ビタミンK1は糞便細菌移植によって明らかになったリポ多糖誘発骨格筋障害を改善する

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ビタミンK1は糞便細菌移植によって明らかになったリポ多糖誘発骨格筋障害を改善する

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38018317/

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悪液質、サルコペニアと筋肉のジャーナル早見表
原著論文
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ビタミンK1は糞便細菌移植によって明らかになったリポ多糖誘発骨格筋障害を改善する

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jcsm.13379

蕭楡、馮建国、賈静、李潔、周英俊、宋湛勇、関發生、李雪新、劉李
初出：2023年11月28日
https://doi.org/10.1002/jcsm.13379
について
セクション

要旨
背景
敗血症に伴う筋力低下は集中治療室（ICU）の患者によくみられ、転帰不良と密接に関連している。敗血症による筋力低下の機序は不明である。最近の研究で、腸内細菌叢と代謝産物が骨格筋量と代謝の調節に関与していることがわかってきた。本研究では、敗血症に伴う筋力低下に対する腸内細菌叢と代謝産物の影響を検討することを目的とした。

方法
リポ多糖（LPS）誘発炎症モデルマウスにおいて、LPS誘発炎症に対する感受性の異なるマウスを糞便微生物叢移植（FMT）アッセイのドナーマウスとし、レシピエントマウスを感受性（Sen）群と抵抗性（Res）群に分けた。骨格筋量と機能、および大腸バリアの完全性を検査し、両群のマウスの腸内細菌叢と代謝産物組成を分析した。腸内微量代謝産物であるビタミンK1がLPS誘発性筋損傷に及ぼす影響を調べ、その基礎となる機序を探った。

結果
レシピエントは様々なLPS誘発性筋損傷と腸管バリア破壊を示した。センの前脛骨筋（TA）は、MuRF-1（0.825±0.063 vs 0.304±0.293、P = 0.0141）およびMAFbx（1.055±0.079 vs 0.456±0.3、P = 0.0092）の発現レベルの上昇を示した。大腸タイトジャンクションタンパク質ZO-1（0.550±0.087対0.842±0.094、P = 0.0492）およびオクルディン（0.284±0.057対0.664±0.191、P = 0.0487）は、Sen群において有意に発現が低下した。メタボローム解析では、Res群の糞便中（P = 0.0195）および血清中（P = 0.0079）のビタミンK1がSen群のそれよりも有意に高いことが示された。ビタミンK1介入後、筋萎縮関連タンパク質の発現は低下した（P < 0.05）。一方、SIRT1タンパク質の発現は上昇し（0.320±0.035 vs. 0.685±0.081, P = 0.0281）、pNF-κBタンパク質の発現は低下した（0.815±0.295 vs. 0.258±0.130, P = 0.0308）。PI3K（0.365±0.142対0.763±0.013、P = 0.0475）、pAKT（0.493±0.159対1.183±0.344、P = 0.0254）およびpmTOR（0.509±0.088対1.110±0.190、P = 0.0368）のタンパク質発現レベルは、TA筋で上昇した。一方、ビタミンK1は血清中の炎症因子濃度を低下させた。

結論
ビタミンK1は、SIRT1のアップレギュレーションを介してNF-κBが介在する炎症に拮抗し、タンパク質合成と異化のバランスを調節することにより、LPSが誘発する骨格筋障害を改善する可能性がある。

はじめに
集中治療室後遺症による筋力低下（ICU-AW）は、重症患者によくみられる生命を脅かす合併症である。ICU-AWの罹患率は重症患者で30～50％、敗血症患者では67％にも達する。ICU-AWは、ICUにおける死亡率増加の独立した危険因子である。2 敗血症による筋力低下は重症患者によくみられる合併症であり、長期にわたる身体機能の障害をもたらし、退院後の機能低下、入院期間の延長、回復の遅れ、死亡の遅れに関連する3。

最近、多くの研究により、腸内細菌叢と代謝産物が上流の免疫活性の調節因子として敗血症に関連した臓器機能障害に関与している可能性が確認された6,7。しかし、体内の主要な代謝・免疫臓器である敗血症において、腸内細菌叢が骨格筋量と代謝機能をどのように調節しているかに関する証拠はほとんど見つからなかった。現在までに、腸内細菌叢-筋肉軸は広く提唱されている。多くのin-vitro実験や前臨床試験で、筋肉と腸内細菌叢の密接な関連が示されている8, 9。オシロスピラ（Oscillospira）とルミノコッカス（Ruminococcus）の微生物分類群の増加と、バルネシエラ科（Barnesiellaceae）とクリステンセネラ科（Christensenellaceae）の微生物分類群の減少が、筋肉障害と関連していることが報告されている10。病原体を持たないマウスと比較して、無菌マウス（腸内細菌叢を欠損）では、骨格筋量の減少と、骨格筋代謝および機能に関連する遺伝子の発現低下が認められた。この所見は、微生物代謝産物を投与することで回復した11。ブタドナーからの糞便微生物叢移植後、無菌マウスは筋発達や脂肪生成能力を含む骨格筋特性を再現することができた12。複数の腸内微生物代謝産物が骨格筋代謝や炎症に関与していることが提唱されている。例えば、酪酸はPI3K/Akt/mTORシグナルを介して糖尿病性腎症によって誘発される筋萎縮を緩和する13。インドール-3-プロピオン酸（IPA）は、筋の成長と発達に寄与するだけでなく、抗炎症作用も有することが見出され、その一部はIPA/miR-26a-2-3p/IL-1βカスケードと関連している14。全体として、腸内細菌叢は骨格筋量および生化学的・代謝的指標と密接に関連しており、腸および腸外臓器における主要な免疫調節因子である16, 17。これらの研究に基づくと、腸内細菌叢と代謝産物は、敗血症による筋力低下の発症における重要な因子である可能性がある。

