糖尿病マウスの腸内細菌叢の変化、全身および眼表面免疫の低下、角膜アルカリ化学損傷後の創傷治癒反応の低下の関連性

哉百名


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ORIGINAL RESEARCH（オリジナル研究）論文
Front. Immunol.、2023年1月31日
第2部 微生物免疫学
第14巻 - 2023年｜https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1063069
この記事は、研究トピックの一部です。
糖尿病と腫瘍免疫における腸内細菌叢の役割

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糖尿病マウスの腸内細菌叢の変化、全身および眼表面免疫の低下、角膜アルカリ化学損傷後の創傷治癒反応の低下の関連性
Yashan Bu1、Kendrick Co Shih1*、Ho Lam Wong1、Sum Sum Kwok1、Amy Cheuk-Yin Lo1、Joseph Yau-Kei Chan1、Alex Lap-Ki Ng1、Tommy Chung-Yan Chan2、Vishal Jhanji3およびLuis Tong4,5（敬称略
1香港大学李嘉誠医学部眼科（香港特別行政区ポックフラム）、中国
2香港サナトリウムと病院眼科、香港、香港SAR、中国
3ピッツバーグ大学メディカルセンター眼科（米国ペンシルバニア州ピッツバーグ
4シンガポール国立眼科センター角膜・外眼部疾患サービス（シンガポール、シンガポール
5シンガポール眼科研究所、眼表面研究グループ、シンガポール、シンガポール
目的：眼球のアルカリ化学損傷後の角膜上皮創傷治癒、眼表面および全身性免疫反応、マイクロバイオーム指標に対する持続的高血糖の影響を、対照群と比較して糖尿病マウスで検討することを目的とする。

方法 Ins2Akita（秋田）マウスと野生型マウスの右眼に角膜アルカリ性傷害を誘発した。各群は、ベースラインと、その後、傷害後0、3、7日目に観察された。角膜の再上皮化は、スリットランプ下で、コバルトブルーライトフィルターを用いたフルオレセイン染色で観察した。角膜核出標本は、hematoxylin and eosin染色で角膜の厚さの変化についてベースライン時と受傷後とで比較された。涙のサイトカインと成長因子のレベルは、プロテインマイクロアレイアッセイを用いて測定し、群間および時間帯間で比較した。末梢血と眼表面試料についてフローサイトメトリーを実施し、CD3+CD4+細胞数を測定した。糞便サンプルを採取し、ショットガンシーケンスを用いて腸内細菌叢の構成と多様性パターンを測定した。

結果 秋田県産マウスは、対照群に比べ角膜創傷治癒が有意に遅れていた。これは、傷害後0、3、7日目の血管内皮成長因子A、アンジオポエチン2、インスリン成長因子1の涙液レベルの低下と関連していた。さらに、秋田県産マウスでは、対照群と比較して、傷害に対する末梢血および眼表面CD3+CD4+細胞数のアップレギュレーションが明らかに欠如していた。このことは、秋田県産マウスでは、受傷後、腸内細菌叢の多様性指標が対照群に比べて低下することと関連していた。特に、秋田県産マウスでは、受傷後、対照群に比べFirmicutes bacterium M10-2の存在量が低下していた。

結論 糖尿病マウスでは、角膜創傷治癒の障害は、眼球化学物質傷害に対する全身および局所的な免疫応答の不能と関連していた。糖尿病マウスと対照マウスの腸内細菌の多様性と存在量のパターンのベースラインと傷害後の違いは、この反応の変化に関与している可能性がある。

1 はじめに
糖尿病（Diabetes mellitus: DM）は、世界的に重要な健康問題である。糖尿病は、視力を脅かす眼の合併症と関連しており、労働年齢層における失明の最も一般的な原因となっている。網膜疾患とは別に、角膜疾患もDMの主要な合併症であり、全糖尿病患者の70％が罹患しています（1, 2）。臨床的には、糖尿病性角膜症は角膜上皮の創傷治癒反応の障害を特徴とし、角膜びらん症候群の再発、感染性角膜炎、無菌性角膜潰瘍、そして最終的には瘢痕化による角膜失明を引き起こすリスクが高くなると言われています。糖尿病性角膜症の臨床症状は、持続的な高血糖による角膜への有害作用、角膜損傷時の眼表面での成長因子の分泌低下、神経栄養因子の減少を伴う角膜下基底神経の損傷、角膜上皮細胞のアポトーシス増加によって説明できる（3、4）。過去10年間に糖尿病性角膜症の病態に関する理解は大きく進展したが、臨床における治療戦略はまだ確立されていない。in vivoおよびin vitroの研究において、サブスタンスP（5）やアロエベラ（6）を含む局所治療薬の糖尿病性角膜障害への使用が検討されているが、複数の身体システムにわたる糖尿病の長期合併症を改善した可能性のあるグルコース非依存性の全身治療法の探求が依然として必要である。

過去20年間のメタゲノムにおける次世代ディープシーケンスの出現により、現在では、宿主の代謝および免疫の発達およびプログラミングにおける腸内細菌叢の重要性が理解されています（7）。新たに集められた証拠から、腸内細菌群の構成は、脱髄疾患、炎症性腸疾患（IBD）、自己免疫性ブドウ膜炎などの自己免疫疾患の発症に重要な役割を担っていることがわかりました（8）。腸内細菌は、粘膜表面の抗炎症性制御性T（Treg）細胞と炎症性ヘルパーT（Th）17細胞の間の免疫反応のバランスをとる上で重要なメディエーターとして働くと報告されている（9-13）。最近、腸内常在菌の代謝への影響、特に肥満、インスリン抵抗性、メタボリックシンドロームの発症に果たす役割に関心が集まっている。研究者らは、高脂肪食が腸内細菌叢の特定の有害なパターンと関連していることを発見し、これをディスバイオーシスと呼んでいる（14）。これは、宿主にメタボリックシンドローム促進状態をもたらし、宿主はその後、肥満やインスリン抵抗性の臨床表現型を獲得する。これらの代謝作用は、糞便移植技術によって健康な痩せ型個体に移植され、同様のインスリン抵抗性亢進状態を生じさせる可能性がある。このように、腸内細菌はメタボリックシンドロームや2型糖尿病の管理において、操作の重要なレバーとなる可能性があります。腸内細菌が宿主の代謝と免疫を同時に変化させる可能性を考えると、糖尿病患者がエンドトキシン血症の結果として、腸管T細胞免疫を変化させている可能性があることを指摘することは重要である(15)。したがって、糖尿病患者における微小血管合併症、例えば糖尿病性角膜症の発症と免疫反応の変化は、糖尿病患者における腸内細菌組成の変化と潜在的に相関している可能性がある。

