肥満細胞は免疫感知と抗原回避行動を結びつける

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出版：2023年7月12日
肥満細胞は免疫感知と抗原回避行動を結びつける

https://www.nature.com/articles/s41586-023-06188-0

トーマス・プラム
レベッカ・ビンズバーガー
...
ハンス-ライマー・ローデヴァルト
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ネイチャー (2023)この記事を引用する
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指標詳細
要旨
肥満細胞の生理的機能については、いまだ謎の部分が多い。バリア障害において、肥満細胞は2型免疫に組み込まれ、免疫グロブリンE（IgE）とともにアレルギー疾患を促進する。しかしながら、アレルギー症状は、アレルゲン、毒素、寄生虫の排出を促進し、将来の抗原回避の引き金となる可能性がある1,2,3。ここで我々は、近交系マウスにおける抗原特異的回避行動4,5が、マスト細胞に決定的に依存していることを示す。つまり、抗原認識と回避行動を結びつける免疫学的センサー細胞を同定したのである。回避行動により、胃と小腸における抗原を介した適応免疫、自然免疫、粘膜免疫の活性化と炎症が抑制された。回避行動はIgE依存性であり、免疫段階ではTh2サイトカインによって、実行段階ではIgEによって促進された。胃と小腸を覆う粘膜肥満細胞は、抗原摂取を速やかに感知した。我々は、変異マウス、薬理学的阻害、神経活動記録、迷走神経切開を用いて、肥満細胞と脳との間の潜在的なシグナル伝達経路を調べた。ロイコトリエン合成を阻害すると回避が阻害されたが、全体的には、単一の経路を遮断しても回避が完全に阻害されることはなく、複雑な制御が行われていることが示された。これらを総合すると、抗原回避の舞台は、適応免疫が過去の免疫反応の証として肥満細胞にIgEを装備させた時に整う。その後抗原を摂取すると、肥満細胞は抗原摂取の終了を知らせる。マスト細胞を介した抗原回避行動によって、それ自体は無害な抗原に対する免疫病理の原因となる連続的で無益な反応や、毒素の反復摂取を防ぐことは、免疫の重要な一手段であると考えられる。
主なもの
肥満細胞は、内外の環境にさらされたバリア組織に存在する造血細胞である6。肥満細胞は、免疫グロブリンE（IgE）媒介性アレルギーにおける役割で最もよく知られており、世界人口の40％に影響を及ぼしている7。タイプ2の免疫応答は、バリアが破壊され、寄生虫を含む感染性病原体や、アレルゲンまたは毒素と総称される、組織を損傷する、または無害なタンパク質抗原が侵入した場合に起こる。特にインターロイキン(IL)-4が関与するタイプ2免疫応答は、免疫グロブリンのクラススイッチを抗原特異的IgEへと組み替え、マスト細胞発現の高親和性IgEレセプター(FcεRI)に結合させる。抗原に再接続されると、肥満細胞はプロテアーゼ、ヒスタミン、セロトニン、ロイコトリエンなどのメディエーターを放出し、アレルギー病態の一因となる。IgEを介したアレルギーにおける肥満細胞の役割は、もともと寄生虫に対する免疫経路を用いた過剰反応によるものと考えられることが多い8。この見解とは対照的に、Margie Profet1氏は、急性アレルギー反応、例えばくしゃみ、咳、嘔吐、下痢は、毒素やアレルゲンを速やかに排出する役割を果たしているのではないかという仮説を提唱した。さらに、これらの症状は原因を認識するのに役立ち、将来のアレルゲンや毒素の回避を可能にする1。抗原回避行動の証拠が報告され4,5、この概念1が拡大されているが2,3、「回避の免疫学」はこの分野に入っていない。さらに、この行動適応における細胞および分子の基盤、特に肥満細胞の役割については、十分に理解されていない。
ここでわれわれは、肥満細胞とIgEがタンパク質回避行動の促進に重要な役割を果たしていることを明らかにする。胃と小腸を覆う粘膜肥満細胞は、摂取した抗原に素早く反応する。マスト細胞を保有するマウス（マスト細胞欠損マウスは保有しない）は、その後、無撹乱行動条件下で抗原を含む水か含まない水を自由に選択させると、抗原の取り込みを回避する。この知見は、回避行動のシグナルとして肥満細胞が重要な保護的役割を担っていることを示しており、そのシグナルに従えば、免疫系と無害な物質との度重なる接触によって引き起こされる炎症を予防または軽減することができる。IgEが出現する以前から、動物の進化においてマスト細胞が顕著に保存されていることは、回避行動が免疫防御の基本的な様式である可能性を示している。
肥満細胞は抗原回避行動に必須である
我々は、Caraら4が行った飲物回避試験を応用し、遺伝的に肥満細胞を欠損させたマウスを用いた9。野生型BALB/c Cpa3+/+および肥満細胞欠損BALB/c Cpa3Cre/+マウス9に、アジュバントとして水酸化アルミニウム（ミョウバン）と複合体化したOVA（OVA-alum）を0日目と14日目に腹腔内注射することにより、モデルタンパク質抗原であるオバルブミン（OVA）に対する全身性免疫応答を誘導した（図1a）。Tヘルパー2型になりやすいBALB/cマウスでは、これによって強固なOVA特異的IgE抗体応答が誘導される（図1f）。対照動物にはミョウバンのみを投与した。20日目から、マウスを忌避試験にかけた。この忌避試験は、マウスが普通の水よりも卵白水（8％のスクロースとOVA源として20％の卵白を水に加えたもの）を好むかどうかに基づいている。
図1：2型免疫マウスにおける抗原回避行動にはマスト細胞が必須である。
a,b,2型免疫スキーム、回避試験の実験スケジュール（a）、ボトル位置決めを行ったインテリケージのセットアップ（b）。c,ミョウバン免疫マウスおよびOVAミョウバン免疫BALB/c Cpa3+/+マウスとCpa3Cre/+マウスの卵白水嗜好性を、実験1および2の過程における全水摂取量に対する卵白水摂取量の割合で表示（カラースケールは割合を示す）。d,卵白水の嗜好性は、舐めた水の総数に対する舐めた卵白水の数として表示した。データは平均値±s.e.m.で示した。 e, 卵白水嗜好性は、実験期間中の1日あたりの平均として、総水摂取量に対する卵白水摂取量の割合で示した。 f,g, インテリケージ実験終了時に測定した抗OVA IgE（f）および抗OVA IgG1（g）の血清量。h-j、インテリケージ実験終了時に測定した胃肥満細胞の絶対数（h）、全生細胞中の小腸上皮内肥満細胞の頻度（i）および小腸固有層肥満細胞の頻度（j）。バーは平均値を表し、各ドットは1匹のマウスに対応する。c-jでは、Cpa3+/+ミョウバン（c-hではn=13、iではn=12、jではn=13）；Cpa3+/+ OVA-ミョウバン（c-hではn=16、iではn=15、jではn=16）； Cpa3Cre/+ミョウバン（c-hはn=9匹、iはn=7匹、jはn=9匹）；Cpa3Cre/+ OVA-ミョウバン（c-hはn=13匹、iはn=11匹、jはn=13匹）。統計解析は、Tukey多重比較検定を用いた一元配置分散分析を用いて行った(e-j)。i.p.は腹腔内。
出典データ
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行動アッセイは環境の影響やマウスの社会的ウェルビーイングに敏感であるため、混合実験群で構成されるマウスの大規模コホート（1ケージあたり13～16匹）をインテリケージに収容した（図1b）。このシステムは、偏りのない自然行動を途切れることなく評価できる（Methods）。ケージには8本の飲料ボトルが備え付けられており、そのうち4本には卵白水、4本には普通の水が入っていた（図1b）。実験中、マウスは卵白水と普通の水を自由に選ぶことができた。個々の飲水嗜好は継続的に記録された。非免疫マウス（ミョウバン）は、肥満細胞（Cpa3+/+）の有無（Cpa3Cre/+）にかかわらず、12日間の測定期間中、卵白水を強く好んだ（図1c-e）。対照的に、免疫Cpa3+/+マウスは1日目から5日目にかけて卵白水を避けるようになり、その後はほとんど普通の水しか飲まなくなった。したがって、以前のデータ4と同様に、Cpa3+/+マウスは非免疫時には卵白水を選ぶが、免疫時には普通の水を選ぶ。回避マウスは正常な運動（ケージコーナーへの訪問回数；図示せず）を示し、病気の徴候は見られなかった。Cpa3+/+マウスとは著しく対照的に、肥満細胞欠損Cpa3Cre/+マウスは、免疫しても卵白水を避けることができなかった（図1c-e）。このことは、肥満細胞の排他的な機能、すなわち抗原回避行動には他の免疫細胞や非免疫細胞では補えない機能があることを示している。
要約すると、非免疫マウスは水よりも卵白水を好んだのに対し、免疫マウスは卵白水を敬遠した。さらに、Cpa3Cre/+ミョウバンマウスとCpa3Cre/+ OVA-ミョウバンマウスの間で、卵白水をより好む傾向が観察されたことから、OVA回避反応のごく一部が免疫に依存し、肥満細胞に依存しない可能性が示された（図1d）。
肥満細胞は不安様行動10に関連しており、Cpa3Cre/+変異マウスの行動解析を妨害する可能性がある。このような潜在的な欠損をコントロールするために、高架式プラス迷路（Extended Data Fig.1a-d）、オープンフィールド試験（Extended Data Fig.1e-i）、明暗試験（Extended Data Fig.1j-m）、ホームケージモニタリングシステム（Extended Data Fig.1n-s）での24時間の行動記録（Extended Data Fig.1n-s）で、不安関連行動と一般行動を評価した。これらのアッセイはいずれも肥満細胞欠損マウスと野生型同腹マウスを区別しなかったことから、Cpa3Cre/+マウスにはこれらのアッセイで測定可能な行動障害がなく、飲酒回避実験を混乱させる可能性がないことが示された。
免疫した肥満細胞欠損Cpa3Cre/+マウスにOVA回避がみられなかったのは、野生型同腹子と比較してOVA特異的IgEおよびIgG1抗体価が低下していたためではなかった（図1f,g）。嫌悪の発現は、野生型マウスの胃と小腸における肥満細胞の顕著な蓄積と関連していた（図1h-j）。小腸上皮内肥満細胞の増加が最も顕著であったのに対し、小腸固有層肥満細胞の増加はそれほど顕著ではなかった（図1i,j）。予想通り、Cpa3Cre/+マウスでは、これらの組織の肥満細胞数はごくわずかであった（図1h-j）。
マスト細胞の欠如に加えて、Cpa3Cre/+マウスでは好塩基球の数が正常の約40％に減少している9。好塩基球の役割を解明するために、好塩基球欠損Mcpt8-Creマウスを分析した（Extended Data Fig.2）。マウスには、卵白水と普通の水の2つのボトルを与えた（2ボトルテスト）。Mcpt8-Creマウスでは卵白水の忌避は損なわれず（拡張データ図2a,b）、免疫後も好塩基球欠損のままであった（拡張データ図2c,d）。胃の肥満細胞数の減少を除き、すべてのパラメータ（小腸の肥満細胞、抗OVA IgG1およびIgE）は好塩基球欠損マウスと野生型マウスの間で区別がつかなかった（Extended Data Fig.） したがって、好塩基球は回避行動には関与していない。
