2024年5月10日
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https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2351532
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要旨
腸内細菌叢の変化が慢性腎臓病（CKD）関連の血管石灰化（VC）に重要な役割を果たすという新たな証拠が示されている。我々は、CKD-VCに関与する特定の腸内細菌叢とその基礎となる機序を調べることを目的とした。我々は、16S rRNA遺伝子のアンプリコンシークエンシングにより、大動脈石灰化を伴うCKDラット（5/6腎摘出術後、高カルシウム・高リン酸食で誘導）の糞便中のPrevotella copri（P.コプリ）の存在量の増加を同定した。さらに、CKD患者において、P. copriの存在量と大動脈石灰化スコアとの間に正の相関があることを確認した。さらに、生きたP. copriを経口投与すると、腸管破壊、Toll様受容体-4（TLR4）の発現亢進、リポ多糖（LPS）レベルの上昇を伴い、in vivoでCKDに関連するVCおよび血管平滑筋細胞の骨形成分化が悪化した。P. copri由来のLPS（Pc-LPS）は、高リン酸誘導性VCおよびVSMCの骨形成分化を促進することが、in vitroおよびex vivo実験で一貫して証明された。メカニズム的には、Pc-LPSはTLR4と結合し、VC中に核因子κB（NF-κB）およびヌクレオチド結合ドメイン、ロイシンリッチ含有ファミリー、ピリンドメイン含有-3（NLRP3）インフラマソームシグナルを活性化した。NF-κBを阻害すると、NLRP3インフラムソームが減少し、Pc-LPSによるVSMC石灰化が抑制された。本研究により、Pc-LPSを含む炎症調節代謝産物の増加とNF-κB/NLRP3シグナル伝達経路の活性化が関与するメカニズムによって、CKDに関連したVCにおけるP. copriの新たな役割が明らかになった。これらの知見は、P. copriとその由来LPSが、CKDにおけるVCの潜在的な治療標的であることを強調するものである。

キーワード：血管石灰化プレボテラ・コプリ腸内細菌慢性腎臓病セリポポリサッカライド

はじめに
血管石灰化（VC）は慢性腎臓病（CKD）患者に多くみられ、その後の心血管系の罹患率および死亡率に大きく関与している。引用1-3 VCは、アルカリホスファターゼ（ALP）、ラント関連転写因子2（RUNX2）などの骨形成因子のアップレギュレーションによって特徴づけられる血管平滑筋細胞（VSMCs）の表現型変換を伴う、骨形成に類似した、活発に制御された病態生理学的プロセスである、また、収縮性表現型マーカーであるα-平滑筋アクチン（α-SMA）のダウンレギュレーションは、最終的にVCにつながる。Citation7-9 新たなエビデンスは、腸内細菌叢がCKDにおける心血管合併症の発症に中心的な役割を果たしていることを示唆している。 Citation10,Citation11腸内の微生物集団は、ヒト細胞の総数を上回り、ヒトの臓器に匹敵する複雑な生態系を形成しているCitation12腸内細菌異常症は、高血圧、アテローム性動脈硬化症、血栓症の発症にも関与しているCitation13,Citation14しかし、腸内細菌叢がCKDにおける心血管合併症の発症に関与しているかどうかは、解明される必要がある。

実験的研究でも臨床研究でも、CKDに関連する明確な腸内細菌叢パターンが同定されている。特に進行したCKDの病期では、尿毒症性毒素産生に関連する微生物ファミリーが優勢になる。引用11,引用15 尿毒症の環境は腸内細菌叢の異常をさらに悪化させ、ひいては腸管バリアの完全性を損なう。その結果、生きた細菌、リポ多糖（LPS）のような内毒素、腸由来の尿毒症性毒素が全身循環に移行しやすくなり、全身性の炎症を引き起こし、心血管合併症のリスクを高めることになる。引用16 他の研究者やわれわれのチームは、尿毒症性毒素、トリメチルアミンN-オキシド（TMAO）、ビタミンK、短鎖脂肪酸などの要素とCKDの心血管転帰との関連を明らかにしている。とはいえ、特定の病原性細菌を特定し、VCの発症を促すそのメカニズムを理解することは、依然として難題である。

CKDにおけるVCに対する腸内細菌叢の影響をより深く探るため、ヒトと動物の糞便サンプルの16S rRNA遺伝子配列決定とin vitro、ex vivo、in vivoモデルを用いて、CKDにおけるVCの制御における腸内細菌叢の潜在的役割を探った。

方法
2.1. 臨床観察コホート研究と解析
CKDと診断され、2023年2月から6月までに朱江病院に入院した患者をこの研究に組み入れた（ClinicalTrials.gov ID: ChiCTR2300074963）。登録患者全員について、人口統計（性別、年齢、肥満度）、心血管指標（収縮期血圧、拡張期血圧、心拍数）、血液生化学プロファイル（血清クレアチニン［SCr］、血中尿素窒素［BUN］、推定糸球体濾過量）のデータ収集に加えて、大動脈のカルシウムスコアを算出した、推定糸球体濾過量[eGFR]、カルシウム、リン、副甲状腺ホルモン[PTH]）、尿生化学マーカー（微量アルブミン尿、24時間尿蛋白排泄量、尿蛋白/クレアチニン）、透析療法の様式（腹膜透析と血液透析）、薬剤の使用（スタチン、ナトリウムグルコース共輸送体2）。入院時に、臨床医はCKDの診断も記録した。この診断は、過去の腎生検の情報があればそれに基づくこともできたが、生検による確定診断は必須ではなかった。具体的には、慢性腎臓病疫学共同研究（Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration）の式を用いてeGFRを算出した。(1）組み入れ基準：参加者（18～80歳）は、慢性腎臓病ステージ5（尿毒症期）の診断基準（KDIGO 2012 Clinical Practice Guideline for the Evaluation and Management of Chronic Kidney Disease）を満たし、CTスキャンが利用可能であった。(2) 除外基準：妊娠中および授乳中の女性、重症感染症患者、他の重要な臓器機能障害患者、血液および免疫系疾患患者。食事による摂取が腸内細菌叢の構成に影響を及ぼす可能性があるため、さらに、試験前4週間に抗生物質、プロバイオティクス、プレバイオティクス、シンバイオティクス、下剤を摂取した者は除外した（図S1）。同意の得られた参加者は全員、書面によるインフォームド・コンセントを通じて承諾を得た。研究計画は綿密に検討され、朱江病院の倫理委員会（ID：2022-KY-287-01）により承認された。