このような腸内細菌、免疫、糖尿病患者の合併症の関係をさらに調べるために、我々はネズミを用いた糖尿病性角膜創傷治癒モデルを採用した。ヘテロ接合体秋田マウスの角膜に、濃度、曝露時間、表面積を一定に制御したアルカリ性熱傷傷害を行った。対照として野生型マウスを用いた。化学的傷害は、角膜上皮の傷を作り、眼表面の炎症反応を誘発するため、角膜上皮の創傷治癒と眼表面免疫の両方を調べることができることから、傷害の方法として選択された(16-18)。

2 方法論
2.1 ヘテロ接合体秋田マウスの繁殖と選択
実験には、秋田自然変異（Ins2Akita）ヘテロ接合体マウスを使用した。これはI型糖尿病のモデルであり、ヘテロ接合の秋田マウスは3-4週齢から高血糖、低インシュリン血症、多飲、多尿を発症する(19)。マウス飼育には、8-12週齢の野生型（WT）雌およびヘテロ接合体秋田県産雄マウスを使用した。動物は、水と十分な餌を与え、12時間明暗サイクルに従った温度制御された動物室で飼育された。すべての動物飼育および実験手順は、Association of Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Researchに準拠し、香港大学CULATR (4696-18) の認可を受けた。血糖値はマウスが5週齢に達した時点で最初に測定し、子孫の表現型が秋田犬とWTのどちらであるかを決定した。

2.2 血糖値測定
伏在静脈から十分な量の血液サンプル(~5μl)を採取した。簡単に言うと、伏在静脈の周りの毛を取り除き、毛細管で十分な血液サンプルを得るために穿刺を行う。測定には血糖値測定器（Contour plus）と共に血糖値測定ストリップを使用した。止血は、滅菌綿で穿刺創を優しく圧迫することで行った。血糖値は、秋田マウスとWTマウスを識別するために生後5週目に測定し、さらに角膜のアルカリ性損傷後0日目、3日目、7日目に、既報（19）と同様にして測定した。

2.3 角膜のアルカリ性傷害の誘発
化学的傷害を誘発するために、マウス角膜にアルカリ性火傷を行った。全身麻酔のため、動物にケタミン（0.6 mg/100 μl/10 g body wt）およびキシラジン（0.15 mg/100 μl/10 g body wt）を腹腔内注射する。傷害の前にマウスの角膜に局所鎮痛剤を塗布した。0.1 M NaOHに浸した直径1.5 mmのろ紙で角膜中央部を10秒間覆った後，直ちにろ水で30秒間角膜と結膜嚢を洗浄した．感染を防ぐため、抗生物質が適用された。角膜の再上皮化は、先に述べたように、損傷後0日目、3日目、7日目にフルオレセイン染色でスリットランプ下で観察した（20）。

2.4 ヘマトキシリン・エオジン染色
摘出した角膜を直ちにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の4％パラホルムアルデヒドで一晩固定した。その後、角膜はエタノールの増加勾配で脱水し、最後にクロロホルムで一晩乾燥させた。その後、角膜をパラフィンワックス［Tissue PrepTM Embedding Media (Certified), Fisher Chemical］で浸潤し、Shandon Histocentre2 Embedding Station, Midwestを使用して埋没させた。ミクロトーム（HM 315 Microtome, Microm）を用いて厚さ5μmの矢状角膜切片を作製した。切片を正帯電性顕微鏡用スライド（Lab'IN Co）にマウントし、乾燥させた。角膜切片を脱パラフィンし，hematoxylinで30秒，eosinで5秒染色した．角膜厚の測定には角膜中央部の切片のみを選び、2回の測定値の平均を解析に用いたのは、先に述べたとおりである(20)。

2.5 涙のタンパク質マイクロアレイアッセイ
マウス涙液サンプルは、シルマーストリップをマウス結膜に 5 分間当てることにより採取した。ストリップの湿潤部分を切り取り、長さを測定した。切り取った部分の表面積とそれぞれの涙の体積をImageJで算出した。総タンパク質濃度は、Nanodropで測定した。総タンパク質濃度を正規化値として、総タンパク質あたりの全データ点を算出し、Prismグラフを作成した（21）。WTサンプルと秋田サンプル間、および時点間の涙液タンパク質濃度を比較するために、対応のないt検定を実施した。

2.6 フローサイトメトリー
マウス尾静脈よりリストレーナーを用いて末梢血を採取した。EDTAを含む1.5mlエッペンドルフチューブに血液（150〜200μl）を採取した。赤血球を赤血球溶解バッファーで溶解し、250gで5分間遠心分離した。マウスから眼表面試料を摘出し、コラゲナーゼで37℃、一晩消化した。これを100μmのセルストレーナーで濾過した。次に、リンパ球細胞または眼表面細胞サンプルをフローサイトメトリーバッファー（Invitrogen）で3回洗浄し、FITC蛍光体を結合したラット抗マウスCD4抗体およびPEを結合した抗マウスCD3抗体（Invitrogen）と1時間インキュベートした後、直ちにフローサイトメトリーに付した。フローサイトメトリーはBD FACSCanto II (HKU core facility)を用いて行った。補正は、FITCとPEによるシングルステインサンプルで計算した。CD3+CD4+T細胞優勢は、以前に記載したように、糖尿病およびWTサンプルについてFlowJoソフトウェアによって得られた(22)。

2.7 腸内細菌叢のショットガンシーケンス
ベースライン、3日目、7日目に、マウスを個別にシングルケージに入れ、30分間かけて糞便サンプルを採取した。DNAサンプルを抽出し、サンプル中に存在する微生物種をショットガンシーケンスで同定し、その後、統計学的および計算機的手法を用いたバイオインフォマティクス解析を行った(23)。未組み立てのリードを入力として用い、既知の細菌、ウイルス、真菌、原生生物、抗生物質耐性遺伝子の参照データベースと配列を照合した。微生物相の多様性パターンは、ヒートマップとα多様性指数で表示された。

2.8 ポリメラーゼ連鎖反応ゲル電気泳動によるジェノタイピング
マウスを犠牲にした後、尾の先端部（長さ1-3cm）を採取した。尾端は約2mmの細片に切断した。この試料から各マウスのDNAを抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によりDNAの増幅と測定を行った(19)。

