ムチン糖鎖は口腔内微生物群集の構成と機能を駆動する

2023年3月26日 11:45

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発行：2023年3月23日
ムチン糖鎖は口腔内微生物群集の構成と機能を駆動する

https://www.nature.com/articles/s41522-023-00378-4

クロエ・M・ウー
ケルシー・M・ウィーラー
...
Katharina Ribbeck
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npj Biofilms and Microbiomes 9巻記事番号：11 (2023) この記事を引用する
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11 Altmetric（アルトメトリック
メトリックス詳細
アブストラクト
ヒトのマイクロバイオーム構成は健康と密接に関連しているが、宿主がどのように微生物の住人を管理しているかはまだ不明である。この粘液には、ゲル形成性の糖タンパク質（ムチン）が含まれており、潜在的な制御機能を持つ数百の糖鎖構造を示しています。私たちは、ムチンが口腔内の微生物群集にどのような影響を与えるかを研究するために、扱いやすい培養ベースのシステムを活用し、ムチンの糖鎖が多様な微生物の共存を可能にし、疾患に関連した組成のシフトに抵抗することを発見した。また、ムチンの糖鎖ライブラリーを単離した場合と同様に、特異的な糖鎖パターンが微生物群集の調節に重要であることを明らかにした。ムチンは、代謝の多様性を支える栄養素として機能し、凝集を抑えて空間構造を整理し、競合する分類群間の拮抗を制限する可能性があるなど、いくつかの方法で微生物コミュニティを形成することを発見しました。全体として、本研究は、ムチン糖鎖が自然宿主のメカニズムであり、健康な微生物群集を維持するための治療介入の可能性があることを明らかにした。
はじめに
ヒトの体内には、数兆個もの多様な微生物が存在し、粘膜表面には複雑な群集が形成されています。微生物のホメオスタシスを維持することは、人間の健康にとって不可欠であるが、宿主が有益な微生物を選択し、競合する微生物との共存を確立する仕組みは、ほとんど理解されていない。私たちの微生物群は、主に粘液に存在しています。粘液は複雑な粘弾性マトリックスで、体内のすべての非角化上皮表面を覆っています。粘弾性と糖鎖の変化を含む粘液の障害は、多くの病態1,2,3,4やマイクロバイオームの不均衡（ディスバイオシス）2,5,6,7と関連しており、健康にとって粘液バリアの重要性が浮き彫りにされています。
粘液の構造および生物学的機能の多くは、ムチンを中心に構成されています。ムチンは、ペプチド骨格を分岐した糖鎖（グリカン）で密にコーティングした大型糖タンパク質です（図1a）。ムチンは、微生物とさまざまな形で相互作用することができます。例えば、複雑な糖質を分解する機構を持つ細菌は、全粘液8,9や精製ムチン10,11を栄養源として利用できる。また、ムチンは微生物12,13,14と結合し、その空間的な組織化を媒介することができる15。さらに、ムチンとその化学的に多様なO-結合型糖鎖は、バイオフィルム形成16,17,18、コミュニケーション16、競争18,19など微生物の行動に影響を与えることができます。これらの機能は、微生物のホメオスタシス維持にムチンが重要な役割を果たしていることを示唆しているが、複雑な微生物群集の文脈におけるムチンの影響については、ほとんど研究されていないのが現状である。最近、ムチン糖鎖を添加した餌を与えたマウスが微生物組成に違いを示すことが示され20、ムチン糖鎖の生化学的重要性や微生物との相互作用の基礎となるメカニズムについて新たな疑問が投げかけられた。
図1：異なる粘膜ニッチからのムチンが多様な口腔微生物コミュニティを促進する。
a ムチン糖タンパク質のネットワークに組み込まれた微生物群集の模式図。GalNAc： N-アセチルガラクトサミン；GlcNAc： b プールのヒト唾液から得た接種コミュニティの16S rRNAシーケンスによる相対存在量。c ムチンを含まないグルコース培地での経時的な分類学的多様性（Shannon-Wiener Index）。d ヒト唾液（MUC5B）、ブタ胃粘液（Muc5ac）、ブタ腸粘液（Muc2）から分離した、人体全体の粘膜ニッチを代表する一次ゲル形成性ムチン型。 e, f ムチン添加または無添加培地で培養した微生物群集のα（e）とβ（f）多様性（48時間、n = 4）。e, f）において、中心線は中央値を、枠線は上下4分位を、ひげは最小値と最大値を示す。各ポイントは独立した複製を表す。ムチンを含まない培地との有意差は、反復測定一元配置分散分析（ANOVA）とダネットの多重比較検定で評価した。*g ムチンを含む、または含まないグルコース培地でのコロニー形成単位（CFU）のカウントにより、総増殖量を測定した。各ポイントは平均CFU/mL（n = 3）を表し、エラーバーは標準偏差（s.d.）を示す。 h 16 S rRNAシーケンスデータのPCoAバイプロットで、培養環境（48時間、n = 4）によるコミュニティの分離を示した。各ポイントは独立した複製を表す。i-lグルコース培地でMUC5B、Muc5ac、Muc2を含まない（i）または含む（j）連鎖球菌グループの相対的存在量（l）。各ポイントは平均相対存在量を表し、バーはs.e.m.を表す（n = 4）。すべての実験は、補足図1に描かれているように、接種コミュニティ1および2を用いて行われた。(a)の模式図は、The FEBS Journalに掲載された構成要素（ムチン・ポリマー、バクテリア）を許可を得て転用したものである15。
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ここでは、ヒト唾液、豚胃粘液、豚腸粘液などの複数の粘膜ニッチから精製したムチン（グリコシル化が異なる）、および組成や構造の複雑さが異なる単離ムチン糖鎖ライブラリーが、それぞれ微生物群集にどのように特異的に影響するかを調査している。我々は、多様な唾液微生物叢21が存在し、組成の変化が様々な病態に関連している口腔に注目した22,23。ムチンと微生物群集の両方をヒトの唾液から分離することができるため、口腔ニッチのアクセス性の高さから、本来の宿主と微生物の相互作用を捉えることができました。さらに、天然の口腔内コミュニティは、幅広い代謝能24と顕著な空間分布パターン25,26を示すが、これらの表現型に対するムチンの影響についてはまだ明らかにされていない。
宿主因子が細菌群集にどのような影響を与えるかを調べることは、個人差や実験的コントロールの欠如のため、in vivoでは困難である。一方、in vitroのセットアップでは、宿主本来の機能やコミュニティの複雑さを把握できないことが多い。このギャップを埋めるため、我々は、厳密に制御された培養ベースのシステムを使って、ムチンが口腔内の微生物群集をどのように制御しているかを明らかにした。その結果、異なる粘膜組織から分離されたムチンは、多様なコミュニティメンバー間の共存を促進し、疾患に関連する異生物のシフトに抵抗する機能が保存されている一方で、異なる糖鎖構造セットが特定の微生物組成を決定することを明らかにした。さらに、ムチンが代謝活性のランドスケープを拡大し、より空間的に分散した群集構造を形成している証拠を発見した。これらの結果は、ムチン糖鎖が健康な微生物相を確立するための強力な自然宿主ツールであることを示唆しています。
研究成果
ムチンを用いて培養した口腔内微生物群集は分類学的多様性が高まる