抗原回避行動におけるIgEの役割
マスト細胞は、高親和性IgE受容体（FcεRI）を介した抗原やIgEによって活性化されるだけでなく、IgE以外の刺激によっても活性化される11。我々は、抗原回避行動における IgE の役割を検証した。BALB/c野生型（Igh-7+/+）およびIgE欠損（Igh-7-/-）11マウスにOVA-ミョウバンまたはミョウバン単独を免疫し（図1a）、回避アッセイを行った（図1b）。ミョウバン免疫Igh-7+/+およびIgh-7-/-マウスとは対照的に、OVA-ミョウバン免疫Igh-7+/+マウスは卵白水を忌避した。IgE欠損Igh-7-/-マウスは回避しなかった（図2a-c）。予想通り、Igh-7-/-マウスは抗OVA IgEを産生できなかったが、抗OVA IgG1は産生した（図2d,e）。したがって、抗原回避行動にはIgEと肥満細胞の両方が必須である。
図2：回避免疫におけるIgEの役割。
a-c,ミョウバン免疫およびOVAミョウバン免疫BALB/c Igh-7+/+およびIgh-7-/-マウスの卵白水嗜好性を、インテリケージ実験(a)の期間中、全水摂取量に対する卵白水摂取量の割合で表示した（カラースケールはパーセンテージを示す）。各行は個々のマウスに対応している。灰色のフィールドは、1日間トランスポンダーを失ったため測定ができなかったマウスを示す。 b, aのデータを、舐めた水の総量に対する卵白の舐めた水の量として、時間に対して表示した。d,e, 実験終了時の抗 OVA IgE (d)および抗 OVA IgG1 (e)の血清量。f,g, BALB/c Cpa3+/+およびCpa3Cre/+マウスは、0日目と9日目にマウス抗OVAモノクローナルIgE抗体を投与され、10日目から回避試験（図1bと同じインテリケージ）に供された（Methods）。h,i, 実験終了時の全生細胞中の胃肥満細胞の絶対数（h）および小腸上皮内肥満細胞の頻度（i）。j,k, OVAまたはコントロールタンパク質（BSA）を胃内投与（i.g.）した後のIgE感作BALB/c Cpa3+/+マウスの胃（j）および小腸上皮内（k）肥満細胞における肥満細胞活性化の指標であるCD63の発現。データは平均値±s.e.m.で示した。a-eについては、Igh-7+/+ミョウバン（n＝3匹）；Igh-7+/+ OVA-ミョウバン（n＝7匹）；Igh-7-/-ミョウバン（n＝6匹）；Igh-7-/- OVA-ミョウバン（n＝14匹）。f-iについては、Cpa3+/+（n = 7）；Cpa3Cre/+（n = 6）。j-lについては、Cpa3+/+ IgE/BSA（n = 6）；Cpa3+/+ IgE/OVA（n = 5）；Cpa3+/+ OVA-alum/OVA（n = 2）。統計解析は、Tukey多重比較検定を用いた一元配置分散分析（c-e）および両側Studentのt検定（g-k）を用いて行った。正確なP値を示す。MFI、平均蛍光強度。
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免疫のない状態でIgEが十分であるかどうかを調べるため、モノクローナル抗OVA IgEをBALB/cマウスに注射した。その結果、野生型マウスは部分的に感作されたが、肥満細胞欠損マウスは感作されなかった（図2f,g）。7匹の野生型マウスのうち4匹は、程度の差こそあれ回避を示した（図2f,g）。注目すべきは、IgEの移入後、胃および小腸の肥満細胞レベルは上昇しなかったことである（受動感作の場合、図2h,i；能動免疫の場合、図1h,i）。部分的回避反応（図2f,g）と一致して、OVA接触で胃肥満細胞の活性化を示したマウスは半数に過ぎなかったが（図2j）、小腸上皮肥満細胞の活性化を示したマウスはいなかった（図2k）。さらに、IgE導入ではなく能動免疫により、BALB/cマウスは胃内OVA塗布でアナフィラキシー（体温低下に基づく）を感作した（図2l）。したがって、モノクローナルIgE移入は回避行動を部分的に誘導することができる。しかし、肥満細胞の完全な活性化と回避を達成するには、免疫化が必要かもしれない。
Th2サイトカインは抗原回避行動を促進する
我々は、肥満細胞を持つ（C57BL/6 Cpa3+/+）、あるいは持たない（C57BL/6 Cpa3Cre/+）Th1-biased株を、抗原回避行動反応を起こす能力に関して分析した。スクロース12に対する感受性が高いため、わずか1％（BALB/c実験では8％）でも、OVA-アルム免疫C57BL/6 Cpa3+/+マウスの1匹を除くすべてが卵白水を好んだ（Extended Data Fig.） しかし、ショ糖濃度が低い場合（0.25％）、C57BL/6 Cpa3+/+マウスでは回避行動が明らかになり（Extended Data Fig.3b,e）、C57BL/6 Cpa3Cre/+マウスでは肥満細胞依存性が見られた（Extended Data Fig.3b,e）。ミョウバンのみで免疫したC57BL/6マウスでは抗原回避は観察されなかった（Extended Data Fig.）
C57BL/6マウスには、各回免疫の2日後にTh2促進および肥満細胞促進サイトカインカクテルを注射した（Methods）。この処置は回避反応を増強したが、この反応は依然として肥満細胞とOVA免疫に依存していた（Extended Data Fig.） BALB/cマウスの回避反応と比較すると、C57BL/6マウスの回避反応はサイトカイン刺激下でもあまり顕著ではなかった（図1c vs 拡張データ図3c）。OVA特異的IgEレベルと胃肥満細胞数は同程度であったが（図1f,hと拡張データ図3g,h）、小腸上皮内肥満細胞レベルは、サイトカイン刺激C57BL/6マウス（拡張データ図3i）と比較して、BALB/cマウスでは約8倍高かった（図1i）。免疫したC57BL/6マウスにOVAを経口投与すると、胃と小腸の両方の肥満細胞が活性化されたが（Extended Data Fig. まとめると、Th2サイトカインは、OVAを免疫したTh1傾向のC57BL/6マウスにおいて、肥満細胞依存性の回避行動を促進する。しかし、BALB/c系統（図2l）とは対照的に、OVA免疫C57BL/6マウスは経口抗原チャレンジによるアナフィラキシーに抵抗性であった。
抗原回避は炎症を防ぐ
回避および非回避の条件下で、胃および小腸を中心に消化管における免疫学的結果を調べた。この目的のために、野生型BALB/cマウスを免疫し、2瓶試験（「回避」）またはOVA経口投与（「非回避」）のいずれかを最長16日間行った（Methods）（Extended Data Fig.） 肥満細胞欠損BALB/cマウスも同じプロトコールに供した。予想通り、野生型マウスは卵白水を回避したのに対し、肥満細胞欠損マウスは2瓶試験で卵白水を好んだ（Extended Data Fig.4b）。OVAを強制経口摂取させた野生型マウスは下痢を起こしたが、肥満細胞欠損マウスは1匹を除いてOVA経口摂取後も健康であった（Extended Data Fig. 下痢の発生は、非回避条件下での炎症および免疫学的プロセスの誘導を示唆した。実際、胃と小腸の好中球の割合が増加し、血清中（つまり全身）のIL-4とIL-6のレベルが上昇した（Extended Data Fig.）
試験開始から7日目、11日目、16日目に採取した胃と小腸の全ライセートについて、RNA配列決定（RNA-seq）により遺伝子発現の変化を分析した（Extended Data図4a）。RNA-seqによって、非回避条件と回避条件を比較し、免疫経路の活性化と炎症の可能性に関する包括的で高解像度のデータが得られると考えたからである。サンプルは、分散の約45％に相当する500個の最も変動性の高い遺伝子に基づいて、主成分分析（Extended Data図5a-d）にかけられた。その結果、回避（2瓶テスト）と非回避（OVA経口投与）の条件下で、野生型マウスの間に最も大きな違いがあることが示された（Extended Data Fig.） この区別は、2瓶試験でも経口摂取でも非回避性であった肥満細胞欠損マウスでは、（小腸では）あまり明らかではなかったか、あるいは（胃では）見られなかった（Extended Data Fig.5c,d）。
胃と小腸における遺伝子発現の違いを、回避と非回避の条件下で比較しながら明らかにした（Extended Data Fig.） まず、正常な免疫系を持つマウスにおいて、抗原回避行動によって阻止される消化管抗原駆動性免疫と炎症について明らかにするために、野生型マウスを回避（2瓶試験）条件下と非回避（経口摂取）条件下で比較した。すべての時点および組織において、適応免疫、自然免疫、粘膜免疫、および走化性を示す遺伝子の発現は、非回避条件下で上昇した（Extended Data Fig.）
回避または非回避に特徴的な発現差遺伝子（DEG）を同定するため、ボルケーノプロットを用いて遺伝子発現の倍数変化とP値を分析した（図3a-d）。このようにして、回避マウス（マウスがまだ少量のOVA溶液を飲む2瓶試験）と水のみを投与されたマウスを比較した（図3a,c）。また、経口摂取（非回避）マウスと水のみ摂取マウスを比較した（図3b,d）。非回避条件下では、胃と小腸で肥満細胞関連遺伝子と免疫関連遺伝子（定義については方法を参照）からなるDEGが出現した（図3b,d）（補足表3）。回避マウスでは、この範囲と大きさの転写反応は観察されなかった（図3a,c）。注目すべきことに、回避マウスでも、水のみマウスと比較して、マスト細胞関連遺伝子の活性化を含むいくつかの遺伝子活性化が見られた（図3a,c）。この遺伝子活性化は、水のみマウスと回避マウスを比較することで初めて明らかになったが、抗原感作マウスにおける自発的抗原取り込み量の閾値を規定しているのかもしれない（図3aと図3b、図3cと図3d）。
図3：抗原回避は消化管組織における免疫活性化と炎症を防ぐ。
a-d、回避マウスを比較した胃（a,b）および小腸（c,d）組織におけるDEGのボルケーノプロット（7日間2瓶試験； 胃n=4、腸n=3）と水のみを摂取したマウス（胃n=2、腸n=3）（a,c）および非回避マウス（7日間経口摂取；胃n=3、腸n=3）と水のみを摂取したマウス（胃n=2、腸n=3）（b,d）を比較した。実験概要はExtended Data Fig. 赤い点は、免疫関連のGO用語に関連する遺伝子を表す（MethodsおよびExtended Data Fig.） e,7日目の回避および非回避条件下でのマウスの胃および小腸における遺伝子発現のlog2倍変化のヒートマップ。示された遺伝子はbとdから取られたもので、log2 fold change >3、P≤0.05を満たす。倍数変化はスケールで示す：白は有意に制御されていない遺伝子を示す。すべてのデータは野生型BALB/cマウスのものである。統計的比較はDESeq2パッケージを用いて行った（Methods）。P値はBenjamini-Hochbergアルゴリズムを用いて多重比較で調整した。FC, fold change; NS, not significant.