本研究では、腸内細菌叢と代謝産物が敗血症による筋力低下の発症に関連するという仮説を立てた。16sDNA配列決定と代謝解析を行い、特徴的な差分物質を同定し、リポ多糖が誘発する骨格筋損傷に対する防御の役割とメカニズムを明らかにした。

方法
動物および実験デザイン
すべての実験は動物実験のガイドラインに従って行われ、西南医科大学動物倫理委員会（No.20211122-007）の承認を得た。本実験は、1964年のヘルシンキ宣言およびその後の改正で定められた倫理基準を確認するものである。6-8週齢（20-22g）の雄性特定病原体フリーC57BL/6マウスを北京華深生物技術有限公司から購入した。すべての動物は西南医科大学の動物飼育施設で飼育され、21℃～25℃の温度管理された環境、12時間の明暗サイクル、標準的な実験用飼料と清潔な水を自由に摂取できる環境で飼育された。データ収集と統計解析は、群分けを盲検化して行った。マウスは例外なく致死しなかった。

試験1：7日間の死亡率観察実験
LPS注射前にC57BL/6Jマウス（n = 42）の糞便を採取した。これらのマウスは、LPS誘発炎症に対する感受性についてマウスをスクリーニングするために、リポ多糖（LPS、10mg/kg、Escherichia coli O55:B5由来、Sigma）を腹腔内注射するために選択された。これらのマウスをランダムに異なるケージに収容した。24時間以内にマウスが瀕死の状態になり、敗血症の重症度が高ければ、マウスを犠牲にしてS-sen群と定義した。ただし、7日間生存し、活動状態に回復したマウスを敗血症抵抗性マウスとした。これらのマウスは同じバッチから購入した。

試験2：糞便微生物叢移植実験
(1)健常対照群（Ctrl群、n＝10）、(2)抗生物質投与群（ABX群、n＝10）、(3)S-res群からのFMT（Res群、n＝10）、(4)S-sen群からのFMT（Sen群、n＝10）。Ctrl群は無治療であった。ABX群には複合抗生物質を5日間毎日経口投与した。Res群には抗生物質を5日間毎日経口投与した後、S-resマウスの糞便脂質を投与し、その後15 mg/kgのLPSを腹腔内注射した。Sen群には抗生物質を5日間毎日経口投与した後、S-senマウスの糞便脂質で処理し、15 mg/kgのLPSを腹腔内注射した。LPS腹腔内注射の24時間後にマウスを犠牲にした。24時間以内に瀕死状態になり、敗血症の重症度が高いマウスは犠牲にし、解析には含めなかった。

試験3：ビタミンK1投与実験
(1)Ctrl群（n=10）、(2)LPS群（n=10）、(3)ビタミンK1投与群（VK1群、n=10）。Ctrl群は無処置。このマウス群が試験2のCtrl群である。LPS群には15mg/kgのLPSを腹腔内注射した。VK1群には15mg/kgのLPSを腹腔内注射した後、1mg/kg BWのビタミンK1を経口投与した。マウスはLPS腹腔内注射の24時間後に犠牲にした。

糞便微生物叢移植投与
18,19典型的な手順では、マウスに複合抗生物質（バンコマイシン100 mg/kg、硫酸ネオマイシン200 mg/kg、メトロニダゾール200 mg/kg、アンピシリン200 mg/kg）を1日1回、5日間投与し、内在性腸内細菌叢を除去した。各マウスの糞便をモデル化前に回収し、1mLのPBSで再懸濁した（125mg：1mL）。この懸濁液を、1分間激しくボルテックスし、800gで8分間遠心分離することにより、移植ビヒクルとして回収した。この糞便菌液をレシピエントマウスに1回150μL、1日1回、3日間経口投与した。

敗血症重症度スコア
敗血症の重症度は、犠牲にする前に以下の変数を用いて評価した：前述したように、毛孔形成、歩行の変化、嗜眠、呼吸数の変化、流涙、握力の低下、体の緊張の低下、操作後の呼吸困難、探索行動の欠如、および体温の変化20。合計得点は敗血症の重症度を反映する。敗血症の重症度は2～3点を軽度、4～7点を中等度、8～10点を重度と評価した。本試験では、敗血症の重症度が重篤と評価された時点でマウスを犠牲にした。

病理組織学
腓腹筋（GA）組織を採取し、PBSで洗浄し、4％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、エタノールで脱水し、キシレンで透過し、パラフィン包埋し、切片化し、H＆E染色した。その後、光学顕微鏡で形態学的評価を行い、筋線維の直径と断面積（CSA）を記録して筋線維の大きさを評価した。

