フライドミート摂取と腸内細菌叢および糞便代謝物との関連と、グルコースホメオスタシス、腸内エンドトキシンレベル、全身性炎症への影響。無作為化対照摂食試験

フライドミート摂取と腸内細菌叢および糞便代謝物との関連と、グルコースホメオスタシス、腸内エンドトキシンレベル、全身性炎症への影響。無作為化対照摂食試験
Jian Gao, Xiaoyu Guo, Wei Wei, Ran Li, Ke Hu, Xin Liu, Wenbo Jiang, Siyao Liu, Weiqi Wang, Hu Sun, Huanyu Wu, Yuntao Zhang, Wenbo Gu, Ying Li.
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孫 昌浩
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Tianshu Han
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対応する著者 Changhao Sun, changhaosun2002@163.com, and Tianshu Han, snowcalendar@126.com
Diabetes Care 2021;44(9):1970-1979
https://doi.org/10.2337/dc21-0099
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参考文献が公開されました。揚げ物、腸内細菌叢、グルコースメタボリズム
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目的
この無作為化比較給餌試験は、揚げ肉摂取が腸内細菌叢および糞便中の代謝産物に及ぼす影響、およびそうした影響が宿主のグルコースホメオスタシス、腸内エンドトキシンレベル、および全身性炎症に影響するかどうかを明らかにすることを目的としたものである。

研究デザインおよび方法
合計117名の過体重成人を2群に無作為に割り付けた。59名には週4回揚げ肉を提供し、58名には食品群および栄養組成を一定にしたまま揚げ肉摂取を4週間制限した。腸内細菌叢は16S rRNA配列決定により解析された。経口ブドウ糖負荷試験0、30、60、120分後のグルコースおよびインスリン濃度、糞便中の微生物宿主コメタバイトレベル、腸内エンドトキシンおよび炎症血清バイオマーカーレベルを測定した。インスリンの曲線下面積（AUC）、インスリン原性指数（IGI）、筋インスリン抵抗性指数（MIRI）を算出した。

結果
揚げ肉を摂取した参加者は、対照者よりもIGI値が低かったが、インスリンおよびリポ多糖（LPS）、TNF-α、IL-10、IL-1β値のMIRIおよびAUC値は高かった（P < 0.05）。揚げ肉の摂取は微生物群集の豊かさを低下させ、LachnospiraceaeおよびFlavonifractorの存在量を減少させる一方で、Dialister、DoreaおよびVeillonellaの存在量を増加させ（P FDR <0.05）、糞便中コメタボライトプロファイルに著しい変化をもたらし、3-インドールプロピオン酸、バレリック酸および酪酸濃度が低く、カルニチンおよびメチルグルタール酸濃度が高い（P FDR <0.05）ことが示された。これらの代謝物濃度の変化は，IGI値およびMIRI値の変化，LPS，FGF21，TNF-α，IL-1β，IL-10レベルの変化と有意に関連していた（P < 0.05）．

結論
揚げ肉摂取は、腸内細菌叢および微生物-宿主代謝産物に影響を与えることにより、グルコースホメオスタシスを損ない、腸内エンドトキシンおよび全身性炎症レベルを上昇させた。

はじめに
最適でない食事は2型糖尿病の重要な予防可能な危険因子であり（1,2）、近年、揚げ物摂取と2型糖尿病リスクとの関連に関心が高まっている。いくつかの前向き研究で、揚げ物の摂取頻度が高いほど2型糖尿病の発症率が高いことが示され（3,4）、過剰なエネルギー摂取と揚げ物の際の有害物質の生成がこの関連を媒介すると思われたが、一方、地中海食の一部として食品を頻繁に摂取する地中海地域の別の前向き研究では、この関連は支持されなかった（5）。同様に、17人のインスリン抵抗性女性を対象とした食事介入研究では、不飽和脂肪酸で揚げた食品の摂取がインスリン感受性に有益な影響を与えることがわかった（6）。これらの研究は、他の栄養素や揚げ物の際の有害物質の生成などの交絡因子が、揚げ物と2型糖尿病との関連に影響を与えることを示唆した。これらの交絡因子を厳密にコントロールした場合、揚げ物の摂取が2型糖尿病の発症にどのように影響するか、まだほとんど分かっていない。