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組織特異的シグネチャーの可視化と、肥満細胞や免疫に関連する遺伝子以外の遺伝子のアノテーションのために、シグネチャー遺伝子のヒートマップを作成した（図3e；遺伝子のフィルタリングについては、Methodsを参照）。その結果、組織のリモデリングと抗菌機能に関連する遺伝子が同定され、特に胃と小腸で違いが見られた（図3e）。最後に、我々のDEGと公表されている炎症性遺伝子発現リスト14との比較も行った。胃と小腸の両方において、野生型マウスでは非回避条件下で炎症シグネチャーが見られたが、回避条件下では見られなかった（Extended Data Fig.） まとめてみると、回避条件下と非回避条件下で消化管遺伝子の発現を組織レベルで比較した結果、胃と小腸で広範な免疫活性化と炎症が見られ、そのほぼすべてが抗原回避行動によって阻止された。
非回避Cpa3 Cre/+マウスにおける免疫活性化
次に、非回避行動によって誘導された免疫関連および炎症関連の反応のうち、どの程度が肥満細胞に依存しているのかを調べた。Extended Data Fig.5e,fの解析と同様に、BALB/c野生型マウス（回避）と肥満細胞欠損マウス（非回避）の遺伝子発現を2ボトル・テストで比較した（Extended Data Fig.6aの実験概要に従う）。肥満細胞欠損マウスでは、非回避条件下（Extended Data Fig. 肥満細胞欠損マウスの胃では、免疫遺伝子の発現亢進は11日目と16日目にのみ検出された（Extended Data Fig.） 肥満細胞欠損マウスの腸では、7日目にのみ免疫遺伝子発現の上昇が認められた（Extended Data Fig.） したがって、肥満細胞を介した抗原回避行動によって阻止される免疫学的および炎症反応は、肥満細胞によってのみ駆動されるわけではないが、その大部分を占めている。
摂取抗原の肥満細胞による感知
口腔から消化管に至る経路でOVAに反応する肥満細胞を同定するため、Nr4a1-緑色蛍光タンパク質（Nr4a1-GFP）レポーターマウスを免疫した。これにより、FcεRI15を介して活性化された肥満細胞をin vivoで追跡することが可能になった（図4a）。OVA免疫したNr4a1-GFPマウスが25％OVA水を飲んだ3時間後、細胞懸濁液を分離し、活性化についてフローサイトメトリーで肥満細胞を分析した。口腔（歯肉と舌）の肥満細胞はGFP陰性のままであったが、胃と小腸の肥満細胞は顕著なシグナルレポーター発現を示した（図4bおよびExtended Data Fig.） 食道と結腸も分析したが、マスト細胞は検出されなかったか（食道）、ごく少数しか検出されなかった（結腸）ため、これ以上の分析は不可能であった（図示していない）。抗原反応性の直接的な証明として、対照マウス（BALB/c）ではなく免疫マウスから単離したばかりの胃肥満細胞は、in vitroでOVA刺激に反応して細胞内Ca2+の特異的増加を示した（Extended Data Fig.） これらの結果を総合すると、経口抗原曝露は組織常在性の胃および小腸肥満細胞を急速に活性化することがわかる。
図4：マスト細胞活性化のin situ追跡と抗原回避におけるFLAPの役割。
a, Nr4a1-GFPレポーター対立遺伝子を用いたFcεRI活性化肥満細胞の検出モデル。b, (BALB/c x C57BL/6)F1 Nr4a1-GFPマウスにOVA-ミョウバンまたはミョウバンのみを免疫し、OVAまたはBSAを含む飲料水を与えた（Methods）。c, ロイコトリエンの生成とMK-886によるFLAP阻害を示すモデル。d,e,BALB/c野生型マウスをOVA-alumで免疫し（図1aと同様）、インテリケージ（d）または2ボトル（e）試験の1時間前に、マウスをPBSまたはMK-886で処置した（方法）。嗜好性は、6時間、12時間、24時間の総水摂取量に対する卵白水摂取量の割合で表示した。棒グラフは平均値を表し、各点は1匹のマウスに対応する。ミョウバンビヒクル（n = 5匹）、ミョウバンMK-886（n = 5匹）、OVA-ミョウバンビヒクル（n = 8匹）、OVA-ミョウバンMK-886（n = 12匹）（d）、ミョウバンビヒクル（n = 14匹）、ミョウバンMK-886（n = 14匹）、OVA-ミョウバンビヒクル（n = 19匹）、OVA-ミョウバンMK-886（n = 19匹）（e）。統計解析は、dおよびeにおいて、両側スチューデントのt検定によって行った。AA、アラキドン酸。図4aはBioRender.comで作成。
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抗原回避行動におけるロイコトリエンの役割
粘膜抗原の接触後、肥満細胞は活性化され、その顆粒から新たに合成された脂質メディエーターや、生体アミン、プロテオグリカン、プロテアーゼなどの前段階のメディエーターを放出する16。ロイコトリエンやプロスタグランジンなどの脂質メディエーターは感覚ニューロンを活性化する17。
ロイコトリエンは、細胞質ホスホリパーゼA2と5-リポキシゲナーゼ（5-LO）によってリン脂質から生成される。後者は5-LO活性化タンパク質（FLAP）を必要とするため、ロイコトリエンの生成に必須である18（図4c）。FLAPを薬理学的に阻害することで、OVA回避に対するロイコトリエンの寄与を具体的に検証しようとした。この目的のため、BALB/c野生型マウスにミョウバンまたはOVA-ミョウバンを免疫し、回避試験の1時間前にFLAP阻害剤MK-886を投与した（文献19）。FLAP阻害は24時間にわたって回避を減少させ、6時間後（図4d、実験1）または24時間後（図4e、実験2）には、ビヒクル処理した対照と比較してP値が有意になった。この阻害効果はマウスの約半数で見られた。これらのデータは、ロイコトリエンが少なくとも初期の抗原回避行動に関与している可能性を示している。
次に、Cpa3Y356L,E378A変異マウス（Extended Data Fig. 8a）、Cpa3-/-（Cpa3とMcpt5の二重欠損）マウスを用いた肥満細胞プロテアーゼ5（Mcpt5）（Extended Data Fig.8b）、Mcpt6-/-マウスを用いた肥満細胞トリプターゼ（Mcpt6）（Extended Data Fig.8c）、ヒスチジン脱炭酸酵素（Hdc）Hdc-/-マウスを用いたヒスタミン（Extended Data Fig.8d）である。これらの系統の免疫マウスは、野生型マウスと同程度にOVA回避行動を起こした（Extended Data Fig.
抗原を強制摂取させたマウスで濃縮された回避シグネチャー遺伝子のひとつは、セロトニン（5-ヒドロキシトリプタミン；5-HT）合成酵素であるTph1（図3b,d,e）である。胃のマスト細胞の大部分は5-HTを保有していた（Extended Data Fig.） マスト細胞由来の5-HTは、内臓の倦怠感、吐き気、嘔吐の主要な調節因子であるイオン性セロトニン3受容体（5-ヒドロキシトリプタミン受容体3；5-HTR3）を介してシグナルを伝達する可能性がある20。我々は、特異的阻害剤であるパロノセトロン21をマウスに投与することで、抗原回避における5-HTR3の役割を検証した。パロノセトロンは抗原回避行動を有意に減少させなかった（Extended Data Fig.） まとめると、私たちが試験したマスト細胞メディエーターのうち、ロイコトリエン合成阻害のみが抗原回避行動を阻害した。
神経経路の解明
一部の免疫マウス（野生型マウスの29％が最初の1日以内に、また一部のマウスは最初に舐めた直後にも抗原回避反応を示した）（Extended Data Fig. 小腸上皮は、腸神経系の粘膜下神経叢や腸管神経叢に存在する内在性一次求心性ニューロンや、後根神経節や迷走神経節に存在する外在性ニューロンによって神経支配されている22 (Extended Data Fig. 10a)。我々は、粘膜下神経叢（Extended Data Fig. 10b,c）および腸管神経叢（Extended Data Fig. 10d-f）ニューロンで遺伝子コード化されたカルシウムセンサーを発現させた免疫マウスの腸管セグメントを生体外でカルシウムイメージングすることにより、内在性ニューロンへの肥満細胞シグナルの可能性を調べた。免疫マウスの横隔膜迷走神経切開により、外来迷走神経を介した回避シグナルを評価した（Extended Data Fig.） さらに、レジニフェラトキシン（RTX）を介した外因性Trpv1発現迷走神経および後根神経節感覚ニューロンの枯渇が、抗原回避に及ぼす影響を検証した（Extended Data Fig.） いずれの実験でも、回避シグナルを伝達する神経細胞の経路を示す証拠は得られなかった（Extended Data Fig.） Trpv1を発現する（RTX感受性）ニューロンは、後根神経節ニューロンのサブセットに過ぎないので23、RTX非感受性の後根神経節ニューロンの機能を否定することはできない。
考察
我々はここで、2型免疫動物が胃と小腸を裏打ちする肥満細胞によって速やかに抗原を感知することを示した。抗原回避行動は肥満細胞とIgEに依存し、Th2サイトカインによって増幅されることがわかった。抗原を摂取しない場合と摂取する場合の比較から、抗原摂取には閾値があり、その結果、消化管において見かけ上「許容できる」低レベルの免疫活性化が起こることが示された。この閾値を超える抗原の摂取は、通常は回避行動によって阻止されるはずであるが、化学走性だけでなく、適応免疫、自然免疫、粘膜免疫を示す強力な遺伝子の活性化をもたらした。免疫関連および炎症関連遺伝子プログラムのこのような広範かつ持続的（少なくとも16日間）な発現上昇は、食物アレルギーに似たOVAに対する深遠な免疫反応を示している。消化管上皮は、栄養の取り込みを制御し、腸壁を越えて微生物が侵入するのを防ぐ重要なバリアを形成している。活性化した肥満細胞は、プロテアーゼMcpt1（参考文献24）とMcpt4（参考文献25）の分泌によって腸管漏出を誘導すると考えられ、実際にMcpt1とMcpt4遺伝子は非回避条件下で強く発現上昇していた（図3e）。非回避シグネチャーには、Sprr2a3、Itnr、Reg3gなどの抗菌機能に関連する遺伝子や、Has1、Adamts4、Apold1などの組織リモデリングに関連する遺伝子も含まれており、バリア機能の低下を示している可能性がある。したがって、回避行動は抗原による免疫活性化を防ぎ、バリアの完全性を確保し、アレルギー病態から保護する13,26,27。回避行動をとらない肥満細胞欠損マウスでは、強制給餌をした野生型マウスに比べて免疫遺伝子誘導の程度が低かったことから、免疫活性化は肥満細胞に大きく依存しているが、完全ではない可能性がある。
マスト細胞とIgEが哺乳類の種で数百万年にわたって保存されていることは、これらの免疫成分が進化上強固な利点をもたらしたことを強く示唆している。実験的には、1901年にRichetとPortier28によってアナフィラキシーが発見されたとき、それは犬に繰り返し接種された毒素に対する致死的な「非保護」反応と解釈された。アレルギー反応の免疫学的「目的」については、長い間議論が続いてきた1,2,8。肥満細胞とIgEがアレルギー病態に寄与する一方で、肥満細胞29とIgE29,30を介したTh2防御反応の例はほとんどない。マスト細胞やIgEの有益な機能は、寄生虫免疫においてよく引き合いに出される31。しかし、寄生虫感染は、マスト細胞が存在しない場合には、障害されないか32、あるいは遅延するだけである33。また、マスト細胞やIgEの機能は、他の細胞（例えば、好酸球34）や抗体アイソタイプ35,36の機能と重複していることもある。免疫学的防御における肥満細胞の実際の役割を理解することが複雑であることを考えると、今回観察された抗原回避行動における肥満細胞の役割は興味深い。回避反応における肥満細胞の非冗長な機能は、非感染性抗原（アレルゲン）や中毒に対する免疫反応の再発を防ぐという進化上の利点を表しているのかもしれない。アレルゲンは多くの場合、無害で無毒性の物質2であり（例えば、職業性アレルゲンの長いリストを参照37）、無傷のバリアが存在する場合には免疫原性を示さないが、腸、肺、皮膚にバリア欠損がある場合には、2型反応を引き起こす可能性がある。洗剤や溶剤などの刺激物質は、内表面や外表面の完全性を損傷し38、抗原特異的IgE産生は、バリア欠損をきっかけに亢進する39。ある物質が、例えばパパイン40やDerp1（文献41）のように、バリアを傷つけ、かつ免疫原性を持つかどうか、あるいは物理的、化学的な侮辱や感染26がバリアを傷つけ、無害な物質に対する免疫の扉を開くかどうかは、結果とは無関係である：2型免疫、IgEの産生、マスト細胞への抗原特異的IgEの負荷（図5）。毒素も無害物質も、回避することで繰り返し接触することを防ぐことができ、その結果、ここでタンパク質抗原について示したように、局所的・全身的な免疫の活性化と炎症が起こる。