ムチンが微生物叢の組成をどのように形成するかを評価するために、ヒト唾液に由来するネイティブな口腔内コミュニティを、口腔内細菌27を培養するために開発されたグルコースベースの化学的に定義された培地に、ムチンが存在しないか存在する状態で植え付けました。この実験では、グルコースベースの培地による選択的濃縮の可能性を考慮し、ムチンの効果を検証しています。その後、16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子配列決定法を用いて、経時的にその組成をプロファイリングした。これらの初期接種物は分類学的に豊かで、8つの系統にまたがる少なくとも54の属を含んでいた（図1b、補足図1）。
グルコースベースの培地だけで培養すると、群集の多様性は急速に失われた（図1b、c）。ムチンが群集組成に与える影響を評価するため、グルコースベースの培地に、ヒト唾液由来のムチン（主にMUC5B）、ブタ胃粘液（主にMuc5ac、ヒトMUC5ACのカウンターパート）、ブタ腸粘液（主にMuc2、ヒトMUC2のカウンターパート）（図1d）を補充しました（図1）。重要なことは、ムチンが本来の組織から精製され、その重要な粘弾性特性28,29と、市販の製剤では失われる可能性のある複合糖鎖29の緻密な被覆を保持していることである。各ムチンは、微生物の多様性の崩壊を部分的に緩和し（図1e）、ムチンを添加せずに培養したものよりも、出発時の接種物の組成に近いコミュニティを形成した（図1f）。全体的な増殖と総抽出DNA量は、どの環境でも同程度に保たれていた（図1g, 補足図2）。したがって、観察された組成パターンは、総バイオマス量や配列決定されたDNA量の劇的な変化と混同されるものではない。これらの結果から、ムチンの種類を問わず、より多様なコミュニティを維持し、本来の微生物相に近い組成にするための高レベルの機能が保存されていることが明らかになった。
ムチンは潜在的に有益な細菌を支持し、ディスバイオシスに抵抗する
MUC5B、Muc5ac、Muc2の非存在下で培養したコミュニティを区別する分類群を同定するため、シーケンスデータに対して主座標分析（PCoA）を実行しました。その結果、群集組成は培養環境に応じて明確なパターンを示し（図1h）、最初の2つの主座標がサンプルの分散の大部分（合計93.46％）を捉えました。最も影響力のある個々の分類群のうち、第1および第3分類群はSalivarius群連鎖球菌（Streptococcus salivarius、Streptococcus vestibularis、Streptococcus thermophilusを含む）に属し、第2および第4分類群はMitis群連鎖球菌（Streptococcus mitis、Streptococcus oralis、Streptococcus infantisを含む）に属しました（図1H）。
グルコースベース培地のみでは、健康関連菌であるMitisおよびParasanguinis連鎖球菌が経時的に減少し、それに伴ってSalivarius連鎖球菌が伸長することが観察された（図1i）。また、グルコース培地にムチンを添加すると、MitisとParasanguinis連鎖球菌は維持され、Salivarius連鎖球菌の増殖は制限された（図1j-l）。口腔内のMitis連鎖球菌とSalivarius連鎖球菌の比率の多様性の低下やシフトは、虫歯30やクローン病31などの疾患と相関しており、微生物の異常繁殖に対するムチンの保護的役割が示唆されます。さらに、シークエンスデータの階層的クラスタリング解析により、コミュニティは、培養された特定のムチンタイプに基づいてクラスタリングされることが明らかになった（補足図3）。このことは、微生物の組成が、与えられた体表面から分泌されるムチンタイプの特定のポリマー構造と生化学に依存する可能性を示している。
ムチン糖鎖は、特定の構造パターンに依存して、コミュニティの多様性とメンバーシップに影響を与える
ムチンのグリコシル化がコミュニティーの構成に影響を与えるかどうかを直接調べるために、O-糖鎖をネイティブな形で保存する非還元的アルカリβ-脱離法を用いて、MUC5BとMuc5acから単離した糖鎖のプールを作成した（図2a）。質量分析により、各ライブラリーで50以上の糖鎖ピークが同定された。糖鎖の長さ、分岐パターン、末端修飾がライブラリーの多様性を決定した（図2b-d）。ムチンとムチン糖鎖で成長したコミュニティは、多様性とメンバー数において広く同様の傾向を示し（図2e, f, h）、糖鎖構造がムチンの微生物組成を形成する保存的能力に貢献していることが明らかになった。完全なムチンポリマーと同様に、糖鎖は総増殖量や抽出DNA量に大きな変化を与えることなく、組成に影響を与えた（補足図4）。MUC5B糖鎖とMuc5ac糖鎖は、出発時の接種菌に近いコミュニティを形成しており（図2f）、ムチン糖鎖（ペプチド骨格ではない）が複雑なコミュニティ構成を維持する鍵であることが示された。異なる組織からの糖鎖プールの影響をより詳細に調べるため、シークエンスデータに階層的クラスタリングを適用したところ、コミュニティは主にその環境にMuc5ac糖鎖が含まれているかMUC5B糖鎖が含まれているかによってクラスター化し、接種コミュニティによってサブクラスターが形成されることがわかった（図2g）。このように、各ムチン糖鎖プールの正確な構造パターンが、微生物群集の組成を駆動するのである。
図2：単離されたムチン糖鎖は、構造依存的に微生物の多様性を促進し、特定の微生物分類群を支持する。
a この実験で比較した異なるムチンと糖鎖プールの概要。 b MS分析により同定された顕著な糖鎖構造。c MUC5BとMuc5acの糖鎖のフコシル化、シアリル化レベル、および連結した単糖の平均数 d MUC5BとMuc5acから分離した糖鎖のライブラリ間の重複。e, f）において、中央の線は中央値を、ボックスの限界は上下の四分位を、ひげは最小値と最大値を示している。各ポイントは独立した複製を表す。培地単独での有意差は、反復測定一元配置ANOVAとDunnettの多重比較検定で評価した。*g MUC5B糖鎖またはMuc5ac糖鎖で生育した群集の階層的クラスタリング解析。デンドログラムは、微生物組成に基づくコミュニティの平均連鎖クラスタリング（1-ピアソン距離メトリック）を表す（48時間）。ヒートマップは、0.1%以上の微生物分類群の相対的な存在量を示している（48時間）。各列は独立した複製を表す。 h 選択した分類群の相対存在量の低下に対するムチンおよびムチン糖鎖の影響。棒の長さは、培地のみに対する存在量の変化の平均を表す。各ポイントは独立した複製での変化を表し、エラーバーはs.e.m.を示す。すべての実験はコミュニティ3および4を接種して行われた（補足図1も参照）。培地のみ、MUC5B、Muc5ac、および単糖類に関する解析は、各接種コミュニティ1〜4（n = 8）の複製を含む。MUC5B糖鎖、Muc5ac糖鎖、加水分解糖鎖の解析は、接種コミュニティ3および4（n = 4）を含む。e, f）では、比較のため、コミュニティ1および2を接種した培地のみ、MUC5B、Muc5acのデータを図1e, fから重複して掲載しています。