さらに、日常生活では主要なタンパク源である肉類が揚げ物によく使われる。肉類に含まれるタンパク質は上部腸で大部分が消化されるが、約10％が大腸に到達し、腸内細菌叢による発酵に供される可能性がある(7)。肉のタンパク質消化率はフライ中に低下することが報告されており（8,9）、消化率の低下により、おそらく腸内細菌叢が利用できる未消化のタンパク質が増えることになるのでしょう。また、最近の研究では、揚げ物肉の摂取量が多いほど腸内細菌叢の多様性が低いことが分かっており（10）、動物の腸内細菌叢の組成や活性に影響を与えているようです（7,11）。今回、私たちの研究チームは、健康な過体重の若年成人を対象に実施した無作為化対照給餌試験において、揚げ肉と選択したコメタボリットの影響を調べました。また、胃内投与によるマウスでのコメタボロームの影響についても検討しました（補足資料）。

研究デザインおよび方法
参加者の募集
この無作為化対照給餌試験の参加者は、2020年1月から2月にかけてハルビンの健康な過体重成人から募集し、試験はchictr.org.cnに登録され、No. ChiCTR1900028562に登録された。包含基準は、年齢18～35歳、BMI＞24kg/m2、揚げ物の摂取が週1回以上とした。除外基準は、1）3ヶ月以内に抗生物質、プロバイオティクス、プレバイオティクスを服用した人、2）糖尿病、脂質異常症、胃腸疾患を患っている人、3）3ヶ月以内に外科的治療を受けた人、4）激しい運動やタンパク質補給を頻繁に行う人、5）喫煙または飲酒習慣がある人、であった。参加基準を満たしたボランティアには、介入前のベースライン情報収集のため、身体状況調査および電子食事質問票調査を実施した。研究計画は、ハルビン医科大学の倫理委員会により承認された。研究の性質と潜在的なリスクは、書面によるインフォームドコンセントを得る前に、参加者に説明された。

介入戦略
参加者は、人口統計学、食事摂取量、身体測定、生化学指数のベースライン特性に2群間で有意差がないことを確認するため、無作為割付配列の生成により実験群と対照群に無作為に割り付けられた。無作為割付配列の生成に用いた方法および割付隠蔽の仕組みの詳細については、補足資料に記載されている。

この試験での食事はすべて、訓練を受けた担当者の監督下、ハルビン医科大学の食堂で済ませた。食事介入の処方は主にAlternate Health Eating Index (AHEI)-2010 (12)に基づいて行われた（補足表1）。両群で提供された食品群の量と栄養素の構成はAHEIスコア>85と一定であったが（補足表2）、肉の調理法が異なり、実験群では150℃で3分間揚げる、対照群では100℃で煮る、蒸す、ソースで和える、であった。実験群ではフライ肉が週4回提供された。介入前に、2群間の等カロリー給餌を確実にするため、フライに必要な肉1gあたりの油とでんぷんの量を計算する前実験を行った（補足図1）。訓練された担当者が各参加者の食べ残しを計量・記録し、各人の実際の食事摂取量を算出し、参加者は均一な食事以外の食べ物や飲み物を口にすることができないようにした。参加者は習慣的な日常的身体活動を維持するよう求められ、介入期間中も毎日の歩数記録と身体活動に関するアンケートの収集によりモニタリングされた。

サンプルサイズと検出力分析
サンプルサイズの計算（経口ブドウ糖負荷試験中のインスリンレベルの曲線下面積[AUC]の群間差が7％、インスリンレベルAUCのSD＝20 mU/L * hと仮定）により、1群あたり39名のサンプルサイズが、検出力レベル1-β＝0.8、有意水準α＝0.05の統計的有意性に達するために必要であるとわかった(13)。グルコースレベルAUCについては、SDが1.5 mmol/L * hであると仮定して、1.20 mmol/L * hの有意差を検出するために、1群あたり25人のサンプルサイズが必要であった(14)。そこで、10％の脱落率を考慮して、130人（各介入群65人）の参加者を試験に採用した。

サンプル収集
参加者は試験に参加した後、1週間のバランス期間を経て、4週間の食事介入を開始した。血液と朝尿は介入開始0、2、4週目に、糞便は0、4週目に採取された（補足図2A）。参加者は12時間の夜間絶食後、2時間の75g経口ブドウ糖負荷試験を受け、0、30、60、120分後に血液サンプルを採取した。血液および糞便サンプルの詳細な採取手順は、補足資料に記載されている。

