マダニ媒介感染におけるライム病病原体Borrelia burgdorferiのトランスクリプトーム変化の経時的マップ

2023年7月9日 11:37

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Anne L. Sapiroauthor has email address
ベス・M・ヘイズ
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要旨
ライム病の原因菌であるBorrelia burgdorferi（Bb）は、マダニ媒介動物と脊椎動物の宿主の間を循環しながら、大きく異なる環境に適応している。しかし、マダニの体内で数日間にわたって起こる転写変化の全容を捉えることは技術的に困難である。われわれは、Bb細胞を濃縮する実験的アプローチを開発し、Bbのグローバルなトランスクリプトーム・スケープを縦断的に明らかにした。その結果、宿主に寄生してから1〜4日後の血液接触期間中に発現が大きく変化するBb遺伝子が192個同定された。アップレギュレートされた遺伝子の大部分は、細胞外皮に存在するタンパク質、あるいはBbの珍しいタンパク質リッチな被膜に組み込まれた45の外表面リポタンパク質を含む、機能未知のタンパク質をコードしていた。これらのタンパク質はBbと宿主との相互作用を促進する可能性があるため、質量分析を利用してBbと物理的に会合するマダニのタンパク質候補を同定した。このBb濃縮法は、生体外Bbトランスクリプトームとマダニとの相互作用タンパク質の候補とともに、Bb感染サイクルのマダニ段階におけるBbのプライミングと感染の重要な決定要因に関する研究を促進するためのリソースを提供する。
eLifeの評価
このTools and Resources論文において、著者らは、RNA配列決定や質量分析などの分析において、感染中のボレリア・ブルグドルフェリの数が少ないという課題を克服している。スピロヘータを物理的に濃縮することで、マダニ摂食中のB. burgdorferiのグローバルなトランスクリプトーム変化を研究するための技術的進歩を提供し、すでにフィールドで収集された知識を構築するのに役立つため、これは重要である。提示されたエビデンスは説得力があり、ここに記載された戦略は、この分野の研究者に利益をもたらすだけでなく、より広範な応用をサポートする可能性もある。
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eLifeの評価について
はじめに
媒介微生物病原体は節足動物に咬まれることで感染し、媒介動物と宿主の間を移動する際に、大きく異なる環境に適応するための洗練された方法を進化させてきた。その適応機構を明らかにすることは、病原体感染を阻止する道を開くだけでなく、媒介動物の生理学や微生物共生に関する基本的な知見を提供することにもなる（Shaw and Catteruccia, 2018）。北米で最も報告されている媒介感染症であるライム病は、細菌病原体Borrelia burgdorferi（Bb）によって引き起こされる（Rosenbergら、2018；Steereら、2016）。その主な媒介者であるクロアシマダニIxodes scapularisは、感染した脊椎動物の宿主からBbを獲得する食事と、その後の生活段階で新たな宿主にBbを感染させる食事の、2回に分けて数日間かけてBbを獲得し、感染させる（Tilly et al.） Bbは感染時にマダニの中腸で増殖し、その一部が唾液腺に播種される（Dunham-Ems et al.） Bbは咬傷部位に押し出されたマダニの唾液を介して新しい宿主に寄生する（Spielmanら、1987年）。I.scapularisの摂食は長期にわたること、媒介動物と病原体の関係には高い特異性があること、Bbの感染を成功させるために必要な事象が複雑に絡み合っていることを考えると、マダニの血液摂取は病原体の拡散を防ぐための絶好の介入ポイントとなる。しかしながら、このプロセスに関与する分子メカニズムについては、現在のところ明確な理解が得られていない。
Bbはマダニから脊椎動物の宿主へと循環する際、劇的に異なる環境に適応しなければならず、このプロセスに関与する遺伝子を理解することで、感染を防ぐために標的とすべき重要な相互作用を特定することが可能になる。感染したマダニが餌を食べるとき、Bbは血液食によって誘発される環境変化に応答し、RpoN-RpoSシグマ因子カスケードやHk1/Rrp1二成分系を含む主要な転写回路によって駆動される細胞改変を受ける（Radolf et al.）マダニまたは哺乳類に似た増殖条件下で培養したBb細胞のin vitro解析では、宿主のスイッチングに伴う広範なトランスクリプトームのリモデリングが明らかになり、マダニ媒介感染症の遺伝的な決定要因がさらにあることが指摘されている（Samuelsら、2021年総説）。しかし、このような試験管内での発現変化が、マダニ媒介性の血液を摂取する間の生体内での複雑な変化とどのように対応しているのかは、完全には明らかになっていない。ベクター内部からのBb遺伝子発現に関する包括的で縦断的なデータの取得は、血液食事の動的な性質やマダニに対する細菌細胞の存在量が一般的に低いことによる技術的な課題によって妨げられてきた（Samuels et al.）マダニからトランスクリプトーム全体の測定を行うことで、いくつかの進展が見られた。Bb配列の濃縮とマイクロアレイの組み合わせにより、1回目と2回目のマダニ血液食の間でBb遺伝子発現の大規模な変化が同定された（Iyerら、2015年）。さらに最近では、TDBCapSeqによって感染マダニRNA-seqライブラリーからBb配列を濃縮することで、摂食したマダニと哺乳類宿主の間で循環するBb遺伝子発現の違いについて、より明確な解像度が得られるようになった（Grassmann et al.）しかし、マダニ摂食の主要なステップで起こる分子遷移の時間的な解明には限界がある。この問題を解決するには、自然のマダニ環境におけるBbのトランスクリプトーム変化を捉える新たなアプローチが必要である。
Bb感染決定因子の全容はまだわかっていないが、運動性、代謝、免疫回避など、マダニの段階で重要な機能プロセスに関する知識は増えている（Kurokawa et al.）これらの機能は多くの場合、タンパク質が豊富なユニークなBb外表面に依存している。Bbの生存、移動、次の宿主への伝播には、いくつかの特異的なダニ-Bbタンパク質相互作用が重要である。Bbは広範な外表面タンパク質（Osp）ファミリーをコードしており、そのメンバーは宿主交代時に発現が異なる。これらのタンパク質のひとつであるOspAは、マダニの細胞表面タンパク質であるTROSPA（Tick Receptor for OspA）と結合し、Bbが最初の捕血時にマダニの中腸に定着するのに必要である（Pal et al.）他にもいくつかのタンパク質がマダニ内でのBbの移動に関係している（Pal et al.）例えば、BBE31はマダニのタンパク質TRE31と結合し、この相互作用を阻害すると、マダニの腸から唾液腺への移動に成功するBb細胞の数が減少する（Zhang et al.）しかし、これらの相互作用だけではマダニにおけるBbの増殖や遊走を阻止するには不十分であり、マダニ媒介感染にはBbとマダニによるさらなる分子因子が関与している可能性が示唆される。
この重要なヒト病原体のマダニ媒介感染を促進するBbの決定因子をより包括的に明らかにするため、我々は、感染したI. scapularisの幼虫がマウス宿主にBbを感染させる際に、そのBb集団の生体外トランスクリプトーム・プロファイリングを行う新規のシーケンスベースの戦略を開発した。この方法を用いて、マダニに感染してから1～4日後の感染血液中にマダニ内部から分離した細菌細胞について、ゲノムワイドなBb発現変化を縦断的にマッピングした。その結果、Bb感染に以前から関与している遺伝子やその他多くの遺伝子を含む、192の高度に発現差のある遺伝子が同定された。マダニ感染時に発現が増加した遺伝子は、外表面のリポタンパク質に富んでおり、これはBbがマダニ内を移動する際に細胞外皮を劇的に変化させることを示唆している。マススペクトロメトリー解析により、摂食に伴うマダニ環境の劇的な変化が明らかになり、マダニと微生物の分子間相互作用が、これまで考えられていたよりも広範で多様なものであることを示す、新たな決定因子が同定された。Bb濃縮法とその結果得られたデータセットは、Bb伝播の重要な決定要因に関するさらなる研究を促進するための重要なコミュニティー資源となる。
研究結果
2段階の濃縮プロセスにより、マダニ吸血中のBbの強固な転写プロファイリングが容易になった。
感染サイクルのマダニ期を通してBb遺伝子の発現をより包括的に理解するため、我々は、Bbが脊椎動物の宿主に感染する数日間の血液食事中に、I. scapularisの幼虫マダニから分離されたスピロヘータのBbトランスクリプトームを特徴付ける実験的アプローチを開発した。我々は、マダニがマウスの血液食宿主に付着した後、食餌の各日における主要な病原体感染イベントを網羅する縦断的な転写プロファイルを確立することを目的とした（図1A）。Bbに感染したマダニの幼虫を未熟なマウスに食べさせ、摂食開始後、マダニがマウスから完全に離脱する4日後まで、摂食しているマダニを1日間隔で採取した。このようなRNA配列決定（RNA-seq）手法の大きなボトルネックは、病原体の転写産物が非常に少数派である複雑な多生物サンプルから、十分な量のBb転写産物を捕捉することである。ハイブリダイゼーションによる豊富な配列の除去（DASH）（Dynerman et al., 2020; Gu et al., 2016）を用いて、単にポリA除去でダニmRNAを除去し、ダニrRNA配列を除去することでBb mRNAを発見しようとした最初の試みは失敗に終わった。このアプローチでは、Bb mRNAにマッピングされたRNA-seqリードの平均はわずか0.09%にとどまり、ロバストなトランスクリプトームワイドディファレンシャル遺伝子発現解析（Haas et al.）
図1.
