ラットにおける揚げ油の摂取はグリセロ脂質代謝、腸内組織学および微生物叢の構造を障害する

哉百名

ラットにおける揚げ油の摂取はグリセロ脂質代謝、腸内組織学および微生物叢の構造を障害する

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4848804/

Zhongkai Zhou, Yuyang Wang, [...], and Chris Blanchard

論文情報追加

要旨
背景
油で揚げることは、世界中で人気のある調理法である。しかし、揚げ物とともに摂取する食用油は、高温で再利用され続けるため、よく知られた多くの化学反応を引き起こすことから、その安全性が懸念されている。そこで、本研究では、ラットの揚げ物油摂取によるエネルギー代謝、大腸組織、腸内細菌叢の変化を調べ、上記の変化に関与する機序を探る。

研究方法
油揚げは公知の方法に従って調製した。Wistar成熟雄ラットを無作為に3群に分けた(n = 8/群)。グループ1：余分な油を摂取しない基礎食（コントロールグループ）；グループ2：非加熱キャノーラ油を補充した基礎食（NEOグループ）；グループ3：揚げキャノーラ油を補充した基礎食（DFEOグループ）。非加熱または加熱した油の1点5ミリリットル（1.5mL）を1日1回、6週間連続で給餌針を用いて経口ガベージにより与えた。DFEOがラットの体重、脂質代謝に関するKEGGパスウェイ、腸管組織、腸内細菌叢に及ぼす影響を、RNAシークエンス、HiSeq Illuminaシークエンスプラットフォーム等の手法を用いて解析した。

結果
3群のうち、DFEO食はラットの体重を最も減少させる結果となった。代謝パスウェイ解析では、Control群とNEO群で13のKEGGパスウェイが有意に濃縮され、その大部分が糖質、脂質、アミノ酸代謝に関連するものであることがわかった。NEO群とDFEO群を比較すると、有意に濃縮された機能パスウェイは、主に慢性疾患と関連していることが浮き彫りになった。その中で、1つの代謝経路（すなわち、グリセロ脂質代謝経路）のみが有意に濃縮されていたことから、この代謝経路（グリセロ脂質代謝）の阻害が、DFEO群のラットのエネルギー代謝の低下に対する反応である可能性が示唆された。関連遺伝子解析の結果、Lpin1 の発現低下とグリセロ脂質代謝経路の阻害が強く関連しているようであった。消化管の組織学的解析では、DFEO により腸管粘膜にいくつかの変化が生じ、それに伴い内分泌組織の破壊と炎症が確認された。微生物相データでは、DFEO群のラットは3群の中でPrevotellaの割合が最も低く、Bacteroidesの割合が最も高いことが示された。特に、DFEO群のラットはAllobaculum（ファーミキューテス）が多く、コントロール群およびNEO群では見られなかったという特徴があった。

結論
本研究では、DFEO が健康に及ぼす悪影響について調べた。DFEO は、グリセロ脂質代謝を損ない、腸の組織構造を破壊し、微生物叢プロフィールをアンバランスにする可能性があることがわかった。さらに重要なことは、これらの変化に関与するメカニズムを明らかにする初めての試みであり、健康な食生活を設計するための指針を提供する可能性があることである。

電子補足資料
本論文のオンライン版（doi:10.1186/s12944-016-0252-1）には補足資料が含まれており、正規ユーザーが利用することが可能である。

キーワード 揚げ油、微生物叢、組織学、代謝、Kegg 経路
背景
消化管に存在する微生物は、病原微生物からの防御 [1] 、栄養素やエネルギーの獲得、難消化性糖質の発酵など、宿主の生理機能に多大な影響を与える [2]。この微生物群集の構造は、免疫系の調節、代謝、感染症との闘いという点で宿主に寄与しています[3-5]。腸内細菌の組成と活性は、多くの環境またはライフスタイルの変数に反応して変化する可能性があり、最も重要なものの1つが食事です[6]。実際、腸内細菌叢の変動全体の57%は食事による変化であり、遺伝的背景は12%に過ぎないことが報告されています[7]。さらに、正常な宿主微生物群集の崩壊は、肥満、糖尿病、過敏性腸疾患などの慢性疾患の発症に寄与する可能性があります[8]。食事は腸内細菌叢の主要な決定要因です[3, 9, 10]。例えば、以前の研究では、脂肪または炭水化物制限食を摂取している人の腸内でバクテロイデーテスとファーミキューテスの比率が増加し、比率が高いほど体重減少が大きいことが分かりました[11]。