図5：肥満細胞とIgEが回避免疫を促進する。
2型免疫の枠組みにおける肥満細胞を介した回避行動のモデル。バリアーの損傷は、抗原（例えば、小麦粉、卵、ピーナッツ、病原体など）の侵入を容易にし、2型免疫反応を引き起こす。適応免疫では、抗原中和に向けて特異的なIgGおよびIgE抗体が生成される。抗原特異的IgEは肥満細胞に結合し、肥満細胞は抗原に再び遭遇すると、回避行動を示す。FLAP依存性ロイコトリエンを阻害すると回避行動が阻害されることから、このメディエーターが免疫-脳軸に寄与している可能性が示唆される。抗原を回避しているマウス（回避を聞き入れているマウス）は、回避を無視した場合に起こる消化管免疫活性化と炎症の発症からほぼ守られている。回避の免疫は、肥満細胞とIgEの存在に依存している（図示していない）。B、B細胞；DC、樹状細胞。BioRender.comで作成。
フルサイズ画像
バリア組織に位置し、感覚ニューロンに近接していることから42、肥満細胞はタンパク質抗原を感知し、その存在を中枢神経系にシグナル伝達する態勢を整えている。活性化された肥満細胞から分泌される化合物にはロイコトリエンがある16。CysLT2Rを介して脊髄ニューロンの経路を活性化し、かゆみを誘発するLTC4について示されているように、ロイコトリエンは感覚ニューロンを活性化することができる17。従って、抗原感知後にマスト細胞から放出されたロイコトリエンが、後根神経節や脊髄ニューロン経路を介して、最初の 24 時間以内に回避シグナルを発することが考えられる。インテリケージにおける抗原消費動態の解析から、回避は最初の経口抗原接触で頻繁に発現することが示された。この段階でのロイコトリエンの機能は、ロイコトリエン産生阻害剤を用いた我々の実験と一致する43 （図4）。
回避シグナルは、脊髄と脳幹から入力を受ける傍上腕核（PBN）によって脳内で処理される44。PBNのニューロンの活性化は、実験的に新規の食物（例えば、甘い溶液）と倦怠感を誘発するシスプラチンの注射をペアにした後、条件付味覚回避を引き起こすのに十分である45。この設定では、シスプラチンを注射すると、成長分化因子15（GDF-15）が循環系に放出され45、GFRAL陽性脳幹ニューロン45,46,47を介してPBNに対になった食物の回避がシグナル伝達される。Florsheimらは、GDF-15は肥満細胞とロイコトリエンの下流で誘導され、抗原回避を促進すると提唱している43。GDF-15の遮断は、1回目の飲酒試験ではなく、2回目の飲酒試験において回避を効果的に減少させた。この段階では、GDF-15の全身的放出と脳幹ニューロンを介したシグナル伝達が回避を維持している可能性がある。
肥満細胞による環境抗原の感知は、病原体の中和と破壊にとどまらず、抗原回避による炎症性疾患の予防にまで免疫を拡大する。マスト細胞は骨髄由来であるにもかかわらず、他の免疫系とは遠縁の関係にある48,49。今回の研究では、マスト細胞は2型免疫応答によって誘発される抗原認識を行動に結びつけるセンサー細胞であることが明らかになった。このようにして、ついに50、肥満細胞は重要かつ冗長ではない新たな機能を持つようになったのである。
方法
マウス
BALB/c Cpa3Cre/+（文献9）、C57BL/6 Cpa3Cre/+（文献9）、BALB/c Mcpt8-Cre51、BALB/c Cpa3-/-（文献52）、BALB/c Cpa3Y356L,E378A（文献53）、BALB/c Hdc-/-（文献54）。54）、BALB/c Mcpt6-/-（参考文献55）およびC57BL/6または（BALB/c × C57BL/6）F1バックグラウンドのNr4a1-GFP56マウスはDKFZ Heidelbergのマウス飼育施設で維持された。BALB/c Igh-7-/-（文献11）マウスはImperial College Londonで繁殖され、ハイデルベルク大学学際神経行動学コアで実験に使用された。BALB/c野生型マウスとC57BL/6 Wnt1|GCaMP3 (Wnt1-Cre;R26R-GCaMP3)57,58 マウスはKU Leuvenのマウス飼育施設で飼育された。マウスは、20～24℃、湿度45～65％の制御された環境で、12時間の昼夜サイクルで飼育された。行動テストはすべて成体（7週齢以上）の雌雄マウスで行った。Cpa3Cre/+、Mcpt8-Cre、Cpa3Y356L,E378A、Cpa3-/-およびMcpt6-/-マウスのコントロールは、性別を一致させ、年齢を一致させた野生型同腹子を用いた。Igh-7-/-マウスとHdc-/-マウスのコントロールは、性別を一致させ、年齢を一致させた野生型マウスを同じ動物飼育室で飼育した。すべての動物実験は施設および政府の規則に従って行われた。ハイデルベルクでの実験はドイツ・カールスルーエのRegierungspräsidium Karlsruheによって承認された。ルーヴェンでの実験は、ベルギーのルーヴェンにあるKUルーヴェンのAnimal Care and Animal Experiments Committeeによって承認された。
免疫
マウスは、0日目と14日目に2mgのAl(OH)3（ミョウバン）（InvivoGen）と複合体化した25μgのOVA（Sigma-Aldrich）を腹腔内注射することにより積極的に免疫され、回避試験は20日目に開始された。Th2サイトカイン処理には、2μgのIL-3（Peprotech）、12μgの抗マウスIL-3（MP2-8F8、BioLegend）、2μgのIL-4（Peprotech）、12μgの抗マウスIL-4（11B11、BioLegend）および0.4μgのIL-9（Peprotech）からなるカクテルを2日目と16日目にマウスに腹腔内注射した。IL-3を抗IL-3抗体MP2-8F8と、IL-4を抗IL-4抗体11B11と混合すると、サイトカイン-抗体複合体が生成され、in vivoで活性が増加する59。IL-9についてはこのような効果は報告されていないため、抗IL-9抗体は用いなかった。受動感作では、マウスに10μgの抗OVA IgEモノクローナル抗体（E-C1、コンドレックス）を0日目に腹腔内注射し、9日目に静脈内注射した。
インテリケージ
インテリケージでマウスを飼育することで、ハンドリングによるストレスを防ぎ、自然な行動を観察することができる60。全身免疫のために、マウスは上記のように0日目と14日目にOVA-alumの注射を2回受けた。17日目、マウスはイソフルラン麻酔下でユニークなRFIDトランスポンダーをうなじに皮下埋め込み、13～16匹のグループに分けてインテリケージ装置（TSE Systems社製）に入れた。マウスは12時間の明暗サイクルで飼育され、飼料と水を自由に摂取できた。馴化後（1～3日）、8本中4本の水を、0.25%（w/v）、1%（w/v）（C57BL/6）または8%（w/v）（BALB/c）のスクロースを含む20%（v/v）の卵白水に交換した。飲水行動は最長14日間分析された。データはIntelliCage Plusソフトウェア（NewBehavior AG）を用いて収集した。
受動感作のために、マウスは上記のように0日目と9日目にモノクローナル抗OVA-IgEの注射を2回受けた。11日目に、マウスはイソフルラン麻酔下でユニークなRFIDトランスポンダーのうなじへの皮下埋め込みを受け、インテリケージ装置に入れられた。マウスは12時間の明暗サイクルで飼育され、餌と水を自由に摂取できた。馴化後、8本中4本のボトルの水を8%(w/v)のスクロースを含む20%(v/v)の卵白水に交換した。飲水行動を最長14日間分析した。データはIntelliCage Plusソフトウェア（NewBehavior AG）を用いて収集した。
卵白の調製
卵白（20% v/v）は以下のように調製した：鶏卵の卵白を卵黄から分離し、水で希釈し、ろ紙（グレード3 hw; 65 g m-2; Ahlstrom Munksjö）で濾した。実験に使用した20％卵白溶液は、平均0.78±0.17エンドトキシン単位/mlを含み、これは標準的なマウスチャウのそれよりもかなり低い61。
二瓶試験
2回目の免疫から1週間後、BALB/c Cpa3+/+およびBALB/c Cpa3Cre/+またはノックアウトマウスと対応する同腹子を個別に飼育した。ケージには2つの同じボトルが設置され、一方には水が、もう一方には8％のショ糖を含む20％卵白水が入れられた。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果から、20％卵白水溶液には約40mg ml-1 OVAが含まれていた（図示せず）。24時間ごとにボトルの重量を測定し、飲水行動における側方嗜好性をコントロールするためにボトルの位置を変えた。回避試験は最大7日間行った。
複数回のOVA経口投与
マウスは50mgのOVAを2-3日ごとに胃内投与された（7日間投与では4回、11日間投与では6回、16日間投与では8回）。マウスは、各食餌の1時間後に下痢の有無を検査された。この OVA 投与量と比較すると、IntelliCage 実験における肥満細胞欠損 BALB/c Cpa3Cre/+ マウスの自発的消費量は、1 日平均 586 mg OVA であった（図 1）。したがって、経口投与された抗原量は、肥満細胞欠損マウスが自発的に消費した抗原量を上回らなかった。
FLAPおよび5-HTR3の薬理学的阻害
マウスを上記のようにOVA-alumで免疫した。20日目にマウスは一晩水を飲まなかった。パロノセトロン（Sigma-Aldrich）を回避試験の12時間前に0.5 mg kg-1の用量で腹腔内注射した。MK-886（Abcam）を回避試験の1時間前に10 mg kg-1の用量で胃内投与した。MK-886の反復投与はマウスの行動を変化させる可能性があるため62、マウスには1回のみ投与し、その後1日間観察した。インテリケージ（MK-886）および2瓶試験（MK-886；パロノセトロン）を24時間実施した。
Nr4a1-GFPマウスにおける肥満細胞活性化の解析
マウスを上記のようにOVA-alumで免疫した。20日目に、Nr4a1-GFPマウスを個別に飼育した。12時間の水欠乏の後、水中25％OVA（Sigma-Aldrich）を含むボトルをケージに入れた。対照マウスには、25％のウシ血清アルブミン（BSA、Roth）を水に溶かしたボトルを与えた。3時間後、ボトルからの消費量を確認するためにボトルの重量を測定し、さらなる分析のためにマウスを安楽死させた。精製マスト細胞の活性化は、GFP発現をフローサイトメトリーでモニターした。
Nr4a1-GFPマウスにおけるアナフィラキシーの解析のために、マウスを上記のようにOVA-alumで免疫した。21日目に、マウスは50mgのOVA（Sigma）または50mgのBSA（Sigma）を胃内投与され、体温は直腸体温計を用いてモニターされた。3時間後、マウスはさらなる分析のために安楽死させた。精製マスト細胞の活性化は上記のようにモニターした。
Trpv1陽性感覚ニューロンの薬理学的切除
上記のようにマウスをOVA-alumで免疫した。OVA免疫の間に、10日目から、レジニフェラトキシン（Cayman Chemicals）を、連続した日に3つの漸増用量（30、70および100μg kg-1）で脇腹に皮下注射した。対照マウスにはビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中のジメチルスルホキシド）を投与した。20日目、Trpv1の脱神経は、尾に加えられた不快な熱（52℃）に対するマウスの離脱潜時が延長することで確認された（テールフリックテスト；データは示さず）。翌日から、OVA回避を2瓶試験で分析した。
組織消化