すべての画像は、経験豊富な2人の放射線科医によって、研究デザインについて盲検化されたソフトウェア（Inobitec PRO 2.9.0）を用いて解析された。Agatstonスコアに基づき、上行大動脈、大動脈弓、下行胸部大動脈の石灰化スコアの合計を算出した。石灰化の基準は、病変部のCT値が130HU以上で、石灰化面積が1mm2以上であることであった。石灰化スコアは、石灰化面積にそれぞれの係数を乗じることによって導き出された。各CTスライスは独立して解析され、全スライスにわたる合計スコアが患者の大動脈石灰化スコアを表した。CKD患者における胸部CTの使用は、特定の臨床的適応によって推進された： 1)免疫反応の変化による感染症リスクの増大により、CKD患者は特に肺炎に罹患しやすい。2)浮腫や胸水などの肺合併症を評価する必要性。これらはしばしば心血管系の問題を伴い、予後に大きな影響を及ぼす。これらの検査は、腎障害の可能性を避けるために造影剤を使用せずに行われた。大動脈石灰化の有無で患者を区別することで、CKD進行におけるVCと腸内細菌叢の変化の関連を探ることを目的とした。

2.2. 動物実験
本研究は、中国南方医科大学朱江病院のInstitutional Animal Care Committee（LAEC-2023-088）からすべての動物実験の承認を得た。また、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）のGuide for the Care and Use of Laboratory Animals（8th Edition, 2011）のガイドラインを遵守した。体重220～250gの雄性Sprague-Dawleyラットを中国南方医科大学中央動物飼育施設から調達した。すべての動物は12時間明期/12時間暗期サイクルに従った標準的な実験室条件下で飼育され、水道水と餌へのアクセスは自由であった。CKD群（n=5）とVC群（モデル、n=5）の2群に無作為に割り付けた。引用7,引用8,引用22 簡単に説明すると、ラットはペントバルビタールナトリウム（50mg/kg）を腹腔内注射して麻酔した。その後、2/3右腎摘出を行い、1週間後に左腎を完全に摘出してCKDを誘発した。術後2週間後にSCr値を評価した。その後、CKDラットに高カルシウム・高リン食（カルシウム4％、リン酸塩1.8％、広東省医学実験動物センター、中国）を与え、カルシトリオール1μg/kgを毎日経口投与した。4週間後、CKDラットとVCラットを安楽死させ、糞便サンプルを採取して16S rRNA分析を行った。VCを促進するプレボテラ・コプリ（P. copri、中国広東省微生物培養収集センター）の潜在的役割を調べるため、ラットを3群に分けた： Sham（n＝5）、モデル＋Vehicle（n＝5、VCラットはコントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水を3週間投与）、モデル＋P. copri（n＝5、VCラットはP. copri菌液［1×10Citation9 CFU/200μLリン酸緩衝生理食塩水］を3週間経口投与）の3群にグループ分けした。さらに、P. copriの除去がCKDのVCに与える影響を調べるため、ラットを3群に無作為に割り付けた：シャム（n＝5）、モデル＋ビヒクル（n＝5、CKDラットにビヒクル対照として同量の0. 9％生理食塩水をビヒクルコントロールとして1週間経口投与した後、カルシトリオール［1μg/kg］を添加した高カルシウム・高リン酸食を4週間摂取させた）、およびモデル＋Met（n＝5、CKDラットにメトロニダゾール［200mg/kg/d］を1週間経口投与し、P. copriを除去した後、モデル＋ビヒクル群と同じ治療を4週間行った）。実験終了時、さらなる解析のために安楽死させたラットから大動脈組織を採取した。

2.3. 細胞培養
Citation7,Citation8,Citation22簡単に言えば、大動脈分離のために、ラットをペントバルビタールナトリウム（150mg/kg）で腹腔内安楽死させた。大動脈を解剖し、滅菌ハサミで縦に開き、滅菌下で小片に分割した。これらの大動脈セグメントを、10％ウシ胎児血清（FBS）、100U/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）で培養した。大動脈摘出片から遊走したVSMCsは、5％CO2雰囲気の加湿インキュベーター内で、37℃の増殖培地中で維持された。80％のコンフルエントに達した時点で、VSMCsの部分培養を行った。実験には、継代3から8の細胞を用いた。石灰化誘導のために、VSMCsは10mMのβ-グリセロリン酸（BGP）と3mMの塩化カルシウム（CaCl2）を添加したDMEMからなる石灰化培地で処理した。Pc-LPSは、LPS抽出キット（Abcam、ab239718）を用いてP. copriから抽出した。いくつかの実験では、VSMCを3～8日間、石灰化培地と併用して、様々な濃度のPc-LPS（0.2、0.4、1.2ng/mL）で処理した。NF-κBの強力な阻害剤であるピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム（PDTC、1μmol/L；Selleck）を、いくつかの実験でVSMCの処理に用いた。

2.4. 動脈輪器官培養
胸部大動脈は、前述のようにペントバルビタールナトリウム（150mg/kg）の腹腔内注射により安楽死させた2ヶ月齢の雄性Sprague-Dawleyラットから解剖した。大動脈輪は、その後の評価と分析のために、所定の時点で回収した。

2.5. ALP活性アッセイ
ALPの活性は、ALPアッセイキット（Beyotime, China）を用い、製造元のガイドラインに従って測定した。具体的には、細胞サンプルと動脈組織からタンパク質を抽出し、得られたタンパク質の濃度をBCA Protein Assayで定量した。続いて、これらのタンパク質サンプルをパラニトロフェニルリン酸基質と混合し、37℃で10分間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、3M NaOHを加えて反応を終了させた。その後、吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて405nmで測定した。データは最終的に、タンパク質1ミリグラムあたりのALP活性の単位で表した。