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糖鎖構造の複雑さの役割を評価するために、Muc5acの糖鎖を部分的に酸加水分解し、複雑さを減らした糖鎖ライブラリーを作り32、ムチン糖鎖を構成する単糖の構成要素の混合物をテストした（図2a）。加水分解された糖鎖ライブラリーは、ムチン糖鎖と培地のみと比較して、多様性に中間の効果を示した（図2e、f）。このことは、興味深いことに、すべての細菌群にわたって部分的に機能するのではなく、一部の分類群で、完全に複雑なMuc5acおよびMUC5B糖鎖プールと同等の程度の変化を示した。具体的には、培地のみと比較して、加水分解された糖鎖はParasanguinis streptococciとGemellaの存在量を増加させたが、Mitis streptococciやGranulicatellaは増加しなかった（図2h）。これは、特定の細菌を濃縮するには非修飾コア構造で十分だが、他の細菌の維持にはフコース、シアル酸、拡張N-アセチルラクトサミン鎖の存在に重要となる可能性のあることを示唆した。単糖だけでは、Salivarius streptococciを制限したり、これらの優勢な常在菌を保持することができないことから（図2h）、ムチン糖鎖の特定の化学結合と立体化学がこの機能の鍵を握っているのかもしれない。これらの知見を総合すると、ムチン糖鎖は微生物群集の多様性と組成を維持することが明らかになった。この効果の強さと特異性は、構造や複雑さが異なる糖鎖プール（糖鎖の分岐の種類や程度、糖鎖あたりの単糖の数が異なるため）において異なる。
ムチン糖鎖は、在来属や高い多様性を保持するための栄養基質として機能する
ムチンが群集組成を調節するメカニズムを探るために、我々はまず、ムチン糖鎖が特定の細菌を支持する栄養源として機能するという可能性を検証した。そこで、ムチン、単離されたムチン糖鎖、または単糖類のプールを唯一の炭素源とする培地で培養した口腔内コミュニティの組成をモニターした。ムチンとムチン糖鎖は、分類学的に豊かな群集の成長を支持し、出発時の接種液と同程度の多様性を維持した（図3a、b）。この発見と一致するように、階層的クラスタリングにより、接種した群集はムチンを含む培地で培養した群集と最も密接にクラスタリングし、次いでムチン糖鎖でクラスタリングすることが判明した（補足図5）。各単独炭素源での成長には違いが見られたが（図3c, d）、各ムチンを含む基質での実質的な成長は、48時間後に豊富な多様な分類群が、拡大する集団の中で活発に支持されていることを示した（単に最初の植え付けから持ち越したのではない）。これらのデータは、ムチン糖鎖が多様性の高い群集の成長を促進すること、そして糖鎖の構造の複雑さがその機能の鍵を握っていることを示唆している。
図3：ムチンとムチン糖鎖を唯一の炭素源とすることで、固有属と高い多様性を持つ口腔内コミュニティが形成される。
a ムチンまたはムチン糖鎖を添加して培養した微生物群集の相対存在量。b グルコースベース培地、またはムチン、ムチン糖鎖、単糖類を唯一の炭素源とする炭素なし培地で48時間培養した微生物群集のアルファ多様性（n = 4）。中央の線は中央値を、ボックスの限界は上下の四分位を、ひげは最小値と最大値を示している。各ポイントは独立した複製を表す。ネイティブの微生物群に対する有意差は、Dunnettの多重比較検定による反復測定一元配置分散分析で評価した。*c 48時間にわたる異なる炭素基質上での総コミュニティ成長。各ポイントは平均CFU/mL（n = 3）を表し、エラーバーはs.dを示す。 e ムチン糖鎖を唯一の炭素源とする培地で成長（48時間）後の優勢属の存在量の変化。ヒートマップは、開始時の接種量と比較した相対存在量の変化を示している。分類群の存在量における有意な差は、一元両側t検定により確認した。有意差の閾値は、多重比較のためのボンフェローニ補正で調整した。*f 異なる炭素源を用いた培養で保持された（log2 fold change [FC] > -1）属および連鎖球菌グループのベン図。太字の属は、CAZyデータベースにより、推定ムチン糖鎖分解装置をコードしている可能性が高い（補足図6も参照）。 g, h グルコース、ムチン、ムチン糖鎖、または単糖を唯一の炭素源として、本来の口腔コミュニティから分離したサリバリウス（g）およびミティス（h）連鎖球菌菌株の増殖。各ポイントは平均CFU/mL（n = 3）を示し、エラーバーはs.d.を示す。（a-f）の実験は、補足図1に描かれているように、コミュニティ3および4を接種して実施した。
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次に、ムチン糖鎖の存在によって恩恵を受ける群集のメンバーを特定することを目指した。驚くべきことに、グルコースや単糖をベースとした培地では分類群が広範囲に失われたのに対し、ムチン糖鎖では48時間にわたって本来のコミュニティから支配的な属の大部分を保持した（図3e、f）。全体として、ムチン糖鎖は、開始時の群集から最も多くのグループ（15属）を保持し、ムチンがこれらのグループのほとんど（11/15属）を支え、さらにS. mitisも保持した（図3f）。これらの保持グループの多くには、推定されるムチン糖鎖分解機構をコードする株が含まれている（図3f、補足図6）。これらの結果は、ムチン糖鎖が、グルコースや単糖をベースとした培地では失われる、自生唾液中の様々な細菌に利益をもたらす栄養源として機能することを示している。
ムチンによる栄養補給の役割をさらに追求するため、我々は、自生する口腔コミュニティからMitisおよびSalivarius連鎖球菌を分離し、唯一の炭素源としてグルコース、ムチン、糖鎖、またはプールした単糖類を与えたときの成長を特徴づけました。Salivariusは、グルコース培地ではどのムチン基質よりも急速な増殖を示したが、Mitisは8時間後にムチン培地で最も高い増殖を示した（図3g、h）。これらのグループの個々の代表株は、口腔内連鎖球菌の代謝プロファイルの不均一性を表していない可能性があり、この制限を考慮してこれらの結果を解釈する必要がある。しかし、これらの実験は、唯一の炭素源環境におけるMitisとSalivarius連鎖球菌の間の競争力学に栄養が関与している可能性を示す。
ムチン糖鎖が代謝豊かな微生物群集を支える
ムチン糖鎖が支える分類学的多様性が、より多様な代謝機能に結びつくかどうかを検証するため、Biolog EcoPlatesを用いて、微生物群集の様々な炭素源の酸化能力をプロファイリングしました。グルコース、ムチン、ムチン糖鎖、またはプールされた単糖のいずれかを添加した化学的に定義された培地（アミノ酸、ビタミン、その他の炭素源を含む）において、口腔内のコミュニティを24時間培養しました。これらの群集を希釈してEcoPlatesに植え付け、代謝プロファイリングを行った。ムチン糖鎖で増殖したコミュニティは、全体的な代謝活性（平均発色率）と代謝の豊かさ（利用した炭素源の割合）が最も高く、次いでムチン、単糖類、グルコースと培地だけの順だった（図4a、b）。別の96ウェルプレートでOD590を測定してモニターした全体的な成長は、異なる培地間で同等であった（図4c）。より具体的には、ムチン糖鎖で増殖した群集は、炭水化物、アミノ酸、カルボン酸など幅広い炭素源を利用できたが、無傷のムチンポリマーやプールした単糖で増殖した群集は、それぞれこれらの炭素源の一部を利用した（図4d-f、補足図7）。ムチン糖鎖は、ニッチ分割を可能にする複雑な栄養基質33として、あるいは代謝経路34を制御することによって、代謝機能に富んだ多様な微生物群集を形成している可能性があることが、単独炭素源実験とあわせて示された。
図4：ムチン糖鎖で育てた口腔内コミュニティは、多様な代謝基質を利用している。
a 各培地環境で24時間生育した微生物群集を希釈し、Biolog EcoPlatesに接種した際の平均的な井戸の発色。各ポイントは3反復の平均値、エラーバーはs.d.を示す。 b 代謝の豊かさは、利用した炭素源の割合（正規化吸光度>0.15）で示す。c 各環境の群集の総成長。別の96ウェルプレートでOD590によりモニターした。d 96時間後の各微生物群集の炭素利用を正規化した吸光度値を示すヒートマップ。0～72 hの炭素利用プロファイルを補足図7に示す。 e 96 hの測定に基づく基質タイプ別の利用率。各ポイントは独立した複製を表し、エラーバーはs.d.を示す（n = 3）。 f 96時間後に各培養環境のコミュニティが利用した炭素基質に関するベン図。
