TLR欠損マウスの腸内細菌叢を形成するのは、自然免疫の欠陥よりもむしろ家族内感染である

2023年7月11日 11:24

J Exp Med. 2012 Jul 30; 209(8)： 1445-1456.
doi: 10.1084/jem.20120504
PMCID: PMC3409501
PMID: 22826298
TLR欠損マウスの腸内細菌叢を形成するのは、自然免疫の欠陥よりもむしろ家族内感染である

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3409501/

Carles Ubeda,1,2,6 Lauren Lipuma,1,2,5 Asia Gobourne,1,2,5 Agnes Viale,3 Ingrid Leiner,1,2 Michele Equinda,1,2 Raya Khanin,4 and Eric G. Pamer1,2,5
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要旨
腸内細菌叢は免疫系の発達に寄与し、逆に免疫系は微生物叢の構成に影響を及ぼす。腸内のToll様受容体（TLR）は細菌のリガンドを認識する。TLRシグナル伝達は自然免疫系の主要な役割を担っているが、TLRが腸内細菌叢の構成にどの程度影響を与えているかは不明である。われわれは、TLR欠損マウスとMyD88欠損マウスの回腸と盲腸に生息する複雑な細菌集団の特徴を明らかにするために、16SリボソームRNAの塩基配列決定を深く行った。MyD88欠損マウスとTLR欠損マウスのコロニーの微生物叢は著しく異なり、各コロニーとも小腸と大腸に明確で区別可能な細菌集団を保有していた。MyD88欠損マウス、TLR2欠損マウス、TLR4欠損マウス、TLR5欠損マウス、およびTLR9欠損マウスと、それぞれの野生型（WT）同腹仔との比較から、TLR欠損が腸内細菌叢の組成に及ぼす影響は、恒常性条件下および抗生物質投与からの回復後では最小であることが示された。したがって、TLR欠損マウスコロニー間の違いは、互いに隔離して長期飼育した後の微生物叢の長期的分岐を反映していた。隔離されたマウスコロニーの長期飼育は、腸内細菌叢の変化をもたらし、それが母体伝播によって子孫に伝えられることで、WTマウス系統と変異マウス系統の間の顕著な組成の違いを説明する。
哺乳類の消化管には複雑な微生物集団が生息しており、微生物叢と呼ばれている。次世代DNA配列決定プラットフォームは、複雑な細菌集団から増幅された16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子の配列決定に使用され、腸内細菌叢の調査を可能にし、何千もの異なる細菌種が常在コミュニティに寄与していることを明らかにした（Dethlefsen and Relman, 2011）。腸内の細菌分類群のほとんどは、ファーミキューテス門とバクテロイデーテス門に属し、プロテオバクテリア門、アクチノバクテリア門、疣贅菌門、あるいはフソバクテリア門に属する細菌は少数派を形成している（Eckburg et al.）小腸と大腸に生息する細菌群集は別個である（Garner et al.）さらに、腸上皮に近接する微生物集団は、腸管内腔に生息する微生物集団とは異なる（Hill et al.）
腸内細菌叢は宿主に多くの恩恵をもたらす。腸内細菌は、消化できない化合物を分解する酵素を産生することで、栄養素の吸収という腸の主要機能に貢献している（Hooperら、2002）。腸内細菌は免疫系の発達にも寄与し（Hill and Artis, 2010）、病原性細菌による感染に対する抵抗力を高める（Vollaard and Clasener, 1994）。腸内細菌叢は腸の血管新生を促進し（Stappenbeckら、2002）、腸管上皮傷害からの保護を提供する（Rakoff-Nahoumら、2004）。微生物叢の組成の変化は、肥満（Leyら、2005年）、糖尿病（Wenら、2008年）、自己免疫（Wuら、2010年）、炎症性腸疾患（Elinavら、2011年）、感染症（Donskeyら、2000年）などの疾患の原因となりうる。
腸内に生息する常在細菌集団の組成や構造は、外因性因子によって変化する可能性がある。母体からの感染は、微生物叢の組成を決定する最も初期の、そして間違いなく最も重要な要因である（Spor et al.）同腹マウスの微生物叢は、母体由来が異なる遺伝的に同一のマウスの微生物叢よりも類似していることが示されている（Ley et al.、2005）。ヒトでは、兄弟姉妹の微生物叢は、血縁関係のない個体の微生物叢よりも類似しており、著しく異なることがある（Turnbaugh et al.）食事もまた、腸内微生物集団の構成に影響を与える環境要因のひとつである。ヒトから分離した微生物叢をコロニー形成させた無菌マウスを用いた研究では、低脂肪で植物性多糖類が豊富な食事から高脂肪で高糖質の食事に切り替えると、1日で微生物叢の構造が変化することが示された（Turnbaugh et al.）我々や他の研究者は、抗生物質投与が腸内微生物の多様性を劇的に変化させることを明らかにしてきた（Dethlefsenら、2008；Sekirovら、2008；Antonopoulosら、2009；Hillら、2010；Ubedaら、2010；Dethlefsen and Relman、2011）。抗生物質投与後の微生物叢の変化には、長期間持続するものもある（Jernbergら、2007、2010；Ubedaら、2010；Dethlefsen and Relman、2011；Buffieら、2012）。
外因性因子に加えて、免疫系も腸内細菌叢の組成を形成する。IgAを欠損したマウスは、分節した糸状菌（SFB; Suzuki et al.） RagとT-betの二重欠損マウスは、腸の炎症を促進する微生物叢にコロニー形成され、WTマウスに移植すると大腸炎を誘発した（Garrettら、2007）。これと類似した最近の研究では、NLRP6欠損マウス（NLRP6 KOマウスとWTマウスの大腸炎を悪化させる微生物叢にコロニー形成されることが示された（Elinav et al.） Toll様受容体（TLR）シグナルも腸内細菌叢の制御に関与している。例えば、TLR5欠損マウスの腸内細菌叢は、100を超える細菌系統型においてWT同腹仔コントロールと異なっていた（Vijay-Kumarら、2010年）。別の研究では、MyD88欠損マウスは、リケネラ科とポルフィロモナド科の細菌が多い糞便微生物叢を保有していた（Wenら、2008）。微生物叢の組成の変化は、自然免疫シグナル伝達経路の遺伝子変異と関連しているが、異なる大陸の異なる施設に収容され、異なる飼育環境と食餌条件に曝されたマウスのコロニーでは、微生物叢に顕著な違いがあり、自然免疫シグナル伝達経路が微生物叢に及ぼす影響を明確に定義することは困難である。
本研究では、病原体を含まない特定の条件下で飼育されたマウスの腸内細菌叢の構成におけるMyD88とTLRシグナルの役割に注目した。小腸および大腸サンプルから増幅した16S rRNA遺伝子のハイスループットシークエンシングを用いて、MyD88または特定のTLR（TLR2、TLR4、TLR5、TLR9）を欠損したマウスと、そのWT同腹仔マウスの微生物叢を解析した。その結果、MyD88またはTLRシグナルは、定常状態でも抗生物質処理後でも、腸内細菌叢の組成を検出できるほど変化させないことがわかった。異なるMyD88欠損マウスおよびTLR欠損マウスコロニーのコロニー形成微生物叢における実質的な相違は容易に検出されたが、これらの相違は特定のマウス血統のメンバーであることと相関しており、自然免疫シグナル伝達の障害とは相関していなかった。この実験から、変異マウスとWTマウスの微生物叢分析の解釈には注意が必要であり、マウスの親系統と飼育方法に細心の注意を払うことが不可欠であることが示唆される。
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結果
腸内細菌叢に対するMyD88/TLRシグナルの影響