2.6. アリザリンレッド染色とカルシウム含量の定量化
引用7,引用8,引用22 細胞染色では、VSMCを4％パラホルムアルデヒドで10分間固定した後、PBSで洗浄し、2％アリザリンレッド溶液（pH4.2、Solarbio社、中国）に室温で5分間暴露した。余分な色素は脱イオン水で除去し、得られたVSMCsのカルシウム沈着をLeica Microsystemsの顕微鏡を用いて可視化し、画像化した。その後、色素を10％ギ酸で溶出し、分光光度計またはマイクロプレートリーダーを用いて405nmの吸光度を測定し、石灰化の程度を定量した。引用25 同様に組織染色では、ラット大動脈セグメントを4％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、5～6μmの厚さに切片化した。切片をアリザリンレッド溶液で5分間染色した後、余分な色素を除去するために洗浄し、アセトンで脱水し、マウントメディウムでマウントした。染色した切片を倒立顕微鏡で可視化して画像化し、大動脈輪の赤色陽性染色領域をImageJソフトウェアで解析した。大動脈組織のホールマウント染色は、95％エタノールで24時間固定し、1％水酸化カリウム中の0.003％アリザリンレッド溶液で一晩染色し、2％水酸化カリウムですすぎ、倒立顕微鏡で撮影した。カルシウム含量は、動脈カルシウム含量検出用の市販カルシウムアッセイキット（Leagene Biotechnology、中国）を用いて測定した。正確には、VSMCと大動脈組織の両方がホモジナイズされ、その後遠心分離によって上清が分離された。この上清をメチルチモールブルー溶液と混合し、インキュベートした。その後、吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて610nmで評価し、相対的カルシウム含量をタンパク質含量と一致するように調整した。

2.7. 大動脈石灰化のマイクロCTイメージング
Citation7,Citation8,Citation25最初に、ラットをペントバルビタールナトリウム（150mg/kg）の腹腔内注射により安楽死させ、大動脈を採取し、速やかに4％ホルムアルデヒドで固定した。これらの大動脈サンプルをSiemens Inveon社製のMicro-CTスキャナーで0.079 mmの解像度でスキャンした。スキャン後、Siemens Inveon research workplaceソフトウェアを用いてMicro-CT画像を解析した。

2.8. 血清生化学およびサイトカインレベルの測定
5/6腎摘出手術の2週間後と実験後に、ラットの眼静脈から血液サンプルを採取した。その後、血液を遠心分離して血清を分離した。BioAssay Systems社のクレアチニンアッセイキット（BioAssay Systems社、米国）による比色法を用いて、ラットのSCr濃度を測定した。さらに、LPS、インターロイキン-6（IL-6）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、およびインターロイキン-1β（IL-1β）の血清レベルは、製造業者のガイドラインに従って、ラットELISAキット（Shanghai FanKe biological technology co. 血清カルシウムおよびリン酸値は、半自動生化学分析装置（ECA-2000A、中国吉林省）を用いて分析した。PTHおよび線維芽細胞増殖因子23（FGF23）は、ラット特異的ELISAキット（Shanghai FanKe Biological Technology Co.）

2.9. ウェスタンブロット分析
VSMCsおよび動脈組織からのタンパク質抽出は、プロテイナーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含むRIPAバッファーを用いて行った。製造元の指示に従い、Pierce™ BCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher Scientific, USA）を用いて分光光度計でタンパク質濃度を定量した。その後、タンパク質をSDS-PAGEで分離し、PVDF膜（Millipore, USA）に転写した。膜を5％スキムミルクで2時間ブロックした後、BMP2（1:1000、Abcam、米国、ab214821）、RUNX2（1:1000、Cell Signaling Technology、米国、#12556）、α-SMA（1:1000、Cell Signaling Technology、米国、19245S）、オクルディン（1:1000、Proteintech、中国、27,260-1-AP）、ZO-1（1： 1000, Proteintech, China 21,773-1-AP）、TLR4（1:1000, Signalway Antibody, USA, #35463 ）、Phospho-NF-κB抗体（1:1000, Cell Signaling Technology, USA, #3033 ）、NF-κB抗体（1： 1000, Cell Signaling Technology, USA, #8242 ）、ロイシンリッチファミリー、ピリンドメイン含有-3（NLRP3, 1:1000, Abcam, USA, ab263899）、GAPDH（1:8000, Bioworld, China, AP006）を用いた。一次抗体とのインキュベーション後、膜を3回洗浄した。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体と室温で2時間インキュベートした。ブロットの可視化はAmersham Imager 600イメージングシステムで行った。ブロットバンドのデンシトメトリー解析はImage Jソフトウェアを用いて行い、相対的タンパク質発現レベルはGAPDH発現に対して正規化した。

2.10. 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）
TRIzol試薬（Thermo Fisher, USA）を用いて培養VSMCから全リボ核酸（RNA）を単離し、PrimeScript RT試薬キット（TaKaRa, Japan）を用いて、各製造元の説明書に従って相補的DNA（cDNA）に逆転写した。相対的 mRNA 発現量は、比較 Ct (ΔΔCt)法を用いて決定し、対照に対する遺伝子発現の倍率変化を算出した。GAPDHは標準化のための内部参照として使用した。遺伝子のプライマーセットは表S1に示す。

2.11. 組織学的解析
盲腸から1cmの位置にある各ラットの回腸を注意深く採取し、4％パラホルムアルデヒドで24時間固定した。これらの組織サンプルをパラフィンに包埋し、5 µm厚の切片を作製した。これらの切片を脱脂し、標準的なプロトコルを用いてヘマトキシリンとエオジンで染色し、組織形態を解析した。染色後、切片をLeica Microsystemsの顕微鏡で観察し、Image Pro Plus 6.0ソフトウェアを用いて測定値を定量化した。陰窩の深さは陰窩の底から陰窩-絨毛接合部まで、絨毛の長さは陰窩-絨毛接合部から絨毛の先端まで測定した。

2.12. 統計分析
すべてのデータは平均値±SDで表した。調査したパラメータの分布の正規性は、Shapiro-Wilk検定を用いて評価した。2群間の統計的差は、必要に応じてStudentのt検定またはPearsonのカイ二乗検定を用いて分析し、2群以上の差は一元配置分散分析（ANOVA）後にBonferroni post hoc検定を用いて比較した。すべての統計解析はGraphPad Prism統計ソフト（バージョン9.0）を用いて行い、p＜0.05を統計的に有意と認めた。

結果
3.1. P. copriの多さは大動脈石灰化と正の相関があった。
CKDにおける腸内細菌叢とVCの関係を調べるため、CKDラットとモデルラットの間で16S rRNA遺伝子のアンプリコンシークエンシングを行った。Chao1、Observed species、PD whole tree、Shannon indicesを用いてα-diversityを解析したところ、CKDグループとモデルグループとの間に有意な差異が認められた（図1a）。微生物叢組成におけるこれらの差異は、主成分分析によってさらに立証された（図1b）。線形判別分析の効果量を利用して、モデルラットとCKDラットを区別する顕著な分類学的マーカーとしてPrevotellaを特定した（図1c）。特に興味深かったのは、大動脈石灰化を伴うCKDラットの腸内細菌叢において、P. copri種の存在量が著しく増加していたことである（図1d）。