歯肉単細胞懸濁液は既述の方法で調製した63。簡単に説明すると、口蓋と下顎を単離し、10％ウシ胎児血清（FCS；Sigma-Aldrich）、0.15μg DNase Iおよび3.2mg ml-1 collagenase IV（すべてSigma-Aldrichの酵素）を添加したRPMI中、37℃で1時間組織を消化した。その後、最後の5分間に0.5M EDTA（Roth）を添加し、上清を70μmセルストレーナー（ThermoFisher）で濾過した。未消化の歯肉組織を口蓋と下顎から剥がし、同じフィルターを通して潰し、歯肉細胞懸濁液を得た。
舌単細胞懸濁液は、舌を細かくミンチし、0.1 mg ml-1 Liberase（Sigma-Aldrich）および2.5 μg ml-1 DNase I（Sigma-Aldrich）を添加したRPMI中で、37℃で15分間、3ラウンド消化することにより調製した。消化の各ラウンドの後、細胞懸濁液を70μmのセルストレーナー（ThermoFisher）で濾過し、新しい酵素溶液を組織に加えた。すべての画分を合わせて舌単細胞懸濁液を得た。
胃上皮内白血球の単離のために、胃を切開し、食物残渣を除去した。胃を20mM EDTA（Roth）添加HBSS中、37℃で15分間インキュベートし、結合組織から上皮層を遊離させた。細胞懸濁液を100μmジルコニアビーズ（Roth）を充填したスピンカラム（ThermoFisher）にかけた。遠心後、フロースルーを回収し、胃粘膜肥満細胞を含む上皮内細胞懸濁液を得た。
小腸細胞懸濁液の調製のため、小腸を切開し、食物残渣を除去した。腸を、2% FCS（Sigma-Aldrich）、5 mM EDTA（Roth）、1 mM DTT（Merck）、10 mM HEPES（Life Technologies）を添加したHBSS中、37℃で15分間インキュベートし、結合組織から上皮層を遊離させた27。可溶性画分中の細胞（上皮内肥満細胞を含む）を70μmセルストレーナー（ThermoFisher）で濾過した。残りの腸組織をPBSで洗浄し、2% FCS（Sigma-Aldrich）、20 mM HEPES（Life Technologies）、0.2 mg ml-1 コラゲナーゼIV（Sigma-Aldrich）、0.5 mg ml-1 ヒアルロニダーゼI（Sigma-Aldrich）および0.1 mg ml-1 DNase I（Sigma-Aldrich）を添加したRPMIに移した。消化は37℃で30分間行い、消化組織を100μmのセルストレイナー（ThermoFisher）で濾過し、固有層画分（固有層肥満細胞を含む）を得た。
採血は心臓穿刺で行い、その後メーカーのプロトコールに従って赤血球溶解を行った（RBC Lysis Buffer、BioLegend）。
フローサイトメトリー
単細胞懸濁液を遠心分離し、200μg ml-1 mouse IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories）と15分間インキュベートしてFcγ受容体をブロックした。5%FCS(Sigma-Aldrich)を添加したPBSで洗浄後、細胞をフルオロクロム結合抗体（抗体のセクションのリスト参照）で20分間、氷上で遮光しながら染色した。細胞を洗浄し、100 nM SytoxBlue（Life Technologies）とインキュベートし、死細胞の排除を行った。細胞の絶対定量には、BD LSRFortessa（Becton Dickinson）を用いて分析する前に、123カウントのeBeads（Life Technologies）を規定数サンプルに添加した。データは、FlowJoソフトウェア（Treestar）を用い、補足図1に示すゲーティング戦略を用いて解析した。舌と歯肉の肥満細胞は、生きたCD45+MHCII-CD11b-CD117+FcεRI+細胞としてゲーティングされた。胃の肥満細胞は生きたCD45+CD117+FcεRI+/IgE+細胞としてゲーティングした。腸マスト細胞は、生きたCD45+CD3-CD11b-CD19-Gr-1-Ter119-CD117+FcεRI+細胞としてゲーティングされた。好中球は、CD45+CD11b+Siglec-F- Gr-1+/Ly6G+ 細胞として同定された。好塩基球は生きたCD45+CD90.2-CD11c-Gr-1-Siglec-F-MHCII-B220-CD49b+IgE+細胞として同定された。試薬については、抗体のセクションのリストを参照のこと。
肥満細胞の細胞内Ca2+測定
胃マスト細胞のCa2+フラックスを解析するために、胃上皮内白血球をスピンダウンし、カルシウムイメージングバッファー（125 mM NaCl、3 mM KCl、2.5 mM CaCl2、0.6 mM MgCl2、10 mM HEPES、20 mM グルコース、1. 2 mM NaHCO3、20 mMスクロース、NaOHでpH7.4に調整）に0.1% BSA（Roth）、2.5 mM probenecid（Biotinum）、0.01% Pluronic-F127（Sigma-Aldrich）、Fcγ受容体をブロックするために200 μg ml-1 mouse IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を添加した。カルシウムイメージングバッファーで洗浄後、細胞を4μM Fluo-4（Thermo Fisher Scientific）およびCD45 BV421、CD117 PE、FcεRI APC抗体で暗所、室温で30分間染色した。その後、0.1%BSA（Roth）と100 nM SytoxBlue（Life Technologies）を添加したカルシウムイメージングバッファーで細胞を洗浄した。測定中、細胞は37℃に保たれ、BD LSRFortessa（Becton Dickinson）で分析された。30秒間のベースライン測定の後、OVA（Sigma-Aldrich）を最終濃度1.25 mg ml-1になるように添加し、Fluo-4蛍光を90秒間取得した。陽性コントロールとして、イオノマイシン（Sigma-Aldrich）を最終濃度16.4 mmol ml-1になるように添加し、測定の最後の30秒間を行った。データはFlowJoソフトウェア（BD Bioscience）を用いて解析した。
細胞内セロトニン染色
胃上皮内白血球を上記のように調製した。細胞は、死/生識別のためにZombieFITC（1:500、BioLegend）と、Fcγレセプターをブロックするために10μg ml-1の抗CD16/32抗体（39、BioLegend）と共に室温で15分間インキュベートした。5％FCS（Sigma-Aldrich）添加PBSで洗浄後、細胞をCD45 BV785、CD117 APCおよびIgE BV421（R35-72, BD Bioscience）で20分間、氷上で遮光しながら染色した。洗浄と遠心分離の後、細胞を固定し、FoxP3-細胞内染色キット（BioLegend）を用いて、製造元の指示に従って透過処理した。細胞を0.11μg ml-1の抗5-HT（5HT-H209、Dako）抗体またはアイソタイプコントロール抗体で30分間染色し、PBSで洗浄後、抗マウス-IgG1（RMG1-1、BioLegend）抗体で30分間染色してから、BD LSRFortessa（Becton Dickinson）で分析した。
血清学的分析
OVA特異的IgEおよびIgG1は、酵素結合免疫吸着測定法（enzyme-linked immunosorbent assay）により、既述の方法で測定した64。抗OVA IgG1（L71、Biozol）および抗OVA IgE（2C6、Invitrogen）を標準として用いた。検出には、ラット抗マウス IgG1-HRP（1:2000、X56、BD Pharmingen）およびラット抗マウス IgE-HRP（1:2000、23G3、SouthernBiotech）を使用した。血清サンプルは1:40000（IgG1）および1:10（IgE）に希釈した。IL-4およびIL-6は、LEGENDplex Mouse Th Cytokine (BioLegend) assayにより、製造元の説明書に従って測定した。
小腸全層標本のCa2+イメージング
ex vivo Ca2+イメージングのために、免疫した成体Wnt1|GCaMP3マウス、または免疫しAAV9を導入した（pENN.AAV.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40、Addgene）Cpa3+/+およびCpa3Cre/+マウスの回腸を単離した。組織を腸間膜の境界に沿って開き、クレブス溶液（120.9mM NaCl、5.9mM KCl、1.2mM MgCl2、1.2mM NaH2PO4、14.4mM NaHCO3、11.5mM グルコース、2.5mM CaCl2）を入れたシルガード裏ごし皿に平らに固定し、室温で95％O2/5％CO2でバブリングした。腔内内容物はクレブス洗浄で除去した。組織をイノックスリングにマウントし、適合するゴム製Oリング65で安定化させた。リング標本をガラス底の皿に置き、モノクロメーター（Poly V）と冷却CCDカメラ（Imago QE）（TILL Photonics）を装備したZeiss Axiovert 200M倒立顕微鏡で、20倍の対物レンズを使用して画像化した。調製液は、局所重力灌流ピペット（±1 ml min-1）を用いて、室温で常にカルボゲン化クレブス溶液で灌流した。Krebs液のみ、BSA（Krebs液中1％）およびOVA（Krebs液中1％）を、撮像した腸管筋叢または粘膜下叢の上方に配置した灌流ピペットを用いて、粘膜表面にそれぞれ5分間ずつ順次適用した。解析には、Igor Pro（Wavemetrics）66 の特注ルーチンを使用した。ヒートマップは、正規化した蛍光（Fi/F0）のトレースを表示し、各行は、コントロールKrebs条件下、次いでBSA（1%）およびOVA（1%）粘膜灌流条件下での個々のニューロンの蛍光シグナルを示す。各ニューロンのシグナルは、クレブス条件下でのベースライン蛍光に対して正規化した。ヒートマップに描かれたトレースは、検出されたシグナルの最大振幅で上から下へソートされている。活性化ニューロンのパーセンテージについては、ベースラインに対して正規化した平均Ca2+シグナル強度（Fi/F0として表示）を計算するために、各GCaMP発現ニューロンの上に関心領域を描いた。バックグラウンド強度の変化が明らかないくつかの記録では、バックグラウンドサブトラクションを行った。各5分間の記録期間中に少なくとも1つのニューロンCa2+ピークが検出された場合、ニューロンは活動していると考えられた。
膣切開
迷走神経切開は既述の方法で行った67。簡単に説明すると、迷走神経の両幹を横隔膜の下で切断した。すべての迷走神経小枝の切断を確実にするため、食道周囲の神経および結合組織を除去した。迷走神経切断による胃の拡張を避けるため、幽門形成術を行った。対照マウスは偽手術を受け、迷走神経幹は露出させたが切断せず、幽門形成術を行った。
胃および小腸からのRNA単離
ナイーブマウス、免疫マウス、チャレンジマウス（2瓶試験5、7、11日目；または4×、6×、8× OVA経口投与）のBALB/c Cpa3+/+およびCpa3Cre/+マウスをCO2窒息で安楽死させた。胃と小腸（十二指腸から4cm近位）を切開し、食物残渣、脂肪、パイエル斑を除去した。組織は直ちに液体窒素で凍結し、乳鉢で乳棒を使ってすりつぶした。RNA単離はPureLink RNA Mini kit（Invitrogen）の説明書に従って行った。全RNAの品質は、BioAnalyzerシステム（RNA 6000 Pico Kit、Agilent）が提供するRNA完全性番号によって決定した。単離したRNAは、使用するまで-80℃で保存した。
RNA配列決定
ライブラリー調製は、TruSeq Stranded RNA Kit（Illumina）を用い、製造元の指示に従って行った。ライブラリー調製後、インデックス化したサンプルをプールし、2% PhiXスパイクインで2 nMに希釈した。マルチプレックスライブラリーをNextSeq 1000/2000 P2試薬（200サイクル）を用いてNextSeq 1000/2000プラットフォームでペアエンドシーケンスした（条件：Read1/Read2：111サイクル、Index1：8サイクル、Index2：8サイクル）。データはSTARアライナー（v.2.5.2b）68を用いてマッピングし、リードはsubreadパッケージ（v.1.5.1）69のFeatureCountsアルゴリズムを用いてアノテーションした。マッピングとアノテーションはGenome Reference Consortium Mouse Build 38 (GRCm38)70で行った。カウントデータの正規化と差次的発現解析はDESeq2（文献71）を用いて行い、免疫未チャレンジマウスと2瓶試験またはOVA経口投与でチャレンジした同一遺伝子型の免疫マウスを比較した。