図1. 2段階の濃縮プロセスにより、マダニ吸血中のBbのロバストな転写プロファイリングが容易になった。
(A) 幼ダニI. scapularisの摂食過程におけるBbの模式図。幼ダニの中腸にいるBbは、栄養価の高い血液を摂取すると増殖し、転写状態を変化させることで反応する（Ouyang et al.）同時に、マダニの腸は血液食を消化するために多くの変化を起こす（Caimanoら、2015；Sonenshine and Anderson、2014）。2～3日間の摂食の後、少数のBbは中腸を出て唾液腺に入るが（青）、大部分はエンゴール後に腸内に取り残される（Dunham-Emsら、2009）。(B）摂食したマダニからのBb濃縮過程の模式図。マダニ全体を解離し、溶解液にαBb抗体を加え、抗体とBbを磁気的に捕捉する。RNAが抽出され、RNA-seqライブラリーが調製される。その後、DASHを用いてシーケンス前にrRNAを除去する。この処理により、得られるシーケンスデータ中のBbリードが増加する。(C）濃縮処理後の濃縮画分と除去画分におけるBb flaBおよびI. scapularis gapdh RNAの割合を示すRT-qPCR結果。データは2日目、3日目、4日目の各4反復から得られた。****p-value<0.0001、paired t test。ほぼ全てのBb flaB RNAが濃縮画分に見出された。(D）DASHの前後でrRNAにマッピングされたリードの割合。データは平均+/-SDで示す。****p-value<0.0001、paired t test。DASH後、rRNAのリードは激減した。(E）BbにマッピングされたRNA-seqライブラリーのリードの割合。Bb mRNAリードは、濃縮しない場合に比べてライブラリーに占める割合が大きい。データは平均 +/- SDで示す。(F)各日のBbにマップされた数百万(M)のリードの数。データは平均±SDで示す。サンプルあたり平均430万リードがBb遺伝子にマップされ、少なくとも10リードを持つ遺伝子の92%をカバーした。
ライブラリー中のBb転写産物発現を劇的に増加させるため、ライブラリー調製前に、免疫磁気分離の最初のステップを加えることで、ダニ溶解液中のBb細胞を物理的に濃縮した（図1B）。Bb細胞全体（αBb、RRID: AB_1016668）に対する市販の抗体を利用した。ウエスタンブロット分析により、αBbがいくつかのBbタンパク質を特異的に認識することを確認した。その中には、マダニのBb表面に非常に多く存在する表面タンパク質OspA（図S1A）も含まれる（Radolf et al.）さらに、αBbを用いた免疫蛍光顕微鏡検査では、摂食の各日にマダニ内部からBb細胞を明確に認識した（図S1B）。マウスから感染したマダニを付着後1、2、3、4日目に採取した後、αBbと磁気ビーズを用いて、溶解液中のマダニ物質からBb細胞を濃縮した。分離したサンプル中のBb flaB RNAとダニgapdh RNAのRT-qPCRにより、相対的なBb濃縮度を追跡した。Bbが濃縮されたサンプルと、それに対応するBbが除去されたフラクションの両方からBb flaB RNAを測定したところ、Bb flaB RNA全体の95%以上が濃縮フラクションに存在した（図1C）。
濃縮プロセスから回収した全RNAを用いてRNA-seqライブラリーを作成し、その後、Cas9による分解のために不要な配列を標的とするDASHを用いて、ダニ、マウス、Bb由来のrRNA配列の枯渇を行った（Gu et al.、2016；Ring et al.、2022）。DASHにより、不要な配列はライブラリー全体の94%から9%に減少し、Bb転写産物の相対的存在量が大幅に増加した（図1D）。フィーディングの結果、0.6%から3.4%のリードがBbコード領域にマップされ（図1E）、サンプルあたり平均430万個のBb遺伝子リードが得られた（図1Fおよび表S1）。
予想通り、マウスにマダニが付着してから1日目、2日目、3日目に採取したサンプルでは、残りのシーケンスリードの大部分（72～83%）がI. scapularisゲノムにマップされた（表S1）。4日目には、マダニが完全に固着し、マウスから引き抜くのではなくマウスケージから回収されたため、I. scapularisゲノムにマップされたリードは減少した（24-44%）。全サンプルから得られたリードのうち、宿主であるMus musculusゲノムにマップされたのはごく一部であった（1-3%）。4日目のサンプルに残ったリードの出所を特定するために、シーケンスデータセット中の微生物を同定する一般公開されている計算パイプラインCZ ID（Kalantar et al.）この解析の結果、4日目のリードの大部分が細菌種Pseudomonas fulva（41-64%）にマップされた（表S1）。これらのサンプルはBbにマップされたリードの割合が低かったが、それでも総シーケンス深度を増やすことで幅広いトランスクリプトームカバレッジが得られた。全サンプルにおいて、少なくとも10リードがBb遺伝子の92%にマップされた。各サンプルの遺伝子あたりのリード数の中央値は338から1167リードの間で変動した（表S1）。このカバレッジは、大多数のBb遺伝子について、統計的に有意な下流での差次的発現解析に十分であった。
我々のアプローチがBb発現に大きなアーチファクトをもたらしたかどうかを評価するため、免疫磁性濃縮の前後でin vitro培養Bb細胞から得られたRNA-seqライブラリーの塩基配列を決定し、比較した。その結果、最小限の発現差（p<0.05で29遺伝子、fold changeは0.83-1.12）しか認められず（図S2および表S2）、実験的濃縮がBbのグローバルなトランスクリプトーム・プロファイルを有意に変化させないことが示唆された。このように、我々の濃縮アプローチにより、Bbが宿主に感染する際に摂食ニンフ内で起こるBb集団レベルの発現変化をゲノムワイドに解析することが可能となった。
Bbのグローバルな生体外プロファイリングにより、転写変化の範囲と動態が明らかになった。
I.scapularisのニンフが媒介血食している間のマダニにおけるBbの発現変化を大まかに概観するために、付着後1日、2日、3日、4日（n=4）のBbトランスクリプトームデータに対して主成分分析（PCA）を行った。もしBb個体群間で多くの縦断的な発現変化が起こっているのであれば、生物学的複製物間よりも時点間でより大きなデータ変動が観察されるだろうと考えた。実際、各日の複製はグループ化されていたが、異なる時点はほとんど重複していなかった。データの分散の64％を説明する第1主成分は、摂食日とよく相関していた（図2A）。全体的なパターンから、Bb遺伝子の発現変化は摂食期間を通じて概ね同じ方向に傾いており、1日目と4日目の隣接するタイムポイント間で最も劇的な違いがあることが示唆された。
図2.
Bbの生体外グローバルプロファイリングにより、転写変化の程度と動態が明らかになった。
(A）摂食期間中のサンプルの主成分分析。PC1は摂食日と強い相関がある。(B)付着後初日とそれ以外の日の一対比較として、データの解析方法を示した模式図。(C-E) 2日目と1日目の比較(C)、3日目と1日目の比較(D)、4日目と1日目の比較(E)。右上にアップレギュレートされた遺伝子の総数を、左上にダウンレギュレートされた遺伝子の数を示す。黄色の点は1日目と2日目の間で最初に発現が変化した遺伝子、赤色の点は1日目と3日目の間で最初に発現が変化した遺伝子、紫色の点は1日目と4日目の間で最初に発現が変化した遺伝子である。log2 fold change >4の2遺伝子はx=4に、-log10(padj) >60の5遺伝子はy=60に示されている。Wald検定でp-value < 0.05を示し、少なくとも2倍の変化を示した遺伝子だけが強調表示されている。給餌4日目までに、153遺伝子がアップレギュレートされ、33遺伝子が1日目のベースラインレベルからダウンレギュレートされた。
1日目（初期付着）をベースラインとして、それ以降の時点（2日目、3日目、4日目）ですべてのBb遺伝子について差次的発現解析を行った（図2Bおよび表S3）。多重仮説検定で調整したp値＜0.05の変化と、2倍の閾値以上の倍数変化を調べた（表S4に記載）。これらの解析は、PCAによって予測されたグローバルな縦断的発現パターンを反映していた。1日目と比較した差次的発現（DE）遺伝子の総数は、4日目までの各タイムポイントごとに増加した。4日目までに、153の発現上昇遺伝子と33の発現下降遺伝子を含む186のDE遺伝子があった（図2C-E）。1日目より後のすべての時点の比較において、DE遺伝子は非常に重複しており、大部分が同じ方向に変化していた。例えば、2日目に増加したDE遺伝子のうち、30個中29個が3日目にも増加し、30個中29個が4日目にも増加した。2日目、3日目、4日目と1日目のベースラインとの比較では、合計192個のDE遺伝子が見つかった（表S4）。発現変化の全体的なタイミングや動態など、遺伝子間にはいくつかの顕著な違いがあった。いくつかのDE遺伝子の転写レベルは摂食期間中に突然変化したが、他の遺伝子はより緩やかであった。我々の知る限り、これはマダニ摂食の複数の段階にわたるBbのグローバルな発現変化の最初の包括的な報告である。