2.9 統計解析
データは平均値および標準偏差で示した。3日目と7日目に治癒した糖尿病マウスとWTマウスの割合の差を比較するために、Pearson chi-squared検定を使用した。血糖値、涙液中のタンパク質濃度、腸内細菌叢のα多様性パターン、WTマウスと秋田マウスの差の比較には対応のないt検定を用いた。涙液タンパク質濃度のベースラインと受傷後0日、3日、7日の間の変化を比較するには対応のあるt検定を行った。一元配置分散分析により、微生物叢の組成と涙液タンパク質の経時的変化を分析した。p < 0.05のとき、サンプルは有意に異なるとみなされた。すべての統計解析は、GraphPad Prism 9 (California, USA)を用いて実施した。さらに、腸内細菌叢の多様性パターンは、アルファ多様性指数、Chao1、Simpson、Shannonを用いて分析した。

3 結果
3.1 WTおよび秋田マウスの血糖値測定と遺伝子型判定
角膜アルカリ熱傷の誘発前、誘発後3日目、7日目にそれぞれ血糖値を測定した。ベースライン時のWTマウスと比較して、秋田県産マウスは3日目と同様にWTマウス（11.42±0.4621mmol/L）に対して有意に高い血糖値（28.95±1.446mmol/L）を有していた（28.95±1.522mmol/L）。 95 ± 1.522 mmol/L vs. 11.17 ± 1.477 mmol/L）および損傷後7日目（28.09 ± 0.6987 mmol/L vs. 11.71 ± 0.3653 mmol/L）（図1A）（p < 0.001, n = 55）においても同様である。さらに、WTマウスと秋田マウスのゲノムDNAを用いて遺伝子型判定を行い、変異型インスリン2遺伝子（Ins2）の存在を確認した（図1B）。

図1
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図1 WTマウスと秋田マウスの血糖値モニタリングの結果。(A)WTマウスと秋田マウスの血糖値モニタリングの結果。(A）ベースライン、3日目、7日目の血糖値測定。Unpaired t-testにより、ベースライン（受傷前）、受傷3日目、受傷7日目において、秋田県産マウスはWTマウスと比較して有意に血糖値が高いことが示された。(B) PCRゲル電気泳動によるWTマウスと秋田マウスの遺伝子型確認；WTマウスは2本のDNA鎖がともに酵素Fnu4HIで消化できるのに対し、ヘテロ接合体秋田マウスは1本の変異DNA鎖が消化できない；したがって、WTマウスDNAサンプルを含むレーンには1本のバンド、秋田マウスDNAサンプルには2本のバンドが認められる（n = 50 in WT、n = 50 in Akita）。****p<0.0001.

3.2 角膜アルカリ傷害後の角膜上皮の治癒がWTマウスに比べ秋田マウスでは有意に遅れている。
傷害直後（0日目）、傷害3日目、7日目に、フルオレセイン染色とコバルトブルーフィルターによる検査を行い、秋田マウスとWTマウスの再上皮化の度合いの違いを比較した。フルオレセイン色素は上皮の剥がれた角膜表面を染色した。細隙灯検査の代表的な写真から、0.1M NaOHによるアルカリ性熱傷と10秒間の傷害時間は、コバルトブルー光下で緑色のフルオレセインの存在（図2A-i、iv）および明視野画像での角膜の混濁（図2B-i、iv）で示すように著しい角膜上皮損傷を誘発したことが示された。秋田県産角膜のコバルトブルー光下での緑色フルオレセインの存在は、受傷後3日目まではっきりと確認できた（図2A-v）。一方、WTマウスでは受傷後3日目に緑色フルオレセインが確認できなかった（図2A-ii）。角膜混濁の存在は、秋田県産マウスでは明視野画像から確認できたが（図2B-v）、WTマウスでは受傷後3日目から混濁は確認できなかった（図2B-ii, iii）。

図2
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図2 WTマウスと秋田マウスの創傷治癒のスリットランプ画像による解析。(A) 0.1 M NaOHと10秒間の傷害時間を用いた傷害後0、3、7日目のWTおよび秋田マウスの傷害角膜。コバルトブルー光下でフルオレセイン染色を行った。傷害直後の角膜の写真では、WTマウス、秋田マウスともに角膜上皮が著しく障害されていることがわかる。(i, iv) WTマウスの角膜は受傷後3日目に完全に再上皮化した（ii）。秋田マウスの角膜は受傷後3日目（v）および7日目（vi）に完全に再上皮化しなかった。倍率：40×。(B）角膜アルカリ損傷後0日目（i、iv）、3日目（ii、v）、7日目（iii、vi）に撮影したWTおよび秋田マウスの右（損傷）角膜の明視野画像（WTではn＝55、秋田ではn＝55）。

角膜上皮の治癒率と持続的な高血糖の有無との関連を調べるために、カイ二乗検定を行った。3日目および7日目に治癒したWTマウスおよび秋田マウスの数および割合の分割表は、それぞれ表1および2に示すとおりである。カイ二乗検定分析の結果、角膜アルカリ熱傷後、秋田マウスはWTマウスと比較して有意に創傷治癒が遅れた；すなわち、角膜アルカリ熱傷後3日目に、秋田マウス（22.2%）よりもWTマウス（88.9%）が有意に多く角膜完全再上皮化（n = 9, p = 0.0044) (Figure 3A; Table 1) 、糖尿病は角膜創傷治癒を著しく損なうことが立証された。

表1
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表1 角膜アルカリ損傷後3日目に治癒したWTマウスと秋田マウスの数および割合（括弧内）のピアソン・カイ二乗検定分析の分割表（自由度＝1、有意水準＝0.05）。

表2
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表2 角膜アルカリ損傷後7日目に治癒したWTマウスと秋田マウスの数と割合（括弧内）のピアソン・カイ二乗検定解析の分割表（自由度＝1、有意水準＝0.05）。

図3
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図3 角膜アルカリ傷害後3日目に治癒した糖尿病マウスとWTマウスの割合。(A）ピアソン・カイ二乗検定を行い（信頼水準＝95％、p＝0.0044、n＝9）、3日目にWTマウスが糖尿病マウスより有意に治癒した割合が高いことを示した。(B）ピアソン・カイ二乗検定を行い、7日目に治癒したWTマウスと糖尿病マウスの割合に有意差がないことを示した（p＞0.9999、WT群と秋田群の両方についてn＝9）。*p<0.05.