アポトーシス検出
マウスGA筋のアポトーシスは、キットの説明書に従い、TUNELアッセイにより検出した。生体内のパラフィン切片を厚さ5μmに切断した。TUNELアッセイはTMR (Green) TUNEL Cell Apoptosis Detection Kit (Servicebio, USA)を用いて行い、核はDAPIでカウンター染色した。各切片の5つの異なる領域で陽性細胞を数え、TUNEL陽性筋細胞の割合として報告した。

握力測定
マウスを犠牲にする前に握力を測定した。経験豊富な研究者が、力センサーを取り付けた水平の金属棒をマウスに握らせ、マウスの尾を後方に軽く引っ張った。力センサーは、マウスの四肢が水平の棒から離されたときのピーク張力を自動的に記録した。各時点で3回の把持力測定を行い、その平均値を算出して記録した。把持力は体重で均質化した。

筋電図測定
ペントバルビタールナトリウムで麻酔した後、マウスをヒーティングパッドの上に横臥位で置いた。測定は、RM6240システムマルチチャンネル生理学的信号取得・処理システムを用いて行った。複合筋活動電位（CMAP）測定は、通常、後肢神経の機能性にアクセスするために行った。刺激電極は坐骨切欠の脇に、互いに1cmの間隔をあけて配置した。記録電極はGA筋の皮下に配置し、参照電極はアキレス腱に配置した。最後に、接地電極を尾部に配置した。CMAP潜時と振幅を測定した。CMAP測定は、神経筋神経伝導を評価するために臨床および実験環境で一般的に用いられる低侵襲の電気生理学的手法である。潜時は刺激からCMAP反応開始までを測定する。振幅は、双方向波の最大負ピークから最大正ピークによって決定される。潜時は神経信号から筋刺激までの時間を、振幅は脱分極する筋線維の数を評価するために用いた。刺激電流はCMAP反応の振幅が最大値に達するまで徐々に増加させた。測定はすべて3回繰り返した。マウスは犠牲にする前に測定した。

血清炎症因子の検出
モデル化24時間後、マウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔し、採血のために眼球を摘出し、3000rpmで10分間遠心分離した。上清は検査のために凍結した。インターロイキン（IL-1およびIL-6）およびTNF-αの濃度を、キットの説明書に従ってELISA法により測定し、全身の炎症を評価した。

マロンジアルデヒド含量の測定
GA筋のマロンジアルデヒド（MDA）は、脂質過酸化MDA測定キット（Beyotime社製）を用いて、手術前に測定した。簡単に説明すると、MDAは高温・酸性環境下でチオバルビツール酸（TBA）と反応し、MDA-TBA付加物を形成した。これらの付加物を蛍光法で測定した。535nmの最大吸収を比色法で測定した。

全スーパーオキシドジスムターゼ活性測定
GA筋の総スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）活性は、WST-8（北京Beyotime社製）を用いた総スーパーオキシドジスムターゼアッセイキットに従い、糖化前に測定した。簡単に説明すると、WST-8はキサンチンオキシダーゼによって触媒されるスーパーオキシドアニオン（O2-）と反応し、水溶性のホルマザン色素を生成する。SODはスーパーオキシドアニオンの不均化を触媒するため、この反応段階を阻害することができた。したがって、SOD活性は生成されたホルマザン色素の量と負の相関があり、SODの酵素活性はWST-8生成物の比色分析によって算出することができた。

グルタチオン還元酵素の測定
GA筋グルタチオン還元酵素（GR）を酸化型グルタチオンに還元して還元型グルタチオン（GSH）を生成し、GSHと基質DTNBを反応させて黄色TNBと酸化型グルタチオンを生成した。そして、A412を測定することにより、グルタチオン還元酵素活性のレベルを算出した。

ウェスタンブロット分析
TA筋と大腸組織のサンプルを採取し、抽出した。組織はPRO200 Bio-Gen Senesを用いて溶解バッファー中でホモジナイズした。全タンパク質をBeyotime BCA protein assay kitで定量し、10%ポリアクリルアミドゲルのSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースフィルター膜に転写した。その後、膜を5％脱脂粉乳で室温で2時間ブロッキングした。その後、膜を一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、膜を対応する二次抗体とインキュベートした。その後、膜をECL化学発光で可視化した。最後に、ImageJソフトウェアで解析した。一次抗体と希釈倍率は以下の通り： 抗MuRF1 (sc-398606, 1:1000) と抗MAFbx (sc-166806, 1:1000) はSanta Cruz Biotechnology, USAから。抗ZO1（AF5145、1:1000）、抗オクルディン（DF7504、1:1000）およびGAPDH（#AF7021）はAffinity社（中国）より入手。抗SirT1（#9475、1:1000）、抗NF-κB（#8242、1:1000）、抗ホスホ-NF-κB（#3033、1:1000）、抗mTOR（#2983、1:1000）、抗ホスホ-mTOR（#5536、1:1000）、抗AKT（#4691、1:1000）および抗ホスホ-AKT（#4060、1:1000）は、Cell Signaling Technology社（米国）から入手した。抗PI3K (AB_10734439) Proteintech, USAより。二次抗体と希釈倍率は以下の通り： ヤギ抗ウサギlgG抗体（#S0001、1:20000）およびヤギ抗マウスlgG抗体（#43593、1:20000）：Affinity、中国。