図1. 慢性腎臓病（CKD）ラットの血管石灰化に伴い、腸内細菌叢組成が変化し、プレボテラ・コプリ（P. copri）存在量が増加した。(a)CKD群とモデル群の腸内細菌α多様性（Chao 1、観察種、PD全木、Shannon index）。(b) 2群間の重み付けなしUniFrac距離の主成分分析プロット。(c) 2群間で存在量が有意に異なる細菌分類群を示した線形判別分析の効果量。(d) 2群におけるP. copriの相対的存在量。データは平均値±SD、CKD=5、モデル=5で表した。p < .01および*p < .001（スチューデントのt検定による）。

図1. 慢性腎臓病（CKD）ラットの血管石灰化の過程で腸内細菌叢組成が変化し、プレボテラ・コプリ（P. copri）の存在量が増加した。(a) CKD群とモデル群の腸内細菌α多様性（Chao 1、観察種、PD全木、Shannon index）。(b) 2群間の重み付けなしUniFrac距離の主成分分析プロット。(c) 2群間で存在量が有意に異なる細菌分類群を示した線形判別分析の効果量。(d) 2群におけるP. copriの相対的存在量。データは平均値±SD、CKD=5、モデル=5で表した。p<0.01および*p<0.001はStudent's t-testによる。
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図S1に示すように、合計149人のCKD患者が最初に募集された。これらの患者のうち113人は、糞便サンプルの欠落またはその他の除外基準のために、その後除外された。最終的に、本研究のコホートは36人のCKD患者から構成された：大動脈石灰化を有するCKD患者18人（平均年齢57.28±7.60歳、55.56％が男性）と、大動脈石灰化を有しないマッチさせたCKD対照18人（平均年齢54.44±8.08歳、61.11％が男性）である。予想通り、2群間でベースラインの各種パラメータに有意差はなかった（表1）。注目すべきは、大動脈石灰化を起こしたCKD患者の糞便サンプルは、そうでない患者に比べてP. copriの存在が著しく増加し（図2a,b）、血清LPS値も上昇していたことである（図S2）。さらに、スピアマンの相関分析により、この観察がさらに補強された（図2c）。これらの所見から、P. copriの存在量と大動脈カルシウムスコアとの間に有意な正の相関があることが明らかになった。

図2. 慢性腎臓病（CKD）患者におけるプレボテラ・コプリ（P. copri）存在量と石灰化スコアの相関解析。(a)CKD患者の大動脈石灰化はコンピューター断層撮影によって検出された。(b)糞便中のP. copriの相対量。(c）糞便中のP. copriと石灰化スコアとの関連についてのスピアマンの相関分析。データは平均値±SDで表した。***p < 0.001（スチューデントのt検定による）。

図2. 慢性腎臓病（CKD）患者におけるプレボテラ・コプリ（P. copri）存在量と石灰化スコアの相関分析。(a)CKD患者の大動脈石灰化はCTスキャンで検出された。(b)糞便中のP. copriの相対量。(c）糞便中のP. copriと石灰化スコアとの関連についてのスピアマンの相関分析。データは平均値±SDで表した。スチューデントのt検定による***p < .001。
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表1. 登録されたCKD患者のベースライン特性。

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3.2. P.コプリはCKDラットにおいて大動脈石灰化を促進した
VC in vivoにおけるP. copriの制御的役割をさらに調べるために、生きたP. copriの単コロニーをモデルラットに胃内投与した（図3a）。図3bに示すように、Model群のラットはSham群のラットに比べて有意な体重減少を示し、P. copri投与ラットではさらに顕著であった。SCr レベルは、P. copriコロニー形成前の2つのモデル群間で有意差は認められなかった（図3c）。実験後、qRT-PCRによりP. copri投与群でコロニー形成が成功したことが確認された（図3d）。P. copriによるコロニー形成後、SCr、カルシウム、リン酸、PTHおよびFGF23レベルには、2つのモデル群間で有意差は観察されなかった（表S2）。マイクロCT分析、アリザリンレッド染色、およびカルシウム含量の定量を総合すると、P. copriを投与したラットでは、生理食塩水を投与したラットと比較して大動脈石灰化が増加していることが確認された（図3e-i）。図3jに示すように、Sham群と比較して、モデル群ではALP活性が有意に上昇し、P. copri群ではさらに上昇した。さらに、P. copri投与後のCKDラット大動脈では、収縮マーカーであるα-SMAの発現が低下し、骨形成マーカーであるRUNX2およびBMP2の発現が上昇した（図3k-n）。

図3. プレボテラ・コプリ（P. copri）は慢性腎臓病（CKD）ラットの大動脈石灰化を促進した。(a) 実験デザイン。(b) ラットの体重を毎週測定した。(c)血清クレアチニン(SCr)値は術後2週間後に測定した。(d) 実験終了時に糞便中のP. copriの相対量を測定した。(e）ラット大動脈石灰化のマイクロCT解析。スケールバー： 10 mm。(f）アリザリンレッドで染色した大動脈の代表画像。スケールバー：10mm： 10 mm。(g) アリザリンレッドで染色した大動脈切片の代表像。スケールバー： 500μm（上）と250μm（下）。(h) アリザリンレッド陽性領域をimage Jソフトウェアで定量した。(i) Caアッセイキットを用いた大動脈中のカルシウム含量の定量。(j）ALP活性測定キットを用いてアルカリホスファターゼ（ALP）活性を評価した。(k）ラント関連転写因子2（RUNX2）、骨形成タンパク質-2（BMP2）、およびα-平滑筋アクチン（α-SMA）の代表的ウエスタンブロット。(l-n）デンシトメトリーによるRUNX2、BMP2、α-SMAタンパク質発現の定量。データは平均値±SDで表した。有意ではない（ns）、*p < .05、**p < .01、***p < .001は、Bonferroni post hoc testを用いたone-way ANOVAによるもの。