さらに、角膜アルカリ損傷後7日目に、秋田マウス（88.9%）よりも多くのWTマウス（100%）が完全な角膜再上皮化を達成した（図3B；表2）；しかしながら、この差は統計的に有意ではなかった（n = 9、p > 0.9999）。

マウスの左の無傷の眼からの角膜のスリットランプ画像は、WTおよび秋田マウスの両方について、右眼からの角膜の損傷後のベースライン、3日目、および7日目に障害が存在しないことを示した。明視野画像では、すべての角膜で上皮の欠損がなく透明であった（補足図1A）。一方、コバルトブルー光下でのフルオレセイン染色では、角膜が色素を吸収しない、つまり角膜は無傷であった（補足図1B）。

マウス角膜アルカリ熱傷モデルの効果をさらに特徴づけるために、角膜切片のヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色を行ったところ、損傷群と対照群の間で角膜上皮の厚さが有意に減少していた（n = 7, p = 0. 0129）、角膜全体の厚さ（n＝7、p＝0.6725）および間質の厚さ（n＝7、p＝0.4906）では、損傷群と非損傷群の間で厚さに有意な変化は見られなかった（図4E）。一方、WTマウスと秋田マウスのベースライン時の上皮厚の間には、有意な変化は見られなかった（図4A、B）。

図4
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図4 角膜断面のH&E染色と厚さ測定。A）ベースラインのWTマウス、（B）ベースラインの秋田マウス、（C）角膜アルカリ損傷直後のWTマウス、（D）角膜アルカリ損傷直後の秋田マウス、（E）角膜アルカリ損傷後3日目のWTマウス、（F）角膜アルカリ損傷後3日目の秋田マウスから角膜の代表画像を選択した。(G）無傷のマウス角膜（コントロール群）と傷害直後のマウス角膜の全角膜、角膜上皮、角膜間質の厚さ測定。コントロール群と比較して、傷害群では角膜厚さの有意な減少が認められた（n = 7, p = 0.0129）。(H）傷害後3日目のWTマウスと秋田マウスの角膜について、全角膜、角膜上皮、角膜間質の角膜厚を測定した。傷害後3日目の秋田県産マウスでは、WT群と比較して有意に角膜厚の減少が認められた（WT群、秋田県産群ともにn = 7、p = 0.0498）。*p<0.05.

秋田県産マウスにおける角膜創傷治癒の遅れをさらに確認するため、傷害後3日目の角膜の厚さをWT群と秋田県産マウスの間で確認した。傷害後3日目の角膜上皮の厚さは有意に減少していたが（n = 7, p = 0.0498）、角膜全体の厚さ（n = 7, p = 0.4586）および間質の厚さ（n = 7, p = 0.3654）ではWTと秋田のグループの間に有意な変化が見られなかった（図4C、D、F）。

3.3 糖尿病マウスおよびWTマウスのベースラインおよび角膜アルカリ性熱傷後の涙液タンパク質の解析
3.3.1 糖尿病マウスは野生型マウスと比較してベースラインの涙液タンパク質のケモカインと成長因子のレベルが変化していた。
眼表面のサイトカイン分泌レベルを解析するために、ベースライン、角膜アルカリ性熱傷後0日目、3日目、7日目に涙液を採取し、眼表面免疫に関連するサイトカインパネルのタンパク質マイクロアレイアッセイを実施した。アンジオポエチン-1（Ang-1）、アンジオポエチン-2（Ang-2）、C-C motif chemokine ligand 2（CCL2）、インスリン成長因子-1（IGF-1）、血小板由来成長因子（PDGF）、血管内皮成長因子A（VEGF-A）（補足表6）であった。傷害前のベースラインでは、Ang-2の涙液濃度（1,062 ± 371.5 vs. 402.4 ± 69.35 pg/ml, p = 0.0075, n = 6）は、WTマウスと比較して秋田マウスで有意に高かった（図5B）。さらに、CCL2はベースライン時、WTマウスと比較して秋田県産マウスで涙液レベルの上昇を示した（37.9 ± 5.253 vs. 15.9 ± 4.687 pg/ml, p = 0.0189, n = 6）（図5C）。しかし、秋田県産マウス涙液サンプルのAng-1、IGF-1、PDGF、およびVEGF-Aのベースラインレベルについては、不対t検定で示すように、WTのものと比較して有意差は見られなかった（図5A、C〜F）。

図5
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図5 ベースライン（損傷前）、角膜アルカリ損傷後0日目、3日目、7日目に測定したWTマウスおよび秋田マウスの右眼（損傷眼）の涙液タンパク質濃度の比較。(A）Ang-1の涙液濃度は、傷害直後からWTマウスで有意に上昇した（n = 6, p = 0.0412）。(B）Ang-2の涙液量は、秋田県産マウス（n = 6, p = 0.0243）ではベースラインで有意に高く、傷害後7日目には有意に減少していた。(C）CCL2の涙液量は、秋田県産マウスではベースライン時に有意に上昇していた。(D）秋田県産マウスでは、受傷直後（n = 8, p = 0.0018）、受傷3日目（n = 8, p = 0.0026）、7日目（n = 8, p = 0.0147）にIGF-1の涙液レベルが有意に低下していることがわかった。(E) PDGF-BBの涙液量は、秋田マウスの涙液量においてベースラインレベルから受傷後まで減少する傾向を示したが、統計的な有意差はなかった。(F）秋田マウスのVEGF-Aの涙液レベルは、ベースラインレベルと比較して、受傷直後（n = 8, p = 0.0016）、3日目（n = 8, p = 0.0063） 、受傷後7日目（n = 8, p = 0.0032）に有意に減少した（n数はWT群と秋田群の両眼/マウス数、すべての測定で同じ）。*p<0.05; **p<0.01.

3.3.2 糖尿病マウスは角膜アルカリ性熱傷後、涙液成長因子とケモカインの分泌に有意な障害が見られた
傷害後0日目、3日目、7日目の涙液タンパク質のレベルがベースラインと比較して有意に変化するかどうかを比較するために、一元配置分散分析を行い、ベースラインと傷害後の各時点のAng-1、Ang-2、CCL2、IGF-1、PDGF、VEGF-Aの涙液レベルを比較検討した。その結果、WTサンプルでは、ベースラインと角膜アルカリ焼付後0日目、3日目、7日目のそれぞれにおいて、Ang-2、CCL2、IGF-1、PDGF、VEGF-Aの涙液レベルに有意な変化は見られなかった。 補足表2-6）。しかし、涙液中のAng-1は、WTマウスでは受傷後0日目に910.5 ± 216.3 pg/mlから2,967 ± 1,337 pg/mlに増加したが（p = 0.0412, n = 8）、秋田マウスでは増加しなかった。秋田県産のマウスで得られた結果のうち、Ang-2、IGF-1、VEGF-Aの涙液量は、ベースライン測定（補足表2、4、6）と比較して、薬害直後（0日目）に有意な減少が見られた（図5B、D、F）。特に、秋田マウスの涙液IGF-1量はベースラインの520.1 ± 118.3 pg/ml から 77.65 ± 22.04 pg/ml (p = 0.0018, n = 8) に減少し、秋田マウスの涙液VEGF-A量は 3,423 ± 772.8 pg/ml から 143.3 ± 59.82 pg/ml (p = 0.0016, n = 8) に減少していることが確認されました。しかし、WTマウスの傷害直後の涙液には、Ang-1を除き、有意な変化は認められなかった。