TLRシグナル伝達が腸内細菌叢の構成に及ぼす影響を調べるため、骨髄分化因子MyD88遺伝子の欠失（MyD88+/-）がヘテロ接合体であるC57BL/6J雌マウスとC57BL/6J MyD88+/-雄マウスを交配し、仔マウスの遺伝子型を決定した。MyD88-/-マウスは、同じ産仔のMyD88+/-マウスまたはMyD88+/-マウスとペアにし、離乳時（生後21日後）にオートクレーブ滅菌した個別のケージに分けた。マウスは離乳から5～7週後に安楽死させ、回腸上皮と回腸腔および盲腸腔に定着している微生物叢の組成を、Roche/454プラットフォームを用いてPCR増幅した細菌の16S rDNAの塩基配列を決定することにより決定した。TLR2、TLR4、TLR5、およびTLR9の発現が腸内細菌叢に及ぼす影響についても、同様の手法で解析した。各変異株について、5～7匹のKOマウスと5～7匹のWT（+/+または+/-）同腹仔マウスを解析対象とした。合計586,351の配列が我々の品質基準をパスし（材料と方法を参照）、この解析に使用された。MyD88欠損が糞便微生物叢に及ぼす影響の解析では、サンプルあたり平均10,000配列以上を得たが、他の比較では平均2,600配列以上を得た。
まず、UniFrac（Lozupone and Knight, 2005）を用いて系統的距離に基づく類似性を定量化することにより、微生物叢組成に対するTLRシグナリングの影響を特徴付けた。重み付けされていないUniFracメトリックを使用して、異なる細菌分類群の有無（有病率ではない）を集計し、主座標分析（PCoA）を使用して、分散が最大となる直交軸に沿ってコミュニティをクラスタリングした。異なるTLRが微生物叢の構成に異なる寄与をしているかどうかを解析するため、PCoAを用いて、異なる変異マウスコロニーとそれぞれのWTコントロールから得られたすべての糞便サンプルを比較した（図1 A、全コロニー）。解析の最初の2つの主座標（PC1とPC2）は、異なる変異コロニーに属するマウスを分離したが、同じリターに属するWTマウスとKOマウスの間には分離は見られなかった（図1 A、閉じた円または開いた円）。例えば、MyD88欠損繁殖コロニーに属するWT同腹子の微生物叢は、MyD88 KOマウスと強固にクラスター形成していたが、TLR欠損コロニーに属するWTマウスはクラスター形成していなかったことから、その微生物叢の組成は、宿主におけるTLRシグナルの有無ではなく、母体からの伝達によってほぼ決定されていることが示された。各TLR欠損コロニーのWTマウスとKOマウス由来の微生物叢も一緒にクラスター化したが（図1 A）、TLR2欠損コロニーでは2つの異なる産仔が別々にクラスター化した。異なる細菌分類群の頻度を考慮した重み付けUniFrac解析を用いた糞便微生物叢の比較では、TLR5マウス、TLR4マウス、およびTLR2欠損マウスのコロニー由来の微生物集団がPC1およびPC2によってクラスタリングされていることが示された（描かれていない）。糞便微生物叢の解析と同様に、KOマウスおよびWT同腹仔マウスの回腸上皮または回腸腔から単離したサンプルは、重み付けなしのUniFrac解析を用いたPCoAでは区別できなかった。しかし、PC1およびPC2は、TLR2欠損マウスおよびTLR4欠損マウス由来の微生物叢を他のマウスのコロニーから分離した（描かれていない）。MyD88-/-マウス、TLR2-/-マウス、TLR4-/-マウス、TLR5-/-マウス、TLR9-/-マウスのコロニーは、KOマウスとWT同腹仔マウスの比較に用いられたが、私たちの施設に最初に移され、さらにジャクソン研究所のC57BL/6マウスに戻し交配された後、少なくとも5年間は別々に繁殖・維持されていた。従って、MyD88マウスとTLR欠損マウスのコロニー間の微生物叢の違いは、長期間別々に飼育されたことと、当施設に移されたときに異なる細菌叢で最初にコロニー化されたことに起因すると考えられる。
図1.
TLRシグナル伝達と系統由来が、糞便微生物叢の全体的な微生物組成に与える影響。(A）MyD88、TLR2、TLR4、TLR5、またはTLR9 KOマウスコロニーとそれぞれのWT/Het同腹子の糞便サンプルの重み付けなしUniFrac解析のPCoAプロット。各マウスコロニーには5～7匹のKOマウスと5～7匹のWT/Hetマウスが含まれ、示されたように異なる色でラベルされている。マウスコロニーを別々に解析した場合、各マウスの出生地は異なるシンボル形状で示される。(B)コロニー内の各マウスの平均UniFrac距離を、(a)同じ遺伝子型を持つ同じリッター由来の他の全てのマウス、(b)異なる遺伝子型を持つ同じリッター由来の他の全てのマウス、または(c)異なるリッターに属するそのコロニー内の他の全てのマウスに対して計算し、プロットした。UniFrac距離が大きいほど、2つの微生物群集間の非類似度が高いことを示す。エラーバーは±SEMを示す。アスタリスクはグループ間のUniFrac距離の統計的に有意な差を示す（Studentのt検定：*, P < 0.05; **, P < 0.001）。
母体から連続する仔ウシへの微生物叢の伝播が類似しているのか、あるいは経時的に変化するのかを明らかにするため、異なる仔ウシの微生物集団を別々に分析した。同じMyD88ヘテロ接合体両親によって育てられた2つの異なる産仔の頭蓋サンプルは、PCoAによって示されるように、異なっていた（図1 A、MyD88パネル）。しかし、どちらの仔マウスでも、MyD88 KOとWTの仔マウスは一緒に集まっており、仔マウス間の微生物叢の変化は、MyD88シグナル伝達の欠陥に起因する変化よりも顕著であることが示された。TLR2コロニーのマウスを分析したところ、同様の結果が得られた。この場合、3つの異なるヘテロ接合性TLR2欠損親からKOマウスと同腹仔WTマウスが得られた。同腹子のKOマウスとWTマウスは一緒に集まったが、PC1とPC2では親の出自でマウスを分けた。TLR4欠損マウス、TLR5欠損マウス、TLR9欠損マウスのコロニーについても、異なる産仔を解析したところ、同様の結果が得られた（図1 A）。加重UniFracを用いても、回腸上皮または回腸内腔から単離したサンプルを分析しても、異なる産仔の同様の分離が観察された（図には描かれていない）。これらの結果から、腸内細菌叢の組成にはTLRシグナルよりも母体由来の影響が大きいことが示された。微生物叢における遺伝子型と系統の相対的な寄与を示すために、特定のコロニー内の各マウスについて、(a)同じ遺伝子型を持つ同じ産仔の他のすべてのマウス、(b)異なる遺伝子型を持つ同じ産仔の他のすべてのマウス、または(c)異なる産仔に属するそのコロニー内の他のすべてのマウスに対する重み付けなしのUniFrac距離の平均値を計算し、プロットした。UniFrac距離が小さいほど、2つの微生物群集の類似性が高いことを示す。したがって、もしKOマウスの微生物叢がWT同腹子の微生物叢と異なっていれば、遺伝子型の異なるマウス間では、同じ遺伝子型のマウス間よりも高いUniFrac距離が予想される。図1のBに示すように、糞便サンプルでは、異なる遺伝子型のマウス間のUniFrac距離は、同じ遺伝子型のマウス間のUniFrac距離よりも高くはなかった。しかし、異なる産仔のマウス間ではより高いUniFrac距離が観察された。同様の結果が、異なる産仔に属するマウスの回腸サンプルでも得られたことから（描かれていない）、母体由来がTLRシグナル伝達よりも微生物叢の構成に大きな影響を与えることが示唆された。母体由来が腸内細菌叢の組成を形成する主要な役割を果たしていることを証明するために、UPGMA（算術平均を用いた重み付けなしのペアグループ法）クラスタリングアルゴリズムを、全セカルサンプルの重み付けなしのUniFrac距離に適用した。UPGMAアルゴリズムは、微生物叢の類似性が高いサンプル同士が集まる木を生成する。図2に示すように、同じ母体由来のマウス（同じ母体から生まれた異なる産仔を含む）は一緒にクラスタリングされる。対照的に、マウスの遺伝子型によるクラスタリングはより限定的であり、母体由来が異なるマウスコロニーで観察された違いを推進する主要な力であることを示している。
図2.