コンプライアンス指標の測定
BMIは体重（キログラム）÷身長（メートル）の2乗で算出した。複素環式アミンのバイオマーカーとして、尿サンプル中の2-アミノ-3,8-ジメチルイミダゾ［4,5-f］キノキサリン（MeIQx）および2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ［4,5-b］ピリジン（PhIP）濃度を超高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（UPLC-MS/MS）（ACQUITY UPLC-Xevo TQ-S, Waters Corp, Milford, MA）によって測定した。食物と糞便中の窒素含有量は自動ケルダール装置法で検出し、見かけのタンパク質消化率を算出した。血清中のadvanced glycation end products（AGEs）はELISAキット（Cusabio, College Park, MD）を用いて測定した。血清脂肪酸の標的分析は、TRACE GC/PolarisQ-MS システム（Thermo Finnigan, Austin, TX）および DB-WAX キャピラリーカラム（J&W Scientific, Folsom, CA）を用いて実施された。

主なアウトカム測定
血清グルコースは自動生化学分析装置（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を用いて定量した。血清インスリンは自動微粒子化学発光免疫測定システム（Beckman Coulter, Brea, CA）を用いて測定した。HbA1c値は自動血糖値測定器（HA-8380；アークレイ，東京，日本）を用いて測定した．血清C-ペプチド値はELISAキット（Cusabio社製）で測定した．グルコース値とインスリン値の合計AUCは台形法（15）により算出した．インスリン原性指数（IGI）はΔインスリン（0-30分、μU/mL）/Δグルコース（0-30分、mg/mL）（16）、筋インスリン抵抗性指数（MIRI）は血糖値低下（60-120分）/平均インスリン濃度（17）の傾きで算出されました。

副次的アウトカム測定
血清中のリポポリサッカライド（LPS）、LPS結合蛋白（LBP）、可溶性LPS受容体CD14（sCD14）、アディポネクチン、線維芽細胞増殖因子21（FGF21）濃度をELISAキット（Cusabio）を用いて測定した。TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10を含むすべての血清炎症因子は、Luminex assay technology（R&D Systems、Minneapolis、MN）を用いて定量化された。

16S rRNAの塩基配列決定
DNA抽出、PCR、増幅配列決定の詳細な方法は、補足資料に記載されている。FASTQファイルはQuantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME) ソフトウェア (バージョン 1.9.0) を用いてデマルチプレックス、マージペア、クオリティフィルタリングした。配列は類似度97%のoperational taxonomic unit (OTU)にクラスタリングされ、SILVA 132のSSU rRNAデータベースに基づいて注釈が付けられた。

コメタボロームレベルの測定
合計174種類の糞便中の微生物-宿主の代謝物をUPLC-MS/MSシステム（Metabo-Profile, Shanghai, China）により定量化した。標準物質、手順、条件、および方法に関する詳細な情報は、補足資料に記載されている。

統計解析
ベースラインの特性は、連続変数については平均値（SD）、カテゴリー変数については数（％）で示した。主要転帰に対する介入の効果を分析するために、参加者をランダム効果、介入モデルを固定効果とした一般化線形混合モデルを構築した。一般線形モデルおよびχ2検定により，ベースライン特性，コンプライアンス指標の差，介入前後または群間における副次的転帰を比較した。サブグループ解析も行い、その目的および詳細な手順は補足資料に記載した。

微生物群集の豊かさと多様性を解析するために、Abundance-based Coverage Estimator（ACE）とChao1推定量、Shannon indexを用いた（18）。Bray-Curtis 距離に基づく主座標分析は、OTU レベルでのグループ間のグローバルな微生物相組成を比較するために実施された。統計的有意性と生物学的関連性を強調し、グループ間で有意差のあるバイオマーカーを見つけるために、線形判別分析（LDA）と効果量を使用した。LDAスコアの設定値は2（19）であった。直交部分最小二乗判別分析（OPLS-DA）を行い、糞便代謝物の群間分布全体を調べ、クロスバリデーション順列検定を行い、このモデルの適合状況の検証を行った。投影量＞1の変動重要度を持つ代謝物を同定し、単変量解析を行った。

一変量解析では，Student t 検定または Mann-Whitney U 検定を用いて，介入前後または群間における個々の属，微生物群予測経路，糞便代謝物のレベルの有意差を検討し，P 値は Benjamini-Hochberg 誤発見率（P FDR）を用いて調整した．豊富な細菌属および糞便代謝物の変化と変化したアウトカム変数の間の部分スピアマン順位相関分析は、介入前後のBMIの差を調整した上で使用した。