我々のデータセットの完全性を評価するため、まず、摂食開始時に活性化される主要な転写プログラム（RpoN/RpoSシグマ因子カスケードおよびHk1/Rrp1二成分系）に関して、これまでに特徴づけられたターゲットの発現プロファイルを調べた（Caimano et al. 1日目から4日目にかけて、予想通り（Hübnerら、2001年）rpoSの発現が増加し（図S3A）、正準標的のospCやdbpAを含む、摂食ダニ（Grassmannら、2023年）のRpoSによって活性化された遺伝子の大部分も有意に発現が上昇した（79/89、p<0.05、Wald検定）（図S3B）。in vitroでRrp1によって活性化または抑制された遺伝子の大部分（Caimano et al., 2015）も、1日目から4日目にかけて、生体外で予想された方向に有意な傾向を示した（111/148発現上昇、37/57発現低下、p<0.05、Wald検定、図S3C）。また、栄養飢餓時にマダニのBbで活性化するもう一つの主要な転写プログラムであるストリンジェント応答の一部として、RelBbuによって制御される遺伝子の発現傾向も調べた（Drecktrah et al.） RelBbuによって制御される遺伝子の約半数は、この間にストリンジェント応答が活性化された場合に予想される方向に変化した（129/251のアップレギュレート、111/226のダウンレギュレート、p<0.05、Wald検定）（図S3D）；しかしながら、摂食にわたって2倍ダウンレギュレートされた遺伝子の多くは、RpoSやRrp1よりもRelBbuによって制御されており、この時間帯にRelBbuが役割を果たしている可能性を示唆している。
次に、縦断的な時間経過における192の2倍DE遺伝子を、温度および/またはpHの調節を通して、未給餌ダニと給餌ダニに近似した培養条件からBb遺伝子の発現変化を測定した2つの先行研究で同定された遺伝子と比較した(Ojaimi et al., 2003; Revel et al., 2002)。1日目から発現が上昇したDE遺伝子の31％（49/158個）は、「非給餌ダニ」条件と比較して「給餌ダニ」条件下で、一方、1日目から発現が低下したDE遺伝子の24％（8/24個）は、「非給餌ダニ」条件下で、一方または両方の研究でより高発現した（図S4Aおよび表S4）。2日目にアップレギュレートされたDE遺伝子に注目すると、研究はより一致するようになる。2日目に発現が上昇したDE遺伝子の70％（21/30）は、これらの先行研究で「ダニを食べた」条件下でより高発現しており、摂食によって見られた最も劇的な遺伝子発現変化の大部分は、これらの先行研究で観察されたものと一致することが示唆された。
また、哺乳類のBb条件を模倣した透析膜室（DMC）対給餌ニンフにおけるBb遺伝子発現の違いを評価した2つの研究（Grassmannら、2023；Iyerら、2015）ともDE遺伝子を比較した。アップレギュレートされたDE遺伝子の63％（100/158）は、給餌されたニンフとDMCの一方または両方の研究で発現が異なっていた（図S4Bおよび表S4）。ニンフでより高発現した遺伝子は、2日目のDE遺伝子に最も集中していた（17/30、57%）。一方、DMCでより高発現した遺伝子は、3日目と4日目のDE遺伝子に集中していた（55/128、43%）。これらの比較から、摂食中の遺伝子発現変化のタイミングと大きさは、遺伝子発現がマダニでピークに達するか、あるいはBbが宿主に感染してから上昇を続けるかを示す可能性が示唆された。
これらの先行研究との比較を通じて、マダニの摂食中に起こる予想される転写傾向の多くを我々のデータが捉えていることを確認できた。とはいえ、2倍DE遺伝子の14％は、これらの異なるマダニ摂食状況において発現が変化することが過去に発見されていなかった（Grassmann et al、 2002）、あるいはこれらのRNA-seq研究でRpoS、Rrp1、またはRelBbu（Caimanoら、2015; Drecktrahら、2015; Grassmannら、2023）に依存していることが同定された（Samuelsら、2021）。これらの追加遺伝子は、マダニ環境における転写を測定する必要性を強調し、Bb感染サイクルのマダニステージに特異的な遺伝子発現変化を明らかにしたことを示唆している。これらの変化の性質と動態から、感染中のマダニにおけるBbの生存、増殖、伝播の潜在的な遺伝的決定要因に関する洞察が得られる。
摂食中にアップレギュレートされるBb遺伝子は主にプラスミド上に存在する。
Bbは複雑で高度に断片化されたゲノムを持ち（Barbour, 1988）（図3A）、その中には病原体の伝播と生存に不可欠な遺伝子が含まれていることを示唆する（Schwartz et al. 実際、プラスミド上で見つかった多くの遺伝子は、環境の変化や異なる宿主環境で発現が変化することが以前に示されている（Iyerら、2015；Ojaimiら、2005；Revelら、2002；Tokarzら、2004）。したがって、1日目からそれ以降の摂食時点まで発現が変化する192個のDE Bb遺伝子（表S4）の多くがプラスミド上に存在すると推論し、ゲノム全体におけるそれらの分布を調べた。これらの先行報告と一致して、発現上昇遺伝子のほとんどがプラスミド上に存在し（143/158；90％）、代謝遺伝子やその他のハウスキーピング遺伝子の大部分が存在する染色体上には少なかった（15/158；10％）（図3B）。対照的に、ダウンレギュレートされた遺伝子の大部分は染色体上に見つかった（27/34、79%）（図3C）。
図3.
摂食中にアップレギュレートされたBb遺伝子は、主にプラスミド上に見いだされた。
(A) Bb B31-S9ゲノムの染色体とプラスミドの模式図。プラスミド名は、プラスミドが直鎖状（lp）か環状（cp）かを示し、プラスミドの長さをキロベース（kb）で示す。例えば、lp17は17kbの直鎖プラスミドである。ゲノムはほぼ縮尺通りに示されている。(B-C）摂食中に発現が2倍に増加（B）または減少（C）した各染色体またはプラスミドからの遺伝子の数。発現上昇遺伝子はプラスミド全体に分布し、発現低下遺伝子は染色体とlp54に見られる。
我々のデータセットで縦断的に発現が上昇したプラスミドにコードされた遺伝子のいくつかは、マダニの摂食時や哺乳類の感染における役割が知られている。すべてのBb分離株に存在する必須プラスミドであるリニアプラスミド54（lp54）（Casjens et al. lp54上の遺伝子の多くは摂食中にRpoSによって制御されることが知られており、その中には宿主での感染性に重要な接着剤DbpAとDbpBをコードする遺伝子も含まれている（Blevins et al.、2008）。このセットには、外表面リポタンパク質BBA64、BBA65、BBA66、BBA71、BBA73のパラロガスファミリーの5つのメンバーも含まれていた。BBA64とBBA66は、マダニに咬まれることによる最適な感染に必要である（Gilmoreら、2010；Pattonら、2013）。これらの結果は、私たちのデータセットが、血液を摂取する際にマダニ内部で生存するために重要であることが知られている、Bbの主要な転写応答を捉えていることを示している。
制御された遺伝子の多くは、cp32プラスミド・プロファージによってコードされていた。Bb株B31-S9は互いによく似た7つのcp32アイソフォームを保有している（Casjens et al.） cp32プロファージが誘導されると、φBB1と呼ばれるファージビリオンが産生される（Eggers and Samuels, 1999）。ファージ構造遺伝子に加えて、cp32は様々なパラロガス外表面タンパク質のファミリーをコードする遺伝子座を含んでいる（Stevenson et al.） cp32遺伝子のうち、摂食に伴って発現が増加したのは、RevA、Erp、Mlpファミリーのメンバーであった（Gilmore et al.）また、cp32-3、cp32-4、cp32-7（BBS45、BBR45、BBO44）のファージターミナーゼとしてアノテーションされたタンパク質をコードする遺伝子など、いくつかのファージ遺伝子が発現上昇した。いくつかのcp32遺伝子は血液の存在に応答して発現を変化させ（Tokarzら、2004）、RelBbuによって制御されるストリンジェントな応答の一部として発現を変化させることが示されている（Drecktrahら、2015）一方、BBD18とRpoSは摂食後にマダニの中腸でプロファージ産生を制御する（Wachterら、2023）。我々のデータから、いくつかのプロファージ遺伝子はマダニ摂食の過程でアップレギュレートされることが示唆され、cp32プロファージは摂食の終盤に誘導される可能性がある。全体として、私たちのデータは、細胞外皮タンパク質、機能未知のタンパク質、プロファージ遺伝子をコードする多くの遺伝子を保有するBbプラスミドが、マダニ摂食の重要な移行期の間、エンゾーティック・サイクルで重要な役割を果たすという長年の考えを支持するものである。
外表面タンパク質をコードするBb遺伝子は、アップレギュレートされた遺伝子の中で非常に多い
摂食期間中に変化した遺伝子の種類とその変化のタイミングを全体的に把握するため、DE遺伝子を機能的カテゴリーに分類した。プラスミド遺伝子の高い割合が、Bbのユニークなタンパク質リッチな外表面内のリポタンパク質、機能未知の遺伝子、および予測されるプロファージ遺伝子をコードしているので（Casjensら、2000；Fraserら、1997）、DE遺伝子の多くがこれらのカテゴリーに分類されると予想した。我々は遺伝子を、細胞エンベロープ、バクテリオファージ、細胞分裂、DNA複製と修復、走化性と運動性、代謝、トランスポータータンパク質、転写、翻訳、ストレス応答、タンパク質分解、未知のいずれかに関連する遺伝子として分類した（Drecktrah et al.
摂食によって2倍に増加した遺伝子のうち、摂食の各日に明らかに大多数を占めたのは、細胞エンベロープ（全158遺伝子中55遺伝子）と機能不明タンパク質（全158遺伝子中69遺伝子）の2つの大カテゴリーで、代謝、走化性と運動性、トランスポーター、バクテリオファージ、細胞分裂、転写に関連する遺伝子は少なかった（図4A）。アップレギュレートされた遺伝子とは対照的に、摂食中にダウンレギュレートされた遺伝子は、翻訳、タンパク質分解、転写、代謝などの機能カテゴリー間でより均等に分布しており、その多くが染色体上に位置していることと一致した。
図4.