微生物叢組成に対する母親の影響。UPGMAクラスタリング・アルゴリズムを用いて、重み付けされていないUniFrac距離行列を用い、類似性によりセカル微生物叢サンプルをクラスタリングした。色はマウスの母体由来を示す。サンプルは以下の4つのラベルコードで命名した： (1)マウスコロニー（M、MyD88；T2、TLR2；T4、TLR4；T5、TLR5；およびT9、TLR9）、(2)文字で識別されるマウスファミリー、同じ母親からの連続した産仔は番号で区別、(3)マウス遺伝子型（H、ヘテロ接合；K、KO；およびW、WT）、および(4)マウスID番号。サンプルは、円ツリーの外側のラベルで示されるように、母体由来でクラスター化されている。同じ母親からの連続した仔マウス（番号で区別）は一緒にクラスター化されており、TLR欠損コロニーからの微生物叢組成に母親由来が大きな役割を果たしていることを示している。各マウスコロニーには5～7匹のKOマウスと5～7匹のWT/Hetマウスが含まれる。
前述の結果は、TLRシグナル伝達が微生物叢を変化させないことを示しているが、特定の細菌分類群がTLRシグナル伝達の欠陥によって影響を受ける可能性は残っていた。この問題に対処するため、腸内サンプルにおけるさまざまな細菌分類群の相対的代表度を測定した。ほとんどの場合、属レベルで分類することができた。図3は、MyD88-/-マウス、TLR2-/-マウス、TLR4-/-マウス、TLR5-/-マウス、およびTLR9-/-マウスと、それぞれのWT同腹仔で同定された最も豊富な分類群の相対比率を示している。先に示したように（Ubeda et al., 2010）、ほとんどの細菌はバクテロイデーテス（Bacteroidetes）とファーミキューテス（Firmicutes）に属し、回腸と盲腸の微生物叢の組成は異なる。すべてのコロニーにおいて、一部のマウスの回腸上皮はSFBに支配されていた。SFBのコロニー形成レベルはKOとWTの同腹子の間に差はなかったが、TLR4コロニーの同腹子Eでは、SFBがTLR4-/-マウスの微生物叢を支配したが、それぞれのWT同腹子の微生物叢は支配しなかった（描かれていない）。
図3.
腸内細菌叢の細菌組成に対するTLRシグナルの影響。MyD88、TLR2、TLR4、TLR5、またはTLR9 KOマウスとそれぞれのWT/Hetコントロールのコロニーから得た回腸または盲腸サンプルにおける16S rDNA頻度の系統分類。各バーは、5～7匹のマウスの微生物叢組成の平均を表す。最も優勢な細菌分類群が示され、示されたように異なる色でラベルされている。細菌分類群は、mothurを用いて16s rDNA配列を属レベルに分類することにより得られた。配列が属レベルに分類できなかった場合は、属レベルに最も近い分類レベルをUC（unclassified）の前に付けて示した。
TLRシグナルによって有意に影響を受ける細菌分類群を特定するため、Studentのt検定を用いて、KOマウスと同腹のWTマウスにコロニー形成する特定の分類群の相対量を比較した。存在量の少ない分類群（両群の平均が5カウント未満）は、この分析には含めなかった。多重比較の結果としての偽陽性を避けるため、Benjamini and Hochberg偽発見率（FDR）を有意差（P < 0.05）のある分類群に適用した。いくつかの細菌分類群ではp値＜0.05が得られたが、FDR基準（≦0.1；図4）をクリアしたものはなかった。同様の結果は、サンプルをリターの由来でペアにしたスチューデントのt検定、またはノンパラメトリック検定（ウィルコクソン検定）を用いて統計的に有意な変化を計算した場合にも得られた（描かれていない）。操作分類学的単位（OTU）レベル（同一性97％以上）で解析した場合、KOマウスとWTマウスの間に差は認められなかった。一方、異なる産仔の腸内サンプルを解析したところ、いくつかの分類群に有意差が認められ（図4）、産仔間でコロニーおよび部位あたり平均26.6 OTUに有意差が認められた。TLRシグナル伝達に起因する微生物叢の違いを同定し、母体由来に起因する違いを避けるため、KOマウスを同じ産仔のWT同腹仔と比較した。少なくとも3匹のKOマウスと3匹のWTマウスの同腹子を含む仔マウスのみをこの解析に含め、MyD88とTLR5の仔マウスを1匹、TLR4とTLR9のコロニーの仔マウスを2匹含めることができた。このアプローチでは、TLR9コロニーの1匹においてのみ統計的に有意な差が確認され、KOマウスの回腸内腔および上皮ではOlsenella属の存在量が高く、KOマウスの回腸上皮ではParasutterella属、Turicibacter属、および分類されていないErysipelotrichaceaeの存在量が高かった。OTUレベルでは、散発的な変化が観察された：TLR5 KOマウス1匹の盲腸におけるOTU257（Ruminococcaceae）の減少、TLR4 KOマウス1匹の回腸壁におけるOTU8（Lactobacillus）の減少、TLR9 KOマウス1匹の回腸内容物におけるOTU26（Olsenella）の増加。
図4.
腸内細菌叢の特定の細菌分類群に対するTLRシグナル伝達と系統起源の影響。WT/HetマウスとKOマウス（n = 5-7マウス/遺伝子型）間、またはマウスコロニー内の異なる産仔（n = 4-8マウス/産仔）間の異なる腸内細菌分類群（赤）についての統計的に有意な変化（Studentのt検定、P < 0.05; FDR ≤ 0.1）を示すヒートマップ。細菌分類群は、mothurを用いて16s rDNA配列を属レベルに分類することで得られた。配列が属レベルに分類できない場合は、属レベルに最も近い分類レベルをUC（unclassified）の前に付けた。一度でも統計的に有意と認められた分類群のみを示す。Ceは糞便内容物；ICは回腸内容物；IWは回腸壁。
TLRシグナル伝達が腸内細菌叢の多様性に影響を与えているかどうかを調べるため、各腸サンプルについてシャノン多様性指数を算出した。Studentのt検定（P < 0.05）を用いて、KOマウスの微生物多様性がWT同腹子のそれと統計的に異なるかどうかを判定した。KOマウスとWTマウスの間で、シャノン多様性指数に差は見られなかった（描かれていない）。Chao Indexを用いて微生物種の豊かさを推定したところ、同様の結果が得られた（描かれていない）。
抗生物質投与後の腸内細菌叢の変化に対するTLRシグナルの寄与
私たちや他の研究者は、抗生物質投与により腸内細菌叢の組成が劇的に変化することを明らかにしてきた（Ubeda et al.） TLRシグナル伝達が抗生物質投与後の微生物集団の回復に影響するかどうかを調べるため、8～10週齢のMyD88-/-マウス、TLR2-/-マウス、TLR4-/-マウス、TLR5-/-マウス、またはTLR9-/-マウスと、それぞれのWT同腹仔にバンコマイシンを7日間経口投与し、投与中および投与後の微生物叢をモニタリングした。私たちは以前、バンコマイシンが腸内細菌叢に劇的な変化を引き起こし、それが投与中止後も持続することを実証した（Ubeda et al.）個々のマウスにおける微生物の変化を追跡するため、抗生物質投与前、バンコマイシン投与7日後、および投与中止2週後および4週後に糞便ペレットを採取し、この時点でマウスを犠牲にして、微生物叢解析のために盲腸および回腸の管腔内容物および回腸上皮を採取した。すべてのマウスは離乳後に個別に飼育され、品質基準を通過した合計1,354,358配列（平均／サンプル＝3,455）がこの解析に用いられた。図5は、MyD88-/-マウス、TLR2-/-マウス、TLR4-/-マウス、TLR5-/-マウス、およびTLR9-/-マウスと、それぞれのWT同腹子の糞便サンプルで同定された最も豊富な分類群の相対量を示している。予想通り、すべてのマウスコロニーで、バンコマイシン処置7日後に腸内細菌叢が変化した。興味深いことに、コロニーや遺伝子型に関係なく、すべてのマウスにいくつかの共通の変化（乳酸桿菌の拡大、バルネシエラとバクテロイデスの消失）が認められたものの、個々のコロニーには特有の変化が認められた。例えば、TLR4欠損コロニーおよびTLR5欠損コロニーではヘリコバクターの拡大が観察されたのに対し、MyD88欠損コロニーおよびTLR5欠損コロニーではパラバクテロイデスの拡大が観察された。しかし、特定のコロニー内におけるKOとWTの同腹子の微生物叢の変化は区別できなかったことから、TLRシグナル伝達は抗生物質処理後の微生物集団の回復に影響を与えないことが示唆された。以前の結果（Ubeda et al., 2010）と一致して、抗生物質処理したKOまたはWTの同腹子を個別に飼育した場合、抗生物質処理を中止してから1ヵ月後でも、最初の微生物相は回復しなかった。特定の細菌分類群がKOとWTの同腹子の間で有意差があるかどうかを調べるために、スチューデントのt検定を用いた。恒常性条件下での微生物集団の比較で述べたように、FDR基準（≦0.1）を適用しても、抗生物質投与から回復したKOとWTの同腹子の細菌分類群に有意差は見られなかった。
図5.