油で揚げることは、世界中で最も人気のある調理法の一つであり、食品に魅力的な風味、色、食感を与えてくれます。しかし、150〜180℃で揚げた食品は、最大で8〜25 %の油を吸収することが示されており [12]、これは食品の種類、油の性質、調理方法によって異なり、揚げ油が食品配合の主要な食物成分となりつつあることを示しています。このように、揚げ物とともに摂取される揚げ物用油（DFEO）の安全性が懸念されています。空気と水分の存在下で高温（160 ~ 190 °C）での連続調理は、多くの化学反応（例：酸化、加水分解、重合など）を引き起こす [13, 14]。これらの反応は、酸化脂肪酸、極性化合物、高分子生成物など、様々な種類の酸化生成物[15]の生成に伴い、油の組成を変化させる[16-18]。これまでの研究により、油揚げの摂取が肥満、動脈硬化、高血圧、糖尿病などの慢性疾患に寄与することが確認されています[19-21]。さらに、調理しすぎた食用油の摂取は、ラットの血圧を上昇させ、血管弛緩を損ない、内皮機能障害に起因する可能性があり[20]、研究はまた、揚げ油と前立腺がんのリスク増加の間の潜在的関連性を記述している[22]。これまでの研究は、主に揚げ物工程で生じる油の物理的・化学的変化に焦点を当てたものであった。今日まで、腸内細菌叢の変化に関する揚げ油（DFEO）の摂取を直接的または間接的に調査する十分な研究は行われていない。そこで、本研究では、腸内細菌叢の構造制御を通じて、DFEOの消化管環境に対する潜在的な毒性を評価することを目的とした。さらに、DFEOの摂取がエネルギー代謝、特に脂質代謝に及ぼす影響も検討した。我々の知る限り、これはエネルギー代謝と腸内細菌叢の構造の潜在的な関連性を明らかにする最初の試みである。

研究成果
異なる油脂の摂取がラットの体重に及ぼす影響
3つの実験グループのうち、NEOグループのラットは、飼料に含まれる余分な油の摂取により体重が最も高くなり（図1）、次いで対照グループのラットになると予想された。一方、DFEOを与えたラットは、有意差はないものの、3つのグループの中で最も低い体重となった。

Fig.
図1
図1 油脂摂取量の違いが体重に与える影響 Control：余分な油を摂取しない基礎飼料、NEO：基礎飼料＋非加熱キャノーラ油、DFEO：基礎飼料＋揚げ物キャノーラ油
パスウェイの有意な濃縮解析
KEGG オントロジー（KO）用語に基づき、KEGG パスウェイマッピングを実施した。KEGG オントロジー割当は、生物学的機能をさらに理解するために、同定された遺伝子の機能注釈を分類するために使用された（表 1）。対照群とNEO群の間で合計13の有意に濃縮されたKEGGパスウェイが決定され、その中で、「ペントースおよびグルクロン酸相互変換」、「ステロイドホルモン生合成」、「ヒスチジン代謝」の濃縮シグナル伝達経路に基づく糖質、脂質、アミノ酸の代謝に関連したパスウェイがそれぞれ大半である（対照群とNEO群の表1の対比）。この結果は、非加熱油の摂取によりエネルギー代謝が促進され、ラットの体重が増加したことを示唆していると思われる（表1）。一方、NEO対DFEO群では、異なる処理によって誘導された遺伝子制御に関連する機能パスウェイが47個有意に濃縮されており、それらは主に感染症やがんに関連する、マイクロRNA制御やがんにおける転写のミスレギュレーションなどであった。さらに重要なことは、NEO対DFEO群で有意に濃縮された代謝経路、すなわちグリセロ脂質代謝が1つだけ検出されたことである（表1）。私たちの知る限り、これはDFEOの摂取が脂質代謝に及ぼす影響に関与する重要な経路を明らかにした最初の報告である。

表1
表1
群間で異なる処理により誘導される遺伝子制御の機能パスウェイが有意に濃縮されていること
糖・脂質代謝に関するKEGG関連遺伝子を解析した結果、NEO群とDFEO群では、糖脂質代謝の制御に関与する5つの遺伝子（Agpat9、Lpin1、Akr1b1、Tkfc）が認められた（Table 2）。その中で、Lpin1遺伝子の発現低下が最も低く、P値5.00×10-5であり、脂質代謝の抑制に最も重要な役割を果たすと考えられる。

表2
表2
糖質・脂質代謝に関するKEGG関連遺伝子
組織学的研究
対照群のラットは正常な大腸組織構造を示し（図2a）、NEO群のラットは対照群と比較して大腸組織構造に有意な変化を示さなかった（図2b）。しかし、DFEO群のラットでは、大腸壁がび漫性になり、リンパ球が浸潤する（炎症）特徴が見られ、DFEO群の2/8例で観察され（Fig. 2c）、そのうちの1例では、正常腺構造が消失し、結合組織に置き換わっていた。

図2
Fig.
通常食（コントロール、2a、HE、100倍）、基礎食＋非加熱キャノーラ油（NEO、2b、HE、100倍）、基礎食＋揚げ油（DFEO、2c、HE、40倍）を与えたラットの結腸組織の組織学的解析。
異なる油の摂取が細菌群集構造に及ぼす影響
Illumina HiSeq解析により、合計1,034,683個の有効タグと19,418個のOTUを得た。シーケンスデータの合理性は、レアファクション曲線によって評価した（Additional file 1: Figure S1）。配列数が20,000まで増加するとレアファクション曲線が平坦になる傾向が見られ（Additional file 1: Figure S1）、配列データ量が合理的であることが示された。さらに、本研究ではすべての試料が少なくとも30,000塩基の配列を有していた。