主成分分析は、DESeq2パッケージに含まれるvariant stabilizing変換によって正規化されたリードカウントについて、最も変動が大きい上位500遺伝子に基づいて行った。その後のデータ解析と可視化のために、apeglm実装72を使用してlog2 fold changeのゼロ方向への縮小（lfcshrink）を計算した。P値はBenjamini-Hochbergアルゴリズムを用いて調整し、調整後P < 0.05の場合に有意な結果とした。
各実験グループの遺伝子セット濃縮解析（GSEA）は、ClusterProfiler73を用いて、lfcshrinkでランク付けされた完全なデータセットに対して行われた。org.Mm.eg.dbデータベース74の「生物学的過程」に関連するすべての遺伝子オントロジー（GO）用語を考慮した。有意に（Benjamini-Hochberg調整後P < 0.05）濃縮されたGO用語は、さらなる処理のために受け入れられた。個々の記述に基づき、濃縮されたGO用語は、4つの免疫関連サブグループ：自然免疫、適応免疫、粘膜免疫、および走化性に手動で注釈付けされた（個々のGO用語の注釈は、補足表1に記載されている）。サブグループ化されたGOタームから、コア濃縮遺伝子（GOタームの濃縮結果に最も寄与する遺伝子；BroadウェブサイトのGSEA文書）を抽出し、フィルターにかけた（少なくとも1つの比較において、log2 fold change <-1またはlog2 fold change >1.5）。これらの遺伝子のフォールド変化を実験グループ間で比較した（図3a,cおよび拡張データ図7b,c）。
ホールマーク炎症反応」遺伝子セットに含まれる遺伝子をMolecular Signatures Database (hallmark gene set collection: M5932, MSigDB)14から検索し、回避および非回避条件下での野生型マウスにおけるそれらのフォルド変化を比較した。
ボルケーノプロットでは、横線は有意閾値を、縦線はlog2 fold changeの閾値をそれぞれ-3および3で示した。GSEAのコアエンリッチメント遺伝子は赤で示され、手作業でキュレーションされた肥満細胞関連遺伝子は青で描かれている（図3c-f）。胃（図3c,d）と腸（図3e,f）でlog2 fold changeが3以上のDEGをフィルターし、ヒートマップとして表示した（図3g）。このヒートマップでは、他の比較で有意差のない遺伝子は白い四角で描かれている。発現が有意に変化した（P < 0.05）遺伝子は四角に色分けされている。色のスケールはlog2倍変化を示す。
Cpa3 Cre/+マウスにおける不安様行動の解析
不安様行動は、高架式十字迷路、オープンフィールドテスト、明暗テストを用いてテストされた。マウスは明るいオープンエリアを嫌う。しかし、脅威と感じる刺激を探索しようとする自然な衝動がある。不安レベルが低いと探索行動が増加し、逆に不安レベルが高いと運動量が減り、密閉された場所で過ごす時間が長くなる。不安様行動のテストは9:00から13:00の間に行われた。C57BL/6 Cpa3+/+およびCpa3Cre/+マウスは、行動試験が始まる30分前に行動部屋に持ち込んだ。すべての実験装置は、測定終了時に石鹸と70％エタノールで洗浄した。
高架式十字迷路は、4本のアーム（幅6cm、長さ35cm）を持つ不透明灰色のプラスチック製装置で、2本が開口（100ルクスで照明）、2本が閉塞（20ルクス）しており、中立の中央交差点（6×6cm）から十字に設置され、床から70cmの高さに設置されていた。マウスは迷路の中央に置かれ、5分間のテストセッションがデジタル記録され、Sygnis Trackerソフトウェア（Sygnis）で分析された。
オープンフィールド試験では、マウスを明るいオープンアリーナ（幅40cm、長さ40cm、高さ40cm；290ルクス）の中央に置き、デジタルカメラとANY-mazeビデオトラッキングシステム（Stoelting Co.）
明暗テストに使用した行動テストボックスは、29×21cm（高さ21cm、照度300ルクス）の明区画と15×21cm（高さ21cm、照度10ルクス）の暗区画の2区画からなり、床面には区画間を移動できる開口部がある。マウスを暗室に入れ、デジタルカメラとSygnis Trackerソフトウェアで10分間行動をモニターした。
Cpa3 Cre/+マウスの一般行動の解析
LABORASホームケージ観察システム（Metris B.V.）は、動物が発する行動特異的振動パターンを自動的に検出するカーボンファイバープラットフォーム上に設置された適合ホームケージで構成されている75。LABORASソフトウェア（v.2.6.）は、振動を様々な有効な行動（クライミング、グルーミング、ロコモーション、不動）と追跡情報（移動距離と速度）に変換する。これらの行動パラメータは、時間持続時間または回数カウントとして自動的に計算される。C57BL/6 Cpa3+/+およびCpa3Cre/+マウスを、標準的な飼育条件下で、餌と水に自由にアクセスできる較正済みケージに24時間個別に入れた。実験開始前に、マウスをラボラスケージに慣れさせることはしなかった。
抗体
フローサイトメトリーには以下の抗体を用いた： B220 FITC 1:50 (BD Pharmingen, RA3-6B2), CD3 BV421 1:200 (17A2, BioLegend), CD3 FITC 1:50 (17A2, BD Pharmingen), CD3 PE-Cy-7 1:25 (145-2C11, BD Pharmingen), CD11b PerCP-Cy5. 5 1:400 (M1/70, eBioscience), CD11b BV421 1:400 (M1/70, BioLegend), CD11b PE-Cy-7 1:400 (M1/70, eBioscience), CD11c BV421 1:100 (N418, BioLegend), CD16/32 ノンジュゲート 10 μg ml-1 (93, BioLegend), CD19 BV421 (6D5, BioLegend), CD19 APC 1： 400 (1D3, BD Pharmingen)、CD45 BV421 1:400 (30-F11, BioLegend)、CD45 BV785 1:400 (30-F11, BioLegend)、CD49b APC 1:100 (DX5, BD Pharmingen)、CD90. 2 APC-Cy7 1:400（30-H12、BioLegend）、CD117 PE 1:800（2B8、eBioscience）、CD117 APC 1:800（2B8、BD Pharmingen）、CD117 BV711 1:800（2B8、BioLegend）、FcεRI APC 1:200（MAR-1、eBioscience）、Gr-1 BV421 1： 800（RB6-8C5, BioLegend）、Gr-1 BV605 1:200（RB6-8C5, BioLegend）、IgE PE 1:100（RME1, BioLegend）、IgE BV786 1:100（RME-1, BD Pharmingen）、IgE BV421 1:100（RME-1, BD Pharmingen）、Ly6G PerCP-Cy5. 5 1:100 (1A8, BD Pharmingen), MHCII A700 1:100 (M5/114.15.2, eBioscience), Siglec-F BV421 1:100 (E50-2440, BD Pharmingen), Siglec-F PE 1:100 (E50-2440, BD Pharmingen), Ter119 BV421 1:200 (Ter119, BioLegend), 5-HT unconjugated 0. 11 μg ml-1 (5HT-H209、Dako)、mouse-IgG1 PE 1:100 (RMG1-1、BioLegend)。
模式図
図4aおよび図5、ならびに拡張データ図1a,e,jに示した回路図は、Adobe Illustrator (v.25.0.1) でBioRenderを使用し、掲載許可を得て作成した。インテリケージの写真はTSE Systems社から提供され、掲載許可を得ている（図1b）。
報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの利用可能性
RNA-seqデータはNCBI Gene Expression Omnibus (GEO)に寄託されており、GEOシリーズのアクセッション番号GSE225054を通して一般にアクセス可能である。カスタムRNA-seq解析パイプラインはhttps://github.com/robinthiele/AAPIA。ソースデータは本論文とともに提供される。
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参考文献のダウンロード
謝辞
E.FlorsheimとR.Medzhitovには発表前にデータを惜しみなく共有し議論していただいたことに、K.Rajewsky、A.Roers、T.Höfer、B.Rodewaldには原稿についての議論とコメントをいただいたことに感謝する。また、T. Holland-Letz、V. Weru、A. Kopp-Schneiderには統計解析に関する助言を、G. KüblbeckとS. Schäferには優れた技術協力を、J. HallgrenにはMcpt6-/-マウスを提供していただいた。Interdisciplinary Neurobehavioral Core（Heidelberg University）、Genomics and Proteomics Core FacilityおよびCenter for Preclinical Research（German Cancer Research Center）の設備と専門的技術支援に感謝する。本研究は、ヘルムホルツがん研究大学院の助成を受けた（R.B.、D.P.、F.S.、R.T.）。P.V.B.は、KU LeuvenのCell & Tissue Imaging ClusterおよびFWO IRI I000321Nの支援を受けた。T.B.F.とH.R.R.は、ERC Advanced Grant 233074から肥満細胞研究の長期的支援を受けている。H.R.R.はERC Advanced Grant 742883およびDFGのLeibniz Awardの支援を受けている。
資金提供
Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ)よりオープンアクセス資金提供。
著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Thomas Plum, Rebecca Binzberger
著者および所属
細胞免疫学部門、ドイツがん研究センター、ハイデルベルク、ドイツ
Thomas Plum, Rebecca Binzberger, Robin Thiele, Fuwei Shang, Daniel Postrach, Thorsten B. Feyerabend & Hans-Reimer Rodewald
ハイデルベルク大学バイオサイエンス学部（ドイツ・ハイデルベルク
レベッカ・ビンズベルガー、ロビン・ティーレ、ダニエル・ポストラッチ
ドイツ・ハイデルベルク大学医学部
フーウェイ・シャン
腸管神経科学トランスレーショナルリサーチセンター、KUルーヴェン、ルーヴェン、ベルギー
キャンディス・フォン、マリナ・フォルテア、ピーテル・ヴァンデン・ベルゲ
腸管神経免疫相互作用研究室、慢性疾患・代謝・加齢学部、消化器疾患トランスレーショナルリサーチセンター、ルーヴェン工科大学、ルーヴェン、ベルギー
ナタリー・スタケンボーグ、鄭王、ギー・ベックシュテンス
ハイデルベルク大学薬理学研究所（ドイツ・ハイデルベルク
アンケ・タッペ・テオドール & ロヒニ・クナー