抗生物質投与後の糞便微生物叢組成に対するTLRシグナリングの影響。MyD88、TLR2、TLR4、TLR5、またはTLR9のKOマウスおよびWT/Het同腹仔マウスを、バンコマイシン（Vanco）で7日間飲水処理した。糞便サンプルは、治療前、バンコマイシン治療1週間後、および抗生物質中止2週間後と4週間後に採取した。糞便サンプル中の16S rDNA頻度の系統分類は、ハイスループットシークエンシングおよびモスチャーシークエンシング解析によって得られた。各バーは4～7匹のマウスの微生物叢組成の平均を示す。最も優勢な細菌分類群が示され、示されたように異なる色でラベルされている。
私たちや他の研究者は、抗生物質投与によって腸内微生物の多様性が減少することを示してきた（Dethlefsenら、2008；Ubedaら、2010）。しかし、抗生物質投与後の微生物多様性の減少にTLRシグナルが寄与しているかどうかは不明である。この疑問を解決するため、糞便サンプルについてシャノン多様性指数を算出した（図6 A）。予想通り、微生物の多様性はバンコマイシン投与7日後に減少し、抗生物質投与中止後にわずかに増加したが、投与前のレベルに戻ることはなかった。Studentのt検定（P < 0.05）を用いて、KOとWTの同腹子の微生物多様性が有意に異なるかどうかを判定した。この解析では、回復から14日後にMyD88-/-マウスでわずかに高い多様性が検出された。Chao指数を用いた微生物の豊かさの計算では、KOおよびWT同腹子のバンコマイシン処理後の有意差は検出されなかった（図6 B）。
図6.
抗生物質処理後の腸内細菌叢の多様性と濃度に及ぼすTLRシグナリングの影響。(AおよびB）Myd88、TLR2、TLR4、TLR5、またはTLR9のKOマウスおよびWT/Het同腹子マウスを、バンコマイシン（vanco）で7日間飲水処理した。糞便サンプルは、投与前、バンコマイシン投与1週間後、および抗生物質投与中止2週間後と4週間後に採取した。シャノン多様性指数（Shannon diversity index）およびチャオ富度指数（Chao richness index）は、16s rDNAハイスループットシークエンシングおよびモサー分析により求めた。TLRシグナル伝達が全体的な微生物多様性と豊かさに及ぼす影響を解析するために、KOマウス群とそれぞれのWT/Het対照群との間でStudentのt検定を行った（n = 4-7マウス/遺伝子型）。横棒は平均値を示す。アスタリスクは有意性を示す（, P < 0.05）。
バンコマイシン処理前後の微生物叢の組成を、UniFracとPCoAによって各KOコロニーで比較した（図7）。MyD88コロニーで見られるように、PC1では、未処理サンプルとバンコマイシン投与7日後に得られたサンプル、および投与中止2週後および4週後に得られたサンプルを分離した。このように、バンコマイシンは微生物叢に長期間の変化を引き起こす。PC3は、バンコマイシン投与7日後に得られたサンプルと、バンコマイシンを中止して2週間後または4週間後に得られたサンプルとを分離した。この結果は、抗生物質の中止後も微生物叢は進化し続け、時間の経過とともに組成が大きく変化することを示している。重要なことに、KOとWTの同腹子の微生物叢は同様に変化したことから、抗生物質投与後の別個の微生物集団の拡大および縮小にTLRシグナル伝達が寄与していないことが示唆された。PC2は、親由来でサンプルを分離した。この場合、KOとWTの同腹子の違いを分析するために、2つの異なる産仔を使用した。同じ産仔のマウスは、定常状態においてより類似した微生物叢を有しており、バンコマイシン処理によって劇的な変化が誘導されたにもかかわらず、異なる産仔のマウスは異なる微生物叢を維持していた。TLR2欠損、TLR5欠損、およびTLR9欠損のコロニーから採取したサンプルを分析した場合も、同様のパターンが観察された。加重UniFrac解析を用いて異なる細菌分類群の相対的存在量を考慮した場合も、同様の結果が得られた（図には描かれていない）。これらの結果から、TLRシグナルは抗生物質投与中または抗生物質投与からの回復後の腸内細菌叢の形成において検出可能な役割を果たしていないことが示唆される。その代わりに、抗生物質投与によって誘発された深刻な変化の余波においても、腸内細菌叢の組成には、微生物叢の母体伝播の影響が圧倒的に大きいことが示唆された。
図7.
抗生物質投与後の糞便微生物叢の全体的な微生物組成に対するTLRシグナル伝達と系統由来の影響。MyD88、TLR2、TLR4、TLR5、またはTLR9 KOマウスとそれぞれのWT/Het同腹子のコロニーから採取した糞便サンプルの重み付けなしのUniFrac解析によるPCoAプロット。マウスはバンコマイシン（vanco）で治療し、糞便サンプルは治療前、バンコマイシン治療後1週間、または抗生物質中止後2週間および4週間後に採取した。記号の形はコロニー内のマウスの異なる産仔を示す。各コロニーには4～7匹のKOマウスと4～7匹のWT/Hetマウスが含まれる。
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考察
腸内細菌叢は糖尿病、肥満、炎症性腸疾患の発症に関与している。粘膜表面の微生物群集を形成し維持するメカニズムを解読することは、ヒトの様々な疾患を予防あるいは改善するためのアプローチを提供する可能性がある。われわれは、TLRシグナルが腸内細菌叢の構成に影響を及ぼすかどうかを明らかにするために、遺伝子欠損を定義したマウスとハイスループットシークエンシング技術を用いた。その結果、5年以上互いに隔離して飼育・繁殖されたWTマウスとMyD88欠損マウス、TLR2欠損マウス、TLR4欠損マウス、TLR5欠損マウス、またはTLR9欠損マウスのコロニーの微生物叢に有意差があることがわかった。しかし、WTマウスとMyD88欠損マウスまたはTLR欠損マウスの同腹仔を注意深く比較すると、MyD88、TLR2、TLR4、TLR5、またはTLR9の欠損は、回腸上皮、回腸内腔、または糞便内腔に関連する微生物叢の組成、豊富さ、または多様性に有意な変化をもたらさないことが実証された。私たちの実験では、恒常的な条件下でも、バンコマイシンによる高用量の腔内抗生物質投与からの回復後でも、TLR欠乏に起因すると考えられる微生物叢の変化は検出されなかった。TLRシグナル伝達とは対照的に、母体由来が、MyD88欠損マウスおよび個々のTLR欠損マウスのコロニーで観察された微生物叢の違いをもたらす主な要因であるようだ。この結果は、Turnbaughら（2009a）による以前の研究と一致しており、この研究では、同じ家族の個体は、血縁関係のない個体よりも類似した微生物叢を持つことが示されている。われわれの結果はWenら（2008）の結果を拡張するもので、母体由来がMyd88欠損よりも微生物叢組成に大きな影響を与えることを示した。興味深いことに、母方の起源が同じであっても、産仔が異なるマウス（Myd88コロニー）では、微生物叢に若干の違いが観察された。成体マウスの微生物叢は安定しているが、母体微生物叢のわずかな時間的変動が子孫の微生物叢の違いにつながる可能性がある。
バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）は、免疫不全患者に全身感染症を引き起こす重要な病原体である。われわれは、VREの腸管支配が同種移植患者の細菌性敗血症につながる可能性があることを示した（Ubeda et al.）小腸のVREコロニー形成は、抗生物質を介した常在菌叢の枯渇によって促進され、経口LPSによるTLR4刺激または全身性フラジェリンによるTLR5刺激は、VREコロニー形成に対する抵抗性を増強する（Brandlら、2008；Kinnebrewら、2010）。これらの結果は、TLRを介したシグナルが腸管内腔の細菌コロニー形成、特に微生物叢の正常な構成要素ではない外因性投与生物による細菌コロニー形成に影響を与える可能性があることを示している。我々の実験では、常在微生物集団の有病率は、恒常性条件下でも抗生物質投与後でも、TLRシグナルによって検出できるほどの影響を受けないことが示されているが、TLRを介したエフェクター機構が、外因性侵入者による腸内定着を抑制し、それによって定住抵抗性に寄与している可能性が高い。
MyD88シグナル伝達は、非肥満性糖尿病（NOD）モデルマウスにおける糖尿病の発症に関与している（Wenら、2008年）。興味深いことに、無菌のMyD88欠損NODマウスは、細菌にコロニー形成されたMyD88欠損NODマウスよりも糖尿病を発症しやすい。MyD88欠損マウスとWT同腹仔マウスの微生物叢の特徴を調べたところ、MyD88欠損マウスでは、ファーミキューテス門とバクテロイデーテス門に属する細菌の比率が有意に低下し、リケネラ科とポルフィロモナド科に属する細菌のコロニーゼーションが増加していた。別の研究では、MyD88-/-マウスにおいて、主に空腸と回腸でSFBの相対量の増加が観察されたが、同腹仔コントロールは用いられなかった（Larsson et al.）これらの細菌分類群は、本研究で用いたマウスの微生物叢に存在していたが、我々のコロニーでは同様の違いは検出されなかった。Wenら（2008）と我々の研究では、マウスの腸内に生息するリケネラ科とポルフィロモナド科の細菌種が異なる可能性があり、我々の結果の違いを説明しているのかもしれない。WTマウスとMyD88欠損同腹仔マウスの回腸および糞便内容物が類似しているという我々の所見は、MyD88欠損マウスとWTマウスの回腸内腔の微生物叢を比較した最近の研究（Vaishnava et al.） Vaishnavaら（2011）は、腸上皮におけるMyD88を介したシグナルが、Reg3γ抗菌タンパク質の発現を誘導することを示した。Reg3γは、小腸の上皮表面から内腔内容物および関連する微生物叢を隔てる約50μmの領域で細菌を標的としている。MyD88欠損マウスとReg3γ欠損マウスは、ともに腸管上皮表面に近接する細菌密度が増加しており、MyD88主導性のReg3γ発現が腸管上皮表面からの細菌の分離を促進していることが示された。グラム陽性菌に対するReg3γの抗菌特異性が知られているのと一致して、Reg3γ欠損マウスでは回腸上皮に関連するグラム陽性菌（SFBとEubacterium rectale）の数が増加した。一方、回腸内腔の微生物叢は、Reg3γ -/-マウスとそのWT同腹子の間で差がなかったことから、TLRおよびMyD88によるReg3γの常在細菌への影響は、腸上皮に隣接した領域に限定されることが示唆された。この結果から、MyD88欠損は、腸壁の近傍や腸管内腔内の異なる細菌分類群の相対的な割合に影響を与えないことが示された。MyD88の欠損は、Reg3γの発現を誘導するだけでなく、他の抗菌エフェクター経路にも影響を及ぼし、より特異性の低い細菌種を抑制する可能性があるため、異なる分類群の相対的な割合はそのまま維持される。
TLR5シグナル伝達は、肥満、インスリン抵抗性糖尿病、高脂血症、肝脂肪症を含むメタボリックシンドロームの発症に関与している（Vijay-Kumarら、2010）。メタボリックシンドロームは、逸脱した施設固有の微生物叢の潜在的影響を排除するために、ジャクソン研究所から入手したマウスに再導入したTLR5欠損マウスでも持続した。再導入されたTLR5 KOマウスとWT同腹仔コントロールマウスを比較したところ、TLR5欠損が腸内細菌叢に及ぼす顕著な影響が明らかになった。さらに、TLR5欠損によって形成された微生物叢は、無菌のWTマウスに養子移入すると、レシピエントマウスにメタボリックシンドロームの多くの側面を誘導することができた。このように、TLR5欠損マウスで形成される微生物叢は、WT同腹仔で形成される微生物叢とは異なり、メタボリックシンドロームの発症につながる可能性がある。私たちは、WTマウスとTLR5 KOマウスの微生物叢の違いを観察しなかったし、TLR5欠損マウスのコロニーでは、肥満や軽度の腸炎症といったメタボリックシンドロームの徴候は見られなかった。このような違いは、異なる動物施設における飼育条件が影響していると考えられる。われわれは、われわれのWTマウスおよびTLR5欠損マウスの微生物叢を、ジャクソン研究所から最近購入したC57BL/6マウスの微生物叢、およびVijay-Kumarら（2010）の研究で報告されたTLR5欠損マウスおよびWTコントロールマウスの微生物叢と比較した。UniFrac解析のPCoAにより、これら3つのマウスコロニー間の明らかな違いが明らかになった（図8）。先に示したように、TLR5欠損はVijay-Kumarら（2010）の研究によるマウスコロニーの微生物叢組成に影響を与えたが、我々のコロニーには影響を与えなかった（図8）。Vijay-Kumarら(2010)の研究でKOマウスとWTマウスで有意差が認められたOTUのほとんどは、我々のマウスコロニーでも検出できたが、遺伝子型の異なるマウスでは相対的な存在量に有意差は認められなかった。したがって、我々の動物施設における飼育条件や外来微生物群への曝露は、WTマウス系統とTLR欠損マウス系統の間で検出可能な差異をもたらさないが、特定の動物施設に特有の条件が、異なるマウスコロニーにコロニーを形成する微生物集団の分岐を促進する可能性がある。このような条件のひとつが、Th17分化を促進することで微生物叢に影響を与える可能性のあるSFBによるコロニー形成かもしれない。SFBがWTマウスやTLR欠損マウスの微生物叢にどの程度影響するかは不明である。我々のTLR欠損マウスのコロニーは、回腸粘膜（彼らの主要な生息地）に関連する細菌の16S配列決定によって決定されるように、SFBでコロニー化されているが、微生物叢分析が管腔サンプルに限定されているため、他の研究で使用されたマウスがSFBでコロニー化されているかどうかは不明である。したがって、TLR5欠損マウスにSFBが存在するかしないかで、結果が異なる可能性がある。
図8.
TLR5シグナル伝達が微生物叢組成に及ぼすハズバンドリーの影響。我々の動物施設で2週間飼育されたJackson LaboratoryのWT B6マウス（n = 4）、我々の動物施設で飼育されたTLR5欠損マウス（n = 6）およびそれぞれのWT同腹仔コントロール（n = 6）、Vijay-Kumarら（2010；n = 5）のTLR5欠損マウスおよびそれぞれのWT同腹仔コントロール（n = 4）の糞便サンプルの重み付けなしUniFrac解析によるPCoAプロット。
TLRシグナル非存在下でも微生物叢が安定しているという観察結果は、腸内に生息する複雑な細菌集団が、少なくとも部分的には自立した均衡を確立していることを示唆している。土壌中の細菌集団など、他の生態系で行われた実験では、生態系が複雑になるほど安定性と回復力が増すことが示されている（Girvan et al.）したがって、TLRシグナル伝達は、複雑でない微生物集団の安定性と回復力に、より大きな影響を与える可能性がある。無菌のTLR欠損マウスに、ASF（変化したシェードラー細菌叢）のような複雑性の低い微生物叢をコロニー形成させることで、この疑問を解決できる可能性がある。結論として、炎症性疾患に関連する微生物叢の変化は、自然免疫シグナル伝達経路に欠損を持つマウス系統で起こりうるし、実際に起こっているという証拠が増えつつあるが（Elinav et al.