16SrDNA配列解析
糞便菌移植後の新鮮な糞便を採取した。CTAB/SDS法を用いてサンプル中の全ゲノムDNAを抽出した。DNA濃度と純度は1％アガロースゲルでモニターした。濃度に応じて、DNAを滅菌水で1ng/μLに希釈した。異なる領域の16SrDNA/18S rDNA/ITS遺伝子を特定のプライマーとバーコードで増幅した。データは QIIME2 ソフトウェアを用いて解析した。

ノンターゲットメタボロミクス
UHPLC-MS/MS 分析は、Orbitrap Q ExactiveTM HF 質量分析計（Thermo Fisher、ドイツ）と組み合わせた Vanquish UHPLC システム（Thermo Fisher、ドイツ）を用いて行った。糞便（100 mg）を個別に液体窒素で粉砕し、ホモジネートをあらかじめ冷やした80％メタノールでボルテックスして懸濁した。サンプルを氷上で5分間インキュベートした後、15,000 g、4℃で20分間遠心した。上清の一部を、脂質クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）グレードの水を用いて、53%メタノールを含む最終濃度に希釈した。その後、サンプルを新しいエッペンドルフチューブに移し、15,000g、4℃で20分間遠心した。最後に、上清をLC-MS/MSシステムに注入して分析した。

ターゲットメタボロミクス
眼採血法に準じてマウスから新鮮血液を採取し、3000rpmで15分間遠心した。上清は1.5 mL遠心チューブに回収した。キットの説明書に従い、抽出、窒素ブロー、抽出液の再溶解を行い［ultra-performance LC-electrospray tandem MS (UPLC-MS/MS)］、抽出した試料を装置上でUPLC-MS/MSにより検出した。最初に液相系に入ったサンプルは、カラムで分離・精製・濃縮され、MS系に導入された。MSシステムのイオン源でトリプル四重極質量分析計にイオン化された後、イオンの質量電荷比（m/z）に従って分離が行われた。データは多重反応モニタリングモードで収集され、検出されたサンプル中の各分析物と内部標準物質のクロマトグラムとピーク面積が記録された。サンプル中の対応する内部標準物質のピーク面積に対するビタミンK1の比率が計算された。試料中のビタミンK1の濃度は、標準曲線をプロットし、一次方程式を当てはめることにより算出することができた。

統計解析
すべてのデータ解析は、GraphPad Prism 8ソフトウェアを用いて、群配分を盲検化した研究者により行われた。結果は平均値±SDで表した。統計解析は、両側Student t-testまたは一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて行った。測定データは正規分布ではなかったため、ノンパラメトリック検定を用いた。P < 0.05を統計的に有意とみなした。

結果
敗血症感受性マウスと抵抗性マウスの特徴
最初の研究では、LPSを注射して炎症モデルマウスを作製し、マウスの生存率を観察した。ドナーマウスの糞便を採取した時点を図1Aに示す。LPS誘発炎症に対するマウスの感受性は有意に異なった。マウスが24時間以内に瀕死の状態を示し、敗血症の重症度が高い場合、マウスは犠牲にされ、S-sen群と定義される。しかし、7日間生存し、活動状態に回復したマウスをS-res群とした（図1B）。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図1
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パワーポイント
キャプション
握力およびCMAPの測定は、S-sen群のマウスが24時間以内に瀕死状態を呈し、敗血症の重症度が重篤と評価された時点で行い、その後マウスを犠牲にしてTUNEL染色用のGA筋を採取した。しかし、S-resマウスでは、7日目にマウスの握力とCMAPを測定し、その後マウスを犠牲にしてTUNEL染色のためにGA筋を採取した。両群の敗血症重症度スコアを図1Cに示す。S-sen群の敗血症重症度スコアはS-res群より有意に高かった（P < 0.05）。骨格筋の萎縮にはアポトーシスが関与している22。したがって、筋線維中のアポトーシス核を同定するためにTUNEL染色を行った。S-sen群では、切片あたりのTUNEL陽性核の数がS-res群に比べて有意に増加した（P < 0.05、図1D）。次に、犠牲にする前のマウスの体重を測定したところ、S-sen群マウスの体重はS-res群マウスに比べて著しく減少していた（P < 0.01, Figure S1A）。犠牲前に握力および坐骨神経-腓腹筋複合体の筋電図を行い、筋力の変化を調べ、神経筋機能を評価した。握力測定の結果を図1Eに示す。握力はS-senマウスでS-resマウスより低かった（P < 0.05）。また、CMAPの測定結果を図1Fに示す。振幅と潜時は点線間の距離を測定することで描かれている。S-sen群でもS-res群と比較してCMAP潜時が有意に増加し、振幅が有意に減少した。CMAP潜時と振幅の異常は通常、神経筋接合部の機能状態の異常を示唆する。