ハイデルベルク大学病院病理学研究所モデルシステム・比較病理学センター（ドイツ・ハイデルベルク
タンヤ・ポート
ハイデルベルク大学医学部臨床神経生物学教室およびドイツがん研究センター（ドイツ・ハイデルベルク
ダンカン・A・マクラーレン、ハンナ・モニアー
ハイデルベルク大学学際的神経行動学コア（ドイツ・ハイデルベルク
クラウディア・ピッツァー
米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部ブリガム・アンド・ウィメンズ病院、医学部腎臓医学部門および医学工学部門
Cuiyan Xin & Joseph V. Bonventre
京都薬科大学・病態科学・薬理学研究室
田中 聡
ドイツ・エアランゲン、エアランゲン大学病院・フリードリッヒ・アレクサンダー大学感染生物学教室
デイヴィッド・ヴェーリンガー
インペリアル・カレッジ・ロンドン免疫学・炎症学科（英国・ロンドン
ジェシカ・ストリッド
貢献
T. T.PlumとH.R.R.が研究を計画した。T. Plum、R.B.、Z.W.、C.F.、N.S.、M.F.、A.T.T.が実験を行った。J.S.、S.T.、C.X.、J.V.B.、D.V.、P.V.B.はマウスを提供した。T.Plum、R.B.、R.T.、F.S.、D.P.、T.Poth、D.A.A.M.、G.B.、P.V.B.、R.K.、J.S.、C.P.、H.M.、T.B.F.、H.R.R.がデータの解析と解釈を行った。T.PlumとH.R.R.はR.B.とT.B.F.の意見を参考に原稿を執筆した。
連絡先
Thomas PlumまたはHans-Reimer Rodewaldまで。
倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature誌は、Cezmi Akdis氏、Marc Rothenberg氏、および本論文の査読に貢献したその他の匿名の査読者に感謝する。査読者の報告書はこちら。
追加情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
図表
Extended Data 図1 肥満細胞欠損Cpa3Cre/+マウスの不安および一般行動試験。
C57BL/6 Cpa3+/+およびCpa3Cre/+マウスの行動障害を高架式十字迷路（a-d）、オープンフィールド（e-i）、明暗室（j-m）、ホームケージモニタリング（n-s）で解析した。300秒間の行動がデジタル記録され、Sygnis trackerソフトウェアを用いて自動的に追跡された。b, プラス迷路の中間アーム、オープンアーム、クローズアームに滞在した時間。600秒間の行動をデジタル記録し、ANY-mazeビデオ追跡システムを用いて自動的に追跡した。 h, 総走行距離 i, 動かなかった時間または動いた時間 j, 明暗箱のモデル。k,マウスが最初に暗所に入るまでの遅延時間。 l,明所に入った回数。 m,総観察時間に占める外側ゾーンでの滞在時間。n-s,Laborasホームケージモニタリングの結果を、24時間観察における(n)走行距離、(o)よじ登り時間、(p)休息時間、(q)グルーミング時間、(r)走行速度、(s)最大走行速度を1時間単位で示す。日中は白、夜間は灰色で示す。棒グラフは平均値（±SD）を表し、各ドットは1匹のマウスを表す（n-sはn = 9匹）。
出典データ
Extended Data 図2 好塩基球に依存しない抗原回避行動。
a 好塩基球欠損BALB/c Mcpt8-Creマウス、およびBALB/c野生型コントロール（+/+）マウスを図1aと同様に免疫し、2瓶試験で解析した。ミョウバンまたはOVA-ミョウバン免疫マウスの卵白水嗜好性は、実験期間中、全水摂取量に対する卵白水摂取量の割合（カラースケールは割合を示す）として表示した。b, 卵白水嗜好性は、実験期間中の1日あたりの平均として、総水分摂取量に対する卵白水摂取量の割合として表示した。 c, 表示したマウスの末梢血中の好塩基球のフローサイトメトリー分析。赤血球溶解した血液細胞をCD49bとIgEの発現について染色した。ゲート内の数字は、生きたCD45+CD90.2-CD11c-Gr-1-Siglec-F-MHCII-B220-細胞中の好塩基球のパーセンテージを示す。e,f,g,h,胃肥満細胞の絶対数（e）、全生細胞中の小腸上皮内肥満細胞の頻度（f）、実験終了時の抗OVA IgG1（g）および抗OVA IgE（h）の血清量。棒グラフは平均値を表し、各点はマウス1匹を表す。+/+ ミョウバン（a,b,e-hはn=5匹、dはn=11匹）、Mcpt8-Creミョウバン（a,b,e-hはn=7匹、dはn=9匹）、+/+ OVA-ミョウバン（a,b,e-hはn=12匹、dはn=11匹）、Mcpt8-Cre OVA-ミョウバン（a,b,e-hはn=9匹、dはn=8匹）。統計解析は一元配置分散分析（one-way ANOVA）とTukey多重比較検定を用いた（b,d-h）。正確なP値を示す。
出典データ
Extended Data 図3 2型サイトカインは抗原回避行動を増強する。
a,b,c. ミョウバンおよびOVAミョウバン免疫C57BL/6 Cpa3+/+（+/+）およびCpa3Cre/+（Cre/+）マウスを用いたインテリケージ飲水回避実験。a,水と1%スクロース入り20%卵白水のどちらかを自由に選択させたマウス。+/+ ミョウバン+（n = 3匹）；OVAミョウバン+（n = 8匹）；Cre/+ミョウバン+（n = 5匹）；OVAミョウバン+（n = 7匹）。+/+ ミョウバン（n＝3）；+/+ OVA-ミョウバン（n＝7）；Cre/+ミョウバン（n＝3）；Cre/+ OVA-ミョウバン（n＝6）。 c, マウスは、（b）と同様に回避試験前の2日目および16日目に、IL-3、抗マウスIL-3、IL-4、抗マウスIL-4およびIL-9からなるサイトカインカクテル（カクテルはIL-3/4/9と略記）を2回腹腔内注射された。+/+ d,e,f,卵白水の嗜好性（a,b,cより）は、実験期間中の1日あたりの平均として、全水摂取量に対する卵白水摂取量の割合で表示した。g,h,i,実験終了後、a-cのOVA-alum免疫マウスについて、血清中の抗OVA IgE量（g）、胃の絶対数（h）、および全生細胞中の小腸上皮内肥満細胞の割合（i）を分析した。+/+ j,k,l,m, C57BL/6 Nr4a1-GFPマウスにOVA-alum免疫した。k,l,21日目にOVAまたはBSAを胃内投与した。2時間後、胃肥満細胞(k)および小腸上皮内肥満細胞(l)におけるGFP発現をフローサイトメトリーで解析した。 m, 21日目、マウスにOVA/BSAを胃内投与または静脈注射した。マウスの体温は直腸温度計でモニターした。BSA i.g.（n＝5）（k-m）；OVA i.g.（n＝5）（k-m）；BSA i.v.（n＝4）（m）；OVA i.v.（n＝5）（m）。横棒は平均値を表し、各点は1匹のマウスを表す（d-i; k,l）。データは(m)の平均値（±SEM）。統計解析は、(d-i)についてはTukey多重比較検定付き一元配置分散分析を、(k,l)については両側students t-検定を用いて行った。正確なP値を示す。
ソースデータ
Extended Data 図4 回避を無視すると、局所的および全身的な炎症が起こる。
a,免疫、2瓶試験、胃内投与の実験タイムライン。Cpa3+/+（+/+）およびCpa3Cre/+（Cre/+）マウスの群は、図に示したように免疫、チャレンジ、および解析を行った。実験開始時のマウスの総数はn=16（+/+）およびn=17（Cre/+）であった。データは平均値（±SEM）。マウスの群は、RNA配列決定（図3；拡張データ図5、6）およびd-gに示す解析のために、7日目（+/+ n = 6；Cre/+ n = 6）、11日目（+/+ n = 5；Cre/+ n = 6）および16日目（+/+ n = 5；Cre/+ n = 5）に犠牲にした。実験開始時のマウスの総数はn＝15（+/+）およびn＝19（Cre/+）であった。4回投与後（7日目）n＝6（+/+）およびn＝6（Cre/+）、6回投与後（11日目）n＝5（+/+）およびn＝6（Cre/+）、および8回投与後（16日目）n＝4（+/+）およびn＝7（Cre/+）のマウスを、RNA配列決定（Fig. d,e,示した実験群および時点（a）の動物の胃好中球（d）および小腸上皮内好中球（e）の定量。 f,g,示した実験群および時点（a）のIL-4（f）およびIL-6（g）の血清レベルの定量。対照マウスは、ナイーブ（+/+ n = 5；Cre/+ n = 6）または免疫化（+/+ n = 5；Cre/+ n = 6）したが、チャレンジしなかった（d-g）。棒グラフは平均値（d-g）を表し、各点は1匹のマウスで、すべての群についてn＝4-6であった。統計解析は、(b)については二元配置分散分析を、(d-g)については両側students t-検定を用いて行った。正確なP値を示す。
出典データ
Extended Data 図5 BALB/cマウスにおける回避と非回避の条件下での消化管組織の転写解析。
a-d、Extended Data図4aで概説した実験を行ったBALB/c Cpa3+/+およびCpa3Cre/+マウスの（a,c）胃および（b,d）小腸組織バルクRNA-Seqデータにおいて、最も変動が大きい500遺伝子を考慮した主成分分析。実験条件ごとのサンプルのクラスタリングは、マウス間の再現性を証明している。e,f, 実験概要については、Extended Data Fig. 胃（e）および小腸（f）は、指定された日にRNA配列決定によって解析された。log2Fold-changeでランク付けされた遺伝子リストに基づき、遺伝子セット濃縮解析を行ったところ、免疫学的なGene Ontology (GO)用語が強く寄与していることが明らかになった。これらのGO用語を、その説明に従って4つのサブグループに分類した： 「適応免疫」、「自然免疫」、「粘膜免疫」、「走化性」である（補足表1）。各GOタームに対して最も影響力のある「コア濃縮遺伝子」（Methods）を、これらの免疫学的サブグループに従って分類した（補足表2）。回避マウス（2瓶試験）と非回避マウス（OVA経口投与）の胃（e）と小腸（f）の組織について、有意に濃縮された免疫関連GOパスウェイに含まれるコア濃縮遺伝子の絶対log2倍変化を示す。遺伝子は「自然免疫」、「適応免疫」、「粘膜免疫」、「走化性」として手動でアノテーションした。g,h, 回避マウス（2瓶試験）と非回避マウス（OVA経口投与）の胃（g）と小腸（h）の組織における「特徴的炎症反応」14遺伝子のLog2Foldchanges。箱ひげ図（e-h）は中央値と分位を示す。統計解析は(e-h)について両側Wilcoxon-rank-sum検定を用いて行った。a-dのマウスの数は、(a)Cpa3+/+胃ナイーブ非チャレンジング(n = 2)、免疫化非チャレンジング(n = 3)、免疫化経口投与(n = 8)、免疫化二瓶試験(n = 12)； (b）Cpa3+/+小腸ナイーブ非チャレンジング（n＝3）、免疫化非チャレンジング（n＝3）、免疫化経口投与（n＝7）、免疫化2瓶試験（n＝7）、（c）Cpa3Cre/+胃ナイーブ非チャレンジング（n＝3）、免疫化非チャレンジング（n＝2）、免疫化経口投与（n＝9）、免疫化2瓶試験（n＝9）； (d）Cpa3Cre/+小腸ナイーブ非チャレンジング（n = 3）、免疫化非チャレンジング（n = 3）、免疫化経口投与（n = 9）、免疫化二瓶試験（n = 8）。e-hのマウスの数は、（e,g）Cpa3+/+胃免疫化非回避（経口投与）7日目（n = 3）、11日目（n = 2）、16日目（n = 3）、免疫化回避（2瓶試験）7日目（n = 4）、11日目（n = 4）、16日目（n = 4）（グループごとにデータをプールし、参照免疫化非回避（n = 3）と比較）、 (f,h)Cpa3+/+小腸免疫非回避(経口)7日目(n = 3)、11日目(n = 2)、16日目(n = 2)、免疫回避(2瓶試験)7日目(n = 3)、11日目(n = 2)、16日目(n = 2)(グループごとにデータをプールし、参照免疫非回避(n = 3)と比較)。e,fの遺伝子数（少なくとも1つの比較においてlog2FoldChange <1またはlog2FoldChange >1.5）については、補足表1を参照。e-hのボックス境界はデータの第1四分位数と第3四分位数、中央の線は中央値、ひげは四分位数間の1.5倍以内の最も遠い点を示す。