外表面タンパク質をコードするBb遺伝子は、アップレギュレートされた遺伝子の中で非常に多い。
(A）マダニの摂食期間中に変化するBb遺伝子の数を機能カテゴリーに分類したもの。付着2日後に初めて変化した遺伝子を黄色、3日後に変化した遺伝子を赤色、4日後に変化した遺伝子を紫色で示す。アップレギュレートされた遺伝子の大部分は細胞外被と未知のカテゴリーに分類される。(B）外表面のリポタンパク質を示すBbの外膜の模式図。リポタンパク質はペリプラスム空間にも存在しうる。(C）外表面リポタンパク質をコードする全遺伝子の発現量を、マダニ摂食4日間にわたる平均Transcripts Per Million（TPM）としてヒートマップ化したもの。青色で強調表示した遺伝子名は2倍アップレギュレートされ、ピンク色で示した遺伝子は摂食期間中に2倍ダウンレギュレートされた（図2参照）。外表面タンパク質をコードする遺伝子の大半は、発現の大きさは異なるものの、摂食を通して発現が増加した。
これらの機能カテゴリー全体の変化を見ると、細胞外皮タンパク質の過剰発現が顕著であったが、予想外ではなかった。Bbの外表面はリポタンパク質で覆われており（図4B）、これらのタンパク質は、Bbがエンゾーティック・サイクルの間に遭遇する様々な環境と相互作用する上で重要な決定因子である（Kurokawa et al.）我々は、注釈付き外表面リポタンパク質（Dowdell et al., 2017; Iyer et al., 2015）の半数以上（83個中46個）が、時間経過とともに発現が2倍変化することを見出した（図4C）。これらのデータから、摂食中のBb外表面で広範な変化が起こっている可能性が示唆された。
外表面リポタンパク質の大部分における発現変化の機能的意味を理解するために、それらの相対発現量も比較した。発現の大きさは大きく異なり、ospA、ospB、ospC、bba59が最も高発現の外表面タンパク質転写産物であった。摂食によって発現が増加することがわかった外表面タンパク質遺伝子の多くは、発現量がかなり少なかった（図4Cおよび表S5）。しかし、これらの集団レベルの測定では発現量が少ないように見えた遺伝子でも、最終的に中腸を脱出するような少数の重要な細胞で高発現していれば、伝達において重要な役割を果たす可能性がある。バルクRNA-seqでは単一細胞レベルで起こっていることを区別することはできないが、今回のデータから、Bbは血液を摂取する間に、これらのリポタンパク質をコードする遺伝子の大半の転写が増加することによって、複雑な外表面の変化を起こしていることが示唆された。
生体外におけるBb細胞のダニ相互作用パートナー候補の同定
私たちのRNA-seqデータから、Bbが脊椎動物の宿主に感染するための準備が整うにつれ、Bbの外表面は摂食の過程で変化することが示唆された。同時にマダニが血液を消化し始めると、マダニの中腸内環境も変化する（Sonenshine and Anderson, 2014）。Bbは運動性を獲得して中腸から唾液腺に移動する前にマダニの腸上皮に付着するため、マダニとBbの相互作用はマダニの血液食事の初期において極めて重要であると考えられる（Dunham-Ems et al.） BBE31やBBA52といったBb外表面タンパク質の中には、マダニ環境との相互作用を通じて病原体の移動に重要な役割を果たすものがある（Kurokawa et al.）私たちは変化するマダニ環境を探索し、Bbがマダニの血液食を通して相互作用できるマダニタンパク質を同定したいと考えた。私たちのBb濃縮プロセスではマダニをある程度保持していたため、Bbと相互作用するマダニタンパク質はこれらのサンプルに存在するだろうと推論した。
摂食中のマダニに起こる変化を概説し、Bbと相互作用するマダニタンパク質の候補を同定するため、質量分析を用いて、摂食の初期と後期に配列決定したBb細胞とともに濃縮されたマダニ物質の含有量を調査した。付着1日後と付着4日後に破砕した感染マダニのαBb濃縮画分からタンパク質を3回に分けて精製した。各日のコントロールとして、in vitroで培養したBbと混合した感染していないマダニの溶解液でもBb濃縮処理を行い、in vivoでのマダニ-Bb相互作用で引き下げられなかったタンパク質を除外するのに役立てた（図5A）。BbおよびI. scapularisのプロテオームに対してクエリーを行ったところ、サンプル複製あたり414から2240のタンパク質群が同定されました。検出されたタンパク質の大部分はマダニ由来であった（2801/2858、98%）。興味のあるタンパク質を同定するため、感染したマダニ内の3複製中少なくとも2複製で検出され、培養Bbと混合した感染していないマダニの2倍の平均カバー率を持つタンパク質を探した。その結果、感染マダニに付着してから1日後にBbが濃縮されたタンパク質が256個（I. scapularis由来251個、Bb由来5個）、感染マダニに付着してから4日後にBbが濃縮されたタンパク質が226個（I. scapularis由来220個、Bb由来6個）見つかった（表S6）。これらのタンパク質のうち、両日とも検出可能だったのはわずか27個（I. scapularis由来24個、Bb由来3個）であったことから、Bb濃縮時に存在するマダニタンパク質は摂食の過程で劇的に変化することが示唆された（図5A）。少数のBbタンパク質のうち、付着後4日目のサンプルではOspCが同定されたが、付着後1日目では同定されず、RNA-seqで確認された発現変化を裏付ける結果となった。各時点で同定されたマダニタンパク質の異なるセットは、摂食中のBb感染マダニの中腸環境で劇的な変化が起こり、マダニとBbの相互作用のランドスケープが変化する可能性を示唆している。
マダニからBbが濃縮されたタンパク質の一部は、特にBbと遭遇する可能性のあるマダニ細胞表面に局在している場合、摂食中にBbと相互作用する重要なパートナーとして有力な候補となる可能性がある。ダニタンパク質の機能および局在については、予測されたものも実験的に検証されたものも乏しいため、ダニタンパク質と細胞外Bbとの相互作用の可能性を十分に評価することは困難である。しかしながら、付着1日後にのみ見つかったタンパク質のうち、10種類がPANTHER遺伝子データベース（Thomasら、2022）を用いて細胞外マトリックスタンパク質に分類され、このカテゴリは統計的に濃縮された（フィッシャーの正確検定、FDR=0.000093）（図5Bおよび表S7）。さらに30個のタンパク質が細胞成分を細胞膜とアノテーションされた。付着4日後、アノテーションされた細胞外マトリックスタンパク質は検出されなかった。しかし、推定低密度リポタンパク質レセプターとしてアノテーションされた2つのタンパク質を含む、膜に存在すると思われる31のタンパク質が同定された（図5Cおよび表S8）。これらの細胞外マトリックスおよび膜タンパク質は、この期間中にBbと直接相互作用する可能性が最も高く、Bbの拡散プロセスにおいて重要なダニタンパク質の候補であると考えられる。Bbがマダニを通して新たな宿主に移動する準備をしながら外表面を再形成する際、変化するマダニ環境に存在するタンパク質が病原体伝播の重要な決定因子となる可能性がある。
図5.
生体外におけるBb細胞のマダニ相互作用パートナー候補の同定
(A）摂食の過程でBbと相互作用するマダニのタンパク質候補を決定する実験の概略図。マダニは付着の1日後と4日後に採取した。同じ時点の感染していないマダニを対照として培養Bbと混合した。RNA-seq実験と同様にαBb抗体でBbを濃縮し、質量分析にかけてサンプル中に存在するダニタンパク質を同定した。ベン図は、3反復のうち少なくとも2反復において、1日目と4日目のサンプルでコントロールよりも濃縮されたタンパク質を示している。Bbで濃縮されるマダニタンパク質は摂食の過程で大きく変化する。(B）細胞外マトリックス（ECM）タンパク質と注釈された、付着1日後に特異的に同定されたダニタンパク質。(C）付着4日後に一意に同定されたダニタンパク質で、低密度リポタンパク質レセプターと注釈されている。ECMおよび膜タンパク質は、Bbと相互作用するタンパク質の良い候補である可能性がある。
考察
ベクター媒介病原体は、節足動物によって媒介され、新たな血液食宿主に定着するため、異なる環境に適応しなければならない。マダニ媒介性のライム病病原体Bbは、1回の血液食事の間にベクター内で転写変化を起こす。例えば、発現変化によって摂食中のマダニの生存が可能になり（He et al., 2011）、血液食宿主への複数の内部区画を介した伝播が促進され（Kurokawa et al., 2020）、次の宿主への感染を成功させるための細菌の準備が整う（Kasumba et al.）急速に成長し、血液で満たされたマダニ内部のBb物質の相対量が少ないため、生体内で起こるこれらの変化を捉えることは困難であった。現在までのところ、マダニから宿主への感染過程におけるBbの発現に関する理解の多くは、マダニの摂食過程における遺伝子の小さなサブセットの変化を追跡することによって得られている（Bykowski et al.、2007；Gilmore et al.、2001；Narasimhan et al、 2002）、ライフサイクルにわたる環境変化に近似したBb培養条件の活用（Ojaimi et al., 2005; Revel et al., 2002; Tokarz et al., 2004）、マダニ以外の転写制御系の定義（Caimano et al.）ここでは、マダニから分離されたBb個体群の遺伝子発現を、より直接的かつ経時的にプロファイリングするために、RNA-seqベースの実験的戦略を開発した。
マダニから分離したBb細胞のトランスクリプトームを縦断的に収集することで、Bbの適応と伝播の機能的決定要因を明らかにするためのリソースおよび出発点となる。我々は、摂食1日目とそれ以降で2倍変化した192遺伝子に焦点を当てて解析を行った。これらの遺伝子は、Bbの発生サイクル全体を通して転写変化をプローブした先行研究で見出されたものと非常に一致していたが（Caimano et al., 2019, 2015; Drecktrah et al., 2015; Grassmann et al., 2023; Iyer et al., 2015; Ojaimi et al., 2003; Revel et al., 2002）、我々のトランスクリプトーム・プロファイルは、これらの先行研究では観察されなかった26遺伝子の発現変化を明らかにした。これらの新規遺伝子の発現変化は、192のDE遺伝子の全てと同様に、機能未知の遺伝子や外表面タンパク質をコードする遺伝子に集中していた。取り組むべき課題は多いが、Bbのライフサイクルに対する機能未知遺伝子の寄与を明らかにする努力は、マダニ媒介感染症のユニークな側面を理解する上で画期的なものとなる可能性がある。我々のデータから、Bbの外表面タンパク質の発現が、これまで評価されていたよりも広範囲に変化していることが明らかになった。細胞外表面タンパク質をコードする9つの遺伝子が、摂食によって発現が増加した。外表面タンパク質をコードする遺伝子の広範な変化から、Bbは摂食中のダイナミックなマダニ環境をナビゲートするために、季節によるタンスの変化と同様に、外皮を積極的にリモデリングしていることが示唆された。このような外表面の変化は、マダニ内でのBbの持続性、細胞接着、あるいはマダニ内部や脊椎動物宿主での免疫回避に関与している可能性がある（Kenedy et al.）病原体と媒介動物の中腸との分子間相互作用が、伝播の重要な決定要因であることは以前から観察されている（Barillas-Muryら、2022年）。Bb表面の修飾は、マダニのコンパートメントを物理的に移動するのに重要な、マダニと病原体のさまざまな相互作用を促進する可能性がある。