3 群のうち、control 群の試料はタグと OTU が最も多く、他の 2 群の OTU は control 群と比較して有意に減少していた。高いものから順に、control群、DFEO群、NEO群であった（Additional file 1: Figure S2）。この結果は、腸内コミュニティの豊かさを評価するために使用されるChao指数で検証された。Chao indexが大きいほど、腸内コミュニティの豊かさが高いことを意味する。高い方から、コントロール、DFEO、NEOであった（Fig. 3a）。一方、腸内細菌群集の多様性もShannon指数で評価した（Fig.3b）。Shannon indexが大きいほど、群集の多様性が高いことがわかる。したがって、今回のデータでは、コントロール群のサンプルが最も細菌群集の多様性が高く、次いでNEO群であり、本研究ではDFEO群のラットで最も細菌群集の多様性が低いことが示された。この結果は、食餌が微生物の豊富さの主要な決定要因であり、食餌中の余分な油の摂取が腸内細菌の豊富さと多様性を明らかに減少させることをさらに示唆するものであった。

Fig.3
図3
各群の細菌群集の豊かさと多様性を示すChao aとShannon b指数。Control：余分な油を摂取しない基本食、NEO：基本食＋非加熱キャノーラ油、DFEO：基本食＋揚げキャノーラ油
全体の細菌群集組成を、重み付け（NMDS）および非重み付けUniFrac（PCoA）距離行列を用いて比較した（Fig.4、Fig.5）。PCoA、NMDSともに、3群のサンプルはすべて三等分されていることが示された。Fig. 6 は、コントロール群の試料が PC1 に沿って他の 2 群から分離しており、全変動量の 46.25 % を占めていることを示している。3 群の給餌条件は同一であったため、PC1 に沿って明確にクラスタリングされたことは、油の投与が細菌群集組成に劇的な影響を及ぼしたことを反映している。DFEO群とNEO群の点距離はPC2に沿って隣接・分離しており、全変動量の13.37 %を占めた。このことは、これら2つのグループの細菌群集組成は全体としてまだある程度の類似性を示しており、主要なオイル成分に関連する支配的な役割に関連している可能性があることを示唆していると思われる。さらに、グループ間および各グループ内の差異を比較するためにMRPP分析を行ったところ（Additional file 1: Table S2）、任意の2つのグループ間の差異が、個々のグループ内の差異よりも大きいことが示された。これらの結果から、PCoAおよびNMDS解析が検証され、食事が腸内細菌叢の構成に重要な影響を与えること、および今回の研究においてグループ分けが妥当であることが示された。

Fig.4
図4
NMDS解析により、糞便サンプルの生物種の違いを示す。β多様性はunweighted UniFracで解析した。Control：油を摂取しない基本食、NEO：基本食＋非加熱キャノーラ油、DFEO：基本食＋揚げキャノーラ油...。
Fig.5
Fig.
PCoA解析による糞便サンプルの生物種の違い。β多様性はUniFracで重み付けした。Control: 油を摂取しない基本食; NEO: 基本食に非加熱キャノーラ油を加えたもの; DFEO: 基本食に揚げたキャノーラ油を加えたもの
図6.
Fig.
ラットの糞便中に含まれる門地レベルの微生物種の相対的存在量。Control：油脂を摂取しない基本食、NEO：基本食＋非加熱キャノーラ油、DFEO：基本食＋揚げキャノーラ油
門地別では、NEO群、DFEO群ともにFirmicutesの割合がコントロール群に比べ増加した（図6）。一方、Bacteroidetesの割合は、有意差はないものの、コントロール群に比べNEO群で増加し、DFEO群で減少することも明らかになった。このような食餌の影響による細菌プロファイリングは、Fig.1に示すように、動物の体重の影響と一致するようである。

属レベルでは、コントロール群ではPrevotella属が最も多く（0.05848）、NEO群およびDFEO群ではLactobacillus属が最も多かった（それぞれ0.070665および0.0839）（Fig. 7）．上位10属のうち、Prevotella（Bacteroidetes）とRuminococcus（Firmicutes）の相対存在量は、DFEO群とNEO群の両方で対照群に比べ低かった。さらに、本研究では、DFEO群のラットが3群の中で最もプレボテラの割合が低く（図8）、このDFEO群におけるプレボテラの減少は有意であり、DFEOの摂取がプレボテラの増殖をさらに抑制することが示された。

Fig.7
Fig.
ラットの糞便中の属レベルで見た微生物種の相対的存在量。Control：余分な油を摂取しない基礎食、NEO：基礎食＋非加熱キャノーラ油、DFEO：基礎食＋揚げ物キャノーラ油
図8
図8
LEfSeツールによって検出されたラットの糞便サンプルに富む分類群を表すクラドグラム。NEO：基本食＋非加熱キャノーラ油、DFEO：基本食＋揚げたキャノーラ油
対照群と比較して、NEOおよびDFEO群では、いくつかの属の割合が増加した。例えば、DFEO群のラットでは、Lactobacillus属（Firmicutes）、Bacteroides属（Bacteroidetes）、Oscillospira属（Firmicutes）、Bifidobacterium属（Actinobacteria）の割合が最も高くなった。特に、DFEO群のラットでは、Allobaculum（ファーミキューテス）が多く存在し、コントロール群およびNEO群では存在しなかった（図7）。また、DFEO群以外のNEO群のラットでは、Lactobacillus属が最も多く含まれていた。