受傷後7日目、Ang-2の涙液濃度はベースラインの1,062 ± 172.4 pg/ml から201.7 ± 87.21 pg/ml (p = 0.0243, n = 6) に減少した（図5D；補足表2）。一方、秋田県産マウスのIGF-1およびVEGF-Aの涙液濃度も、受傷後3日目およびCABI後7日目のいずれにおいても、ベースラインレベルと比較して有意な低下が見られた（図5D；F；付表4、6）。秋田マウスのIGF-1の涙液濃度は、ベースラインの520.1 ± 118.3 pg/mlから、受傷後3日目に75.46 ± 31.04 pg/ml（p = 0.0026, n = 8）、受傷後7日目に185.7 ± 72.96（p = 0.0147, n = 8）に減少していることが示された。さらに、秋田マウスのVEGF-Aの涙液濃度は、ベースラインの3,423 ± 772.8 pg/mlから、損傷後3日目に805.6 ± 573.1 pg/ml（p＝0.0063、n＝8）、損傷後7日目に601.6 ± 243.8 pg/ml（p＝0.0032、n＝8）まで減少しました（図5F、補足表6）。有意差はなかったが、糖尿病マウスの涙液CCL2レベルは、ベースラインの37.9 ± 5.253 pg/mlから3日目の14.1 ± 9.15 pg/mlのレベルに減少したが（p = 0.1308, n = 8）、WTマウスでは明らかな減少は認められなかった（p = 0.9991, n = 8）（図5C、付表3）。さらに、糖尿病秋田マウスでは、受傷後0日目と3日目のAng-2、受傷後0日目、3日目、7日目のPDGF-BBの涙液発現も減少する傾向が見られた（図5B、E；付表2、5）。

3.4 糖尿病マウスはWTマウスと比較して腸内細菌組成が変化していた
角膜アルカリ損傷後のベースライン、3日目、7日目において、CHAO1指数、Simpson指数、Shannon指数の不対t検定を用いて、マイクロバイオームの多様性パターンを群間で比較した。秋田県産マウスは、CHAO1指数からWTマウスと比較して、角膜アルカリ損傷後のベースライン（n = 7, p = 0.0370）および3日目（n = 7, p = 0.0376）において微生物叢組成に高い多様性が認められた（図6A）が、ShannonおよびSimpson指数ではその差に有意性は認められなかった（図6B, C）。アルカリ性損傷後7日目では、CHAO1指数、Shannon指数、Simpson指数でWTマウスと秋田マウスの腸内細菌群の多様性の差は有意ではなかった（n = 7、p = 0.1048）（図6A）。

図6
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図6 ベースライン（損傷前）で測定したWTマウスと秋田マウスの腸内マイクロバイオーム多様性パターンを、角膜アルカリ損傷後0日目、3日目、7日目と比較した。(A)ベースライン、3日目、7日目のα多様性指数の比較。傷害後3日目のCHAO1指標から、秋田県産マウスはWTマウスに比べて微生物相組成が豊富であることがわかった（n = 7, p = 0.0376）。(B, C）ベースライン、受傷3日目、受傷7日目のSIMPSON index（B）およびSHANNON index（C）によるα多様性指数の比較（受傷3日目）。一元配置分散分析の結果、ベースライン、受傷3日目、受傷7日目に有意差は認められなかった（n = 7）。(D) Firmicutes bacterium M10-2は、角膜アルカリ損傷後7日目に、糖尿病マウスと比較してWTマウスで高い存在感を示した（n = 5, p = 0.0164）; WTマウスではベースラインレベルと比較して損傷後7日目にFirmicutes bacterium M10-2の著しい増加が見られた（n = 5, p = 0.0215） (n numberはWT群と秋田群の両方のマウス数、すべての測定で同じ). *p<0.05.

さらに、受傷後3日目と7日目の腸内細菌叢の多様性パターンの経時的変化を測定した。その結果、秋田県産マウスは、一元配置分散分析検定（p＝0.2894）に基づき、CHAO1指標（n＝7、p＝0.0137）（図6A）からベースラインと比較して受傷後3日目の腸内細菌叢多様性が有意に減少していることが分かった。比較的、WTマウスでは、腸内細菌叢の多様性パターンに経時的な有意な変化は見られなかった（図6A）。

個々では、角膜アルカリ損傷後7日目に、Firmicutes細菌M10-2がWTマウスで有意に多く存在することがわかった（n＝5、p＝0.0164）。一方、損傷後7日目に存在量のレベルの増加がWTマウスでのみ観察され、秋田マウスでは見られなかった（n＝5、p＝0.0215）(図6D). WTマウスと秋田マウスの腸内細菌叢に存在する細菌の相対存在量の平均値を門、属、種レベルで取得し、ヒートマップの形で比較したところ、図7B、Cに示すように、門レベルでは、WTマウスではBacteroidetesが0.52と高い相対存在量であり、秋田マウスでは相対存在量が0.35となった。一方、ファーミキューテス類は、WTマウスで0.35、秋田マウスで0.52と、相対的に存在量が少なかった。また、ProteobacteriaはWTマウスと秋田マウスで相対量が多く、VerrucomicrobiaはWTマウスと秋田マウスで相対量が多くなっていた。Actinobacteria、Deferribacteres、Tenericutesについては、WTマウスと秋田マウスの相対量に有意差はなかった（n = 5）（図7A）。

図7
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図7 WTマウスと秋田マウスの腸内細菌叢に存在する細菌の門、種、属レベルの相対的存在量のヒートマップ。(A）平均相対存在量に基づき、門レベルで作成したWTマウスと秋田マウスの腸内細菌叢に存在する菌のヒートマップ。(B）WTマウスと秋田マウスの腸内細菌叢に存在する細菌のヒートマップ（平均相対存在量に基づく属レベルで作成）。(C) WTマウスと秋田マウスの腸内細菌叢に存在する細菌のヒートマップを、平均相対存在量に基づいて種レベルで作成した。相対存在量の値は、BからDの凡例に示すように対応する色で示されている（WTと秋田でn = 5）。