図3. プレボテラ・コプリ（P. copri）は慢性腎臓病（CKD）ラットにおいて大動脈石灰化を促進した。(a) 実験デザイン。(b) ラットの体重を毎週測定した。(c)血清クレアチニン(SCr)値は術後2週間後に測定した。(d) 実験終了時に糞便中のP. copriの相対量を測定した。(e）ラット大動脈石灰化のマイクロCT解析。スケールバー： 10 mm。(f）アリザリンレッドで染色した大動脈の代表画像。スケールバー：10mm： 10 mm。(g) アリザリンレッドで染色した大動脈切片の代表像。スケールバー： 500μm（上）と250μm（下）。(h) アリザリンレッド陽性領域をimage Jソフトウェアで定量した。(i) Caアッセイキットを用いた大動脈中のカルシウム含量の定量。(j）ALP活性測定キットを用いてアルカリホスファターゼ（ALP）活性を評価した。(k）ラント関連転写因子2（RUNX2）、骨形成タンパク質-2（BMP2）、およびα-平滑筋アクチン（α-SMA）の代表的ウエスタンブロット。(l-n）デンシトメトリーによるRUNX2、BMP2、α-SMAタンパク質発現の定量。データは平均値±SDで表した。有意ではない（ns）、*p < .05、**p < .01、***p < .001は、Bonferroni post hoc testを用いたone-way ANOVAによるもの。
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メトロニダゾールが、P. copriを含む広範な細菌集団を実質的に減少させる能力を有することを示す以前の知見に照らして、我々は、ラットのVCに対するメトロニダゾールによるP. copriの除去効果に着手した（図4a）。モデル群では、Sham群と比較して有意な体重減少が認められたが、メトロニダゾールの投与により、この影響を軽減することに成功した（図4b）。SCr値は、メトロニダゾール投与前の2つのモデル群間で有意差は認められなかった（図4c）。予想通り、メトロニダゾールを投与したラットでは、未投与のラットに比べてP. copriの存在量が有意に減少した（図4d）。しかし、メトロニダゾール投与は、SCr、カルシウム、リン酸、PTH、およびFGF23レベルには有意な影響を与えなかった（表S3）。興味深いことに、アリザリンレッド染色、カルシウム含量およびALP活性測定により、メトロニダゾール処理後の大動脈石灰化の減少が明らかになった（図4e-i）。同様に、メトロニダゾール処置はRUNX2タンパク質レベルをダウンレギュレートし、α-SMAタンパク質レベルのアップレギュレーションを伴った（図4j-l）。

図4. 慢性腎臓病（CKD）ラットの大動脈石灰化に対するメトロニダゾールによるプレボテラ・コプリ（P. copri）クリアランスの効果。(a）実験デザイン。(b) ラットの体重を毎週測定した。(c)血清クレアチニン（SCr）値は術後2週間後に測定した。(d) 実験終了時に糞便中のP. copriの相対量を測定した。(e）アリザリンレッドで染色した大動脈の代表画像。大動脈のカルシウム沈着はアリザリンレッド溶液で染色した。スケールバー： 10 mm。(f) アリザリンレッドで染色した大動脈切片の代表像。スケールバー： 500μm（上）と250μm（下）。(g) アリザリンレッド陽性領域をimage Jソフトウェアで定量した。(h）Caアッセイキットを用いた大動脈中のカルシウム含量の定量。(i) ALP活性測定キットを用いてアルカリホスファターゼ（ALP）活性を評価した。(j）RUNX2（runt関連転写因子2）とα-平滑筋アクチン（α-SMA）の代表的ウエスタンブロット。(k-l）デンシトメトリーによるRUNX2およびα-SMAタンパク質発現の定量。データは平均値±SD、各群n=5で表した。有意ではない（ns）、*p<.05、**p < .01、***p < .001は、Bonferroni post hoc testを用いたone-way ANOVAによるもの。

図4. 慢性腎臓病（CKD）ラットの大動脈石灰化に対するメトロニダゾールによるプレボテラ・コプリ（P. copri）クリアランスの効果。(a) 実験デザイン。(b) ラットの体重を毎週測定した。(c)血清クレアチニン（SCr）値は術後2週間後に測定した。(d) 実験終了時に糞便中のP. copriの相対量を測定した。(e）アリザリンレッドで染色した大動脈の代表画像。大動脈のカルシウム沈着はアリザリンレッド溶液で染色した。スケールバー： 10 mm。(f) アリザリンレッドで染色した大動脈切片の代表像。スケールバー： 500μm（上）と250μm（下）。(g) アリザリンレッド陽性領域をimage Jソフトウェアで定量した。(h）Caアッセイキットを用いた大動脈中のカルシウム含量の定量。(i) ALP活性測定キットを用いてアルカリホスファターゼ（ALP）活性を評価した。(j）RUNX2（runt関連転写因子2）とα-平滑筋アクチン（α-SMA）の代表的ウエスタンブロット。(k-l）デンシトメトリーによるRUNX2およびα-SMAタンパク質発現の定量。データは平均値±SD、各群n=5で表した。有意ではない（ns）、*p<.05、**p < .01、***p < .001は、Bonferroni post hoc testを用いたone-way ANOVAによるもの。
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3.3. P.コプリはCKDラットの腸管バリア障害を悪化させ、血清LPS濃度を上昇させた。
腸内バリア透過性の亢進が、有害な代謝産物や細菌成分の腸管から血流への移行を促進し、腸内細菌異常症によって刺激される全身性炎症反応の誘発に関与していることを裏付ける証拠が増えつつあるCitation27,Citation28 P.コプリ誘発性VCの背景を解明するため、我々は腸管形態の包括的な検討に着手した。図5a-cに示すように、P. copriにコロニー形成されたラットは、絨毛の高さと陰窩の深さの減少によって示される、観察可能な上皮崩壊を示した。同時に、P. copri投与群では、重要なタイトジャンクションタンパク質、特にZO-1とOccludinのmRNAとタンパク質の発現レベルが有意に低下していた（図5d-h）。さらに、血清中のLPSレベル（図5i）およびLPS感受性受容体であるTLR-4の腸管発現レベル（図S3）も、モデル群ではSham群より有意に高く、P. copri群ではさらに上昇した。これらの結果は、P. copriの補給が、VCに関連する固有の腸管バリア機能障害を強め、LPS漏出の増加につながることを示している。さらに、VSMCと大動脈組織の両方におけるTLR4発現の検出は、腸組織で観察されたものと一致しており、Pc-LPS誘発VCにおけるTLR4の重要性を示唆している（図5j-m）。

図5. 大動脈石灰化を伴う慢性腎臓病（CKD）ラットにおいて、プレボテラ・コプリ（P. copri）は腸管バリアを損傷し、細菌性リポ多糖（LPS）の移行を促進した。(a-c）回腸の形態をヘマトキシリン・エオジン染色を用いて評価し（スケールバー＝100μm）、平均絨毛高と陰窩深度を解析した。(d-e）3群における腸管タイトジャンクションタンパク質zonula occludens-1（ZO-1）およびOccludinのmRNA発現レベル。(f)ZO-1とOccludinの代表的ウエスタンブロット。(g-h)デンシトメトリーによるZO-1とOccludinタンパク発現の定量。(i）末梢血中のLPSレベル。(j）ラットの大動脈組織におけるToll様受容体-4（TLR4）の代表的ウェスタンブロット。(k）デンシトメトリーによるTLR4タンパク質発現の定量。(l）血管平滑筋細胞（VSMCs）におけるTLR4の代表的ウエスタンブロット。 m）デンシトメトリーによるTLR4タンパク質発現の定量。データは平均±SD、各群n＝5で表した。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001は、Bonferroniポストホックテストを用いた一元配置分散分析によるものである。