Bb外表面タンパク質とその機能的影響に関するより包括的な知識は、ライム病の蔓延を抑制する新たな手段につながる可能性がある。媒介病原体に対する防御ワクチンは、病原体がコードする表面タンパク質を標的とすることが多い（Kovacs-Simon et al.）これまでのライム病ワクチン開発は、高発現のBb外表面タンパク質OspA（Steere et al. 本研究は、探索可能な新しいBb候補のカタログを提供するものである。さらに、マダニから分離したBb細胞をエサとして用いた生化学的プルダウン法により、マダニとBbの相互作用に関与する可能性のあるマダニタンパク質の予備的リストを発見した。感染に機能的に重要な分子間相互作用をブロックすることも、治療戦略として検討される可能性がある（Barillas-Muryら、2022；Manning and Cantaert、2019）。
マダニの摂食中に発現が変化する遺伝子を同定するために、マダニ中のBbの存在量が少ないことを克服するために、Bbを標的とする抗体を用いた。この方法によって、時間経過にわたってトランスクリプトームを広範囲にカバーすることができたが、注意点もある。培養Bbでは1時間の濃縮操作で遺伝子発現に大きな変化は生じないことが確認されたが、生体外サンプルでは遺伝子発現に影響を与える可能性がある。αBb抗体はOspAやその他多くのタンパク質を標的としているが、マダニ内部のBbの大半を捕捉したが、すべてを捕捉したわけではない。この損失により、ある程度のバイアスが生じる可能性がある。さらに、P. fulvaにマッピングされた4日目のリードが多いことから、この抗体は他の細菌種を濃縮している可能性がある。また、私たちの方法では餌を与えていないマダニのBbから一貫した発現データを得ることができなかったため、研究の縦断的な範囲が制限され、餌を与えてから最初の24時間に起こる重要な変化が見落とされる可能性があることも重要である。この困難さは、扁平なニンフではBbの数が少ないこと（de Silva and Fikrig, 1995）、あるいはマダニの摂食間隔が長く栄養不足の期間が続くことによるストレス（Kung et al.） TBDCapSeqのようなRNA-seqライブラリー調製後の濃縮（Grassmann et al. このような注意点はあるものの、このタイプの抗体ベースの濃縮戦略は、摂食中のマダニの複数のタイムポイントからBbからの遺伝子発現をプローブできるシンプルで柔軟な手法である。このプロトコールは、わずかな改良を加えるだけで、Bbや他の環境に生息する他のボレリア種の塩基配列決定を容易にしたり、他のダニ媒介細菌種を濃縮するのに役立つ可能性がある。
この方法は、マダニ媒介感染症の主要因を理解するための出発点となる、ライフサイクルのベクター段階におけるBb集団レベルの変化に関する重要な洞察を提供するトランスクリプトームリソースを作成した。マダニの全病原体集団のうち、摂食中に次の宿主に最終的に感染するBb細胞は驚くほど少ない（Dunham-Emsら、2009；Regoら、2014）。マダニに寄生するBb細胞集団内には、摂食中のマダニ中腸内の細胞間で不均一に発現するタンパク質を含め、このような差のある結果に寄与する重要な分子変異が存在する可能性がある（Ohnishi et al.）集団全体では変化していないように見える遺伝子や発現レベルの低い遺伝子でも、少数派の細胞では感染に大きな役割を果たしている可能性があり、単一細胞レベルでのトランスクリプトーム解析が鍵となる。我々の研究は、ダニ-微生物研究の解像度を大幅に向上させるために活用できる基礎的な方法論を提供するものである。この研究から生まれた技術的進歩により、マダニ媒介病原体のユニークな生活様式に関する驚くべきメカニズム的洞察が得られるかもしれない。
方法
B. burgdorferiの培養
Bb株B31-S9（Rego et al., 2011）はPatricia Rosa博士（NIAID, NIH, RML）から提供され、BSK II培地で35℃、2.5% CO2で培養した。すべてのRNA-seqおよびBb濃縮実験にはB31-S9を用いた。αBbウエスタンブロットで用いた野生型Bb株B31-A3、ospA1変異体（ospA1）およびospA復元型Bb（ospA+B1）（Battisti et al.
マダニ摂食実験
I.scapularisの幼虫は、RNA-seq実験ではオクラホマ州立大学（OSU）のTick Labから購入し、質量分析実験では疾病管理センターの一部門であるBEI Resourcesから提供された。給餌前と給餌後のマダニは、相対湿度95％（硝酸カリウム飽和溶液）のガラス瓶に入れ、22℃、16時間／8時間（明／暗）の光サイクルで密閉インキュベーター内で飼育した。動物実験はUCSFのInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）の承認（Project Number AN183452）に従って行った。ダニはJackson Laboratoriesから入手した若齢（4～6週齢）の雌性C3H/HeJマウスを用いた。マウスはケタミン／キシラジンで麻酔した後、100匹以下の幼虫マダニまたは30匹以下の幼虫マダニを配置した。幼ダニをインキュベーターに入れ、脱皮させてからニンフとして実験に用いた。ニンフマダニは、摂食中のさまざまな時期（配置から1～3日後）にイソフルラン麻酔をかけたマウスから引き剥がすか、あるいは摂食させて補充し、マウスケージから回収した（配置から4日後）。
αBb抗体によるウェスタンブロット
αBb抗体がospAを標的とするかどうかを調べるため、野生型Bb（B31-A3）、ospA1変異体（ospA1）およびospA復元型Bb（ospA+B1）（Battisti et al. 3mLの培養液を8000×gで7分間遠心し、PBSで2回洗浄した。ペレット化した細胞を50 µLの水で溶解し、サンプルあたり25 µgのタンパク質を5Xローディング色素（0.25% Bromophenol Blue、50% Glycerol、10% Sodium Dodecyl Sulfate、0.25M Tris-Cl pH 6.8、10% B-Mercaptoethanol）と混合し、Mini-PROTEAN TGX 4-15%ゲル（Biorad）で実行し、Trans-Blot Turbo Transfer System（Biorad）を用いて転写した。転写後、ブロットをTBST（0. 1% tween）中で4℃で30分間ブロッキングした後、1:10,000に希釈したαBb抗体（Invitrogen: PA1-73004; RRID: AB_1016668）で室温で1時間処理し、続いて1:5,000に希釈した抗ウサギHRP二次抗体（Advansta: R-05072-500; RRID: AB_10719218）で室温で45分間処理した。Clarity Western ECL Substrate（Biorad）を用いてブロットを露光し、Azure C400 imaging system（Azure Biosystems）を用いて画像化した。この実験を3回繰り返した。
摂食マダニからのBbの濃縮
摂食マダニ由来のBbからRNAを配列決定するため、Bbを濃縮してマダニ材料に対するBbの比率を高めた。104個のBbを腹腔内および皮下に注射してBbに感染させた3匹のマウスに、幼虫のマダニを補食させた。約5ヵ月後、脱皮した幼ダニを8匹のマウスに給餌し、給餌中は個別に飼育した。未給餌のニンフ12匹をBSK II培地で破砕し、数日後に生存Bbを確認することで、マダニの83%がBbに感染していると推定した。すべてのマウスからマダニを抜き取り、配置から1日後（14匹／複製）、2日後（12匹／複製）、3日後（6匹／複製）の4つの生物学的複製にプールし、配置から4日後にケージから回収した（7匹／複製）。回収後すぐにマダニを水で洗浄し、500 µLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中、2 mLのガラス製ダウンス粉砕機（Kimble）に入れた。ダニをまず大型クリアランスペストル、次に小型クリアランスペストルでホモジナイズした。ホモジネートを1.5 mLのエッペンドルフチューブに移し、500 µLのPBSを加えて合計1 mLとした。この段階で、50 µLのホモジネートをインプットサンプルとして取り出し、RNA抽出用に500 µLのTRIzol（Invitrogen）と混合した。2μLのαBb抗体（Invitrogen: PA1-73004; RRID: AB_1016668）をホモジネートに加え、4℃のヌテーターで30分間インキュベートした。インキュベーション中、サンプルあたり50μLのDynabeads Protein G（Invitrogen）をPBSで2回洗浄した。抗体とのインキュベーション後、ホモジネートと抗体の混合物をビーズに加えた。この混合物を4℃のヌテーターに30分間置いた。その後、チューブを磁石の上に置いてビーズを固定し、ホモジネートを取り除いて保存し、枯渇サンプルを作製した。枯渇ホモジネートを8,000 x gで7分間遠心し、900 µLの上清を除去し、500 µLのTRIzolをペレットに加え、枯渇サンプルを作成した。ビーズを1mLのPBSで2回洗浄し、その都度ビーズを再懸濁した。回目の洗浄を除去し、500 µLのTRIzolをビーズに添加し、濃縮サンプルを作製した。オンカラムDNase処理付きZymo Direct-zol RNA Microprep Kit（Zymo Research社製）を用いて、すべての入力サンプル、濃縮サンプル、枯渇サンプルからRNAを抽出した。ステップごとのBb濃縮プロトコルは、dx.doi.org/10.17504/protocols.io.36wgqjrbovk5/v1で入手できる。
培養からのBb濃縮