属レベルでは、BacteroidesはWTマウスで0.35、秋田マウスで0.23と高く、Lachnospiraceae_u_gはWTマウスで0.12、 Parabacteroides, Lactobacillus, Firmicutes_u_gはいずれもWTマウスで秋田マウスより高い（n=5）（図7B）。

種レベルでは、Bacteroides sartorii, Helicobacter typhlonius, Parabacteroides distasonis, Bacteroides sp.2_1_33B, Parabacteroides sp. 20_3、Bacteroides uniformis、Lactobacillus johnsonii、Firmicutes bacterium M10-2はWTマウスで秋田マウスより相対量が多く、Akkermansia muciniphila、Lachnospiraceae bacterium 10-1、Lachnospiraceae bacterium A4、Oscillibacter sp 1-3 およびClostridioidesはWTマウス（n = 5）に比べ、秋田マウスで相対量が多く見られた（図 7C）。

3.5 糖尿病マウスはベースラインと受傷後3日目にT細胞プロファイルに変化を示した
3.5.1 糖尿病マウスは、野生型マウスと比較して、角膜傷害に対する全身性の適応免疫応答が損なわれていた。
WTマウスと秋田マウスの末梢血サンプルをベースラインと傷害後3日目に採取し、フローサイトメトリーによりCD3+CD4+T細胞のレベルを解析した。すべてのゲートはFlowJoソフトウェア上で設定し、リンパ球についてはP1ゲーティング、複数の細胞のダブレットまたはクラスターに対する単一細胞についてはP2ゲーティング、FITCおよびPE蛍光標識細胞の両方についてはQ2ゲーティングを行った（図8A〜C）。ベースライン時のWTマウスと秋田マウスのCD3+CD4+細胞の割合を、有意水準0.05の不対t検定で解析した。秋田県産マウスは、ベースライン時のWTマウスと比較して、CD3+CD4+細胞の割合が有意に大きいことが分かった（n = 7、p = 0.0146）（図8D）。しかし、群間の差は、損傷後3日目には重要でなくなった（図8D）。さらに、ベースライン時のWTマウスと秋田マウスのCD3+CD4+細胞の割合を、縦断的解析のために有意水準0.05のpaired t-testで比較した。WTマウスはベースラインと比較して受傷後3日目の末梢血中のCD3+CD4+細胞が有意に増加したが（n = 7, p = 0.0022）、秋田マウスは受傷前後の末梢血中のCD3+CD4+細胞に大きな変化はなかった（図8D）。

図8
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図 8 ベースラインおよび角膜アルカリ損傷後 3 日目の WT マウスおよび秋田マウスの末梢血試料におけるリンパ球中の CD3+CD4+ T 細胞の割合 (A) リンパ球のゲーティング (P1)．(B）二重または多重細胞に対する単細胞のゲーティング（P2）。(C）CD3+CD4+T細胞のゲーティング。(D）秋田県産マウスは、ベースライン時のWTマウスと比較して、末梢血中のCD3+CD4+T細胞の存在量が多く、不対t検定で示された（n = 7、p = 0.0146）。WTマウスは、ペアt検定で示されるように、損傷後3日目に末梢血中のCD3+CD4+細胞の有意な増加を示した（WTおよび秋田グループの両方についてn = 7、p = 0.0022）。*p<0.05; **p<0.01.

3.5.2 糖尿病マウスは、WTマウスと比較して、角膜傷害に対する眼表面適応免疫応答が損なわれていた。
さらに、CD4+CD3+ T細胞の割合は、化学的損傷後3日目にマウスから採取した眼表面サンプルを用いて試験した。図9A-Cに示すように、FlowJo上でゲートを設定した。paired t-testを用いると、WTマウスは角膜アルカリ損傷後3日目の眼表面上のCD3+CD4+T細胞がベースラインと比較して有意に増加している（n = 7, p = 0.0471）のに対し、秋田マウスの眼表面上のCD3+CD4+T細胞には損傷後そのような有意差は認められなかった（n = 7, p = 0.0941）(図9D)。さらに、秋田県産マウスは、ベースラインでWTマウスと比較してより豊富なCD3+CD4+ T細胞を示したが、その差は、対応のないt検定を用いて有意ではない（n = 7, p = 0.0639）（Figure 9D）。

図9
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図9 ベースラインおよび角膜アルカリ損傷後3日目におけるWTマウスおよび秋田マウスの眼表面試料中のリンパ球におけるCD3+CD4+T細胞の割合。(A)リンパ球のゲーティング(P1)。(B）二重または多重細胞に対する単細胞のゲーティング（P2）。(C) CD3+CD4+T細胞のゲーティング(Q2-4)。(D）ペアt検定を用いると、WTマウスはCABI後3日目に眼表面上のCD3+CD4+T細胞がベースラインと比較して有意に増加したが（n＝7、p＝0.0471）、秋田マウスの眼表面上のCD3+CD4+T細胞には損傷後有意な変化が認められなかった（WT群および秋田群の両方についてn＝7、p＝0.0941）。*p<0.05.

4 考察
4.1 糖尿病性角膜の創傷治癒の再現性の高い動物モデルの報告
我々の実験では、持続的な高血糖状態をモデル化するために、秋田マウスが選択された。このマウスは、3-4週齢から著しい高血糖を示すT1DMの動物モデルである。これまでにも糖尿病性網膜症合併症の動物モデルとして用いられてきたが、糖尿病マウスと対照マウスを用いた角膜の傷害後の治癒障害について調べたのは我々のグループが初めてである(24)。我々の実験では、秋田県産のマウスは、アルカリ性化学物質による傷害後、角膜の再上皮化速度がWTマウスと比較して有意に遅いことが示された。これは、他の種類の動物モデルを用いた糖尿病性角膜創傷治癒研究からの知見と一致する（25）。一方、この結果は、秋田県産マウス角膜に誘発されたアルカリ性熱傷が、糖尿病における角膜創傷治癒の分子病態および治療的側面を研究するための優れたモデルであることも示している。