なお、本研究では、DFEO群のラットで鼓腸が観察され、DFEOの毒性により2匹のラットが死亡したことを付記しておく。これは、DFEO 群で Bacteroides が増加し、膿瘍などの感染症を悪化させる可能性があることと整合的である。しかし、鼓腸のメカニズムについては、さらなる研究が必要である。例えば、Clostridium perfringensは、グループ間で統計的に有意な種であることも判明した。さらに、Bifidobacteriales. S24_7 と Bacteroidiales は DFEO と関連し、Veillonellaceae と Clostridia は NEO 群で有意に増加した。さらに、クラドグラム（図8）でも、Bifidobacteriaceae, Bifidobacterialesの割合はDFEOとの関連性が高く、S24_7とLachnospiraceaeはNEO群のラットで特徴的であることが示された。

考察
本研究では、DFEOの摂取によりラットの体重が最も軽くなることがわかった。これは、DFEOの毒性成分が代謝に悪影響を及ぼし、ラットの体重増加を減少させることを示唆していると思われる。本研究におけるDFEOを摂取したラットの成長反応は、揚げ油を含む飼料が動物の体重増加を少なくすることを報告したLópezらの知見と一致する[23]。対照群とNEO群で有意に濃縮されたKEGGパスウェイは、主に代謝障害と関連していることを考慮すると、本研究はさらに、過剰調理された食用油の反復摂取が慢性疾患のリスクを高めるかもしれないという証拠を提供し、これは他の研究［22、24］と一致する。特に、NEO対DFEOグループで有意に濃縮された代謝KEGGパスウェイは、グリセロ脂質代謝の1つだけであった（表1）。これは、グリセロ脂質（GL）/遊離脂肪酸（FFA）サイクルが「無駄な」サイクルと呼ばれ、ATPを犠牲にしてエネルギーを放出するGLの連続的な形成と加水分解が含まれるので、脂質代謝に対するDFEO影響のメカニズムに関するより良い理解が得られるかもしれません [25]（Deflectronic Fabilités, Inc. したがって、本研究は、DFEO毒性が、特にグリセロ脂質代謝の経路を調節することによってエネルギー代謝を障害することを示唆している可能性がある。グリセロ脂質代謝経路の阻害は、DFEO 群のラットのエネルギー吸収の減少につながり、その結果、ラットの成長性能に影響を及ぼすことがわかった。この経路に関連する4つの遺伝子の発現も調査され、これらの遺伝子、特にそのうちの1つであるLpin1の発現低下がエネルギー代謝の調節に重要な役割を果たすと考えられた。本研究における脂質代謝における所見は、他の2つのグループのラットと比較して、DFEOグループのラットの体重が減少したことと一致する。

DFEOの摂取がラットの成長性能に及ぼす影響については、DFEOが腸管粘膜に誘発する損傷からさらに検討した（腺組織の構造を直接破壊することを含む）。これらの組織構造の変化は、DFEOに含まれる毒性化合物による直接的な損傷と関連している可能性があり、間接的に腸内細菌プロファイルの変化に影響を与えている可能性がある。細菌プロファイルの研究では、飼料に含まれる油の消費量が多いほど、チャオ指数とシャノン指数の両方が低下し、NEOおよびDFEO群のラットで細菌群集の豊かさと多様性が低いことが示された。これは、ラットの高脂肪食の摂取が腸内細菌叢を変化させ、総細菌密度および多様性の減少につながるという先行研究[27, 28]と一致し、食が腸内細菌叢の構成に影響を与える最も重要な要因の1つであることが示唆された。さらに、本研究では、DFEO群のラットで最も低い細菌群集多様性が認められたことから、DFEO中の化学構造も微生物構造に大きく影響する可能性があることがさらに示唆された。一般に、微生物の多様性が高いほど、生態系はより安定であると言われています。したがって、本研究から、DFEOの摂取は腸内細菌の多様性を低下させ、それが腸に対する潜在的な悪影響の一因となっている可能性が示唆された。

動物門レベルでは、3群ともFirmicutesとBacteroidetesが最も優勢であり、これは先行研究[11, 29]と一致した。オイル摂取によりFirmicutesの割合が高くなり、これは高脂肪食を与えた後のマウスの糞便サンプルでFirmicutesが増加したという先行報告 [6, 11]と一致した。しかし、対照群に比べDFEO群ではBacteroidetesの割合が減少し、NEO群では増加したことは、ラットの成長性能に直接影響すると考えられ、これらの細菌パターンは本研究で得られた体重に対応するものと一致した。

プレボテラ属レベルでは、本研究では、NEOおよびDFEO群のラットでプレボテラの割合が減少しており、飼料に含まれる油がプレボテラの増殖を抑制し、脂肪の分解および利用に関与する細菌の増殖を誘導する可能性が示された [30]．この結果は、炭水化物や単糖の分解・利用に関与し、長期間の食事と強く関連するとされるプレボテラの機能と関連している可能性がある[31]。しかし、DFEO群でプレボテラの割合が最も低いことは、この食事と腸内細菌の相互作用により複雑なメカニズムが関与していることを示唆している可能性がある。