図5. 大動脈石灰化を伴う慢性腎臓病（CKD）ラットにおいて、プレボテラ・コプリ（P. copri）は腸管バリアを損傷し、細菌性リポ多糖（LPS）のトランスロケーションを促進した。(a-c）回腸の形態をヘマトキシリン・エオジン染色を用いて評価し（スケールバー＝100μm）、平均絨毛高と陰窩深度を解析した。(d-e）3群における腸管タイトジャンクションタンパク質zonula occludens-1（ZO-1）およびOccludinのmRNA発現レベル。(f)ZO-1とOccludinの代表的ウエスタンブロット。(g-h)デンシトメトリーによるZO-1とOccludinタンパク発現の定量。(i）末梢血中のLPSレベル。(j）ラットの大動脈組織におけるToll様受容体-4（TLR4）の代表的ウェスタンブロット。(k）デンシトメトリーによるTLR4タンパク質発現の定量。(l）血管平滑筋細胞（VSMCs）におけるTLR4の代表的ウエスタンブロット。 m）デンシトメトリーによるTLR4タンパク質発現の定量。データは平均±SD、各群n＝5で表した。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001は、Bonferroni post hoc testを用いた一元配置分散分析によるものである。
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3.4. Pc-LPSはin vitroおよびex vivoでVCを促進した
引用27 VCに対するPc-LPSの効果を調べるため、ラット大動脈輪とVSMCを石灰化培地中でPc-LPSで1週間処理した（図6a）。アリザリンレッド染色により、Pc-LPSはVSMCの石灰化を用量依存的に有意に促進することが明らかになった（図6b,c）。その結果、その後のin vitroおよびex vivoでの実験では、VCを誘導するPc-LPSの最低濃度を利用した。図6d-jに示すように、Pc-LPSの添加は、RUNX2 mRNAおよびタンパク質レベルの上昇を伴うVSMCのALP活性を増強し、α-SMA mRNAおよびタンパク質レベルを低下させた。アリザリンレッド染色、カルシウム含量、およびALP活性アッセイにより、ラット大動脈リングを用いたこれらの結果がさらに裏付けられた（図6k-n）。さらに、Pc-LPSはラット大動脈輪において、RUNX2の発現を顕著に増加させ、α-SMAの発現をタンパク質レベルで減少させた（図6-o-q）。

図6. Prevotella copri由来のリポ多糖（pc-LPS）はin vitroおよびex vivoで血管石灰化を促進した。(a）実験デザイン。(b）アリザリンレッドで染色した血管平滑筋細胞（VSMCs）の代表的な画像。スケールバー： 500 μm。(c）アリザリンレッド色素の定量分析はマイクロプレートリーダーで行った。(d）Caアッセイキットを用いたカルシウム含量の定量。(e）ALP活性測定キットを用いてアルカリホスファターゼ（ALP）活性を評価した。(f-g）ラント関連転写因子2（RUNX2）およびα-平滑筋アクチン（α-SMA）のmRNA発現。(h）RUNX2とα-SMAの代表的ウエスタンブロット。(i-j）デンシトメトリーによるRUNX2およびα-SMAタンパク質発現の定量化。(k) アリザリンレッドで染色した大動脈切片の代表像。スケールバー： 500 μm。(l）アリザリンレッド陽性領域をimage Jソフトウェアで定量した。(m）Caアッセイキットを用いて大動脈中のカルシウム含量を定量した。(n）ALP活性測定キットを用いてALP活性を評価した。(o）RUNX2およびα-SMAの代表的ウエスタンブロット。(p-q）デンシトメトリーによるRUNX2およびα-SMAタンパク質発現レベルの定量。データは平均値±SD、各群n=5で表した。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001は、Bonferroni post hoc testを用いた一元配置分散分析によるものである。

図6. Prevotella copri由来のリポ多糖（pc-LPS）はin vitroおよびex vivoで血管石灰化を促進した。(a）実験デザイン。(b）アリザリンレッドで染色した血管平滑筋細胞（VSMCs）の代表画像。スケールバー： 500 μm。(c）アリザリンレッド色素の定量分析はマイクロプレートリーダーで行った。(d）Caアッセイキットを用いたカルシウム含量の定量。(e）ALP活性測定キットを用いてアルカリホスファターゼ（ALP）活性を評価した。(f-g）ラント関連転写因子2（RUNX2）およびα-平滑筋アクチン（α-SMA）のmRNA発現。(h）RUNX2とα-SMAの代表的ウエスタンブロット。(i-j）デンシトメトリーによるRUNX2およびα-SMAタンパク質発現の定量化。(k) アリザリンレッドで染色した大動脈切片の代表像。スケールバー： 500 μm。(l）アリザリンレッド陽性領域をimage Jソフトウェアで定量した。(m）Caアッセイキットを用いて大動脈中のカルシウム含量を定量した。(n）ALP活性測定キットを用いてALP活性を評価した。(o）RUNX2およびα-SMAの代表的ウエスタンブロット。(p-q）デンシトメトリーによるRUNX2およびα-SMAタンパク質発現レベルの定量。データは平均値±SD、各群n=5で表した。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001は、Bonferroni post hoc testを用いた一元配置分散分析によるもの。
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3.5. VC中のPc-LPSによるNF-κBシグナル伝達経路の活性化
次に、Pc-LPSがVCを制御する分子機序を調べた。これまでの研究で、LPSはNF-κBシグナル伝達経路を活性化することによって血管の炎症を促進し、それがVCの病態に関与していることが示されている（引用文献8,引用文献29）。そこで、Pc-LPSがVC中のNF-κBの活性化に影響を及ぼすかどうかを調べた。図7a-cに示すように、P.copri.投与は、ラット大動脈におけるリン酸化NF-κBおよびNLRP3タンパク質の発現レベルを有意に上昇させた。さらに、P. copriは大動脈において、炎症性サイトカインであるTNF-α、IL-6、IL-1βのレベルをともに上昇させた（図7d）。これらのin vivoの結果と一致して、VSMCにおけるリン酸化NF-κB、NLRP3、TNF-α、IL-6およびIL-1βの発現レベルは、モデル群よりもPc-LPS群で有意に高かった（図7e-h）。対照的に、PDTCによるNF-κBの阻害は、Pc-LPS誘発VSMC石灰化を効果的に抑制した（図7i-l）。PDTCの添加はまた、Pc-LPS処理VSMCにおいてRUNX2を有意に減少させたが、α-SMA mRNAおよびタンパク質レベルは増加させた（図7m-q）。