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ムチンが細菌表面の付着・凝集を抑制し、細菌群を空間的に整理する
ムチンは、栄養機能に加えて、空間構造を形成することによって微生物群集を調節し、それによって増殖や競争に影響を与える可能性がある。空間分布への影響を調べるために、ムチン、ムチン糖鎖、またはプールされた単糖類を含む、または含まないグルコースベースの培地でネイティブな口腔内コミュニティを育て、天然歯のエナメル表面を模倣したハイドロキシアパタイトディスク上にバイオフィルムを形成させた（図5a）。培地のみの場合と比較して、ムチンやムチン糖鎖の存在下で培養した場合、バイオフィルム分率は減少したが、単糖類は減少しなかった（図5b）。総バイオマス量（プランクトン画分とバイオフィルム画分）は、ムチンや糖鎖の存在下で同等かそれ以上であったことから、観察されたバイオフィルムの減少は、総成長の制限によるものではなく、むしろバイオフィルムからプランクトン状態への移行であることがわかった（図5b). これらのバイオフィルム画分の中では、ムチンと糖鎖もより多様なコミュニティを維持し、Salivariusの出芽を制限していた（図5c、d）。バイオフィルム内の分類学的多様性は、細菌の空間的分布と関連しているという仮説が立てられた。
図5：ムチンが口腔内の微生物群集を空間的に組織化し、表面の付着や凝集を抑制している。
a ハイドロキシアパタイトディスクを含む96ウェルプレートで培養したプランクトンおよびバイオフィルム群集分画の模式図 b ムチンおよびムチン糖鎖で培養した群集のバイオフィルム分画と培地のみの群集の相対的な比較。c 16S rRNA配列決定から求めたバイオフィルム画分の相対的存在量。d ムチンまたは糖鎖を含む培地と培地単独で培養した微生物群集のα多様性（48時間、n = 4）。中央の線は中央値を、ボックスの限界は上下の四分位を、ウィスカーは最小値と最大値を示している。各ポイントは独立した複製を表す。培地単独での有意差は、反復測定一元配置ANOVAとDunnettの多重比較検定で評価した。*p < 0.05; ***p < 0.001. e グルコースベース培地（上段）では大きなサリバリウスグループの凝集体（緑色のチャンネル）を示すFISH画像、ムチンベース培地（下段）では示さず。各環境について、個々のチャンネルと、マゼンタ（Mitis）および緑（Salivarius）チャンネルをマージした画像を示す。f グルコースベース培地とムチンベース培地で培養した群集において、サリバリウス連鎖球菌が形成する凝集体の大きさを定量化した。中央の線は中央値を、ボックスの枠は上下の四分位を、ひげは最小値と最大値を示している。g S. salivariusのライブ共焦点イメージングでは、グルコースベース培地では大きな凝集体が、ムチンベース培地ではより小さなグループクラスターが見られる。h, i グルコースベースまたはムチンベース培地で培養したサリヴァリウスの凝集体のサイズ（h）およびz位置の分布（i）を定量化した。(h)の中央線は中央値を、枠内は上下4分位を、ひげは最小値と最大値を示している。(i)では、各ポイントは平均値を、エラーバーは6時間後のグルコースまたはムチンベース培地でのS. salivariusの成長のs.d.を表している。
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群集構造の変化を可視化するために、多重蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を適用し、48時間かけてネイティブ唾液群集が形成するバイオフィルムを画像化した。グルコースベース培地では、サリバリウス群連鎖球菌が大きく厚い凝集体を形成することがわかった（図5e、f、補足図8）。これは、プランクトンおよびバイオフィルム群集の16S組成分析で観察されたサリバリアスの出没と一致している（図1i、5c）。一方、ムチンベースの培地では、付着したバイオマスが大幅に減少し、大きなサリヴァリウスの凝集体が見られなかった（図5e、f、補足図8）。
ムチンがサリバリウス連鎖球菌の空間構成にどのような影響を与えるかをより詳細に観察するために、サリバリウス（ATCC 13419）のライブ蛍光イメージングを実施した。グルコースベースの培地では、サリバリウスはムチンベースの培地で形成されるものより桁違いに大きな凝集体を形成し（図5g、h）、サリバリウス連鎖球菌のネイティブコミュニティにおけるFISH観察を支持した。さらに、ムチン中のS. salivariusは表面上に分布しており、グルコースベースの培地で観察された表面に付着した密集した凝集体とは対照的であった（図5g, i）. このような空間分布の違いは、成長の違い（図5j）や物理的な制約によるものではないと思われる。粘度はムチン濃度（実験に用いた濃度範囲）に対して線形に変化し、絡み合ったネットワーク35ではなく、希薄なポリマー溶液に特有の特性である（補足図9）。むしろ、糖鎖が付着部位として機能したり、成長挙動を形成する制御シグナルとして機能したりするような生化学的メカニズムが、観察された空間的分散を引き起こすのかもしれない。
ムチン糖鎖は、長期的な共存を特徴とする共同体の形成を促す
観察されたムチンの各効果（例えば、多様な組成と代謝、分散した空間分布）は、複雑なコミュニティ内での共存を促進する可能性がある。しかし、バッチ培養実験では、栄養分や宿主因子が枯渇することなく、長時間の相互作用を捉えることはできない。そこで、安定した微生物群集の自己形成を促進する連続継代法36を用いました。具体的には、ムチン糖鎖を含むまたは含まないグルコース培地で培養した各コミュニティを、48時間ごとに増殖させ、合計10回の継代を行った。バッチ培養と同様に、唾液のコミュニティをグルコース培地のみで継代したところ、Salivarius streptococciの存在量が急速に増加し、2継代で培養を追い越し、実験期間中ずっと優勢（存在量99%以上）を維持しました（図6a）。
図6：ムチン糖鎖は、微生物の長期的な共存を促進する。
a, b グルコースベース培地単独（a）またはムチン糖鎖（b）で連続継代した後の微生物群集の分類群の相対存在量。c-e10回（20日間）の継代培養を行ったムチン糖鎖を含む微生物群集の各炭素環境下で培養したサンプルのα多様性、（c）存在量が0.1%を超えるグループの数（d）、抽出DNA量（e）を示す。(c-e)において、各ポイントは平均値を、エラーバーはs.e.m.を示す（n = 4）。すべての実験は、補足図1に描かれているように、接種コミュニティ3および4を用いて行った。グルコースベース培地のみで培養した1つの複製コミュニティの最後の3継代は、シーケンシングリードが不十分であり、解析から除外された。
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一方、ムチン糖鎖を含むグルコース培地で培養すると、20日間で、Streptococcus属、Veillonella属、Lactobacillus属の複数の優占種を含む安定した口腔内コミュニティが形成された（図6b）。これは、分類学的多様性と共存が顕著に増加したことに対応し、総バイオマスは同程度に維持された（図6c-e）。ムチン糖鎖で増殖した群集は、開始時の接種量に応じて、2つの異なる安定状態に集合した（補足図10）。具体的には、接種物3は、低濃度の乳酸菌がVeillonellaと共存する状態に、接種物4は、Parasanguinis streptococciがVeillonellaと共存する状態に組み上がった（補足図10）。Veillonellaはグルコースやムチン糖を炭素源として利用できず、代わりにStreptococcusやLactobacillusの代謝による副産物である乳酸37を利用する38。ムチン糖鎖によって形成された4つの最終的なコミュニティには、それぞれ乳酸産生菌と乳酸利用菌が含まれていた（補足図10）。このように、接種微生物群の正確な相互作用ネットワークが最終的な組成に影響を与える一方で、ムチン糖鎖の存在下で代謝的に協力的な細菌群が持続的に共存していることから、安定状態は機能的に類似していることがわかる。