さらに重要なことは、DFEO群のラットにはAllobaculum（ファーミキューテス）属が多く存在し、対照群とNEO群には見られなかったことである（図8）。この違いは、DFEO群のラットの腸内細菌叢の特徴づけに利用できるかもしれない。一方、これまでの研究で、食餌性脂肪が多いと乳酸菌の存在量が著しく減少することが報告されている[32, 33]。しかし、本研究では、NEO群とDFEO群の両方で乳酸菌の量が増加し、特にDFEO群で増加した。この結果は、DFEOの長期投与により腸に免疫ストレスが生じ、免疫恒常性の喪失につながったと解釈するのが妥当であろう。腸内細菌叢と動物の免疫状態には直接的な関係がある[34]。免疫系は、乳酸菌やビフィズス菌などの有益な細菌の増加を活性化することによって、潜在的な慢性ストレス要因（例えば、DFEOにおける様々な種類の酸化生成物）に抵抗するための下準備をした可能性がある。一方，乳酸菌は脂肪生成を抑制し，脂肪分解と脂肪酸酸化を増加させることができるため，油の追加投与は乳酸菌の代償的な増殖を引き起こした[35]．あるいは、揚げ時間が長いほど低pHとなり、DFEOのH+の活性は非加熱油の100倍となることが報告されている[36]。したがって、DFEOの投与は腸内pH値の低下を誘発し、その低pH環境がLactobacillusおよびBifidobacteriumの増殖をさらに促進する可能性がある。とはいえ、長期的な効果、特に揚げ油については、さらなる調査が必要である。食事と腸内細菌叢の反応は複雑であり、特に非加熱油と揚げ油の腸内細菌叢への影響の違いを記述した関連研究はなく、これらの微生物叢の示す作用はさらに検証される必要がある。

結論
揚げ物加工後の油の摂取は、体重、脂質代謝、腸内細菌叢および組織学的性質に異なる影響を及ぼした。本研究では、DFEOを与えたラットが3群の中で最も低い体重であることがわかった。さらに重要なことは、NEO 群と DFEO 群で有意に濃縮された KEGG パスウェイが 1 つだけ検出され、DFEO の毒性はエネルギー代謝、特にグリセロ脂質代謝のパスウェイを調節することで障害を与えることを示した最初の報告である。グリセロ脂質代謝経路の阻害は、Lpin1 の遺伝子により高度にダウンレギュレートされ、この変化は DFEO 群のラットの体重減少に関連している可能性が示唆された。非加熱油と比較して、揚げ油の摂取は、腸の組織構造に有害な影響を及ぼす可能性がある。炎症性潜在因子として、DFEOの摂取は、Prevotellaの減少およびBacteroidesの増加と関連することが判明した。特に、DFEO群のラットでは、Allobaculum（ファーミキューテス）が多く存在することも特徴的であった。さらに、DFEO群のラットではLactobacillusとBifidobacteriumの割合が増加したことから、DFEO含有飼料による免疫ストレスが関与している可能性が示唆された。

方法
材料
非加熱食用油（生キャノーラ油、NEO）は、地元のスーパーマーケットから購入した。揚げ物用食用油（揚げ物用キャノーラ油、DFEO）は、以前に記載されたように調製した[37]。内径45cm、深さ20cmの鉄製鍋に新鮮なキャノーラ油（7L）を注ぎ、チキンナゲット、ポテトチップス、パン片、または魚100gをそれぞれ4分間または2分間、補充せずに連続して合計30分間揚げ、190±5℃で4日間（各日8時間）加熱した。その他の化学薬品は試薬グレードのものを使用し、受け取ったまま使用した。

動物および飼料
体重295±10gの6週齢のWistar系雄ラットを中国軍医科学院動物舎から購入した。基本食で1週間適応飼育した後、ラットをランダムに3群に分けた。グループ1：余分な油を摂取しない基本食（コントロールグループ）；グループ2：非加熱キャノーラ油を補充した基本食（NEOグループ）；グループ3：揚げキャノーラ油を補充した基本食（DFEOグループ）。非加熱または加熱した油の1ポイント5ミリリットル（1.5 mL）を、1日1回、給餌針を用いて経口ガベージにより連続6週間与えてから動物を犠牲にし、分析を行った。各グループは8匹をプラスチックケージに収容し（4匹／ケージ）、水と餌に自由にアクセスできるようにした。湿度（55 ± 5 %）、光（12/12時間明暗サイクル）、温度（23 ℃）の条件は、実験期間全体を通じて制御された。基礎飼料（標準的なげっ歯類の餌）の主成分は、Additional file 1: Table S1に示されている。

組織学的研究
腸管組織を取り出し、10 %中性ホルマリンで48時間固定し、流水で24時間洗浄した後、30、50、70、80、90、95、100 %エタノールで脱水し、キシレンで2回洗浄してパラフィンに包埋し、ミクロトーム (Leica RM2235; Leica, Heidelberg, Germany) で5 μ m厚に切片化した。スライドはヘマトキシリン・エオジン（H&E）で染色し、組織学的検査を行った。