敗血症抵抗性マウスからの糞便細菌移植は、リポ多糖が誘発する筋肉損傷と腸管バリア破壊を緩和する
腸内細菌叢がLPS誘発炎症の感受性に重要な役割を果たしていることをさらに解明するために、FMT試験が行われた（図2A）。犠牲前の敗血症重症度スコアによると、Sen群はより重症の敗血症を示した（P < 0.05、図2B）。次に、GAのH&E染色を行い、筋線維のサイズを観察した（図2C）。Sen群のGA筋線維径とCSAは、Res群のそれよりも有意に小さかった（P < 0.05、図2C）。次に、筋機能に対するFMTの影響を評価した。SenマウスはResマウスに比べて握力が有意に低かった（P < 0.05、図S1C）。図2Dに示すように、主な結果として、SenおよびRes群はドナーマウスと同様の表現型を再現し、SenマウスではResマウスに比べて潜時が大幅に増加し、振幅が減少した（P < 0.05）。敗血症による筋タンパク質の分解の増加は、筋特異的E3ユビキチンリガーゼであるMuRF-1とMAFbxの発現を刺激した。ウェスタンブロットの結果、MuRF-1とMAFbxの発現はSen群で有意に増加した（P < 0.05、図2E）。LPSが両群のマウスの腸管バリアホメオスタシスに及ぼす影響をさらに明らかにするため、マウスの結腸組織を採取し、タイトジャンクションタンパク質ZO-1とオクルディンを測定した。ZO-1とオクルディンの相対発現は、Senマウスで有意に減少した（P < 0.05、図2F）。

詳細は画像に続くキャプションを参照。
図2
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パワーポイント
キャプション
糞便細菌移植により、ドナーマウスの腸内細菌叢組成が16sDNAシークエンシング技術により再現された。
LPS注射前のS-resマウスとS-senマウスの糞便をドナーマウスの糞便として、LPS注射前のSenマウスとResマウスの糞便をレシピエントマウスの糞便として採取し、16SDNAシークエンシングを行い、ドナーマウスとレシピエントマウスの腸内細菌叢の組成を解析した。S-senマウスとS-resマウス間、SenマウスとSenマウス間で、Chao1、observed_species、shannon indexに有意差は認められなかった（P > 0.05、図3A,B）。OUT abundance-weighted unifrac distanceに基づいてサンプルを構築し、主座標解析を行い、最も寄与の大きい主座標の組み合わせを選択して2次元の主座標解析（PCoA）プロットを描いたところ、2つのサンプルグループは互いに明確に区別されていないことがわかった（P > 0.05、図3C）。門レベルでは、ドナーマウスとレシピエントマウスで同様の腸内細菌叢組成が観察される（図3D）。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図3
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パワーポイント
キャプション
16sDNA配列決定技術により明らかになったレシピエントマウスにおける腸内細菌叢組成の違い
腸内細菌叢が敗血症による筋力低下に対する感受性の重要なメディエーターである可能性を考慮し、16SrDNAを分析することによって腸内細菌叢組成の変化を調べた。16SrDNA配列決定の結果、FMT処理によってSenマウスとResマウスのα多様性に有意差は生じなかった（P>0.05、図4A）。PCoAの結果からも、2群間の腸内細菌叢の全体的な構造差は統計的に有意ではなかった（P > 0.05、図4B）。線形判別効果量（LefSe）分析を直接行い、すべての分類レベルと主要細菌バイオマーカーの分析における同時差異を同定した。LDA分析の結果、Ackermanniaceae、Verrucomicrobiales、Akkermansia、Verrucomicrobiae、およびVerrucomicrobiata phylaはSen群で濃縮され、EnterococcusおよびEnterococcaceaeはRes群で濃縮された（LDAスコア＞4、図4D）。PICRUSt2をマーカー遺伝子に基づくメタゲノム機能予測に使用し、マウスの2群間における腸内微生物の代謝機能の違いをさらに検討した。データベース内のサンプルの機能アノテーションとアバンダンス情報に従い、各サンプルにおけるアバンダンスとそのアバンダンス情報の観点から上位35機能を選択してヒートマップを描き、異なる機能レベルでクラスタリングした。マウスの2群間で有意な機能差が観察された（図S2A）。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図4
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パワーポイント
キャプション
メタボローム解析により明らかになったレシピエントマウスの腸内細菌叢組成の違い