OPLS-DAはSIMCA-Pソフトウェア（14.0）を用いて行い、その他の統計解析はR 3.6.1を用いて実施した。一般化線形混合モデルまたは一般線形モデルでは両側P値＜0.05を統計的に有意とし、個々の属と糞便代謝物の一変量解析ではStudent t testまたはMann-Whitney U testでP FDR＜0.05を統計的に有意とした。

結果
摂食試験の過程とベースラインの特徴
適格性を評価された150人の参加者のうち、130人が無作為化された。介入段階で、対照群から7名、肉炒め群から6名が脱落し、117名が試験を完了した（補足図2B）。人口統計学、食事摂取量、身体測定、生化学的指標に関するベースライン特性は、2群間で類似していた（すべてP>0.05）（表1）。

表1
参加者のベースライン特性 (n = 117)

特徴 対照群（n = 58） 揚げ肉群（n = 59） P
年齢、年 21.73 (2.97) 21.13 (2.66) 0.110
女性, n (%) 31 (53.45) 33 (55.93) 0.332
BMI、kg/m2 26.39 (2.80) 26.06 (2.38) 0.498
体脂肪率, % 26.11 (6.33) 26.93 (6.05) 0.773
ウエスト・ヒップ比、％ 0.87 (0.16) 0.86 (0.15) 0.420
臨床検査値
 HbA1c
  % 5.37 (0.20) 5.36 (0.22) 0.848
  mmol/mol 35.19 (2.20) 35.09 (2.40) 0.803
 空腹時グルコース、mmol/L 4.68 (0.41) 4.64 (0.39) 0.232
 空腹時インスリン、μU/mL 4.42 (2.10) 4.68 (1.89) 0.214
 IGI、μU/mmol * 103 20.93 (13.09) 22.53 (13.87) 0.526
 MIRI、mmol/min ⋅ μU * 10-5 1.64 (2.38) 1.56 (2.40) 0.848
 グルコースのAUC、mmol * min/L 679.13 (93.40) 662.92 (90.11) 0.389
 インスリンのAUC、μU * min/mL 3,605.75 (1,574.29) 4,036.86 (1,907.20) 0.225
食事摂取量
 エネルギー、kcal/日 2,669 (586.52) 2,634 (605.48) 0.341
 総脂肪, %TE 26.62 (7.39) 26.28 (6.98) 0.724
 炭水化物, %TE 61.73 (10.39) 61.41 (11.39) 0.981
 タンパク質, %TE 11.65 (3.70) 12.31 (3.74) 0.480
AHEI-2010のスコアの構成要素
 野菜類 5.32 (2.94) 5.03 (3.04) 0.725
 果物 4.88 (2.80) 5.40 (3.14) 0.524
 全粒穀物 4.84 (2.91) 5.43 (3.05) 0.466
 多価不飽和脂肪酸 5.36 (2.96) 5.00 (3.03) 0.659
 ナッツ類および豆類 5.36 (3.01) 5.00 (2.98) 0.659
 長鎖n-3系脂肪 5.08 (3.03) 5.23 (2.98) 0.851
 赤肉および加工肉 4.8 (2.92) 5.47 (3.04) 0.413
 砂糖入り飲料 5.32 (2.84) 5.03 (3.13) 0.725
 ナトリウム 4.64 (2.93) 5.60 (2.99) 0.234
 アルコール 10.00 10.00 1
 合計スコア 55.60 (11.50) 57.20 (10.84) 0.598
運動習慣、n（％） 39（67.24） 40（67.80） 0.896
揚げ物の摂取頻度、n(%) 0.814
 週に1-3回 31 (53.45) 34 (57.62) 0.653
 週に4-6回 25 (43.10) 22 (37.29) 0.525
 ≥週7回以上 2 (3.45) 3 (5.08) 0.665
連続変数は平均値（SD）、カテゴリー変数はn（%）で表示。TE、全エネルギーに対する割合。
コンプライアンス評価
介入期間中、エネルギー摂取量は減少したが、AHEIスコアは増加し、1日の身体活動量は両群間で差がなかった（補足図3A-C）。BMI、飽和脂肪酸、n-3脂肪酸、n-6脂肪酸、MeIQx、PhIP、AGEs、タンパク質消化率については、両群ともベースラインで同程度であった（Supplement Fig.） 介入後、対照群の参加者は実験群の参加者よりもBMIとAGE値が低かったが、n-3系脂肪酸とタンパク質消化率は高かった（すべてP < 0.05）。