トータルRNA抽出と定量RT-PCR解析
6 週間の実験試験後、ラットは直ちに滅菌ハサミで解剖された。肝臓を取り出し、重量を測定し、0.5cm3の断片に切断し、直ちに液体窒素で凍結し、そしてトータルRNA抽出のためにホモジナイズする前に80℃で保存した。

Trizol Reagent (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) を用いて、製造業者のプロトコールに従って、各肝臓サンプルから総RNAを抽出した。オリゴ（dT）磁気ビーズを用いて、精製ポリ（A）＋mRNAを総RNA試料から抽出した。Total RNAおよびcDNA合成を以下に記載するように行い、得られたcDNAをqRT-PCR分析まで20℃で保存し、各プライマー2μM、cDNA40ngおよびSYBR Primix ExTag10μLを含む20μL容量で実施した。サーマルサイクリング条件は、95 ℃で5分間の初期変性ステップ、その後95 ℃で30秒、58-60 ℃で30秒、72 ℃で30秒を40サイクル行い、各サイクル終了時に蛍光を測定した。18S rRNA 遺伝子を内部コントロールとして使用し、標的遺伝子の発現を正規化した。各反応を 3 回繰り返し、2-ΔΔCT の方法に従って相対転写量を算出した[38]。

デジタル遺伝子発現タグプロファイリング
mRNA を断片化バッファーで短い断片に切断した。この短い poly (A) + mRNA 断片にランダムプライマーを加え、Superscript II を用いて一本鎖 cDNA を合成した。その後、バッファ、dNTPs、DNA polymerase I、RNaseHを加え、2本目のcDNAを生成した。二本鎖cDNAは、T4 DNA polymerase、Klenow Enzyme、T4ポリヌクレオチドキナーゼを加えることにより末端を修復した。続いて、Klenow 3-5' exo-polymeraseを用いて1つの'A'塩基を付加し、DNA ligaseを用いて配列決定用アダプターを断片にライゲーションした。ハイスループットな配列決定のために、cDNA断片（PE200）をアガロースゲル電気泳動で分離し、Illumina Hiseq™ 2000プラットフォームで配列決定した。

転写量と遺伝子発現の差は、プログラムCufflinks [39]を用いて計算した。P値の閾値は、有意性の多重検定を考慮し、偽発見率（FDR）により決定した。本研究では、FDR 閾値≦ 0.01 および Fold change ≧ 2 を遺伝子発現の有意差とみなした。

腸内細菌叢の解析
糞便サンプル採取、DNA抽出・精製
6週間飼育後、全てのラットを新鮮な滅菌ケージに移し、新鮮な糞便を採取し、直ちに液体窒素で凍結し、DNA抽出まで80℃で保存した。各グループの糞便を6個ずつ採取した。

E.Z.N.A. DNA Stool Mini Kit (Omega Biotek, Germany) を用いて、200 mgの試料から製造者のプロトコルにしたがって微生物DNAを抽出した。各サンプルについて、偏りを避けるためにDNAは二重に抽出され、同じサンプルからの抽出物はプールされた。DNAの純度および濃度は、e-Spect ES-2 (Malcom, Japan)を用いて分光光度法で分析した。抽出されたDNAは使用するまで20℃で保存した。

16S rDNA V4超可変領域のPCR増幅
V4 16S rDNA超可変領域を含む配列は、融合プライマー（515Fと806R）を用いてDNAサンプルからPCR増幅した。すべてのPCR反応はPhusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs)を用いて行った。PCR産物は、同量の1Xローディングバッファー（SYB green含有）とPCR産物を混合し、2 %アガロースゲル上で電気泳動により分離して分析した。400から450 bpの間に明るいメインバンドを持つサンプルがさらなる実験のために選ばれた。PCR産物はQiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Germany)を用いて精製した。TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit (Illumina, USA) を用いて、製造元の推奨に従ってシーケンスライブラリーを作成し、インデックスコードを付加した。ライブラリーの品質は、Qubit@ 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific) とAgilent Bioanalyzer 2100システムで評価した。最後に、ライブラリーをIllumina HiSeq2500プラットフォームでシーケンスし、250 bp paired-end readsを生成した。

塩基配列の解析
すべての生リードを標準プロトコルに従って処理し、有効なタグを取得した[40-42]。HiSeq Illuminaシーケンスプラットフォームに基づき、ダブルエンドシーケンス（Paired-End）法を使用した。末端配列はスモールフラグメントライブラリーで構築した。配列解析は、Uparseソフトウェア（Uparse v7.0.1001）を用いて行った。配列データは、リードのトリミングとV4配列の同定を行った後、フィルタリングと操作上の分類単位（OTU）の割り当てを行った。類似度97%以上の配列は、同じOTUに割り当てられた。サンプルの種構成は、OTUのクラスタリング、種アノテーション、存在量分析によって明らかにされた。