ResマウスとSenマウスの腸内細菌代謝機能の違いの可能性を考慮し、ノンターゲット代謝解析を行った。部分最小二乗判別分析(PLS-DA)は、部分最小二乗回帰を用いた教師付き判別分析の統計手法であり、代謝物発現とサンプルカテゴリーとの関係をモデル化する。PLS-DAにより、Res群とSen群における代謝プロファイルの明確な分離が示された（図5A）。さらに、モデルがオーバーフィットしていないかどうかを判断するために、2つのグループ間で順位検証を行った結果、オーバーフィットしていないことが示されました（図5B）。差分代謝物のスクリーニングは主に3つのパラメータを参照した： VIP、FC、P値である。閾値はVIP＞1.0、FC＞1.2またはFC＜0.833、P値＜0.05とし、Res群では90の代謝産物が上昇し、88の代謝産物が下降する178の差分代謝産物をSen群と比較してスクリーニングした（図5C）。その結果、ビタミンK1（FC=2.12、P=0.02、VIP=1.6）、タウリン（FC=1.72、P=0.03、VIP=1.5）、γ-トコフェロール（FC=2.19、P=0.04、VIP=1.5）が、Sen群と比較してRes群で有意に発現が上昇した（図5DおよびS2A,B）。その後、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）解析を用いて、関連する生物学的メカニズムをさらに理解した。アミノアシルtRNA生合成、ユビキノンおよび他のテルペノイド-キノン生合成、および代謝経路は、Sen群と比較してRes群で有意に濃縮されていた（図5E）。さらなる検証のために、SenマウスとResマウスの血清をモデル化前に採取し、UPLC-MS/MSを用いてビタミンK1の定量分析を行った。検量線を用いて標準曲線をプロットした（r≥0.9500、図S2D）。マウス血清中のビタミンK1量を測定した（図S2E）。Resマウスの血清中では、Senマウスの血清中よりも有意に高濃度のビタミンK1が検出された（図S2F）。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図5
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パワーポイント
キャプション
ビタミンK1はリポ多糖誘発性筋損傷と腸管バリア障害を抑制する
代謝分析から、ビタミンK1はRes群で有意に濃縮されていることが明らかになった。そこで、ビタミンK1がLPS誘発の筋損傷と腸管バリア障害を改善できるかどうかを検討した。マウスにLPSを腹腔内注射して急性炎症モデルを誘導し、その後ビタミンK1を経口投与した（図6A）。敗血症重症度スコアが得られ、その結果、ビタミンK1投与は敗血症重症度を減弱させた（P < 0.05、図6B）。モデル化24時間後、マウスの筋力を評価するために握力測定を行った。マウスの握力も犠牲にする前に測定し、その結果、VK1群の握力はLPS群より有意に高いことが示唆された（P < 0.05、図6C）。同様に、坐骨神経-腓腹筋複合体の筋電図測定でも、ビタミンK1前処置により潜時が減少し、振幅が増大することが明らかになった（P < 0.05、図S1E,F）。次に、MuRF-1とMafbxの発現量を評価した結果、ビタミンK1投与はこれらの発現を抑制した（P < 0.05、図6D）。腸の機能的バリアに対するビタミンK1の効果を観察するために、ZO-1とオクルジンタンパク質の発現レベルも調べた。敗血症は腸の機能的バリアを破壊し、透過性を増加させた。しかし、ビタミンK1はそれを有意に改善した（P < 0.05、図6E）。SIRT1の減少は酸化ストレスと炎症の増加と関連しており、SIRT1はNF-κBによる炎症と下流の炎症性サイトカイン合成を抑制した23。LPSマウスのSIRT1タンパク質レベルと比較すると、VK1マウスのそれは有意に上昇し、pNF-κBタンパク質は有意に低下した（P < 0.05、図6F）。ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）/Akt/哺乳類ラパマイシン標的（mTOR）シグナル伝達は、細胞の成長、増殖、代謝を制御する中心的な経路である。筋肉の成長や萎縮は、PI3K/Akt/mTORシグナル伝達経路の活性と密接な関係がある。本研究では、PI3K/ACT/mTORシグナル伝達経路をさらに決定した（図7A）。PI3K、pAKT、pmTORタンパク質の相対発現レベルは、VK1投与群と比較してLPS投与群で有意に低下した（P < 0.05、図7B-D）。続いて、敗血症マウスの酸化ストレスレベルに対するビタミンK1投与の効果を観察した。SODとGRはLPSマウスよりVK1マウスの方が高く、MDAは低かった（P < 0.05、図7E）。血清炎症性サイトカインは炎症反応の状態を反映する。ResマウスではSenマウスに比べて炎症因子（IL-1、IL-6）およびTNF-αのレベルが有意に低かった（P < 0.05、図7F）。