図7. 核内因子κB（NF-κB）の活性化は、Prevotella copri由来のリポ多糖（pc-LPS）による血管平滑筋細胞（VSMCs）の石灰化に必要であった。 a）ラット大動脈のリン酸化NF-κB（pNF-κB）およびヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン、ロイシンリッチリピートおよびピリンドメイン含有3（NLRP3）の代表的ウェスタンブロット。(b-c）デンシトメトリーによるpNF-κBおよびNLRP3タンパク質発現の定量。(d）ラット大動脈における腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン-6（IL）-6およびIL-18の濃度をELISAアッセイにより測定した。(e）VSMCsのpNF-κBおよびNLRP3の代表的ウエスタンブロット。(f-g）デンシトメトリーによるpNF-κBおよびNLRP3タンパク質発現の定量化。(h）VSMCs中のTNF-α、IL-6およびIL-18の濃度をqRT-PCRにより測定した。(i-q）VSMCsを、NF-κB阻害剤ピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム（PDTC）を添加または無添加の石灰化培地存在下でpc-LPSとともにインキュベートした。(l）アリザリンレッドで染色したVSMCの代表的な画像。スケールバー： 500 μm。(j）アリザリンレッド色素の定量分析はマイクロプレートリーダーで行った。(k) Caアッセイキットを用いたカルシウム含量の定量。(l）ALP活性アッセイキットを用いてALP活性を評価した。(m-n）RUNX2およびα-SMAのmRNA発現。(o）RUNX2およびα-SMAの代表的ウエスタンブロット。(p-q）デンシトメトリーによるRUNX2およびα-SMAタンパク質発現レベルの定量。データは平均値±SD、各群n=5で表した。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001は、Bonferroni post hoc testを用いた一元配置分散分析によるものである。

図7. 核因子κB（NF-κB）の活性化は、プレボテラ・コプリ由来のリポ多糖（pc-LPS）誘発性血管平滑筋細胞（VSMCs）の石灰化に必要であった。 a）ラット大動脈のリン酸化NF-κB（pNF-κB）およびヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン、ロイシンリッチリピートおよびピリンドメイン含有3（NLRP3）の代表的ウェスタンブロット。(b-c）デンシトメトリーによるpNF-κBおよびNLRP3タンパク質発現の定量。(d）ラット大動脈における腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン-6（IL）-6およびIL-18の濃度をELISAアッセイにより測定した。(e）VSMCsのpNF-κBおよびNLRP3の代表的ウエスタンブロット。(f-g）デンシトメトリーによるpNF-κBおよびNLRP3タンパク質発現の定量化。(h）VSMCs中のTNF-α、IL-6およびIL-18の濃度をqRT-PCRにより測定した。(i-q）VSMCsを、NF-κB阻害剤ピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム（PDTC）を添加または無添加の石灰化培地存在下でpc-LPSとともにインキュベートした。(l）アリザリンレッドで染色したVSMCの代表的な画像。スケールバー： 500 μm。(j）アリザリンレッド色素の定量分析はマイクロプレートリーダーで行った。(k) Caアッセイキットを用いたカルシウム含量の定量。(l）ALP活性アッセイキットを用いてALP活性を評価した。(m-n）RUNX2およびα-SMAのmRNA発現。(o）RUNX2およびα-SMAの代表的ウエスタンブロット。(p-q）デンシトメトリーによるRUNX2およびα-SMAタンパク質発現レベルの定量。データは平均値±SD、各群n=5で表した。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001は、Bonferroni post hoc testを用いた一元配置分散分析によるもの。
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4. 考察
(2)P.コプリのコロニー形成は、CKDラットにおいて、腸管バリアーを悪化させ、血清LPSレベルを上昇させ、ひいてはVCを悪化させる。我々の知る限り、これはVCにおける腸内細菌異常症の病因的役割だけでなく、CKDにおける腸内細菌異常症の代表的な病原細菌を明らかにした最初の研究である（図8）。

図8. 作用機序の模式図。慢性腎臓病（CKD）誘発血管石灰化（VC）ラットでは、腸内細菌叢のホメオスタシスが破綻しており、これはプレボテラ・コプリ（P. copri）レベルの上昇とリポ多糖（LPS）含量の増加によって証明されている。同時に、LPSに特異的な受容体であるToll様受容体-4（TLR4）の発現が増加する。このアンバランスが粘膜バリアの破壊とそれに続く腸の「漏出」を引き起こし、これが核因子κB（NF-κB）とヌクレオチド結合ドメイン、ロイシンリッチ含有ファミリー、ピリンドメイン含有-3（NLRP3）インフラムソームシグナルを活性化し、全身性の炎症反応を誘発し、VCをさらに悪化させる。