考察
粘液は、人体の粘膜ニッチにおいて微生物のホメオスタシスを維持する上で重要な役割を担っていますが、粘液成分が微生物群集の構成と構造にどのような影響を与えるかは十分に検討されていません。このギャップを解決するために、我々は、宿主が微生物群集の形成をどのように媒介するかを評価するために、非常に扱いやすく、生理的に適切な培養アプローチを設計した。その結果、ムチンとその糖鎖が口腔内の群集組成を広く調節し、多様性を促進し、健康に関連する細菌を保持する一方で、食餌性の単純糖の存在下で微生物の増殖に抵抗することを発見した。さらに、ハイスループットなシーケンスデータと代謝表現型、空間構造の可視化を統合することで、ムチンとその糖鎖がどのように微生物相を制御しているのか、多面的な情報を得ることができた。
ムチンが微生物の共存を促進するメカニズムの一つは、複雑な栄養基質を提供することでニッチ分割33や協調的な代謝を可能にすることである9,11。今回、単離されたムチン糖鎖を唯一の炭素源として供給したところ、非常に多様な群集が増殖することがわかった（図3）。単糖類の栄養成分ではこのような効果を十分に発揮できないことから、ムチン糖鎖の複雑な構成が不可欠であることがわかる。例えば、ムチン糖鎖を効果的に分解・利用するためには、構造の複雑さから、異なる連結特異的なグリコシダーゼを生産する微生物間の協力が必要かもしれない。実際、保持された属の多くは、完全な糖鎖分解に必要な推定上のムチン標的グリコシドヒドロラーゼをコードしておらず（図3f、補足図6）、ムチン糖鎖が協同分解や相互摂食メカニズムを通じて群集の多様性を促進している可能性を裏付けている。しかし、保持された属の約半数は、報告されているムチン糖鎖分解機構をコードしておらず、乳酸などの代謝副産物を利用することも知られていない。さらに、ムチン糖鎖を利用できる細菌は、食餌性の糖類があれば好んで摂取することが、いくつかの研究で示されている39,40。その結果、ムチン糖鎖の栄養的役割は、食餌性多糖類や発酵性糖類が豊富な本来の唾液や消化管粘液ではマスクされる可能性がある。
ムチン糖鎖は、栄養機能が部分的にマスクされる可能性のある高グルコース条件下で、異なる細菌の共存を促進した。具体的には、バッチ培養と連続継代培養の両方でムチン糖鎖を供給すると、Mitis/Parasanguinis連鎖球菌は他の分類群と共存した（図2h、図6b）。もし、Mitis/Parasanguinis連鎖球菌がムチン糖鎖を利用する能力を持っているならば、このグループは糖鎖を唯一の炭素源とする培養に富むと予想される。しかし、Mitis/Parasanguinis連鎖球菌は、糖鎖を唯一の炭素源とした場合には保持されず、またMitis分離株は8時間以上糖鎖の恩恵を受けなかった（図3e、f、h）。このことは、ムチン糖鎖が栄養補給以外のメカニズムで多様なコミュニティを支えており、空間的な組織化や行動制御によって協力的・拮抗的な微生物間相互作用を形成している可能性があることを示しています。複数の二重種モデルは、ムチンが競争を減衰させる能力を持つことを示している18,19,32。本研究の結果と合わせて考えると、ムチンとムチン糖鎖が微生物の共存を促進し、多様なコミュニティを支えることがいかに重要かがわかる。
ムチンによる群集の構成と構造の制御は、口腔の健康において重要な意味を持つ可能性があります。唾液腺機能低下は、一般的に重度のう蝕を引き起こすが41、この状態はムチンの産生低下とも関連している42。ムチンとその糖鎖は、う蝕に関連する2つの特徴、すなわち微生物多様性の低下とMitis連鎖球菌とSalivarius連鎖球菌の間の生物学的異種移行から保護されていることがわかった30。口腔内連鎖球菌のバイオフィルムの変化も、う蝕の進行に伴って記録されている43。グルコース培地とは異なり、ムチンでは、Salivarius連鎖球菌が単独で、あるいは複雑な群集内で増殖しても、厚いバイオフィルムや凝集塊を形成しないことがわかった（図5）。このことから、ムチンが口腔内の群集構造を管理する役割を担っていることが示唆された。おそらく、競合する結合部位を提示し、増殖に関連する遺伝子発現を変化させ、付着した細菌を除去するのであろう（補足図11）。今後の研究により、これらの異なるメカニズムの関連性が解明されるかもしれない。例えば、孤立した糖鎖が群集の空間構造に同様の影響を与えるという証拠があれば、ムチン糖鎖の制御機能が強調されるかもしれない。
MUC5B、Muc5ac、Muc2がそれぞれ多様性を促進するという我々の観察は、（異なる生物から分離された）ムチンのタイプ間で保存された機能を示す発表済みの研究結果と一致する16,18,44. 興味深いことに、ムチンとその糖鎖がどの程度ディスバイオシスに抵抗するか、またどのような微生物を保持するかは、各糖鎖ライブラリーの構造パターンに影響されていた（図2）。また、直感に反するかもしれないが、Muc2が口腔内の微生物群集組成に最も強い影響を与えることが確認された。糖鎖調製を比較して検出された1つの違いは、Muc2がより短く、より伸びない糖鎖を示すことである。Muc5ac糖鎖の32%、MUC5B糖鎖の31%が5つ以上の単糖が結合しているのに対し、Muc2糖鎖は7%未満であった（補足図12）。この特徴的な違いは、ブタ腸内の微生物による分解や内因性糖転移酵素の発現量の違いによるものと考えられるが、いずれにせよ、これらの糖鎖構造は、我々の培養系では口腔内細菌がよりアクセスしやすくなっていると推測された。生体内では、ムチンのグリコシル化プロファイルは体の部位によって異なる45,46。したがって、特徴的なムチンの糖鎖形成パターンは、与えられた粘膜ニッチに特有な健康な微生物相を宿主に選択させるメカニズムを可能にするかもしれない。このことから、糖鎖形成パターンを調整することは、微生物叢の組成や挙動を変化させ、宿主の健康に寄与する有望な戦略であることが示唆された。
研究方法
接種微生物群集の収集
健康な被験者の唾液（5 mL）を、カスタム真空ポンプを用いた穏やかな吸引により採取した。唾液を提供する2時間前から飲食を控えるよう被験者に要請した。唾液サンプルの採取は、研究の性質と起こりうる結果を説明し、書面によるインフォームドコンセントを得た後、プロトコル#1312006096に基づき、施設審査委員会とマサチューセッツ工科大学（MIT）の実験対象としてのヒトの使用に関する委員会から承認を受けた。各接種群について、3人のドナーからの唾液サンプルをプールした。各接種コミュニティの構成は、補足図1に描かれている。
ムチンの精製
ブタ胃ムチン（主にMuc5ac、少量のMuc2、Muc5B、Muc6）47,48、ブタ腸ムチン（主にMuc2）18、ヒト唾液ムチン（主にMUC5B、少量のMUC7）19をネイティブ精製しました。豚の胃と腸からの精製については、MITの動物飼育委員会からプロトコル番号E19-11-0722で承認を得た。新鮮なブタの胃と腸から粘液を掻き出し、以下の濃度の抗菌剤とプロテアーゼ阻害剤を含む0.2M塩化ナトリウムで希釈した（5mLに1gの掻き出し）：アジ化ナトリウム（0. 04 wt％）、ベンズアミジン塩酸塩（5 mM）、ジブロモアセトフェノン（1 mM）、フェニルメチルスルホニルフルオリド（1 mM）およびEDTA（5 mM、pH 7）を加え、4 ℃で一晩穏やかに撹拌して粘液を可溶化させました。不溶物を90,000×gで4℃、1時間の超遠心分離（30,000rpm、ポリカーボネートボトル付きベックマン45 Tiローター）で除去した。顎下腺唾液は、ヒトボランティアからカスタム真空ポンプを用いてバルク（50 mL/サンプル）で採取し、プールして遠心分離し、抗菌剤およびプロテアーゼ阻害剤を上記と同濃度で添加した。別々のSepharose CL-2Bカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ムチンを精製した。215nmのUV吸光度でモニターし、過ヨウ素酸-Schiffまたはフェノール-硫酸アッセイで確認したムチンフラクションを、脱塩、濃縮、凍結乾燥して-80℃で保存した。精製ムチン抽出物の組成をモニターするために、質量分析が日常的に使用されている。例えば、この種の分析により、ブタの胃粘液から精製されたムチンは主にMuc5acで、少量のMuc2、Muc5B、Muc6、さらにヒストン、アクチン、アルブミンが含まれることが示されている47,48。