Bb濃縮プロセスによって遺伝子発現レベルが変化するかどうかを調べるため、培養Bbに対して濃縮プロトコルを行った。BSK II培地中のBbのチューブを35℃で9×104Bb/mLまで増殖させた。1mLの培養液を8,000×gで7分間スピンダウンし、培地を除去した後、Bbを1mLのPBSで洗浄し、再度スピンダウンした。ペレット化したBbを1mLの新しいPBSに再懸濁した。これらのサンプルは、Bb濃縮プロトコルの開始ホモジネートとして使用され、インプット、濃縮、および枯渇フラクションが上記のように収集された。これらのサンプルからのRNA-seqライブラリーを調製し、以下のように配列決定した。
RNA-seqライブラリーの調製と配列決定
濃縮Bb RNAからRNA-seqライブラリを作成するために、50 ngの全RNAをNEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina（New England BioLabs）へのインプットとして使用した。ライブラリーは、全RNAから開始したにもかかわらず、精製mRNAまたはrRNAを除去したRNAでキットを使用する場合の製造元のプロトコールに従って調製した。ライブラリーは、NEBNext Multiplex Oligos for Illumina Dual Index（New England BioLabs）を用いてバーコード化した。
ダニ、Bb、またはマウスrRNA由来のライブラリーからリードを除去するために、カスタムデュアルガイドRNA（dgRNA）を用いてRNA-seqライブラリー中の不要なリードにCas9をターゲティングするDepletion of Abundant Sequences by Hybridization（DASH）（Gu et al.） dgRNAは、DASHitソフトウェア（Dynerman et al.、2020）を用いて設計したダニrRNA、マウスrRNA、およびBb rRNA内の短い配列を標的とした。これらの配列を標的とするcrRNAオリゴ（表S9）を注文した（Ringら、2022）。dgRNAを転写するために、以下のようにdgRNA V2の体外転写のプロトコル（Lydenら、2019b）に従った。tracrRNAおよびプールしたcrRNA DNAテンプレートの両方を、95℃で2分間加熱し、室温までゆっくり冷却することにより、等モル量のT7プライマーにアニールさせた。アニールした鋳型を、1 mL in vitro 転写反応に用いた： 120 μL10X T7バッファー（400 mM Tris pH 7.9、200 mM MgCl2、50 mM DTT、20 mM スペルミジン（Sigma））、100 μLのT7酵素（E. Crawfordのカスタムプレップ酵素、T7バッファーで1:100に希釈、最終濃度： 100μg/mL）、300μlのNTP（各25mM、Thermo Fisher Scientific）、4μgのアニール済みcrRNA鋳型または8μgのアニール済みtracrRNA鋳型、および水を1mLに調製した。in vitro転写は37℃で2時間行った。反応液はZymo RNA Clean & Concentrator-5 Kit（Zymo Research社製）で2回精製した。DASH用のdgRNA複合体を形成するために、crRNAとtracrRNAを80μMに希釈し、等モル量で混合し、95℃で30秒間加熱し、室温までゆっくり冷却してアニーリングさせた。
dgRNAの転写後、DASHプロトコルバージョン4（Lyden et al. 2.5μLの10X Cas9バッファー、5μLの20μM Cas9（New England BioLabs）、および5μLの40μM転写dgRNAを混合することによって、Cas9および転写dgRNAを前処理した。混合物を37℃で5分間インキュベートした後、7.5μLのRNA-seqライブラリー（2.8nM）を加えた。混合物を37℃で1時間インキュベートした後、PCR産物プロトコールに従ってZymo DNA Clean & Concentrator-5（Zymo Research社製）を用いて精製し、DNAを10.5μLの水に溶出した。クリーンアップの間、Cas9を再びバッファーおよびdgRNAと混合し、37℃で5分間インキュベートした。クリーンアップの後、溶出したDNAを2回目のCas9-dgRNA混合物に加え、37℃で1時間インキュベートした。その後、1μLのプロテイナーゼK（New England Biolabs）を加え、混合物を50℃で15分間インキュベートした。その後、ライブラリーを標準プロトコールに従って0.9倍量のsparQ PureMag Beads（QuantaBio社製）で精製し、24μLの水で溶出した。rRNAを除去したRNA-seqライブラリーを、BioRad CFX96でKapa HiFi Real-Time Amplification Kit（Roche）を用いて、25μLのマスターミックスと50μLの反応で増幅した、 23μLのDASHedライブラリープール、および2μLのイルミナP5（5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT）およびP7（5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT）プライマーの25μMミックス。増幅のためのqPCRプログラムは以下の通りであった： 98℃、45秒（1サイクル）、（98℃、15秒、63℃、30秒、72℃、45秒、プレート読み取り、72℃、20秒）を10サイクル（3日目と4日目のサンプル）または11サイクル（1日目と2日目のサンプル）。ライブラリーは、増幅の指数期を離れる前にサイクリング条件から除去し、標準プロトコールに従って0.9倍容量のsparQ PureMag Beadsで精製した。
DASH後、RNA-seqライブラリーをIllumina NovaSeq S2（2レーン）でペアエンド100塩基対リードでシーケンスした。in vitro培養コントロール実験からのライブラリーは、ペアエンド75塩基対リードでIllumina NextSeqでシーケンスした。in vitro対照実験（GSE217146）およびex vivo実験（GSE216261）のFASTQファイルおよび生のBbリードカウントは、NCBIのGene Expression Omnibus（Edgarら、2002）にSuperSeriesアクセッション番号GSE217236で寄託されている。
RNA-seqデータ解析
ダッシュ
DASHによるrRNA枯渇の成功を測定するため、DASHitソフトウェア（Dynerman et al., 2020）を用いて、ガイドRNAによってDASH可能なリードの割合を決定した（Ring et al., 2022）。DASH前のデータについては、MiSeq V2 Micro（Illumina）でDASHを実行する前に、各RNA-seqライブラリーのインプットをシーケンスした。DASH前後の各ライブラリーからseqtk（https://github.com/lh3/seqtk）により選択された200,000ペアエンドリードのランダムサブセットでDASH可能性をテストした。DASH前後のDASH可能リードを比較する対のt検定は、GraphPad Prism v9.5.1を用いて行った。
差次的発現解析
RNA-seqデータをBbにマッピングするために、ゲノムのプラスミド全体に見られる多くのパラロガス遺伝子ファミリーに由来するリードのマッピングを最適化したいと考えた。このため、同一遺伝子の異なるアイソフォームに由来するリードを正確にマッピングするために使用される擬似アライメントツールSalmon v1.2.1（Patro et al. CDS配列へのマッピングにSalmonを使用することで、パラロガス遺伝子へのマッピングが改善される可能性がある一方で、オペロンに存在する遺伝子の末端に位置するリードのマッピングが減少するというトレードオフが生じる可能性もある。とはいえ、すべてのサンプルが同様の影響を受けるはずであり、過少カウントがあっても、差次的発現の結果は変わらないはずである。リードはまず、Trim Galore v0.6.5（https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore）を介して、Cutadapt（Martin, 2011）を用いて品質スコア20未満の塩基をトリミングした。リードは参照トランスクリプトームとしてBb CDS配列にマップした： NCBI Genbank GCA_000008685.2 ASM868v2（プラスミドlp5、cp9、lp56はB31-S9に存在しないため削除）を参照トランスクリプトームとして、Salmonを用いて以下のパラメータでマッピングした： --validateMappings --seqBias --gcBias。マッピングの前に、全ゲノムをデコイとしてSalmon indexコマンドを使用してトランスクリプトームのインデックスを作成し、--keepDuplicatesパラメータで重複遺伝子をすべて保持した。
Salmonからのリードカウントは、Rバージョン3.6.1での微分発現解析のためにDESeq2 v1.24.0 (Love et al., 2014)への入力として使用した。DESeq2関数PlotPCA()は、varianceStabilizingTransformation()関数を実行した後、リードカウントからPCAプロットを作成するために使用した。日間の発現差解析には、DESeq()関数を用いてカウントデータからDESeqオブジェクトを作成した。apeglmメソッドを用いたlfcShrink()関数（Zhu et al. DESeq2はBenjamini-Hochberg多重検定補正を使用し、解析の大部分を調整p値<0.05を持つ遺伝子に焦点を当て、条件間で2倍変化する遺伝子を必要とする追加カットオフを使用した。微分発現解析に使用したコードは、https://github.com/annesapiro/Bb-tick-feeding。
他の生物種へのマッピング