異なるサンプルの微生物群集の種の豊富さと多様性は、チャオ指標とシャノン指標で分析した。サンプル指数はQIIME（バージョン1.7.0）で計算し、Rソフトウェア（バージョン2.15.3）で表示した。ベータ多様性分析を用いて、異なるサンプルの微生物群集の多様性を比較分析した。QIIMEソフトウェア（Version 1.7.0）により、重み付きおよび重みなしunifracのベータ多様性を算出した。PCoA (Principal Co-ordinates Analysis, PCoA) と NMDS (Non-Metric Multi-Dimensional Scaling, NMDS) により、サンプル間の種差を示しました。MRPP解析は、グループ内とグループ間の群集構造の違いを比較するために使用された。

統計解析
体格は平均±SDで表し、Fisher検定を用いて解析した。T-検定およびLDA効果・サイズ分析を用いて、バイオマーカーおよび腸内細菌叢における異なるグループ間の統計的な有意差を判定した。P < 0.05を有意差とみなした。

倫理に関する記述
すべての動物実験手順は、天津科技大学医薬品安全性評価センター動物実験使用倫理委員会（承認番号：17/055/MIS）により報告され、承認された。

謝辞
著者らは、農業科学技術成果転換基金（2014GB2A100527）、中国国家自然科学基金（第31471701号）、中国-欧州研究協力プログラム（SQ2013ZOA100001）、2015 Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology（15JCZDJC34300）、ARC Industrial Transformation Training Centre for Functional Grains, Charles Sturt University, Australiaによる資金提供に感謝します。

追加ファイル
追加ファイル1: 図S1(199K, doc)

異なるグループにおける細菌群集の合理性を示す希薄化曲線。Control：余分な油を摂取しない基礎食；NEO：非加熱キャノーラ油を使用した基礎食；DFEO：揚げキャノーラ油を使用した基礎食。図S2. サンプルのOTUのクラスタリングとアノテーション。X軸は異なるサンプル名。最初のY軸はタグ番号、2番目のY軸はOTUs番号である。表S1. 基本的な食餌の成分 表S2. 対照群、NEO群、DFEO群間の差のMRPP。(DOC 198 kb)

脚注
利害関係

著者らは、競合する利害関係を有していないことを宣言する。

著者の貢献

すべての著者は、実験の計画、データの解釈、原稿の準備、改訂、最終版の承認に貢献した。YM. J.はデータの処理と解析も行った。最終原稿は全著者が読み、承認した。

投稿者情報
Zhongkai Zhou, Fax: +862260601375, Email: nc.ude.tsut@uohzkz.

Yuyang Wang, Email: moc.621@121yyw.

Yumei Jiang、電子メール：nc.ude.tsut@iemuygnaij.

Yongjia Diao、電子メール：moc.liamxof@4080jyd.

Padraig Strappe、電子メール：ua.ude.usc@eppartsp.

Paul Prenzler、電子メール：ua.ude.usc@relznerpp.

Jamie Ayton、電子メール： ua.vog.wsn.ipd@notya.eimaj.

Chris Blanchard、Eメール：ua.ude.usc@drahcnalbc.

記事情報
リピッズ・ヘルス・ディス。2016; 15: 86.
オンライン公開 2016 Apr 28. doi: 10.1186/s12944-016-0252-1
PMCID: PMC4848804
PMID: 27121709
Zhongkai Zhou,corresponding著者Yuyang Wang, Yumei Jiang, Yongjia Diao, Padraig Strappe, Paul Prenzler, Jamie Ayton, and Chris Blanchard
天津科学技術大学教育部食品栄養・安全重点実験室（中国天津市、〒300457
ARC Industrial Transformation Training Centre for Functional Grains, Charles Sturt University, Wagga Wagga, NSW 2650 Australia（機能性穀物に関するARC産業変革トレーニングセンター
NSW Department of Primary Industries, Agriculture Institute, Wagga Wagga, NSW 2650 オーストラリア
天津科学技術大学食品工学・生物工学部、天津、〒300457 中国
Zhongkai Zhou, Fax: +862260601375, Email: nc.ude.tsut@uohzkz.
投稿者情報
corresponding authorCorresponding author.
Received 2016 Feb 3; Accepted 2016 Apr 19.
著作権 © Zhou et al.
Open Accessこの記事は、クリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンス (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) の条件の下で配布されています。このライセンスは、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更があった場合に示すことを条件に、あらゆる媒体での無制限の使用、配布、複製を許可しています。本論文で利用可能なデータには、特に断りのない限り、クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの権利放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）が適用されます。
Lipids in Health and Diseaseからの記事はBioMed Centralの好意によりここに提供されています。
参考文献

  1. マウス結紮パイエル板腸管ループアッセイによるM細胞への細菌取り込み評価への応用. J Vis Exp. 2011;58:3225-3229. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [Google Scholar].