ムチンO-糖鎖の単離
ムチンから非還元型糖鎖を解離させるために、O-糖鎖を本来の形で保存する非還元性アルカリβ-消去アンモニウム分解法を適用した16,18,32,44。精製ムチンを30% w/v炭酸アンモニウムで飽和した30-32%水酸化アンモニウム溶液に溶解し、60℃で40時間インキュベートしてオリゴ糖のグリコシルアミンと部分的に脱グリコシルしたムチンを放出した。遠心蒸発を繰り返して揮発性塩類を除去し、得られたオリゴ糖グリコシルアミンを0.5Mホウ酸で37℃、1時間処理して還元性オリゴ糖ヘミアセタールに変換し、残留ホウ酸はメタノールで遠心蒸発を繰り返して除去した。次に、製造者の指示に従い、3〜5kDaの分子量カットオフ膜を用いた遠心濾過により、遊離還元糖鎖を分離した（Amicon Ultracel）。さらに、ハイパーカーブミニカラム（ThermoFisher）を用いた固相抽出で糖鎖を精製し、遠心蒸発により残留溶媒を除去した。ムチンから放出された糖鎖をパーメチル化し、ナノスプレーイオン化タンデム質量分析（NSI-MS/MS）により、既述のようにポジティブイオンモードで動作するリニア/オービタルハイブリッドイオントラップ装置（Orbitrap-LTQ Discovery, ThermoFisher）に直接注入して分析しました18,49。完全な糖鎖構造プロファイルは、GlycoPOST (#GPST000254) に寄託されました。
放出されたムチンO-グリカンの部分的な酸加水分解
コア糖鎖構造を分離するために、インタクトな糖鎖から異なる単糖を加水分解する部分酸加水分解法32を用いた。末端シアル酸とフコースを除去するため、糖鎖を1Mのトリフルオロ酢酸中で80℃、4時間インキュベートした後、KOHで中和し、室温で10分間インキュベートして塩を沈殿させ、16000×g、10分間遠心して沈殿物を除去した。可溶性糖鎖は、4容量の100%アセトニトリルでプライミングしたHypercarbカートリッジを通して精製し、4容量の水でフラッシュした。Hypercarbカートリッジを2カラム容量の水と1カラム容量の2%アセトニトリルで洗浄し、塩類と単糖類を除去した。その後、2カラム量の50%アセトニトリルを用いて糖鎖を溶出し、遠心蒸発により乾燥させた。
バッチ培養
グルコースを炭素源とする化学的に定義された培地27、または炭素源を添加しない培地からなる様々な制御環境において、健常人由来のネイティブ細菌コミュニティを増殖させた（培地調製の詳細については補足方法を参照、培地成分および濃度の完全リストについては補足表1を参照）。ムチンを含む培地を調製するために、凍結乾燥したムチンを、ポリマーが完全に再水和するように、各実験に記述した培地中で4℃で一晩穏やかに振盪することによって再構成した。その他の追加成分（グルコース、糖鎖、加水分解糖鎖、単糖類）は、使用直前に培地に混合した。プールした唾液サンプルを、0.25%（wt/vol）ムチン、バックボーンから単離したプールしたムチン糖鎖、0.1%（wt/vol）加水分解糖鎖、または0.1%（wt/vol）を含むか含まない培養液100 μLに接種した。 2%（wt/vol）のプールされたムチン上に存在する単糖（N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース、シアル酸を等濃度で含む；各単糖はSigmaから購入した）である。炭素源なしの実験では、ムチン、単離糖、または単糖をそれぞれ0.25%(w/v)で供給した。グルコースは40%(w/v)のストック溶液をMilli-Q水で希釈し、他の基質はそれぞれ秤量して溶液に添加した。培養液は嫌気性条件下で37℃、48時間まで培養した後、遠心分離で回収し、全DNA抽出を行った。脳心筋梗塞（BHI、BD）1.5％寒天プレートでCFUをカウントした。
シリアルパッセージング
ムチン糖鎖を添加または無添加で培養した安定化した共同体の構成員を評価するために、健康な微生物共同体を順次継代した。出発唾液プールのアリコート（5 µL）を、化学的に定義されたグルコース培地単独または単離したムチン糖鎖のプールで補充した100 µLに接種した。培養物は37℃で48時間嫌気的に増殖させた。継代培養の前に、上下に10回ずつピペッティングして各培養物をホモジナイズした。継代は、新鮮な培地100 µLに対して、各培養物から2 µLを植菌することで行った。このプロセスを48時間ごとに繰り返し、合計10回の継代を行った。各継代後にサンプルを採取し、瞬間冷凍して、DNA抽出と配列決定前に-80℃で保存した。
コミュニティメンバーシップの解析
0～48時間の複数時点の細菌サンプルから、最初のリゾチーム処理（ThermoFisher）および溶解マトリックスB（MP Biomedicals）によるビーズビートステップを経て、製造者の指示に従ってMasterPure DNA Purification Kit（EPICENTRE）で抽出し、全ゲノムDNAを分離した。16S rRNA遺伝子のV4領域をPCR増幅し、得られたアンプリコンを洗浄、定量し、MIT BioMicro Center50によってIllumina MiSeqプラットフォームで配列決定した。生の配列（300bpペアエンドリード）を処理し、QIIME2（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）51とHuman Oral Microbe Database52を使用して分類学的割り当てを決定した。QIIME2は、多様性指標の定量化にも使用された。FCを計算する前に、実数を確実に生成するために、各分類群に0.001%（1リード未満に相当）の疑似カウントを追加した。PCoAは、QIIME2 pcoa plugin53,54と重み付けUniFrac距離メトリックを用いて実行し、Emperor55,56で可視化した。階層的クラスタリングはMorpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus)を用いて実施し、可視化した。特に断りのない限り、コミュニティは、1-Pearson距離メトリックと平均連鎖を使用して、少なくとも1つの条件で0.1％以上の平均存在度を持つ各属の相対的存在度に基づいてクラスタリングされた。
連鎖球菌分離株の検証および増殖