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材料と方法
マウスモデルと飼育条件。
すべてのマウス処置は、Memorial Sloan-Kettering Cancer Center（MSKCC）の施設プロトコルガイドラインに従って行われた。マウスは、本研究に特化した実験を記述したMSKCC施設動物ケア委員会（Institutional Animal Care Committee）により承認されたプロトコールのもと、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）の動物ケアガイドラインに従って維持された。TLRシグナル伝達が腸内細菌叢の構成に及ぼす影響を調べるため、C57BL/6J WTマウスと骨髄分化因子欠損マウス（MyD88-/-）を交配させた。ヘテロ接合体（MyD88+/-）マウスを交配し、仔マウスの遺伝子型を決定した。MyD88-/-マウスはWTの同腹子（MyD88+/-またはMyD88+/-）と同居させたまま、離乳時（出生後21日）に、照射した餌と酸性化した水を入れたオートクレーブ滅菌した個別のケージに移した。マウスの腸内細菌叢は少なくとも生後6週齢を超えると安定になることが以前の結果で示されているため、腸内細菌叢解析のために離乳後5～7週齢のマウスを安楽死させた（Buffie et al.）同じMyD88+/-交配ペアから得られた2つの連続した仔マウスを分析した。同様の戦略で、TLR2-/-、TLR4-/-、TLR5-/-、およびTLR9-/-の微生物叢を、それぞれのWT（+/+または+/-）同腹対照と比較した。この場合、産仔は並行繁殖ペアから得た。図および本文中では、親の出自を異なる文字で示す。
前述のコロニーの作製に使用したMyD88-/-マウス、TLR2-/-マウス、およびTLR4-/-マウスは、2000年にイェール大学のMedzhitov研究室から入手した。TLR5-/-およびTLR9-/-マウスは、それぞれ2004年にイェール大学のFlavell研究室から、2003年にInstitut für Mikrobiologie Klinikum recht der Isarから入手した。それぞれのKOマウスは、我々の動物施設に到着後すぐにJackson LaboratoryのC57BL/6マウスに戻し交配され、別々のケージで飼育されてきた。すべてのマウスのコロニーは同じ部屋で、一般に同じラックで維持されてきた。ケージ間での微生物の移行を防ぐため、手袋を交換し、滅菌器具を使用した同じ職員によって維持された。すべてのマウスに放射線照射した餌を与え、オートクレーブ滅菌したケージで飼育した。同腹子の数を増やすため、オスとメスの両方を分析した。性別は微生物組成に影響を与える可能性があるが、同腹マウスの分析から性別による差は無視できる程度であろうことが示唆された。
抗生物質投与を伴う実験では、マウスは上記と同じ条件で個別に飼育された。離乳から5～7週後、マウスはバンコマイシン（1g/リットル）を含む飲料水で1週間処理された。
サンプル収集およびDNA抽出。
腸内細菌叢の多様性に対する同居の交絡効果を避けるため、各マウスコロニーについて、別々に飼育された異なる産仔のマウスからサンプルを収集した。マウスを安楽死させる前に新鮮な便を採取した。マウスを安楽死させた直後、盲腸および小腸（回腸）の遠位3cmの内容物（盲腸の近位最後の1cmを除く）を、手動による押し出しによって回収した。回腸の3cmをPBSで2回洗浄し、回腸上皮からのDNA抽出用に保存した。サンプルは直ちに凍結し、-80℃で保存した。回腸上皮（次項を参照）を除き、DNAは以前に記載されたプロトコール（Turnbaughら、2009a）に基づき、機械的破砕（ビーズビート）を伴うフェノール-クロロホルム抽出技術を用いて抽出した。簡単に説明すると、各サンプルの凍結分画（約100 mg）を、500 μlの抽出バッファー（200 mM Tris, pH 8.0/200 mM NaCl/20 mM EDTA）、210 μlの20% SDS、500 μlのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（24:24:1）、および500 μlの直径0.1 mmのジルコニア/シリカビーズ（BioSpec Products）を含む溶液に、凍結したまま懸濁した。微生物細胞をビーズビーター（BioSpec Products社製）で2分間機械的に破砕し、その後フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出を2回行った。DNAをエタノールで沈殿させ、100μg/mlのRNaseを加えた50μlのTris-EDTA緩衝液に再懸濁した。単離されたDNAは、QIAamp miniスピンカラム（QIAGEN）でさらに精製した。
全ゲノムDNAは、QIAamp DNA単離キット（QIAGEN）と、以前に記載されたプロトコール（Bik et al., 2006）に基づくビーズビーター法を組み合わせて、回腸壁サンプルから抽出した。簡単に言うと、回腸壁断片を180μlのQIAamp ATLバッファーと20μlのプロテイナーゼKで56℃で1時間溶解した。ジルコニア/シリカビーズ（直径0.1mm）を加え、ビーズビーター（BioSpec Products）で2分間ホモジナイズし、さらに56℃で1時間インキュベートした。4μlのRNase A（100 mg/ml）と200μlのALバッファー（QIAGEN）を溶解液に加え、サンプルを70℃で30分間インキュベートした。200μlの絶対エタノールを加えた後、ライセートをQIAampカラムで精製した。
16S rDNA増幅と454/pyrosequencing。
各サンプルについて、精製DNA 50 ng、0.2 mM dNTPs、1.5 mM MgCl2、1.25 U Platinum Taq DNAポリメラーゼ、2.5 μl の10×PCRバッファー、およびV1-V3領域を増幅するように設計された各プライマー0.2 μMを含む25μlのPCRを3回繰り返し行った（Buffie et al、 2012): 454Lib-LプライマーB（下線）とユニバーサル細菌プライマー8F（斜体）からなる修飾プライマー8F（5′-CCTATCCTGTGTTGGCAGTCTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）；および修飾プライマー534R（5′-CCATCCATCCTGCGTTCCGACCTCAGNNNNNNNNATACGCGCGCTGCTGCTGG-3′）は、454 Lib-LプライマーA（下線）、ユニークな6塩基または7塩基のバーコード（Ns）、および広域細菌プライマー534R（斜体）の複合体である。サイクリング条件は、94℃で3分間、続いて94℃で30秒間、56℃で30秒間、72℃で1分間のサイクルを23サイクル（盲腸および糞便サンプル）、25サイクル（回腸内容物サンプル）、30サイクル（回腸壁サンプル）行った。PCRの複製をプールし、QIAquick PCR Purification kit（QIAGEN）を用いてアンプリコンを精製した。PCR産物は454 GS FLX Titaniumプラットフォームで454 Roche推奨の手順に従って塩基配列を決定した。配列はNCBIのSequence Read Archiveに投稿番号SRA052529で寄託されている。
配列解析。
配列データはmothur (Schloss et al., 2009)を用いて編集・処理した。配列は標準的なFASTA形式に変換した。300bpより短い配列、未確定の塩基を含む配列、または8bpより長いホモポリマーストレッチを含む配列、フォワードプライマーまたはバーコードと完全に一致しない配列、または適切な16s rRNA可変領域と一致しない配列は解析に含めなかった。454の塩基品質スコアは0～40（0はあいまいな塩基）で、50塩基のウインドウの最小平均品質スコアが30を下回らないように、スライディングウインドウ法を用いて配列をトリミングした。この基準を満たすまで、配列は3′末端からトリミングされた。SILVA reference alignment (Pruesse et al., 2007)とNeedleman-Wunschアルゴリズムをテンプレートとして、デフォルトのスコアリングオプションで16S rRNA遺伝子に配列をアライメントした。キメラの可能性がある配列はChimeraSlayerプログラム（Haas et al.）微生物多様性の過大評価におけるパイロシーケンスエラーの影響を最小限に抑えるため（Huse et al., 2010）、高存在配列と1塩基または2塩基で異なる希少存在配列は、mothurのpre.clusterオプションを使用して高存在配列にマージした。配列は平均近傍アルゴリズムを用いてOTUにグループ化された。距離ベースの類似度が97％以上の配列は同じOTUに割り当てられた。OTUベースの微生物多様性は、シャノン多様性指数またはチャオ指数（Magurran, 2004）を計算して推定した。各配列の系統分類は、Wang et al. (2007)のベイズ分類アルゴリズムを用い、ブートストラップカットオフを60%として行った。ほとんどの場合、属レベルに分類できた。また、マウスの餌に含まれるViridiplantaeであるStreptophytaに分類された配列（Ubeda et al.