4.2 糖尿病マウスは、角膜傷害に対する眼表面免疫応答が低下していた。
涙液サイトカインのプロテインマイクロアレイアッセイの結果、糖尿病マウスでは、傷害後のVEGF-A、Ang2、IGF-1の涙液レベルがベースラインと比較して減少していることが報告された。涙液の成分は、結膜杯細胞、涙腺、角膜上皮、上強膜血管系など近接した複数の部位から分泌される(26)。涙のサイトカインレベルの変化は、傷害後の角膜創傷治癒を促進するための眼表面での免疫反応の無力さを示唆している。糖尿病合併症におけるVEGFの重要性は、以前に包括的に立証されている（27, 28）。VEGFは、血管内皮細胞の増殖、遊走、血管透過性を促進することが知られている。糖尿病患者の血中VEGF濃度は高く、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性症、様々な心血管疾患などの糖尿病関連病変に重要な役割を果たすことが報告されています。DEDなどの眼表面疾患では、VEGFは眼表面上皮を障害する炎症マーカーとして知られています(29)。しかし、VEGFは内皮、神経、グリアなどの挙動に広く影響を与える多面的な因子としても認識されています(30)。以上のように、糖尿病や角膜創傷治癒反応における VEGF の重要性から、我々の実験で VEGF 量を測定したところ、糖尿病マウスでは傷害後の VEGF 量が抑制されていることがわかった。血清中の VEGF 量が高い状態が続くと、微小血管の合併症の発生に関連すると考えられるが、傷害後の涙液 VEGF 量は角膜創傷治癒反応で重要かもしれないと考えられる。

我々の研究では、秋田マウスの涙液サンプルにおいて、ベースラインのCCL2濃度が上昇していることを報告した。CCL2はMCP-1としても知られ、炎症性ケモカインであり、糖尿病や創傷治癒における役割について議論のあるところである。これまでの研究で、CCL2はマクロファージ反応を回復させることにより創傷治癒に有益であることが示唆されている(31)。一方、炎症を促進する役割を持つため、糖尿病性腎症悪化の危険因子でもある(32)。これまでの眼科領域の研究では、CCL2の過剰発現が糖尿病性網膜症の病態に関与していることが報告されている(33)。我々の実験では、糖尿病マウスでは傷害後にCCL2の涙液分泌が順次減少するが、WTマウスでは減少しないことから、角膜の創傷治癒反応におけるCCL2の重要性が示唆された。

これまでの報告で、糖尿病マウスのAng-2の血中濃度がコントロールに比べて高いことが示されている(34)。また、糖尿病性網膜症の研究において、血液網膜関門の完全性におけるAng-2の機能が以前から注目されていた（35）。我々の実験では、傷害直後（0日目）に糖尿病マウスで涙のAng-2がコントロールに比べて低かったことから、角膜の創傷治癒反応の開始において重要な役割を担っていることが示唆された。

IGFとメタボリックシンドロームとの関連は、以前の実験で広範囲に検討されている(36)。血清IGF-1濃度が非常に高い、あるいは非常に低い患者は、いずれも糖尿病のリスクが高い（37、38）。一方、動物実験では、IGF-1は細胞のアポトーシスを本質的に抑制する作用があり、創傷治癒を促進することが示されている（39, 40）。このことは、糖尿病マウスの傷害後に涙のIGF-1が減少するという我々の発見と一致し、角膜の創傷治癒反応におけるIGF-1の重要性を確認することができた。

以上のことから、サイトカインは、通常、網膜症や腎症などの糖尿病の微小血管合併症の発症に有害であるにもかかわらず、傷害後の角膜創傷治癒の重要なメディエーターであることが明らかになった。角膜アルカリ熱傷後の糖尿病マウスにおいて、これらのサイトカインの涙液レベルが抑制されている事実は、角膜の再上皮化の開始と伝播における局所炎症反応の重要性を実証している。

4.3 角膜損傷と糖尿病マウスにおける腸内細菌多様性の変化
本研究では、糖尿病マウスとWTマウスは、ベースライン時にそれぞれ異なる微生物存在パターンを有していた。角膜損傷に応答して、糖尿病マウスとWTマウスは、ベースラインと比較して、α多様性パターンが変化することが示された。このような反応は、外傷性脳損傷や脊髄損傷などの他の重症非腹部損傷において、腸内細菌の異常が生じ、その後、全身性免疫の障害が生じることが以前に報告されている（41, 42）。このような変化は、腸内細菌叢の組成を一時的に変化させるストレス反応である可能性がある。このことは、心理的ストレスやうつ病が腸内細菌叢の異常を引き起こす可能性があるというこれまでの知見と一致している（43）。その結果、腸内細菌叢が変化すると、今度は適応免疫系に影響を及ぼし、傷害後の治癒を促進する効果が低下する可能性がある。

これまでの研究で、腸内細菌の異常と2型糖尿病との密接な関連性が報告されている。腸内細菌叢は、腸管上皮細胞間のタイトジャンクションタンパク質を調節することにより、腸の健全性の維持に寄与している（44）。腸内細菌叢の変化は、病原性細菌の存在量の増加により、全身性炎症を促進することが示されている（45）。糖尿病では、腸内細菌の異常が内毒素血症を通じて微小血管の合併症をさらに促進する可能性があります。これは、プロバイオティクス治療の使用によって改善することができ、T2DMにおける腸内ディズバイオシスと糖尿病の進行の両方を効果的に逆転させることが示されている(45)。

個々の種レベルでのマイクロバイオーム反応を考慮すると、我々の研究は、今後の研究において操作の対象となりうるいくつかのターゲットを特定した（46）。我々の研究では、バクテロイデスの存在量は、ベースラインでは対照群と比較して糖尿病マウスで最初は低かったが、角膜損傷後に有意に上昇した。以前の研究では、Bio-Breeding diabetes-prone (BB-DP) ラットにおいてBacteroidesの存在量が減少していることが示されている(47)。さらに、我々の実験では、A. muciniphilaは傷害後の糖尿病マウスにのみ存在し、コントロールには存在しない。これまでの研究で、A. muciniphilaは、ヒトの糖尿病合併症の減弱に有益な効果を持つことが示されている(48)。また、マウスの免疫介在性肝障害に対して保護的な役割を持つことが示されている(49)。また、糖尿病マウスでは、コントロールに比べ、H. typhloniusの存在量が低いことが観察された。これは、過去に発表されたヒトでの結果と一致した(50)。しかし、糖尿病合併症におけるその役割は、まだ十分に解明されていない。最後に、Firmicutes bacterium M10-2の存在レベルは、傷害後の糖尿病マウスで有意に減少していた。以前、FirmicutesとBacteroidetesの比率が肥満度と相関していることが報告された(51)。しかし、糖尿病の病態や合併症におけるファーミキューテス菌の役割については、これまで発表された研究はない。