主要および副次的転帰の変化
介入期間中、両群のHbA1c、C-ペプチド値およびグルコース値のAUCの変化率に有意差はなかった（図1A、B、E）。IGI値は両群で有意に上昇したが、介入後は実験群より対照群で有意に高かった（29.75 対 24.75 µU/mmol * 103, P = 0.006）（図1C）。一方、MIRIとインスリンレベルのAUC値は両群で有意に低下し、実験群に比べ対照群で有意に低かった（MIRI：0.82 vs. 1.67 mmol/min ⋅ μU * 10-5, P = 0.008; 3,310.5 vs. 2796.0 μU/mL⋅ min, P < 0.001)(Fig. 1D and F).

図1
図1. HbA1c（A）、C-ペプチド（B）、IGI（C）、MIRI（D）、グルコース（E）およびインスリン（F）のAUCにおける主要アウトカムに関する差異。P値は、バイオマーカーの変化率の差が0と異なることを示す。
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HbA1c（A）、C-ペプチド（B）、IGI（C）、MIRI（D）、グルコース（E）およびインスリン（F）のAUCにおける主要アウトカムに対する差異。P値は、バイオマーカーの変化率に対する差が0と異なることを示す。

腸管内エンドトキシンレベルと全身性炎症のバイオマーカーは、ベースラインでは2群間で同様であった（補足図4）。介入後、対照群のLPS、LBP/sCD14、TNF-α、IL-1β、IL-10値は実験群より有意に低かったが、FGF21値は対照群で実験群より有意に高かった（いずれもP＜0.05）。IL-2、IL-4、IL-8はいずれも有意に低下し、両群間に有意差はなかった。

サブグループ解析
試験参加前に揚げ物の摂取頻度が低い習慣のある参加者計45名を同定した。ベースライン特性は2群間で同様であった（補足表3）。サブサンプルの結果は全サンプルの結果と一致し（補足図5）、主アウトカムおよび副アウトカムに関する差は、揚げ物の制限によるものではなく、揚げ肉摂取の影響であることをさらに支持するものであった。

腸内細菌叢と糞便メタボロームプロファイルの変化
ACEおよびChao1推定量によって示される微生物群集の豊かさは、両群で有意に増加し、対照群のACE値は実験群のそれよりも大きかった（図2AおよびB）。また、Shannon指数で推定した群集多様性は両群で有意に増加し、両群間で有意差はなかった（Fig. 2C）。さらに、腸内細菌叢のOTUレベルの全体組成は、エンドポイントにおいて両群間で有意な差が見られた（R2 = 0.016, P = 0.041）（図2E）。微生物叢予測パスウェイでは、LPS生合成タンパク質（ko01005）、インスリン抵抗性（ko04931）、アディポサイトカインシグナリング（ko04920）、AMPKシグナリング（ko04152）パスウェイが両群間で有意な差を示した（補足図6A）。門レベルでは、FirmicutesとBacteroidetesの比率は両群で低下し、実験群に比べ対照群で有意に低かった（2.87 ± 2.31 vs 4.29 ± 3.89, P = 0.020）(Supplementary Fig. 6B)。属レベルでは、差次的に豊富な5属の細菌が同定された（図2F）。対照群に比べ、実験群ではDialister、Dorea、Veillonellaが多く、LachnospiraceaeとFlavonifractorは少なかった（いずれもP FDR <0.05）（補足図7）。

図2
図2. 腸内細菌叢と糞便メタボロミクスプロファイルの変化。微生物群集の豊かさは、ACE（A）およびChao1推定量（B）で示された。腸内細菌叢の群集多様性はShannon指数で推定した(C)。DおよびE：介入前（D）および介入後（E）のOTUレベルでの腸内細菌叢の全体的な組成を示す。F：LDA効果量により同定された差分腸内細菌属。GおよびH：介入前（G）および介入後（H）の宿主と腸内細菌叢の間のコメタボライトの全体的な組成。I-M：糞中のバレリック酸（I）、酪酸（J）、IPA（K）、カルニチン（L）、MGA（M）についての2群間の差異を示す。同定されたコメタボリットの差のP値は，Benjamini-Hochberg FDRを用いて調整した．R2X、モデルが説明できる行列情報の割合、Q2、クロスバリデーションにより算出したモデルの予測力、P、クロスバリデーションの予測残差のANOVAによるOPLS-DAの妥当性。
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腸内細菌叢と糞便メタボロミクスプロファイルの変化。微生物群集の豊かさはACE（A）およびChao1推定量（B）によって示された。腸内細菌叢の群集多様性はShannon指数で推定した(C)。DおよびE：介入前（D）および介入後（E）のOTUレベルでの腸内細菌叢の全体的な組成を示す。F：LDA効果量により同定された差分腸内細菌属。GおよびH：介入前（G）および介入後（H）の宿主と腸内細菌叢の間のコメタボライトの全体的な組成。I-M：糞中のバレリック酸（I）、酪酸（J）、IPA（K）、カルニチン（L）、MGA（M）についての2群間の差異を示す。同定されたコメタボリットの差のP値は，Benjamini-Hochberg FDRを用いて調整した．R2X、モデルが説明できる行列情報の割合、Q2、クロスバリデーションにより算出したモデルの予測力、P、クロスバリデーションした予測残差のANOVAからのOPLS-DAの妥当性。