本研究の塩基配列（図8）とVijay-Kumarら（2010）の塩基配列を比較する際、両データセットの塩基配列間で共有されている16s rRNAの領域（V1-V2）のみを解析に使用した。異なる実験からの配列内の重複領域を増やすため、また、我々の配列はV3領域から得られたため、上述の300bpではなく、350bpより長い我々の研究からの配列のみをこの解析に含めた。ほとんどの配列は350bpより長かった。
ツリー構築とUniFrac解析。
mothurによって生成された16s rRNA配列アラインメントに対して、clearcut (Sheneman et al., 2006)を用いて系統樹を推定した。得られた木を用いて重み付けなしまたは重み付けありのUniFracを実行した。得られた各サンプル間の距離行列に対してPCoAを実行した。
微生物叢組成に対するTLR欠損または家族由来の寄与の違いを比較するために（図1 B）、コロニー内の各マウスについて、（a）同じ遺伝子型を持つ同じ子マウス、（b）異なる遺伝子型を持つ同じ子マウス、または（c）異なる子マウスに属するそのコロニー内の他のすべてのマウスに対するUniFrac距離の平均値を計算し、プロットした。
統計解析。
KOマウスとそのWT同腹子の間で細菌分類群に統計学的に有意な差があるかどうかを判定するため、両条件で平均数が5未満の細菌分類群を除去し、対数変換した計数データにStudentのt検定を適用した。カウントデータはDESeq Rパッケージ（Anders and Huber, 2010）を用いてリスケーリングした。多重仮説検定を調整するために、Benjamini and Hochberg (1995)によるFDRアプローチを使用し、fdr.Rパッケージを使用した。最終結果は、p値<0.05、FDR≤0.1のフィルターをかけた。同じ統計解析を、異なる産仔のマウス間の差異を決定するために適用した。各コロニーで最も大きい2つの産仔について、その細菌分類群（Myd88については産仔B1とB2、TLR2については産仔BとC、TLR4については産仔EとF、TLR5については産仔BとD、TLR9については産仔AとD）の違いを分析した。
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謝辞
本研究は、Cancer Research Instituteからの博士研究員賞およびスペインMICINN C.からの助成金SAF2011-29458の支援を受けた。Ubeda、およびE.G. Pamerに対する米国国立アレルギー・感染症研究所（National Institute of Allergy and Infectious Disease）の助成金R01-AI042135により行われた。
著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言している。
以下参照：
脚注
使用した略語
FDR
偽発見率
NOD
非肥満性糖尿病
OTU
運用分類単位
PCoA
主座標分析
rRNA
リボソームRNA
SFB
分節化糸状菌
TLR
トール様受容体
UPGMA
算術平均による非加重ペアグループ法
VRE
バンコマイシン耐性腸球菌
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参考文献
Anders S., Huber W. 2010. 配列数データに対する差次的発現解析。ゲノム生物学 11:R106 10.1186/gb-2010-11-10-r106 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Antonopoulos D.A., Huse S.M., Morrison H.G., Schmidt T.M., Sogin M.L., Young V.B. 2009. 抗生物質擾乱後の消化管微生物叢の再現可能な群集動態。Infect. Immun. 77:2367-2375 10.1128/IAI.01520-08 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Benjamini Y., Hochberg Y. 1995. 偽発見率のコントロール： (1)萌芽的研究(2)萌芽的研究. J. R. Stat. シリーズB 57:289-300 [Google Scholar].
Bik E.M., Eckburg P.B., Gill S.R., Nelson K.E., Purdom E.A., Francois F., Perez-Perez G., Blaser M.J., Relman D.A. 2006. ヒト胃内細菌叢の分子生物学的解析。Proc. Natl. Sci. USA. 103:732-737 10.1073/pnas.0506655103 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
を利用したバンコマイシン耐性腸球菌の感染経路の解明。バンコマイシン耐性腸球菌は、抗生物質によって誘発された自然免疫障害を悪用する。Nature. 455:804-807 10.1038/nature07250 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Buffie C.G., Jarchum I., Equinda M., Lipuma L., Gobourne A., Viale A., Ubeda C., Xavier J., Pamer E.G. 2012. クリンダマイシン単回投与後の腸内細菌叢の顕著な変化により、クロストリジウム・ディフィシル誘発性大腸炎への感受性が持続する。Infect. Immun. 80:62-73 10.1128/IAI.05496-11 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Dethlefsen L., Relman D.A. 2011. ヒト遠位腸内細菌叢の抗生物質の反復擾乱に対する不完全な回復と個別反応。Proc. Natl. Acad. Sci. 108:4554-4561 10.1073/pnas.1000087107 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
デスレフセンL.、ヒューズS.、ソギンM.L.、レルマンD.A. 2008. ヒトの腸内細菌叢に及ぼす抗生物質の広範な影響、16S rRNA塩基配列決定により明らかに。(1)ヒトの腸内細菌叢がヒトの腸内細菌叢に及ぼす影響(2)ヒトの腸内細菌叢がヒトの腸内細菌叢に及ぼす影響(3)ヒトの腸内細菌叢がヒトの腸内細菌叢に及ぼす影響(4).
Donskey C.J., Chowdhry T.K., Hecker M.T., Hoyen C.K., Hanrahan J.A., Hujer A.M., Hutton-Thomas R.A., Whalen C.C., Bonomo R.A., Rice L.B. 2000. 大腸菌感染患者の便中バンコマイシン耐性腸球菌密度に対する抗生物質療法の効果。N. Engl. 343:1925-1932 10.1056/NEJM200012283432604 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Eckburg P.B.、Bik E.M.、Bernstein C.N.、Purdom E.、Dethlefsen L.、Sargent M.、Gill S.R.、Nelson K.E.、Relman D.A. 2005年。ヒト腸内細菌叢の多様性。Science. 308:1635-1638 10.1126/science.1110591 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Elinav E., Strowig T., Kau A.L., Henao-Mejia J., Thaiss C.A., Booth C.J., Peaper D.R., Bertin J., Eisenbarth S.C., Gordon J.I., Flavell R.A. 2011. NLRP6 インフラマソームは、大腸微生物の生態系と大腸炎のリスクを制御する。Cell. 145:745-757 10.1016/j.cell.2011.04.022 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
ガーナーC.D.、アントノプロスD.A.、ワグナーB.、デュハメルG.E.、ケレシュテスI.、ロスD.A.、ヤングV.B.、アルティエC. 2009年。Salmonella Enterica serovar typhimuriumマウス感染モデルにおいて、ストレプトマイシンによる小腸微生物生態の撹乱は病理学的変化をもたらす。Infect. Immun. 77:2691-2702 10.1128/IAI.01570-08 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
ギャレットW.S.、ロードG.M.、プニットS.、ルゴ-ヴィラリーノG.、マズマニアンS.K.、伊藤聡、グリックマンJ.N.、グリムシャーL.H.2007年。自然免疫系のT-bet欠損によって誘発される伝染性潰瘍性大腸炎。Cell. 131:33-45 10.1016/j.cell.2007.08.017 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Girvan M.S., Campbell C.D., Killham K., Prosser J.I., Glover L.A. 2005. 細菌の多様性は、摂動後の群集の安定性と機能回復力を促進する。Environ. Microbiol. 7:301-313 10.1111/j.1462-2920.2005.00695.x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Haas B.J., Gevers D., Earl A.M., Feldgarden M., Ward D.V., Giannoukos G., Ciulla D., Tabbaa D., Highlander S.K., Sodergren E., et al. サンガーおよび454-パイロシーケンスPCRアンプリコンにおけるキメラ16S rRNA配列の形成と検出。ゲノム研究 21:494-504 10.1101/gr.112730.110 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Hill D.A., Artis D. 2010. 腸内細菌と免疫細胞恒常性の制御。Annu. Rev. Immunol. 28:623-667 10.1146/annurev-immunol-030409-101330 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
2010年、Hill D.A.、Hoffmann C.、Abt M.C.、Du Y.、Kobuley D.、Kirn T.J.、Bushman F.D.、Artis D. メタゲノム解析により、抗生物質が誘発する腸内細菌叢の時間的・空間的変化と、それに伴う免疫細胞のホメオスタシスの変化が明らかになった。Mucosal Immunol. 3:148-158 10.1038/mi.2009.132 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Hooper L.V., Midtvedt T., Gordon J.I. 2002. 宿主と微生物の相互作用はどのように哺乳類の腸の栄養環境を形成するか。Annu. Nutr.22:283から307 10.1146/annurev.nutr.22.011602.092259[PubMed][CrossRef][Googleスカラー]。