Extended Data 図6 肥満細胞非依存性の消化管炎症。
b,c,免疫関連GOパスウェイ（Methods）に含まれるコアエンリッチメント遺伝子の絶対倍数変化（2ボトルテストで得られた回避Cpa3+/+マウスと非回避Cpa3Cre/+マウスの胃（b）と小腸（c）組織について）。遺伝子は「自然免疫」、「適応免疫」、「粘膜免疫」、「走化性」のカテゴリーに分類された。箱ひげ図は中央値と分量を示す。統計解析は両側Wilcoxon-rank-sum検定を用いて行った(b,c)。b,cのマウスの数は、(b)Cpa3Cre/+胃免疫非回避（経口投与）7日目（n = 3）、11日目（n = 3）、16日目（n = 3）、免疫回避（2瓶試験）7日目（n = 3）、11日目（n = 3）、16日目（n = 3）（群ごとにデータをプールし、参照免疫非回避（n = 2）と比較）、 (c) Cpa3Cre/+小腸免疫非回避（経口投与）7日目（n = 3）、11日目（n = 3）、16日目（n = 3）、免疫回避（2瓶試験）7日目（n = 3）、11日目（n = 3）、16日目（n = 2）（グループごとにデータをプールし、参照免疫非回避（n = 3）と比較）。b,cの遺伝子数（少なくとも1つの比較でlog2FoldChange <1またはlog2FoldChange >1.5）については、補足表1を参照のこと。 b,cの枠線はデータの第1四分位数と第3四分位数を、中央の線は中央値を、ひげは四分位範囲1.5倍以内の最も遠い点を表す。
Extended Data Fig. 7 新鮮な単離胃肥満細胞は、細胞内Ca2+フラックスによってin vitroでOVAに反応する。
a, (BALB/c x C57BL/6)F1 Nr4a1-GFPマウスにOVA-ミョウバン免疫、またはミョウバンのみ免疫し、OVAまたはBSA入りの飲料水を与えた（Methods）。b,OVA-ミョウバンまたはミョウバン免疫マウスの胃肥満細胞におけるFluo-4蛍光（細胞内Ca2+濃度を示す）の代表的な痕跡。c,OVA-ミョウバン免疫マウスとミョウバン免疫マウスのマスト細胞を比較し、Fluo-4平均蛍光強度（bと同様）を測定開始30秒で正規化（1.0と設定）した（Methods参照）。OVA-ミョウバン（n = 17）、ミョウバン（n = 13）。統計解析は、(a)についてはTukey多重比較検定を伴う一元配置分散分析（one-way ANOVA）により、(c)については両側students t-検定により行った。正確なP値を示す。
ソースデータ
Extended Data 図8 肥満細胞メディエーターの遺伝的または薬理学的遮断後の回避行動。
a-d,肥満細胞プロテアーゼ（a,b,c）またはヒスチジン脱炭酸酵素（d）を欠損したBALB/cマウスを図1aのように免疫した。卵白水摂取嗜好性は、2ボトル試験の期間中、1日あたりの総水分摂取量に対する卵白水摂取量の割合として表示し（ヒートマップ；各行は個々のマウス）、実験全体の総水分摂取量に対する卵白水摂取量の平均割合として表示した（下パネル）。変異マウスはCpa3Y356L,E378A（a）、Cpa3-/-マウス（b）、Mcpt6-/-マウス（c）、Hdc-/-マウス（d）。Cpa3+/+ミョウバン（n = 8匹）、Cpa3Y356L,E378Aミョウバン（n = 8匹）、Cpa3+/+ OVA-ミョウバン（n = 13匹）、Cpa3Y356L,E378A OVA-ミョウバン（n = 13匹）（a）； Cpa3+/+ミョウバン（n = 7匹）、Cpa3-/-ミョウバン（n = 6匹）、Cpa3+/+ OVA-ミョウバン（n = 10匹）、Cpa3-/- OVA-ミョウバン（n = 11匹）（b）； Mcpt6+/+ミョウバン（n = 2マウス）、Mcpt6-/-ミョウバン（n = 4）、Mcpt6+/+ OVA-ミョウバン（n = 5）、Mcpt6-/- OVA-ミョウバン（n = 10）（c）；Hdc+/+ミョウバン（n = 3マウス）、Hdc-/-ミョウバン（n = 3）、Hdc+/+ OVA-ミョウバン（n = 5）、Hdc-/- OVA-ミョウバン（n = 5）マウス（d）。e,f, 野生型BALB/cマウス（naive）およびOVA-alum免疫化野生型BALB/cマウス（OVA-alum）の胃肥満細胞を抗5-HT特異抗体またはアイソタイプコントロール抗体で細胞内染色し、フローサイトメトリーで解析した（Methods）。細胞内5-HTまたはアイソタイプ抗体染色（e）、および5-HT+胃マストの頻度（f）のヒストグラム（fのデータは代表的なもの）を示す。ナイーブ（n＝8マウス）、OVA-ミョウバン（n＝4）（f）。g、BALB/c野生型マウスをOVA-ミョウバンで免疫し、2瓶試験の12時間前にマウスをPBSまたはパロノセトロンで処置した（Methods）。ミョウバン投与群（n = 8匹）；ミョウバン・パロノセトロン投与群（n = 7匹）；OVA-ミョウバン投与群（n = 21匹）；OVA-ミョウバン・パロノセトロン投与群（n = 23匹）（g）。棒グラフ（a-d, f,g）は平均値を表し、各点は1匹のマウスである。統計解析は、Tukey多重比較検定付き一元配置分散分析（a-d）、両側students t-検定（g）を用いて行った。正確なP値を示す。
出典データ
Extended Data 図9 OVA回避のカイネティクス。
a,野生型BALB/cマウスの時間分解卵白水舐回数（図1c、実験1および2より引用）。個々の野生型マウスの卵白水舐をインテリケージ内で12日間にわたって記録し、最初の120時間を示す。実験とマウスIDは各グラフの右上に記載されている（n = 17）。 b, 野生型マウスにおける卵白水忌避の開始日数の分布を示す円グラフ。
出典データ
Extended Data 図10 抗原回避に関与しない腸管、迷走神経、およびTrpv1発現ニューロン。
a、腸-脳シグナル伝達経路のモデル。外在性迷走神経節および後根神経節ニューロンは、それぞれ腸から脳幹および脊髄へシグナルを送る。内在性の一次求心性ニューロンは粘膜下叢と腸間膜叢に存在する。b-e,クレブス緩衝液（t = 0-299s）、1％BSA（t = 300-599s）、および1％OVA（t = 600-899s）を連続的に粘膜に過灌流した後、ミョウバンおよびOVA-ミョウバン免疫したWnt1|GCaMP3マウスの全厚腸管調製物における粘膜下神経叢（b,c）、腸管神経叢（d,e）ニューロンのCa2+過渡変化の顕微鏡記録。b,c、ミョウバンマウスn=5匹から得た188個のニューロン、およびOVA-ミョウバンマウスn=5匹から得た178個のニューロンの解析に基づき、代表的な47個のニューロン（ミョウバンマウスn=3匹、およびOVA-ミョウバンマウスn=3匹）のカルシウム過渡変化（b）、および全ニューロン中の活性ニューロンの割合（c）を示す。d,e、ミョウバンマウスn=5匹から得た442個のニューロン、およびOVA-ミョウバンマウスn=5匹から得た419個のニューロンの解析に基づき、127個の代表的ニューロン（ミョウバンマウスn=3匹、およびOVA-ミョウバンマウスn=3匹から得た）のカルシウム過渡変化（d）、および全ニューロン中の活性ニューロンの割合（e）を示す。f, Cpa3+/+（+/+）およびCpa3Cre/+（Cre/+）マウスに、ウイルスベクター構築物からCa2+センサーGCaMP6を導入し（Methods）、図1aと同様に免疫した。腸管神経叢ニューロンのCa2+過渡変化の記録。全ニューロン中の活性ニューロンの割合を示す（ミョウバンマウス2匹からは52ニューロン、OVAミョウバンマウス2匹からは56ニューロン）。g,hは、幽門形成術（偽薬）または迷走神経切断術（方法）を受けたナイーブまたはOVA-ミョウバン免疫BALB/cマウスの卵白水嗜好性を、（g）は実験期間中の総水摂取量に対する卵白水摂取量の割合、（h）は2ボトル試験期間中の1日あたりの平均摂取量に対する卵白水摂取量の割合で示したものである。i,j、ビヒクルまたはレジニフェラトキシン（RTX）注射を受けたOVA-alum免疫BALB/c Cpa3+/+およびCpa3Cre/+マウスの卵白水嗜好性（Methods）。iでは、実験期間中の総水分摂取量に対する卵白水分摂取量の割合を示した。各行は個々のマウスである（Cpa3Cre/+ ビヒクル n = 6; Cpa3Cre/+ RTX n = 6; Cpa3+/+ ビヒクル n = 6; Cpa3+/+ RTX n = 10）。(j)では、2本試験期間中の1日あたりの平均摂取量として、全摂取量に対する卵白摂取量の割合を示した。c,e,fでは、ドットは顕微鏡記録の平均値±SD。h,jでは、各ドットは1匹のマウスであり、バーは平均値を表す。統計解析は、(c,e,f,)では二元配置分散分析を、(h,j)ではTukey多重比較検定を用いた一元配置分散分析を行った。正確なP値を示す。
出典データ
補足情報
補足図1
FACSゲーティング戦略の概要。異なる臓器における肥満細胞、好中球、好塩基球の同定には、特徴的な表面マーカーの組み合わせが用いられた。赤い矢印は、適用したゲーティングスキームの順番を示している。個々のプロットでは、前のプロットのゲートに該当する細胞のみが示されている。すべてのプロットにおいて、ゲート内の細胞のパーセンテージが示されている。
報告概要
査読ファイル
補足表1
GO用語。この表は、RNA-seqデータ中の免疫関連で有意に濃縮されたGO用語を、比較対象および組織別に手動でアノテーションしたものである。アノテーションは、「適応免疫」、「自然免疫」、「粘膜免疫」、「走化性」と題された4つのシートにグループ分けされた。統計的比較はClusterProfilerパッケージ（Methods）を用いて行った。P値はBenjamini-Hochbergアルゴリズムを用いて多重比較のために調整した。
補足表2
コアエンリッチメント遺伝子。この表は、免疫関連で有意に濃縮されたGO用語から得られたコア濃縮遺伝子のlog2倍変化を含んでいる。遺伝子は、組織および免疫カテゴリー別にシートでサブグループ化されている： 適応免疫」、「自然免疫」、「粘膜免疫」、「走化性」。リファレンスとテストの比較が示されている。
補足表3
差次的遺伝子発現解析。この表は示差的発現解析の結果である。データは組織ごとに2枚に分けられている。リファレンスとテストの比較が示されている。統計的比較はDESeq2パッケージ（Methods）を用いて行った。P値はBenjamini-Hochbergアルゴリズムを用いて多重比較のために調整した。
補足表4
特徴的な炎症反応遺伝子 この表は、Liberzonらによって報告された「Hallmark inflammatory response」遺伝子セットに記載され、我々のデータセットで見つかった遺伝子のlog2倍変化を含んでいる。データは組織ごとに2枚に分かれている。
ソースデータ
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ 拡張データ Fig.
ソースデータ 拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ 図9
ソースデータ拡張データ 図10
権利と許可
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この記事について
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Plum, T., Binzberger, R., Thiele, R. et al. Mast cells link immune sensing to antigen-avoidance behaviour. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06188-0
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2022年6月12日受領
受理2023年5月10日
2023年7月12日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41586-023-06188-0
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