2群間の糞便代謝物の全体組成の差は、エンドポイントでも観察された（P = 0.039）（図2K）。さらに代謝物カテゴリーで層別化すると、アミノ酸と短鎖脂肪酸（SCFA）の代謝物が2群間で有意に異なることが示された（いずれもP < 0.001）（補足図8AおよびF）。個別代謝解析では、カルニチン、3-インドールプロピオン酸（IPA）、吉草酸、酪酸、メチルグルタル酸（MGA）が同定された。対照群に比べ、カルニチンとMGAは濃縮されていたが、揚げ肉群ではバレリック酸、酪酸、IPAが有意に枯渇していた（すべてP FDR <0.05）（図2I-M）。

相関分析
腸内細菌叢の変化、糞便中のコメタボライトレベル、および変化した結果変数の間の相関を図3に示す。フラボニフラクターの存在量の変化は、糞便中のバレリック酸レベルの変化と正の相関があり（r = 0.226）、一方、Doreaの存在量の変化は、それと負の相関があった（r = -0.336）。さらに、Dialister、Dorea、Veillonellaの存在量の変化は、糞便中のカルニチンレベルの変化と正の相関があった（Dialister：r = 0.218, Dorea：r = 0.395, Veillonella：r = 0.314）（all P < 0.05）.

図3
図3. 腸内細菌叢、コメターボライト、およびグルコースホメオスタシス、腸の健康、炎症のバイオマーカー間の相関解析。赤と青の線はそれぞれ有意な正と負の相関を、灰色の線は有意でない相関を示し、線の色が薄いものから濃いものは相関係数の大きさを反映している。FGF21、線維芽細胞増殖因子21、LBP、リポポリサッカライド結合タンパク質、sCD14、可溶性リポポリサッカライド受容体CD14。
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腸内細菌叢、コメターボライト、グルコースホメオスタシス、腸の健康、炎症のバイオマーカー間の相関解析。赤線と青線はそれぞれ有意な正と負の相関を、灰色線は有意でない相関を示し、線の色は相関係数の大きさを反映したものである。FGF21、線維芽細胞増殖因子21、LBP、リポポリサッカライド結合タンパク質、sCD14、可溶性リポポリサッカライド受容体CD14。

糞便中の吉草酸，酪酸およびIPA濃度の変化は，インスリン濃度のAUCの変化（吉草酸：r = -0.266，酪酸：r = -0.282），MIRI値（r = -0.243，酪酸：r = -0.282）と負の相関があった． 243、IPAは-0.286）、LPS値（r = -0.198、IPAは-0.243）、TNF-α値（r = -0.204, valeric acid, r = -0.352 butyric acid, r = -0.436 ）が認められた。糞便中のMGA値の変化はIGI値と負の相関（r = -0.285）を示し、一方、TNF-α値とは正の相関（r = 0.310）を示した。糞便中のカルニチン濃度の変化は、MIRI値（r = 0.241）、LPS（r = 0.214）およびLBP/sCD14（r = 0.238）濃度と正の相関があった（すべてP < 0.05）。

結論
本研究では、揚げ肉の摂取が腸内細菌叢の組成と機能、微生物-宿主のコメタボリックに影響を与え、それが過体重の若年成人におけるグルコース恒常性障害と関連し、腸内エンドトキシンおよび全身性炎症のレベルを増加させることが明らかにされた。さらに、同定された揚げ肉摂取に関連するコメタボライトを胃内投与することにより、マウスにおけるグルコースホメオスタシスへの影響を明らかにした。