RNA-seqライブラリー中の非Bbリードのソースを決定するために、トリミングリードをSTAR v2.7.3a (Dobin et al., 2012)を用いてダニおよびマウスゲノムにマッピングした。I. scapularis ISE6ゲノム（RefSeqアセンブリGCF_002892825.2, ISE6_asm2.2_dedeplicated）（Miller et al., 2018）は、STARのランモードgenomeGenerateで--genomeChrBinNbits 18オプションを使用してインデックスを作成した。Mus musculus genome GRCm39 (RefSeq assembly GCF_000001635.27)は、STAR run mode genomeGenerateを用いて基本オプションでインデックスを作成した。各ゲノムにSTARを用いて基本オプションでリードをマッピングした。これらのゲノムにマップされたリードの割合は、ユニークにマップされたリード、複数の遺伝子座にマップされたリード、多すぎる遺伝子座にマップされたリードの割合を加算して求めた。4日目のサンプルでダニ、マウス、Bbにマップされなかったリードの潜在的なソースを特定するために、1日目と4日目のライブラリーの100万リードをCZ ID（Kalantar et al. 次に、Bowtie2（Langmead and Salzberg, 2012）の標準オプションを使用して、全RNA-seqライブラリーをP. fulvaゲノム（NCBI GenBank GCF_001186195.1 ASM118619v1）にマッピングし、全体のアライメント率を計算した。
他の研究との比較
先行研究で同定された遺伝子を、時間経過に伴う発現変化と比較した。ここでは、Grassmannら2023年に見出された、摂食したニンフとDMCの両方でRpoSにより発現が上昇した遺伝子、およびマダニ感染時のみRpoSにより発現が上昇した遺伝子（Grassmannら、補足表5および6）をRpoS制御遺伝子とみなした。本研究では、RpoSは摂食したニンフではどの遺伝子の発現も抑制しなかった。DMCのみにおいてRpoSによりアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた遺伝子（Grassmannら、補足表7および8）は、この研究の以前のバージョンにおいてRpoS比較に使用されたCaimanoら2019（表2および3）のDMCにおいてRpoSにより制御されることが見出された遺伝子とともに、参考のために表S3および表S4に記載されている。Rrp1アップレギュレートおよびダウンレギュレート遺伝子は、Caimanoら2015、表S2においてin vitroで同定されたものであった。RelBbuアップレギュレートおよびダウンレギュレート遺伝子は、Drecktrah et al. 2015によって3つの異なるin vitro条件：飢餓（表S6およびS9）、回復（表S7およびS10）、定常期（表S5およびS8）で調べられた。簡単のため、これらの条件の1つ以上で発現が増加または減少した遺伝子をRelBbuが発現している遺伝子とみなした（表S3およびS4）。1つの遺伝子は条件間で相反する方向に制御されており、表では「両方」と記し、比較解析から除外した。Revel et al. 2002の "unfed tick "と "fed tick "の培養条件間で変化した遺伝子は表3のものである。Ojaimi et al. 2003 Table 4の遺伝子のうち、in vitroでの発現が25℃に対して35℃で増加したものは "feed tick "で高発現とみなし、Ojaimi et al. 2003 Table 5の遺伝子のうち、35℃に対して25℃で発現が増加したものは "unfed tick "で高発現とみなした。Iyerら2015のDMCよりもニンフで高発現する遺伝子は表S4に、ニンフよりもDMCで高発現する遺伝子は表S8に見出した。Grassmannら2023のニンフとDMCの間で差次的に発現した遺伝子は、少なくとも3倍の差およびq値＜0.05という彼らのカットオフに従って、補足表3に見出されたWT DMC対Fed Nymphsの間のDESeq2比較から決定された。これらの研究の多くはBbの異なる株と異なるゲノムアノテーションを用いたため、いくつかの遺伝子はここで用いたB31-S9株には存在しないため、ここでは検討しなかった。
遺伝子の分類
遺伝子を機能グループに分類するために、機能カテゴリーは利用可能な場合は(Drecktrah et al., 2015)から得た。その他の遺伝子機能は(Fraser et al., 1997)から得た。共転写された「後期」バクテリオファージオペロン（Zhang and Marconi, 2005）内に見出された遺伝子は、その機能が不明であっても「バクテリオファージ」とみなした。外表面タンパク質は、Dowdellら, 2017で見出されたものに加え、Dowdellら, 2017でも見出されたIyerら, 2015に列挙された追加の外表面タンパク質を用いた。 2017のSupporting Table S2のカテゴリーでは、外表面局在の証拠としてSpIIとSpIを挙げた。外表面およびペリプラスムのリポタンパク質は、他の分類がない場合は「細胞エンベロープ」に分類した。(Casjensら, 2000)の遺伝子ファミリー情報が分類を助けるために考慮された。表S4に各遺伝子の分類元を示す。
Bb濃縮を測定するRT-qPCR
Bb濃縮プロトコルの有効性を検証するために、濃縮画分および枯渇画分におけるBb flaBおよびI. scapularis gapdh転写物レベルを定量化するためにRT-qPCRを用いた。cDNAは、qScript cDNA合成キット（Quantabio）を用いて、付着後2日目、3日目、4日目のBb濃縮サンプルおよびそれにマッチする枯渇サンプルから抽出した8μLのRNAから合成した。cDNAはqPCRで使用する前に2倍に希釈した。flaBコピーを測定するために、精製したPCR産物から濃度既知の標準品を作成した。これらの標準品は以下の配列を持つプライマーでPCRを行った： 5'-CACATATTCAGATGCAGACAGGTTCTAおよび5'-GAAGGTGCTGTAGCAGGTGCTGGCTGT。このPCR鋳型を106コピーと101コピーの間で10倍に希釈した希釈系列を、濃縮サンプルと枯渇サンプルと並行して行った。qPCRは、Taqman Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）を用いて行った。flaBの増幅に用いたプライマーは以下の通りである： 5'-TCTTTTCTCTGGTGAGGGAGCTおよび5'-TCCTTCCTGTTGAACACCCTCT（900nMで使用）、プローブは/56-FAM/AAACTGCTCAGGCTGCACCGGTTC/36-TAMSp（250nMで使用）であった。tick gapdh RT-qPCRでは、cDNAサンプルをさらに2倍に希釈した。qPCRプライマー配列を用いて濃度既知のスタンダードを作成した： qPCRはPowerUp SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）を用いて行った。flaBとgapdhの両方について、各サンプル中のコピー数は既知の濃度の標準物質に基づいて計算した。各時点における4つの生物学的複製から、3つのテクニカルレプリケートを平均した。それぞれの濃縮画分と枯渇画分に含まれるコピー数を合計し、いずれかのサンプルに含まれるflaBまたはgapdhの割合を算出した。すべてのqPCRはQuantStudio3 Real-Time PCR System（Applied Biosystems）で行った。ペアのt検定はGraphPad Prism v9.5.1を用いて行った。
免疫蛍光顕微鏡検査
αBb抗体がマダニ内部のBbを認識するかどうかを調べるため、各摂食日のマダニを50 µLのPBS中で破砕した。10µLの溶解液をスライドにスポットし、風乾させた後、スライドを炎で3回短時間加熱した。熱固定したスライドをアセトンで1時間処理した。スライドをαBb一次抗体（PBS+0.75%BSAで1:100に希釈）と共に37℃、30分間、加湿器でインキュベートした。一次抗体なしのコントロールも各日使用した。スライドをPBSで1回、室温で15分間洗浄した後、蒸留水ですすぎ、風乾した。PBS + 0.75% BSA で 1:100 に希釈した抗ウサギ IgG Alexa 488 (Invitrogen: A-11008; RRID: AB_143165)を加湿スライドチャンバー内で 37℃、30 分間添加した。スライドをPBSで15分間、室温で3回洗浄し、2回目の洗浄時に1:100ヨウ化プロピジウム（Invitrogen）を加えた。その後、スライドを蒸留水ですすぎ、風乾した後、マウント用メディウム（Fluoromount-G、SouthernBiotech）とカバースリップを加えた。蛍光イメージングは、100X/1.40対物レンズを用いた広視野エピ蛍光用Nikon Ti2倒立顕微鏡で行った。画像はNIS-Elements AR View 5.20で撮影し、ImageJソフトウェア（Schneider et al.）一次抗体を含まないコントロールスライドでは、強い蛍光シグナルは観察されなかった。
Bb濃縮サンプルの質量分析
Bb濃縮後のサンプルからどのマダニタンパク質が検出されたかを同定するため、非感染マダニと感染マダニの両方をマウスに摂取させた。非感染マダニ付着1日後（1反復あたり11マダニ）、感染マダニ付着1日後（1反復あたり27マダニ）、非感染マダニ付着4日後（1反復あたり8マダニ）、感染マダニ付着4日後（1反復あたり16マダニ）の生物学的複製を3回採取した。αBb濃縮の前に、感染していないマダニ試料をPBSで洗浄した培養液中で増殖したBb（付着1日後に3×104Bb、付着4日後に3×106Bb）と混合し、混合溶解液を室温で30分間回転させた。感染したダニ試料は直ちにBb濃縮工程を行った。濃縮工程はRNA-seqに用いたのと同じプロトコールに従った。必要に応じてサンプル量を1 mLに増やし、2 µLのαBb抗体（Invitrogen: PA1-73004; RRID: AB_1016668）を加え、サンプルを4℃で30分間回転させた。このインキュベーションの間に、サンプルあたり50μLのDynabeads Protein GをPBSで洗浄し、溶解液に加え、4℃で30分間回転させた。ビーズを1mLのPBSで2回洗浄し、50μLの溶解バッファー（iST LYSE、PreOmics）に入れた。サンプルを95℃で5分間煮沸し、溶解液をビーズから取り出して質量分析準備のために凍結した。
質量分析には、CaptiveSpray Source（Bruker）を装備したtimsTOF ProにnanoEluteをインラインで取り付けた。クロマトグラフィーは、25cm逆相C18カラム（PepSep）を用いて、40℃で0.5μL min-1の一定流速で行った。移動相Aは98/2/0.1%水/MeCN/ギ酸(v/v/v)、B相は0.1%ギ酸(v/v)を含むMeCNであった。108分間のメソッド中、ペプチドは3ステップのリニアグラジエント（5%から30%のBで90分間、30%から35%のBで10分間、35%から95%のBで4分間）で分離され、その後95%で4分間のアイソクラティックフラッシュを行った後、洗浄し、低有機条件に戻した。実験は、PASEFモードでイオンモビリティを活性化し、データ依存のアクイジションとして実行した。MSおよびMS/MSスペクトルはm/z 100から1700で収集し、z = +1のイオンは除外した。