4.4 糖尿病マウスは、角膜傷害に対する全身および局所免疫応答が損なわれている。
自然免疫反応による刺激を受けて、CD4+細胞は、Tヘルパー（Th）細胞と制御性T（Treg）細胞に分化し、適応免疫の促進を行う。Th細胞とTreg細胞は、急性腎障害(52)や皮膚障害(53)などの傷害に応答する際に重要な役割を果たす。

我々の研究では、秋田犬はベースラインでWTマウスと比較して末梢血CD4+ T細胞数が多かった。この所見は、秋田マウスにおける腸内細菌叢の異常とエンドトキシン血症に対する持続的な炎症反応を表しているのかもしれない。しかし、これは角膜損傷後に秋田犬とWTマウスで有意に変化した。WTマウスでは傷害後にCD3+CD4+T細胞数が増加したが、糖尿病マウスでは眼表面、末梢血ともに有意な変化は見られなかった。このことは、糖尿病マウスが傷害に対して適切な適応免疫応答を開始することができないことを強く示唆している。このことは、糖尿病マウスでは眼球表面の免疫反応や傷の治癒が損なわれていることを部分的に説明できるかもしれない。さらに、腸内マイクロバイオームとT細胞介在性免疫の関連性についての我々の理解から、WTマウスと秋田マウスの免疫反応の違いは、観察されたマイクロバイオームの多様性と豊度パターンの違いの結果である可能性がある。

4.5 本研究の限界
我々の研究にはいくつかの限界があった。まず、我々の実験では、糖尿病の動物モデルとして秋田マウスを使用した。特に糖尿病の病態や合併症の非血糖経路に関しては、このモデルの糖尿病とヒト患者の糖尿病には病因の違いがあり、それが交絡因子となる可能性があることに留意することが重要である。他の糖尿病および角膜傷害の動物モデルでも、我々の観察結果が見られるかどうかを確認することは有意義であろう。さらに、マウスとヒトの腸内細菌叢の違いも、我々の標的菌や経路がヒトの腸内に適用されない可能性があるため、もう一つの制約となる。第三に、これは治療試験というより観察研究である。今後、プロバイオティクスや糞便移植により、糖尿病マウスの腸内細菌の異常を治療することが、角膜の創傷治癒の結果に与える影響を検証する必要がある。

4.6 臨床的意義
我々の結果は、腸内マイクロバイオーム、全身および局所免疫、そして角膜創傷治癒の間に潜在的な関連性があることを示し、糖尿病におけるこの関係のさらなる探求が有意義であることを示唆するものである。角膜症は、角膜創傷治癒の遅延、再発性角膜浸食症候群、神経栄養性潰瘍によって示される、一般的で視力を脅かす糖尿病の合併症である。現在の治療法は限られており、糖尿病によって引き起こされる根本的な病的変化に対処できていない。この分野の研究を続けることで、DMの合併症を改善するための有望で費用対効果の高い選択肢として、特定の食事の改善、糞便移植、プロバイオティクス療法への道を開くことができるかもしれない。

5 結論
要約すると、糖尿病マウスでは、角膜創傷治癒の障害は、眼化学傷害に対する全身および局所的な免疫反応の欠如と関連していることが明らかになった。糖尿病マウスの免疫系が局所的にも全身的にも眼球傷害に反応しないことは、末梢血T細胞増殖の欠如、涙液ケモカインおよび成長因子の産生の欠如によって証明された。これは、WT対照の免疫系が、迅速な免疫反応によって角膜の創傷治癒を促進したのとは、全く対照的である。さらに、我々の研究では、腸内細菌の多様性と存在パターンのベースラインの違いが、糖尿病マウスとコントロールの間で観察された免疫反応の違いに関係している可能性を仮定した。腸内マイクロバイオームと全身および眼表面免疫との関係を明らかにするためには、さらなるin vivoおよびin vitroの実験が必要であるが、今回の結果は、この2つのシステムの密接な関連性を示す証拠の増加につながるものであった。腸内細菌は、糖尿病患者の罹患率および死亡率を低下させる有用かつ非侵襲的な操作の標的を提供する可能性がある。

データの利用可能性に関する声明
本論文の結論を裏付ける生データは、著者により不当な予約なしに入手可能である。

倫理に関する声明
本動物実験は、CULATR（Committee on the Use of Live Animals in Teaching and Research）により審査され、承認された（4696-18）。

著者の貢献
すべての著者は、ICMJE の著者資格の基準を満たすことを証明する。YB、KS、AC-YLは研究デザイン、データ収集、データ解析、原稿執筆、編集に携わった。JY-KC、HLW、A-KN、TC-YC、VJ、LTは、データ収集、データ解析、原稿執筆、編集に携わった。すべての著者は論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

出版社からのコメント
本論文で述べられたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品，あるいはそのメーカーが行う可能性のある主張は，出版社によって保証または承認されたものではない．

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1063069/full#supplementary-material に掲載されています。

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キーワード：腸内細菌、糖尿病、角膜創傷治癒、アルカリ性化学傷害、T細胞介在性免疫、眼表面

引用元 Bu Y, Shih KC, Wong HL, Kwok SS, Lo AC-Y, Chan JY-K, Ng AL-K, Chan TC-Y, Jhanji V and Tong L (2023) The association between altered intestinal microbiome, impaired systemic and ocular surface immunity, and impaired wound healing response after corneal alkaline-chemical injury in diabetic mice.（腸内細菌の変化と眼球の免疫低下、糖尿病マウスにおける角膜アルカリ化学反応による傷害治癒の障害との関連性）。Front. Immunol. 14:1063069.論文番号: 10.3389/fimmu.2023.1063069

Received: 2022年10月06日; Accepted: 2023年01月09日
公開：2023年1月31日

編集者

アクタル・ラスル（パキスタン、ファイサラバード、ガバメント・カレッジ大学
査読者

フィリップ・スティーブン・コバーン（オクラホマ大学健康科学センター、アメリカ合衆国
K. M. Sakthivel PSG College of Arts and Science, インド
Copyright © 2023 Bu, Shih, Wong, Kwok, Lo, Chan, Ng, Chan, Jhanji and Tong. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権者のクレジットを記載し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製が許可されます（一般的な学術慣行に従っています）。本規定に従わない使用，配布，複製は認めない．

*Correspondence: Kendrick Co Shih, kcshih@hku.hk

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は，著者個人のものであり，必ずしも所属機関のもの，あるいは出版社，編集者，査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはそのメーカーが行う可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。

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