図8. 作用機序の模式図。慢性腎臓病（CKD）誘発血管石灰化（VC）を起こしたラットでは、腸内細菌叢の恒常性が乱れ、プレボテラ・コプリ（P. copri）レベルの上昇とリポ多糖（LPS）含量の増加が証明されている。同時に、LPSに特異的な受容体であるToll様受容体-4（TLR4）の発現が増加する。このアンバランスが粘膜バリアの破壊とそれに続く腸の「漏出」を引き起こし、これが核因子κB（NF-κB）とヌクレオチド結合ドメイン、ロイシンリッチ含有ファミリー、ピリンドメイン含有-3（NLRP3）インフラムソームシグナルを活性化し、さらに全身性の炎症反応を誘発し、VCをさらに悪化させる。
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腸内細菌叢と心血管疾患との関連は以前から報告されているが、腸内細菌がVCの影響を媒介するかどうかはまだ不明である。我々の先行研究では、CKDラットに抗生物質を投与して腸内細菌叢を抑制すると、大動脈石灰化が抑制されることが示され、VCの治療戦略として腸内細菌叢を再構築する可能性が示唆された。注目すべきことに、本研究では、Sham群とモデル群の間で腸内細菌組成に顕著な違いが観察された。特に、大動脈石灰化を起こしたCKDラットでは、Prevotellaの存在量が増加しており、これは、心臓弁石灰化における以前の所見と一致していたCitation24。その後の解析で、P. copriが、CKD患者とVCを起こしたラットの両方の腸内で優勢な種であることが特定された。P.コプリは、ヒトの腸内、特に欧米化されていない集団に多く見られる細菌の一種である。P.コプリはヒトのマイクロバイオームの天然成分であるが、その過剰発現は強直性脊椎炎と関節リウマチの両方に関連している。引用37 さらに、P.コプリは、宿主の脂肪沈着を有意に増加させる代謝産物を産生することにより、ブタの慢性炎症を悪化させることが報告されている引用38,引用39 したがって、炎症におけるその役割から、P.コプリは心血管疾患に関与する重要な病原体の可能性がある。我々は、シャムラットにP. copriをコロニー形成させる予備実験を行った。興味深いことに、P. copriのコロニー形成のみでは、CKDが存在しないにもかかわらず大動脈石灰化は誘導されなかったことから、ヒトの糞便中に観察されるP. copriの増加は、CKDに関連したVCのイニシエーターというよりはむしろプロモーターである可能性が示唆された。本研究では、P. copriのコロニー形成がCKDラットの大動脈石灰化を増悪させ、それがP. copriの除去によって抑制されることを初めて証明した。これらの所見は、P. copriを標的とすることが、CKDにおける大動脈石灰化を抑制する治療戦略の可能性を示唆している。

VCを発症したCKD患者におけるP.copriの増加は、今回の研究では明確には明らかにされていないが、CKDの影響と腸内細菌叢動態の複雑な相互作用から生じている可能性がある。具体的には、pHの変化、尿素の増加、栄養プロフィールの変更など、CKDによる腸内環境の変化は、P. copriの増殖を促進する。さらに、CKDにおける食事の制限は、この微生物バランスをさらに変調させる可能性がある。重要なことは、CKD患者における炎症カスケードが、P. copriの増殖を増幅し、炎症を持続させ、腸管バリアを損なう可能性があることである。引用11,引用15,引用16 CKD患者のVCでP. copriが増加する理由を結論づけるには、それぞれの潜在的なメカニズムを探る厳密な実験的研究が必要である。我々は、P.copriの増加とVCをつなぐシグナル伝達経路を解明することに焦点を当てた。グラム陰性菌の外膜に存在する炎症刺激物質であるLPSが、重要な役割を果たすことが明らかになった。先行研究では、VCにおける大腸菌由来のLPSの役割が強調されていたが、Citation40,Citation41我々のモデルでは、大腸菌レベルに差のある変化は見られなかった。重要なことは、LPSの供給源は大腸菌だけではないということである。引用42 重要なことは、P.コプリをコロニー形成したCKDラットは腸管が顕著に破壊され、その結果、LPSに同調する受容体であるTLR4の発現が上昇したことである。我々はさらに、P.コプリ由来のLPS（Pc-LPS）がVCを促進するだけでなく、VSMCsの収縮型から骨形成型への表現型転換を促し、Pc-LPSがP.コプリによるVC促進における主要なエフェクターであると位置づけた。

引用44,引用45 私たちの先行研究と現在の研究の両方が、血管炎症の主要な制御因子である転写因子NF-κBが、CKDラットモデルのVCを促進することを強調している。 Citation8,Citation46重要なことは、LPSがTLR4に結合するとNF-κBが活性化され、IL-6、IL-1β、TNF-αを含む複数の炎症因子の転写が誘発されることである。その結果、Pc-LPSはTLR4に結合し、NF-κBとNLRP3インフラマソームのシグナルを活性化し、TNF-α、IL-1β、IL-6のレベルを上昇させた。PDTCを用いてNF-κBを阻害すると、Pc-LPSによる骨形成分化とVSMCの石灰化が顕著に減少した。これらの結果は、Pc-LPSによって誘導されたVSMC石灰化を調節するNF-κBシグナルの役割を強調するものである。

我々の研究にはいくつかの限界がある。第一に、微生物の組成は消化管全体で大きく異なる可能性がある。糞便サンプルは主に小腸などの他の場所ではなく、遠位結腸の微生物集団を表しているため、糞便サンプルに多く存在しない種の関連性を見逃している可能性がある。第二に、我々の研究は細菌種間の複雑な相互作用を掘り下げていないため、VCに対する他の異常に豊富な細菌種の影響を完全に排除することはできない。第三に、われわれが採用したモデルは、カルシトリオールの経口投与とカルシウムとリンの濃縮食を伴う5/6腎摘出術からなるもので、典型的な臨床環境の複雑さを完全に再現することはできない。P.コプリを潜在的なバイオマーカーや治療標的として活用することの有用性を検証するためには、さらなる研究が必要である。さらに、我々は特にP. copriのクリアランスに焦点を当てたが、メトロニダゾールが腸内細菌叢の全体的な構成に影響を与える可能性があることを認めた。このことを認識した上で、今後の研究では、このような広範な影響をより正確に評価するように計画すべきである。メトロニダゾールのような広域抗生物質が腸内細菌叢にどのような影響を及ぼすのか、特にCKDとVCとの関連において、より詳細な理解が必要である。

結論
要約すると、我々は、NF-κB/NLRP3シグナル伝達経路の阻害を含むメカニズムによって、P. copriとその由来Pc-LPSがCKD関連VCにおいて重要な役割を果たすことを明らかにした。特定の腸内細菌群集、特にP.コプリを標的とすることは、CKDにおけるVCの有望な治療戦略である。初期細菌マーカーのモニタリングにさらに重点を置くことで、VCに対するより信頼性の高い指針が得られる可能性がある。

著者貢献
QY Haoが実験を行った。J Yanはデータの解析と原稿の執筆を行った。JT Weiが実験とデータ解析を行った。YH Zeng、LY Feng、DD Que、SC Li、JB Guo、Y Fan、YF Ding、XL Zhangが実験を行った。PZ Yangは実験の構想と設計を行った。JW Gaoは、研究の構想・設計とデータ解析を行った。ZH Liは実験の構想・設計、データ解析、原稿の修正を行った。

補足資料
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情報開示
著者による潜在的な利益相反は報告されていない。

補足資料
本論文の補足データは、https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2351532 からオンラインでアクセスできる。

追加情報
資金提供
本研究は、中国国家自然科学基金会（82200442、82070247、82370237、82000460）および広東省基礎応用基礎研究基金会（2022A1515012263）からの助成金により行われた。
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