生データファイルはPEAKS Online Xpro 1.6 (Bioinformatics Solutions Inc.)を用いて検索した。プリカーサー質量の許容誤差は20ppm、フラグメント質量の許容誤差は0.03に設定した。I. scapularis reference proteome (Proteome ID UP000001555, taxon 6945)およびBb reference proteome (Proteome ID UP000001807, strain ATCC 35210/B31)はUniprotからダウンロードした。I.scapularisプロテオームを一次検索リファレンスとし、Bbは存在する細菌タンパク質を同定するための二次検索として使用した。カルバミドメチル化は固定修飾として選択された。酸化（M）と脱アミド化（NQ）は可変修飾として選択した。
実験は生物学的3連で行い、サンプルは装置上で1回実行した。データベース検索（-10 log(p-value)≥20、1%ペプチドおよびタンパク質FDR）で存在するタンパク質は、以下のろ過プロセスにかけた。タンパク質は、それぞれの日（付着後1日または4日）内に、3つの生物学的複製のうち2つで見つかったものだけを含むようにフィルタリングされた。感染していないサンプルと感染したサンプルで見つかったタンパク質の平均面積を計算した。各タンパク質の平均面積の比を感染／非感染として計算し、それぞれの摂食日（付着後1日または4日）内に感染／非感染の比が2より大きいタンパク質を濃縮タンパク質として同定した。
同定されたタンパク質を機能グループに分類するために、PANTHERバージョン17.0（2022年02月22日リリース）を用いたPANTHER Overrepresentation Test（2022年07月12日リリース）を使用した（Mi et al. データベース内のすべてのI. scapularis遺伝子を参照リストとして使用し、各日に濃縮されたすべてのタンパク質をPANTHERタンパク質クラスについて解析した。使用した検定タイプはFisher's Exactで、補正として偽発見率を計算した。生データファイルと検索されたデータセットは、Proteome Xchangeコンソーシアムの正会員であるMass Spectrometry Interactive Virtual Environment (MassIVE)で、識別名で利用できる： MSV000090560。
データの利用可能性
シーケンスデータについては、in vitro対照実験（GSE217146）およびex vivo実験（GSE216261）のFASTQファイルおよび生のBbリードカウントが、NCBIのGEOデータベースにSuperSeries accession number GSE217236で寄託されている。質量分析データについては、Mass Spectrometry Interactive Virtual Environment (MassIVE)の識別子で生データファイルと検索されたデータセットが利用できる： MSV000090560。データ解析に使用したコードは、https://github.com/annesapiro/Bb-tick-feeding。
補足表
表S1. 16のBbシーケンスサンプルから得られたマッピング統計の概要。
表S2. Bb濃縮前後のin vitro培養Bb間の差次的発現解析結果。
表S3. マダニ給餌のタイムポイントにまたがるBbからのトランスクリプトーム全体の差次的発現解析結果。
表S4. マダニ摂食のタイムポイントをまたいだBb遺伝子の2倍差発現。
表S5. 摂食タイムポイントにわたるBb遺伝子の全トランスクリプト数（TPM）。
表S6. Bb濃縮サンプルの質量分析。
表S7. 給餌1日目に濃縮されたダニタンパク質のアノテーションとGO用語の濃縮。
表S8. 摂食4日目に濃縮されたダニタンパク質のアノテーションとGO用語の濃縮。
表S9. DASHで使用したマダニ、マウス、およびBb rRNA配列を標的とするcrRNA。
謝辞
プロジェクトを通してフィードバックをくれたChou研究室の全メンバー、特にマダニの摂食を手伝ってくれたFauna YarzaとPatrick Rockefeller Grimes、管理補助をしてくれたEthel Enoex-Godonooに感謝する。また、Amy LydenとEmily CrawfordにはDASHのサポートと試薬を、Olga BotvinnikとThe Chan Zuckerberg Biohubシークエンシングチームにはインプットとシークエンシングのサポートをいただいた。Patricia Rosa氏、Jenny Wachter氏、Scott Samuels氏、Meghan Lybecker氏には、本プロジェクトに関するフィードバックをいただいた。また、William Hatlebergには図解を手伝ってもらった。本研究は、SVCF-Wave FundからAnne SapiroへのLife Sciences Research Foundationフェローシップ、Arnold and Mabel Beckman FoundationからBalyn ZaroへのBeckman Young Investigator賞、CZ Biohub、Pew Biomedical Research Foundationからの助成金、Seemay ChouへのNIH助成金1R01AI132851、Patrick SecorとMargie KinnersleyへのNIH INBRE助成金P20GM103474によって行われた。
利害関係
Seemay Chouはアルカディア・バイオサイエンスの社長兼CEOである。
図S1.
αBb抗体はOspAを認識し、マダニ中のBbと血液を介して結合する。
(A)培養Bbの溶解液にαBbを用いたウェスタンブロット：野生型(A3、左)、ospAを欠く変異体(ospA1)、ospAを復元した変異体(ospA+B1)(Battisti et al., 2008)。αBbは他のタンパク質の中でもOspAを認識する。(B) 餌を与えた各日のαBb（緑、左）とヨウ化プロピジウム（PI）（DNA、赤、中央）による免疫蛍光顕微鏡観察（マージは黄色、右）。 αBb抗体は血液を介したマダニ中のBbを認識する。
図S2.
濃縮プロセスはin vitro培養Bbにおいて大規模な遺伝子発現変化を誘導しない。
培養BbインプットとαBbによる濃縮後のサンプルを比較した対数2倍変化対平均正規化カウント数。赤い点、p値<0.05、Wald検定。処理中に誘導された遺伝子発現変化は、給餌日数間で観察されたものよりはるかに小さい。
図S3.
ダニにおける生体外RNA-seqによる転写プログラムの裏付け
(A) 各日のrpoSのTranscripts Per Million (TPM)のTukey式ボックスプロット。黒い点は複製を表す。****p値 < 0.00001、Wald検定。rpoSの発現は摂食期間中に増加する。(B）4日目と1日目を比較したDE遺伝子のボルケーノプロット。マダニのRpoSによって発現が上昇する遺伝子は摂食中に増加する。(C)4日目と1日目を比較したDE遺伝子のボルケーノプロット。Rrp1がアップレギュレートした遺伝子（青）とダウンレギュレートした遺伝子（ピンク）。Rrp1が制御する遺伝子は、摂食中にアップレギュレートされる遺伝子とダウンレギュレートされる遺伝子とよく相関している。(D) 4日目と1日目を比較したDE遺伝子のボルケーノプロットで、RelBbuがアップレギュレートした遺伝子（青）とダウンレギュレートした遺伝子（ピンク）を示す。RelBbu遺伝子の約半数は摂食中に予想された方向に変化する。
図S4.
マダニの摂食によって変化する遺伝子は、以前にプローブしたマダニの摂食の文脈で発現が変化する遺伝子と重なる。
(A）2倍変化した遺伝子と、マダニの摂食を模倣した条件下で増殖させたBb培養で発現が変化した遺伝子との重なり。遺伝子は1日目から2倍変化した最初の日に基づいてグループ分けされている。「摂食ダニ」培養条件は、Revelら2002年では37℃、pH6.8、Ojaimiら2003年では35℃、pH7.4であり、一方または両方の研究でこれらの条件下で上昇した遺伝子を赤色で強調表示した。「未給餌ダニ」培養条件は、Revelら2002年では23℃、pH7.5、Ojaimiら2003年では23℃、pH7.4であり、一方または両方の研究でこれらの条件下で上昇した遺伝子は、水色で強調表示されている。これらの研究でどちらの条件でも上昇しなかった遺伝子は灰色で示した。特に2日目に上昇する遺伝子については、以前の研究で「ダニを食べた」培養条件で上昇した遺伝子と大きな重複が見られる。(B）2倍変化した遺伝子と、哺乳類の条件を模倣した餌付けニンフと透析膜チャンバー（DMC）の間で発現が変化した遺伝子との重なり。遺伝子は1日目から2倍変化した最初の日に基づいてグループ分けされている。摂食したニンフでのBb発現とDMCでのBb発現は、Iyerらは2015年にバクテリアRNA増幅とマイクロアレイを用いて比較し、Grassmannらは2023年にTBDCapSeqを用いて比較した。片方または両方の研究で食餌ニンフで上昇した遺伝子は赤で強調表示され、片方または両方の研究でDMCで上昇した遺伝子は紫で強調表示されている。2つの研究間で相反する条件で上昇した遺伝子は濃い灰色で、どちらの条件でも上昇しなかった遺伝子は薄い灰色で示した。2日目に上昇する遺伝子は、給餌されたニンフで上昇する遺伝子と重なりが大きく、3日目と4日目に最初に上昇する遺伝子は、DMCで上昇する遺伝子と重なりが大きい。
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annesapiro@gmail.com
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米国・カリフォルニア州・サンフランシスコ・カリフォルニア大学・生化学・生物物理学科
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Patrick R. Secor
米国モンタナ州ミズーラ、モンタナ大学生物科学部
バリン・W・ザロ
米国カリフォルニア州サンフランシスコ、カリフォルニア大学薬学部・心臓血管研究所
シーメイ・チョウ
米国カリフォルニア大学サンフランシスコ校生化学・生物物理学科
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seemaychou@gmail.com
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