リボソーム遺伝子間スペーサー領域の配列決定によりS. salivariusまたはS. oralis/mitis/infantisと同定されたネイティブコミュニティからの分離株を培養した。これらの連鎖球菌を分離するために、唾液から採取した口腔内コミュニティをムチン糖鎖を含むまたは含まない培地で培養し、上下にピペッティングしてホモジナイズし、1μLの培地を用いて、ヘミン、ビタミンK（VWR）を含むブルセラ血液寒天プレートで個々の菌を分離した。37℃の嫌気性ボックスで48時間増殖後、シングルコロニーを摘出し、連鎖球菌の増殖と表現型の同定を容易にする選択培地であるMitis-Salivarius寒天（VWR）に再静置した。37℃の嫌気性ボックスで48時間培養した後、シングルコロニーを摘出し、液体培地で培養した。濁ったところで、細菌DNAを抽出、精製し、ナノドロップで定量した。次に、リボソーム配列（RIS）の大サブユニットと小サブユニットの間の遺伝子間スペーサー領域を、Phusion high fidelity polymerase Master Mix（NEB）、精製テンプレートDNA、および以下のプライマーを用いてPCR増幅した：フォワード（5′-TGCGGCTGGATCCTCCTT-3′）およびリバース（5′-CCGGGTTTCCATTCGG-3′）57．遺伝子産物を増幅するために、以下のサイクルパラメータを使用した：最初の変性、98℃で3m、35サイクル：変性、98℃、10秒、アニーリング、56℃、30秒、伸長、72℃、45秒、最終伸長、72℃、10m。合計7つの分離株を入手し、配列決定に成功しました。BLASTによるアラインメントでは、4株がStreptococcus salivarius、3株がStreptococcus oralisと同定された。Streptococcus oralis RIS領域と一致する配列は、Streptococcus mitisおよびStreptococcus infantis RIS領域とも99％以上の同一性で一致した。MitisおよびSalivariusグループの連鎖球菌の分離株は、グルコース、ムチン、単離ムチン糖鎖、または単糖類のいずれかを唯一の炭素源として含む化学的に定義された培地で、37℃の嫌気的条件下で増殖しました。MitisおよびSalivarius群連鎖球菌の代表的な1株について、0、8、24時間後にBHI 1.5%寒天プレート上のCFU/mLを測定した。
ムチンをターゲットとするグリコシドヒドロラーゼ（GH）の定量化
接種物中の優勢な属に対応する各代表細菌株について、糖質活性酵素（CAZy）データベース58からGHプロファイルを取得した。ムチン中に存在する結合を標的とするGHの総数が列挙された。GHはアミノ酸の類似性に基づいてファミリーに分類され、これは基質特異性に加えてこれらの酵素の構造的特徴を反映している。興味のある特定のGHファミリーは、GH2 [β-gal]、18 [β-glcNAc]、20 [β-glcNAc、lacNAc、β-SO3-glcNAc]、27 [α- galNAc], 29 [α-fuc], 31 [α-galNAc], 33 [neu5ac], 35 [β-gal] でした、 36［α-galNAc］、42［β-gal］、95［α-fuc］、98［β-gal］、101［α-galNAc］、109［α-galNAc］、112［lacNAc］、151［α-fuc］、ここで括弧内に標的連結を示す。
Biolog EcoPlatesを用いたメタボリックプロファイリング
グルコース、Muc5ac、単離Muc5ac糖鎖、単糖類のいずれかを添加した化学的に定義された培地で、嫌気的条件下で37℃、24時間、ヒト唾液のネイティブ細菌群を培養した。培養液を1:10に希釈し、Biolog EcoPlatesに接種した（1ウェルあたり90 µL、炭素源ごとに3レプリケート）。接種密度の違いによる人為的な差異を避けるため、吸光度値は750nmの測定値で補正し、炭素源を含まない接種群からなるブランクウェルで正規化しました。
バイオフィルムバイオマス分析
バイオフィルム形成をモニターするために、Muc5ac、Muc5ac糖鎖、またはムチン糖鎖を含むプール単糖を添加または非添加したグルコースベース培地でネイティブ口腔コミュニティを培養し、歯のエナメル質を模した直径5mm、厚さ2mmのハイドロキシアパタイトディスク（Clarkson Chromatography Products）でバイオフィルムが形成されるようにしました。さまざまな時点で、浮遊性画分を除去し、残った付着性画分をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄して緩く付着した細胞を除去し、ボルテックスと超音波処理によって円盤から細胞を剥離させました。ナノドロップ法により、培養液中の総細菌量と、総DNA量59,60に基づくバイオフィルム中の細菌量を定量化した。
FISHのためのコミュニティバイオフィルムの固定化
ヒト唾液のネイティブ細菌群を、グルコースまたはMUC5Bを含む化学的に定義された培地で、ガラス底96ウェルプレートの静的嫌気条件下で37℃、48時間培養しました。サンプルは、公表されている方法25に従い、10mM Tris（pH7.5）中の2％（wt/vol）パラホルムアルデヒドを用いて、氷上で1.5時間固定しました。1×10mMトリス（pH7.5）で15分間穏やかに洗浄し、サンプルを重力で沈降させ、上清を除去した。サンプルは50%(vol/vol)エタノールで保存し、FISHの直前に風乾させた。
FISH、画像取得、解析
蛍光標識オリゴヌクレオチドは、www.biomers.net から購入した。ガラス底96ウェルプレート上に口腔内細菌群集が形成したバイオフィルムサンプルに、標準的なFISHプロトコル25を適用した。ハイブリダイゼーション溶液（900 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7.5, 0.01% SDS, 20% (vol/vol) formamide, 各プローブ最終濃度2 nM）でサンプルを覆い、46 ℃で2時間半インキュベートした。洗浄バッファー（215 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM EDTA）でサンプルを洗浄し、48 ℃で15分間インキュベーションした。その後、サンプルを氷冷水、100%エタノールで洗浄し、風乾し、ProLong Gold Antifade Solution（ThermoFisher）でコーティングし、4℃の暗所で一晩硬化させた。補足図8は、ネイティブな口腔コミュニティーのFISH染色、個々の連鎖球菌株を用いたプローブ標的特異性の検証、および各プローブ配列、標的生物、蛍光体、参考文献を報告する表を追加した視野を示す26,61,62. 画像は、63×/1.4 NA油浸対物レンズを装備した共焦点レーザー走査型顕微鏡（Zeiss LSM 800）を用いて取得した。各視野は、DY-415標識ユニバーサル細菌プローブは405nm、S. mitis/oralis/infantisを標的とするDY-490標識プローブは488nm、S. salivarius/vestibularis を標的とするAto-550標識プローブは563nm、Streptococcusを標的とするAto-633標識プローブは635nmの励起波長で画像化されました。Zeiss ZEN 2.1 イメージングソフトウェア (RRID:SCR_013672) で画像を解析し、IMARIS 9.9.1 (RRID:SCR_007370) でバイオフィルム定量化および細菌バイオマスの3D再構成を実施しました。
S. salivariusの構造を画像化
S. salivarius（ATCC® 13419由来）の一晩培養液をグルコースベースまたはムチンベース培地で100倍に希釈し、ガラス底96ウェルプレートで37℃、静置、嫌気条件下で6時間インキュベートした。イメージング前にSyto9（ThermoFisher）で30分間バイオフィルムを染色した。画像は、63×/1.4NA油浸対物レンズを装備した共焦点レーザー走査型顕微鏡（Zeiss LSM 800）を用いて取得した。Syto9の励起波長488 nm、ステップサイズ0.5 μmを使用しました。Zeiss ZEN 2.1 imaging software (RRID:SCR_013672) で画像を解析し、IMARIS 7.7.2 (RRID:SCR_007370) でバイオフィルム定量化および細菌バイオマスの3D再構成を行った。