これまでの研究で、揚げ物摂取と2型糖尿病リスクとの関連について検討されてきたが、栄養学的交絡因子が制御されていないため、これらの知見は一貫していなかった(3-6)。本研究では、AHEIスコアが85点以上の等カロリー食を提供し、食品群の量や栄養素の構成は一定に保たれた。しかし、揚げ肉を摂取した参加者は、依然としてグルコースホメオスタシスが損なわれていることがわかった。高熱調理は糖化を強力に促進することが報告されており、そのため多くの揚げ物には高濃度のAGEsが含まれる(20)。以前の研究では、AGEsを多く含む食事はインスリン抵抗性と関連することが示された(21)。これらの研究と同様に、揚げ物温度は厳密に管理され、芳香族炭化水素はほとんど生成されないにもかかわらず、揚げ物群の参加者はAGEsのレベルが高いことも明らかになった。

さらに、実験群ではタンパク質の消化・吸収率が低いことも確認されました。タンパク質の消化吸収率は、腸内細菌叢に影響を与えることが報告されている（22）。また、実験群では腸内細菌叢の豊富さが低く、OTUレベルでの腸内細菌叢の全体構造も対照群とは異なっていたことから、揚げ肉の摂取がヒトの腸内細菌叢に選択的に影響を及ぼしていることが示唆された。また、微生物叢が予測するパスウェイでは、グルコースホメオスタシスに関連するパスウェイも介入中に有意に変化していることが示されました。さらに、2型糖尿病の古典的バイオマーカー（23）であるFirmicutesとBacteroidetesの比率は、実験群で対照群より有意に高く、揚げ肉摂取のグルコースホメオスタシスへの影響がさらに支持された。属レベルでは、揚げ肉摂取によりLachnospiraceaeとFlavonifractorの存在比が減少した。Lachnospiraceaeは腸のホメオスタシスに重要な役割を果たし（24）、肥満とインスリン抵抗性を予防することができる（25）。Flavonifractorは腸の健康にとって重要な種であり、その存在量は肥満と負の相関がある（26）。さらに、実験群ではDialister、Dorea、Veillonellaの存在量が増加した。Dialisterは病原性細菌であり、その存在量の増加は体重増加に関係する(27)。Doreaの存在量は肥満と正の相関があり、その増加は糖尿病前兆のある患者で認められる（28）。

腸内細菌叢の結果と一致して、揚げ肉摂取は、糞便中のコメタボリット、特にSCFAとアミノ酸の代謝産物にも有意な変化を引き起こした。揚げ肉の摂取は、酪酸、吉草酸、IPAなどのいくつかの有益な糞便中のコメタボライトのレベルを有意に減少させたが、カルニチンやMGAなどのいくつかの有害なコメタボライトのレベルも増加させた。また、これらの有益または有害な代謝産物とグルコースホメオスタシスに関するバイオマーカーのレベルとの間に、負または正の相関が観察された。酪酸はSCFAの一種であり、そのグルコースホメオスタシスに対する有益な効果は既に先行研究において証明されている(29,30)。そこで、同定された他の代謝産物のグルコースホモスタシスへの影響を調べるために動物実験を行ったところ、バレリック酸とIPAのグルコースホモスタシスへの有益な影響とカルニチンのグルコースホモスタシスへの有害な影響がさらに示され、これまでの研究により支持されていることが明らかになった。バレリック酸はSCFAとして、酸化ストレスと神経炎症を抑制し、オートファジー経路を調節する(31)。IPAは、血漿中のエンドトキシンレベルを低下させることができ、IPAを強化した食事の摂取は、空腹時血糖値を有意に低下させ、インスリン抵抗性を改善することができる（32,33）。カルニチンはトリメチルアミンN-オキシド（TMAO）に酸化されることがあり、血漿中のTMAOの高値は心血管疾患および糖尿病と関連している（34）。

また、腸内細菌叢構成成分の存在量変化とコメタボロットの相関関係から、揚げ肉摂取に感受性のある重要な細菌属をいくつか同定した。その結果、フライ肉摂取によりFlavonifractorの存在量が減少し、Dialister、Dorea、Veillonellaの存在量が増加し、その結果、糞便中のバレリック酸レベルがダウンし、カルニチンレベルがアップすることが示されました。これらの結果は、これまでの研究でも支持されている。FlavonifractorはSCFAを産生できること、Flavonifractorはバレリック酸の代謝に関与すること（35）、Doreaが多く存在するとSCFA産生菌が減少し、結果としてバレリック酸を含む糞中SCFAs濃度が低下することが報告されている(36). さらに、DialisterとVeillonellaは宿主のアミノ酸代謝に関与しており、カルニチンの生産と代謝を媒介することで宿主のTMAOレベルに影響を与える可能性がある（37,38）。