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図6
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図7
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考察
腸内細菌叢の異常は敗血症に重要な役割を果たしていると報告されている。さらに、微生物およびその代謝産物は、宿主筋の成長と機能を制御する複数の収束経路に関与している。そこで本研究では、敗血症による筋力低下を制御する腸内細菌叢とその代謝産物の役割を明らかにした。

本研究では、LPSの腹腔内注射を用いて炎症モデルマウスを作製したところ、同じ遺伝的背景を持つマウスでもLPS誘発全身性炎症に対する感受性に違いが見られた。この性質は、FMTによって他のマウスでも再現することができた。FMTアッセイにより、腸内細菌叢がLPS誘発性筋損傷の上流感受性伝導体としての役割が強調された。したがって、Resマウスの腸内細菌叢と代謝産物の組成は、敗血症からマウスを保護していると考えられた。常在細菌叢は複雑な生態系である。16SrDNA配列決定の結果から、ResマウスとSenマウスの腸内細菌叢組成は、特定の細菌叢において統計学的に有意な差異があるものの、概ね類似していることが示唆された。マウスは同じバッチで購入され、同じケージ内で適応的に飼育された。ヒトと異なり、マウスは共食行動をとるため、腸内細菌叢の組成が類似している可能性がある27。

メタボロミクスは、トランスクリプトミクスとプロテオミクスを拡張したフェノミクスに近い。メタボロミクスは、トランスクリプトミクスやプロテオミクスの延長線上にあるフェノミクスに近いもので、生物の生理状態をより直接的かつ正確に反映する。メタボロミクスにより、Resマウスの糞便中のビタミンK1の相対的含量は、Senマウスの糞便中のそれよりも有意に高いことが示唆され、血清中の定量がさらに検証された。試験3では、外因性ビタミンK1投与がLPS誘発炎症反応と筋損傷を予防することが示された。これらの結果は、ビタミンK1がLPS誘発性筋損傷の治療薬として信頼できる可能性があることを示している。ビタミンK1およびその誘導体が脂質過酸化を防止し、抗炎症作用を発揮することは、以前の研究で報告されている28, 29。さらに重要なことに、ビタミンKの補給はin vivoおよびin vitroでLPS誘発炎症を抑制することが判明している30。

LPSはグラム陰性菌の外膜の主要成分である。グラム陰性菌感染において、LPSは敗血症の主要なメディエーターである。LPSがパターン認識受容体（PRR）によってリポ多糖結合タンパク質（LBP）に結合すると、炎症性因子の放出が誘発され、敗血症の発症に重要な役割を果たす炎症性・抗炎症性バランスの調節不全につながる32。LPSによる生物学的作用は、感染性ショックと類似していることが観察されており、ヒトにおける敗血症性ショックの病因における重要な細菌毒素である36。したがって、敗血症発症におけるLPSシグナル伝達および下流エフェクターの阻害は、有望な治療手段となりうる。研究2では、糞便微生物叢移植後、レシピエントマウスがLPS誘発性筋障害に対して異なる感受性を示すことが観察された。LPS誘発筋損傷は、主に筋肉量と機能の低下として現れた。H&E染色の結果、Sen群のマウスの骨格筋筋線維の大きさは、Res群のマウスのそれよりも有意に小さいことが示唆された。その結果、Res群のマウスの骨格筋線維の大きさは、Sen群のマウスのそれよりも有意に低いことが示された。Sen群のマウスの骨格筋におけるMuRF-1とMAFbxの発現の増加は、骨格筋におけるタンパク質のホメオスタシスが純合成から純分解へとシフトし、筋線維のサイズの減少につながることを示唆した。一方、MuRF-1およびMAFbxタンパク質の発現レベルは、Senマウスに比べてResマウスで有意に低下していた。メタボローム解析の結果、Res群の糞便中および血清中のビタミンK1濃度は、Sen群のマウスに比べて有意に高いことが示唆された。これまでの研究で、ビタミンK1はSIRT1タンパク質の発現レベルをアップレギュレートすることが示されている39。

SIRT1は、炎症反応、アポトーシス、エネルギー代謝の調節に関与する脱アセチル化酵素である40。急性全身性炎症に関連する免疫代謝過程のバランスをとる上で、SIRT1が重要な役割を果たすことも同定された41。骨格筋では、LPSがNF-κB活性を上昇させることにより、MuRF-1とMAFbxの発現をアップレギュレートすることが実証されている43,44。本研究におけるVK1マウスにおけるSIRT1発現の有意なアップレギュレーションとNF-κBタンパク質の活性化レベルの低下は、ビタミンK1が、SIRT1/NF-κB経路を介したMuRF-1とMAFbx発現のダウンレギュレーションによって、LPS誘発筋傷害を改善する可能性を示唆している。NF-κBの活性化は、タンパク質の分解に関与するだけでなく、炎症においても重要な役割を果たしている45。Sen群における炎症因子の発現レベルは、Res群と比較して有意に上昇していた。ビタミンK1介入後、GRおよびSODレベルは有意に上昇したが、MDAレベルは有意に低下したことから、ビタミンK1の酸化ストレスレベルに対する抑制効果が示唆された。酸化ストレスは、活性酸素種や相対的窒素種の過剰産生によって特徴付けられ、炎症反応や臓器障害を引き起こす可能性がある（図8）46,47。

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図8
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ノンターゲット代謝解析の結果、アミノアシルtRNA生合成がKEGG解析の上位経路に含まれていることが示された。アミノアシルtRNA合成酵素は、タンパク質合成に重要な役割を果たす必須酵素ファミリーである48。非分裂筋細胞では、PI3K/AKT/mTORシグナル伝達経路がタンパク質合成を刺激し、タンパク質分解を抑制する。このことは、敗血症とエンドトキシン（LPS） により生じる炎症性障害が、キャップ依存性翻訳に関与 する因子、すなわちmTORを阻害し、筋タンパク質合成を 抑制するというこれまでの知見と一致している。さらに、敗血症はリボソーム数を変化させないことが示されており、遊離リボソームサブユニット数の増加が観察されることから、翻訳の開始と効率に障害があることが示唆される50。mTORキナーゼ活性の阻害は、部分的には炎症性サイトカインの過剰産生によるものであり、これらのサイトカインの特異的阻害剤は筋タンパク質合成を回復させる51,52。ビタミンK1介入後の骨格筋炎症因子レベルの有意な低下とPI3K/ACT/mTOR経路の有意なアップレギュレーションは、ビタミンK1によるLPS誘発筋損傷の改善は、部分的には骨格筋炎症レベルの抑制によるものであり、それがLPS誘発のPI3K/ACT/mTOR経路の阻害を克服し、骨格筋タンパク質合成を回復させたことを示唆している（図8）。本研究では、ビタミンK1投与により炎症レベルが強く抑制され、酸化還元レベルのバランスが保たれた結果、間接的に筋萎縮が抑制され、機能的な腸管バリアが保護された。SIRT1は、ミトコンドリアの酸化的代謝を顕著に改善し、酸化ストレス下でのミトコンドリア機能を制御する可能性がある54。全体として、これらの所見は、ビタミンK1が敗血症による筋力低下を治療するための信頼性の高い薬剤である可能性を示した。