Huse S.M., Welch D.M., Morrison H.G., Sogin M.L. 2010. OTUクラスタリングの改善による希少生物圏のしわ寄せ。Environ. Microbiol. 12:1889-1898 10.1111/j.1462-2920.2010.02193.x [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Jernberg C., Löfmark S., Edlund C., Jansson J.K. 2007. 抗生物質投与がヒト腸内細菌叢に及ぼす長期的な生態学的影響。ISME J. 1:56-66 10.1038/ismej.2007.3 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Jernberg C., Löfmark S., Edlund C., Jansson J.K. 2010. ヒト腸内細菌叢における抗生物質曝露の長期的影響。微生物学。156:3216-3223 10.1099/mic.0.040618-0 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Kinnebrew M.A., Ubeda C., Zenewicz L.A., Smith N., Flavell R.A., Pamer E.G. 2010. 細菌フラジェリンは、バンコマイシン耐性腸球菌感染に対するToll様受容体5依存性の防御を刺激する。J. Infect. Infect. 201:534-543 10.1086/650203 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Larsson E., Tremaroli V., Lee Y.S., Koren O., Nookaew I., Fricker A., Nielsen J., Ley R.E., Bäckhed F. 2012. 腸の長さに沿った宿主遺伝子発現の腸内微生物制御と、MyD88を介した腸内微生物生態制御の解析。Gut. 61:1124-1131 10.1136/gutjnl-2011-301104 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
2005年、Ley R.E.、Bäckhed F.、Turnbaugh P.、Lozupone C.A.、Knight R.D.、Gordon J.I.。肥満は腸内微生物の生態系を変化させる。Proc. Natl. Sci. USA. 102:11070-11075 10.1073/pnas.0504978102 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Lozupone C., Knight R. 2005. UniFrac：微生物群集を比較するための新しい系統発生学的手法。微生物群集を比較するための新しい系統学的手法。Microbiol. 71:8228-8235 10.1128/AEM.71.12.8228-8235.2005 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Magurran A.E. 2004. 生物多様性の測定. Blackwell Publishing, Oxford, UK: 256 pp [Google Scholar].
Pruesse E., Quast C., Knittel K., Fuchs B.M., Ludwig W., Peplies J., Glöckner F.O. 2007. SILVA：ARBと互換性のある品質チェック済みリボソームRNA配列データの包括的オンラインリソース。このデータベースは、RNA配列のアラインメントを行い、ARBと互換性のあるリボソームRNA配列データを収集したものである。
ラコフ・ナホウム S., パグリーノ J., エスラミ・ヴァルザネ F., エドバーグ S., メジトフ R. 2004. Toll様受容体による常在細菌叢の認識は、腸の恒常性維持に必要である。Cell. 118:229-241 10.1016/j.cell.2004.07.002 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
(注1)本データは、本書刊行時点の情報に基づいて作成したものです。微生物群集の記述と比較のための、オープンソース、プラットフォーム非依存、コミュニティ支援型ソフトウェア。Appl. Microbiol. 75:7537-7541 10.1128/AEM.01541-09 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Sekirov I., Tam N.M., Jogova M., Robertson M.L., Li Y., Lupp C., Finlay B.B. 2008. 腸内細菌叢の抗生物質誘発性擾乱は、腸内感染に対する宿主の感受性を変化させる。Infect. Immun. 76:4726-4736 10.1128/IAI.00319-08 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
シェネマンL., エヴァンスJ., フォスターJ.A. 2006. Clearcut：緩和近傍結合の高速実装。Bioinformatics. このような場合、「逐次処理」を行う必要があるため、「逐次処理」を行う前に、「逐次処理」を行う前に、「逐次処理」を行う前に、「逐次処理」を行う前に、「逐次処理」を行う前に、「逐次処理」を行う必要がある。
Spor A., Koren O., Ley R. 2011. 環境と宿主の遺伝子型が腸内細菌叢に及ぼす影響の解明。Nat. Rev. Microbiol. 9:279-290 10.1038/nrmicro2540 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Stappenbeck T.S., Hooper L.V., Gordon J.I. 2002. パネス細胞を介した常在微生物による腸管新生の発生制御。Proc. Natl. Acad. Sci. 99:15451-15455 10.1073/pnas.202604299 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
鈴木一彦、Meek B.、土井裕之、村松正樹、千葉崇、本庶隆、Fagarasan S. 2004. IgA欠損腸管における分割型糸状菌の異常増殖。Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101:1981-1986 10.1073/pnas.0307317101 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
ターンボーP.J.、ハマディM.、ヤツネンコT.、カンタレルB.L.、ダンカンA.、レイR.E.、ソギンM.L.、ジョーンズW.J.、ローB.A.、アフォーリットJ.P.、他2009a. 肥満と痩身の双生児におけるコア腸内細菌叢。Nature. 457:480-484 10.1038/nature07540 [PMCフリー記事] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Turnbaugh P.J., Ridaura V.K., Faith J.J., Rey F.E., Knight R., Gordon J.I. 2009b. ヒト腸内細菌叢に対する食事の影響：ヒト化グノトビオティックマウスにおけるメタゲノム解析。Sci. Transl. Med. 1:6ra14 10.1126/scitranslmed.3000322 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Ubeda C., Taur Y., Jenq R.R., Equinda M.J., Son T., Samstein M., Viale A., Socci N.D., van den Brink M.R., Kamboj M., Pamer E.G. 2010. バンコマイシン耐性腸球菌による腸内細菌叢の支配は、マウスでの抗生物質投与によって可能となり、ヒトでは血流浸潤に先行する。J. Clin. Invest. 120:4332-4341 10.1172/JCI43918 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Vaishnava S., Yamamoto M., Severson K.M., Ruhn K.A., Yu X., Koren O., Ley R., Wakeland E.K., Hooper L.V. 2011. 抗菌レクチンRegIIIγは、腸内における微生物叢と宿主の空間的分離を促進する。Science. (注1)本学会は、平成23年4月1日から平成24年3月31日までの間に、本学会が主催する「平成23年度科学研究費補助金(基盤研究(B))」に採択されました。
Vijay-Kumar M., Aitken J.D., Carvalho F.A., Cullender T.C., Mwangi S., Srinivasan S., Sitaraman S.V., Knight R., Ley R.E., Gewirtz A.T. 2010. Toll様受容体5欠損マウスにおけるメタボリックシンドロームと腸内細菌叢の変化。Science. 328:228-231 10.1126/science.1179721 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Vollaard E.J., Clasener H.A. 1994. コロニー形成抵抗性。Antimicrob. Agents Chemother. 38:409-414 10.1128/AAC.38.3.409 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Wang Q., Garrity G.M., Tiedje J.M., Cole J.R. 2007. このような環境下での生物多様性保全は、生物多様性保全の重要な課題である。Appl. Environ. Microbiol. 73:5261-5267 10.1128/AEM.00062-07 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Wen L., Ley R.E., Volchkov P.Y., Stranges P.B., Avanesyan L., Stonebraker A.C., Hu C., Wong F.S., Szot G.L., Bluestone J.A., et al. 1型糖尿病の発症における自然免疫と腸内細菌叢。Nature. 455:1109-1113 10.1038/nature07336 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
Wu H.-J., Ivanov I.I., Darce J., Hattori K., Shima T., Umesaki Y., Littman D.R., Benoist C., Mathis D. 2010. 腸内常在分化糸状菌がTヘルパー17細胞を介して自己免疫性関節炎を引き起こす。Immunity. 32:815-827 10.1016/j.immuni.2010.06.001 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
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