今回のランダム化比較試験では、16S rRNAアンプリコンプロファイリングと定量的標的細菌メタボロミクスを併用することで、揚げ肉摂取に伴う宿主-腸内細菌叢代謝のクロストークを理解するための新たな知見を提供できる可能性がある。しかしながら、本研究には一定の限界があることも認識している。まず、本研究は健康な過体重の若年成人だけを対象とした。これは、この集団では揚げ物が人気であり（39）、この試験のコンプライアンスを確保できることと、成人期初期の過体重が成人期後期の2型糖尿病の高い発症率と関連することが記録されている（40）ためである。したがって、この集団における揚げ物摂取とグルコース代謝との関連を明らかにすることは重要であり、2型糖尿病の早期予防のための食事介入戦略を確立するのに役立つものである。しかし、これらの知見は他の集団には当てはまらないかもしれない。第二に、糞便サンプリングはベースラインと試験終了時のみ実施された。今後、より頻繁にサンプリングを行うことで、腸内細菌叢と代謝産物の変化についてより完全な情報を得ることができるかもしれない。第三に、AHEIスコアを85以上に維持するために、本研究では参加者に魚と鶏肉のみを提供し、揚げ物の際の温度と時間を厳格に管理して有害物質の発生を抑制したことである。これらのことから、肉の種類や調理法が結果に影響を与える可能性は否定できず、腸内細菌叢は何らかの地域環境の影響を受けている可能性もある。第四に、IGIとMIRIはM値とよく相関することが報告されているが、インスリン感受性の測定にはゴールドスタンダードであるeuglycemic-hyperinsulinemic clampは使用されていない。したがって、揚げ物の健康への影響に関する追加的な証拠を提供するためには、今後、他の地域での揚げ物条件の異なる他の種類の揚げ物肉を検討する研究、およびオイグリセミック-ハイパーインスリン血流クランプを用いたインスリン感受性の測定が依然として必要である。

要約すると、揚げ肉摂取はグルコースホメオスタシスを損ない、腸内細菌叢および微生物-宿主のコメタボリックに影響を与えることで腸内エンドトキシンのレベルおよび全身性炎症を増加させるということである。

J.G.とX.G.は同等に貢献した。
臨床試験登録番号 ChiCTR1900028562, chictr.org.cn
添付の論文、p.1907を参照。
この記事には、https://doi.org/10.2337/figshare.14731347 のオンライン補足資料が含まれています。
記事情報
謝辞 参加者の協力に感謝する。

資金提供 本研究は、国家自然科学基金（82030100 to Y.L., 81803227 to T.H.）、中国国家重点研究開発計画（2017YFC1307401 to C.S. ）、中国科学技術協会（2019QNRC001）による青年エリート科学者支援プログラムからの資金援助により行われました。

二重の利害関係 本論文に関連する潜在的な利益相反は報告されていない。

著者による寄稿。Y.L.、C.S.、T.H.は研究デザインを考案した。J.G.、K.H.、W.W.、H.S.、H.W.は研究の実施に参加した。J.G.、X.G.、S.L.は統計解析を行った。R.L.、W.W.、Y.Z.は統計解析を繰り返し、検証を行った。K.H.、X.L.、W.W.、および W.G. は、生体試料中のバイオマーカー濃度を測定した。J.G.、X.L.、W.J.、W.W.はマウス試験と代謝物の介入を行った。J.G.、X.G.、T.H.は原稿を執筆した。著者全員が原稿の重要な修正を行い、提出された原稿を承認した。C.S.は、原稿が誠実、正確、かつ透明性のある研究報告であること、研究の重要な側面が省略されていないこと、当初の計画（および関連する場合は登録）通りの研究との相違が説明されていることに同意した。C.S.はこの研究の保証人であり、そのため研究のすべてのデータにアクセスすることができ、データの完全性とデータ解析の正確性に責任を負う。

フライドミート摂取と腸内細菌叢および糞便中代謝物との関連、およびグルコースホメオスタシス、腸内エンドトキシンレベル、全身性炎症への影響。無作為化対照摂食試験

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