われわれの研究にはいくつかの限界がある。第一に、われわれの研究は、LPSが誘発する骨格筋障害に対するビタミンK1の効果に焦点を当てたものであり、他の微分代謝産物やその基礎となる機序のさらなる解析は行っていない。この点については、今後の研究課題である。第二に、本研究では雄マウスを選んだ。というのも、エストロゲンの関係もあるが、雌の炎症反応は雄のそれとは大きく異なることが以前から指摘されていたからである。この炎症反応の亢進は、感染症や敗血症に対する反応を促進するが、自己に対する免疫反応には有害である55。女性の炎症に関しては、我々の所見にはいくつかの限界がある。

結論
以上の結果から、腸内代謝産物が敗血症に伴うマウスの筋力低下に関与していることが示唆された。ビタミンK1は、SIRT1をアップレギュレートし、NF-κB活性化炎症反応に拮抗し、酸化ストレスを制御し、タンパク質合成を促進し、タンパク質分解を抑制することにより、LPSが引き金となる筋損傷に対する保護効果を有する可能性がある。本研究は、敗血症に伴う筋力低下の新たなメカニズムを明らかにし、ビタミンK1が敗血症に伴う筋力低下を予防する有効な戦略である可能性を示唆するものである。

謝辞
実験プラットフォームを提供していただいた西南医科大学心血管代謝研究所に感謝する。本原稿の著者は、Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscleの著者資格および出版に関する倫理指針を遵守していることを証明する。

利益相反
すべての著者は利益相反がないことを宣言する。

資金提供
本研究は、四川省科学技術計画共同イノベーションプロジェクト（No.2022YFS0632）の支援を受けた。

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要旨
背景 敗血症に伴う筋力低下は集中治療室（ICU）の患者によくみられ、転帰不良と密接に関連している。敗血症による筋力低下のメカニズムは不明である。最近の研究で、腸内細菌叢と代謝産物が骨格筋量と代謝の調節に関与していることがわかってきた。本研究では、敗血症に伴う筋力低下に対する腸内細菌叢と代謝産物の影響を検討することを目的とした。

方法 リポ多糖（LPS）誘発炎症モデルマウスにおいて、LPS誘発炎症に対する感受性の異なるマウスを糞便微生物叢移植（FMT）アッセイのドナーマウスとし、レシピエントマウスを感受性（Sen）群と抵抗性（Res）群に分けた。骨格筋量と機能、および大腸バリアの完全性を検査し、両群のマウスの腸内細菌叢と代謝産物組成を分析した。腸内微量代謝産物であるビタミンK1がLPS誘発性筋損傷に及ぼす影響を調べ、その基礎となるメカニズムを探った。

結果 レシピエントは様々なLPS誘発性筋損傷と腸管バリア破壊を示した。センの前脛骨筋（TA）は、MuRF-1（0.825±0.063 vs 0.304±0.293、P = 0.0141）およびMAFbx（1.055±0.079 vs 0.456±0.3、P = 0.0092）の発現レベルの上昇を示した。大腸タイトジャンクションタンパク質ZO-1（0.550±0.087対0.842±0.094、P = 0.0492）およびオクルディン（0.284±0.057対0.664±0.191、P = 0.0487）は、Sen群において有意に発現が低下した。メタボローム解析では、Res群の糞便中（P = 0.0195）および血清中（P = 0.0079）のビタミンK1がSen群のそれよりも有意に高いことが示された。ビタミンK1介入後、筋萎縮関連タンパク質の発現は低下した（P < 0.05）。一方、SIRT1タンパク質の発現は上昇し（0.320±0.035 vs. 0.685±0.081, P = 0.0281）、pNF-κBタンパク質の発現は低下した（0.815±0.295 vs. 0.258±0.130, P = 0.0308）。PI3K（0.365±0.142対0.763±0.013、P = 0.0475）、pAKT（0.493±0.159対1.183±0.344、P = 0.0254）およびpmTOR（0.509±0.088対1.110±0.190、P = 0.0368）のタンパク質発現レベルは、TA筋で上昇した。一方、ビタミンK1は血清中の炎症因子濃度を低下させた。

結論 ビタミンK1は、SIRT1のアップレギュレーションを介してNF-κBが介在する炎症に拮抗し、タンパク質合成と異化のバランスを調節することにより、LPSが誘発する骨格筋障害を改善する可能性がある。

キーワード 腸内細菌叢；炎症；筋力低下；SIRT1；敗血症；ビタミンK1.

© 2023 The Authors. Wiley Periodicals LLC発行のJournal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle。

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参考文献
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2022YFS0632/四川省科学技術計画共同イノベーションプロジェクト
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