ムチンゲルの微細構造解析
20mMの4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid（HEPES）と20mMのNaCl、pH7で、MUC5Bの濃度が0から0.5％（wt/vol）のムチン試料を準備した。蛍光性で負に帯電した（カルボキシル化）直径1μmの微小球（Magsphere Inc.）を全体の希釈比1：12000で加え、サンプルをボルテックスした後、ピペットをホウケイ酸スクエアキャピラリー 0.9mm × 0.9mm × 15mm（Vitrocom）に入れた。キャピラリーは、ワセリン、ラノリン、パラフィンの1：1：1混合液で両端をシールし、イメージング用に顕微鏡スライドにマウントした。
公表されている方法63に従って、単一粒子追跡を実施した。簡単に説明すると、Zeiss LD Plan-Neofluar 20x/0.4 Corr Ph2対物レンズ（Carl Zeiss Microscopy GmbH）およびHamamatsu Flash 4.0 C11440-22CU カメラ（Hamamatsu Photonics）を搭載した Zeiss Axio Observer D.1 倒立顕微鏡を用いて画像を取得しました。撮像は、室温で10秒間、1秒間に30.3フレームで行った。各サンプルについて、毛細血管内の平均10カ所の異なる位置から少なくとも150個の粒子を撮像した。公開されているMATLABコード64,65を使用して、各画像フレーム内の粒子を識別し、個々の軌跡を追跡しました。各サンプルの粒子全体のアンサンブル平均MSDを計算し、並進拡散定数（D）を抽出した。これらの拡散定数から、ストークス-アインシュタイン関係を用いてムチン環境の粘性（μ）を算出した。これらの粘性とストークスの法則を用いて、各ムチン環境を通過する細菌細胞のおおよその沈降速度と、100μmの距離（図5gで可視化された最も高いバイオマス）での対応する沈降時間を計算した。式と計算結果は、補足図9に示す。
統計解析
特に断りのない限り、Dunnettの多重比較検定による反復測定一元配置分散分析を用いて、培地のみに対する多様性の有意な変化を評価した。分類群の存在量の有意な変化は、一元両側t検定で確認した。有意水準は、多重比較のためのBonferroniの補正で調整した。
データの利用可能性
16Sシーケンスの生データは、DDBJ Sequence Read Archive (DRA)にBioProject accession number PRJNA892622で公開されています。ムチン糖鎖プロファイルのMSデータは、GlycoPOSTにアクセッション番号GPST000254で寄託されています。その他のすべてのデータは、合理的な要求があれば対応する著者から入手可能である。
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謝辞
本研究は、NIBIB/NIH award R01-EB017755 (to K.R.), National Science Foundation Career award PHY1454673 (to K.R.), The National Science Foundation grant nos. EF-2125118、EF-2124863、EF-2125132、米国陸軍研究局（Institute for Collaborative Biotechnologiesのための協力協定W911NF-19-2-0026）、陸軍研究局MURI賞W911NF2210185、NIEHS/NIH grant no. P30-ES002109（MIT BioMicro Centerへ）、NSF GRFP grant no.1745302（K.M.W., C.M.W., and A.MS. へ）です。この文書に含まれる見解および結論は著者のものであり、陸軍研究局または米国政府の明示または黙示の公式方針を代表するものと解釈されるべきではない。米国政府は、本書の著作権表記にかかわらず、政府目的のために別刷りを複製し配布することを許可されています。Kristi HatchとScience Editors Networkの編集協力、Ribbeckラボのメンバーの助言とサポートに感謝する。
著者情報
著者と所属
マサチューセッツ工科大学生物工学部（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ市
クロエ・M・ウー、ケルシー・M・ウィーラー、ジェラルド・カーカモ・オヤルセ、アビゲイル・マクシェーン、カタリーナ・リベック
マサチューセッツ工科大学微生物学大学院プログラム（米国・マサチューセッツ州・ケンブリッジ
ケルシー・M・ウィーラー
米国ジョージア大学複合糖質研究センター（ジョージア州アテネ市
青木和弘＆マイケル・ティーマイヤー
米国ウィスコンシン州ミルウォーキー、ウィスコンシン医科大学、細胞生物学・神経生物学・解剖学教室
青木和弘
プリンストン大学化学・生物工学部（米国ニュージャージー州プリンストン市
スージット・S．ダッタ
米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、フォーサイス研究所、微生物学部門
ジェシカ・L・マーク・ウェルチ
米国オハイオ州コロンバス、ネイションワイド・チルドレンズ・ホスピタル歯学部
アン・L・グリフェン
オハイオ州立大学歯学部バイオサイエンス学科・小児歯科学科（米国・オハイオ州・コロンバス
アン・L・グリフェン
貢献度
K.M.W.、C.M.W.、K.R.は、微生物群集組成実験の構想・設計を行った。K.M.W.とC.M.W.は16S配列決定実験の実施と解析を行った。C.M.W.とK.M.W.はムチン関連生化学物質を提供した。C.M.W.は代謝実験の実施と解析を行った。C.M.W.とG.C.-O.は、イメージング実験を行い、分析した。K.A.はMS実験を行い、解析した。A.MSは糖鎖データの解析を行った。S.S.D.、J.L.M.W.、M.T. A.L.G. および K.R. が本研究を監修した。C.M.W.、K.M.W.、K.R.は論文を執筆した。著者全員が論文の査読に貢献した。
筆頭著者
Katharina Ribbeckに対応します。
倫理に関する宣言
競合する利益
著者は、競合する利害関係を宣言していない。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関の管轄権の主張に関して、中立を保っています。
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補足資料
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Wu, C.M., Wheeler, K.M., Cárcamo-Oyarce, G. et al. Mucin glycans drive oral microbial community composition and function. npj Biofilms Microbiomes 9, 11 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00378-4
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2022年10月03日受領
2023年2月20日受理
2023年3月23日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41522-023-00378-4
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