  2. Ozgun H, Tao Y, Ersahin ME, Zhou Z, Gimenez JB, Spanjers H, et al. Impact of temperature on feed-flow characteristics and filtration performance of an upflow anaerobic sludge blanket coupled ultrafiltration membrane treating municipal weptewater. Water Res. 2015;83:71-83. doi: 10.1016/j.watres.2015.06.035. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] を参照。

  3. Hooper LV, Littman DR, Macpherson AJ. 微生物叢と免疫系の相互作用。Science. 2012;336（6086）:1268-1273.DOI：10.1126/科学.1223490. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  4. Li H, Lelliott C, Håkansson P, Ploj K, Tuneld A, Verolin-Johansson M, et al. 食餌誘導肥満マウスにおける腸、脂肪、および肝臓の炎症。Metabolism. 2008;57（12）：1704から1710まで。[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  5. Sekirov I, Finlay BB. 腸内感染症における腸内細菌叢の役割(The role of the intestinal microbiota in enteric infection). J Physiol.2009;587(17):4159-4167. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  6. Hildebrandt MA, Hoffmann C, Sherrill-Mix SA, Keilbaugh SA, Hamady M, Chen YY, et al. High-fat diet determines the composition of the murine gut microbiome independently of obesity.高脂肪食は肥満とは無関係にマウスの腸内細菌の構成を決定する。Gastroenterol. 2009;137（5）：1716から1724まで、10.1053/j.gastro.2009.08.042。[PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  7. また、このような研究成果を踏まえて、「日本学術振興会特別研究員奨励賞」を受賞しました。ISME J. 2010;4(2):232-241.論文番号: 10.1038/ismej.2009.112. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

    1. Kamada N, Seo S-U, Chen GY, Núñez G. Role of the gut microbiota in immunity and inflammatory disease. Nat Rev Immunol. 2013;13(5):321-335. doi: 10.1038/nri3430. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  9. Bernstein CN, Shanahan F. Disorders of a modern lifestyle: reconciling the epidemiology of inflammatory bowel diseases.バーンスタインCN、シャナハンF.現代のライフスタイルの障害：炎症性腸疾患の疫学を調整する。Gut。2008;57（9）：1185-1191。[PubMed] [CrossRef][Googleスカラー]。

  10. Flint HJ, Duncan SH, Scott KP, Louis P. Interactions and competition within the microbial community of the human colon: links between diet and health. Environ Microbiol. 2007;9(5):1101-1111. doi: 10.1111/j.1462-2920.2007.01281.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  11. Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, Gordon JI. 微生物生態学：肥満と関連するヒト腸内細菌。ネイチャー。2006;444（7122）：1022から1023まで。[PubMed] [CrossRef][Googleスカラー]。

  12. Mendonça MA、Coelho Araújo WM、Borgo LA、Araújo HC. 揚げ物油：熱による変化。J Culinary Sci Tech. 2015;13(2):116-132. doi: 10.1080/15428052.2014.952481. [CrossRef] [Google Scholar] を参照。

  13. Gertz C. Chemical and physical parameters as quality indicators of used frying fats. Eur J Lipid Sci Tech. 2000;102:566–572. doi: 10.1002/1438-9312(200009)102:8/9<566::AID-EJLT566>3.0.CO;2-B. [CrossRef] [Google Scholar].

  14. Koh E, Surh J. Food types and frying frequency affects the lipid oxidation of deep frying oil for preparation of school meal in Korea. Food Chem. 2015;174:467-472. doi: 10.1016/j.foodchem.2014.11.087. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]を参照。

  15. Choe E, Min D. Chemistry of deep-fat frying oils. J Food Sci. 2007;72(5):R77-R86. doi: 10.1111/j.1750-3841.2007.00352.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  16. Bansal G, Zhou W, Barlow PJ, Joshi PS, Lo HL, Chung YK. フライ油の品質変化を測定するために利用可能な迅速試験のレビューと標準法との比較。2010;50(6):503-514.doi:10.1080/10408390802544611.Crit Rev Food Sci Nutr. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  17. Marmesat S, Velasco J, Dobarganes M. Quantitative determination of epoxy acids, keto acids and hydroxy acids formed in fats and oils at frying temperatures. J Chromatogr A. 2008;1211(1):129-134. doi: 10.1016/j.chroma.2008.09.077. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  18. Romero A, Bastida S, Sánchez-Muniz F. 油分補給をしないひまわり油と高オレイン酸ひまわり油での冷凍食品の国内フライにおける環状脂肪酸モノマー生成。Food Chem Toxicol. 2006;44(10):1674-1681. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  19. Chuang H-C、Huang C-F、Chang Y-C、Lin Y-S、Chao P-M. C57BL/6 J マウスの妊娠中の酸化した揚げ油の摂取は、成体における食事誘発性肥満に対するオスとメスの子孫の感受性に異なる影響を与える。J Nutr. 2013;143(3):267-273. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  20. Leong X-F、Mustafa MR、ダスS、Jaarin K.加熱植物油を与えた実験Sprague-Dawleyラットの血圧上昇と血管弛緩障害の関連性。Lipids Health Dis. 2010;9（1）：66から75まで。[PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  21. Xian TK, Omar NA, Ying LW, Hamzah A, Raj S, Jaarin K, et al. Reheated palm oil consumption and risk of atherosclerosis: evidence at ultrastructural level（再加熱パーム油消費と動脈硬化のリスク：超微細構造レベルでの証拠）。2012;2012（2012）：828170-828175。[PMC無料記事] [PubMed][Googleスカラー]。

  22. Stott-Miller M, Neuhouser ML, Stanford JL. 揚げ物の消費量と前立腺癌のリスク。Prostate. 2013;73（9）：960から969まで。[PMC無料記事] [PubMed][CrossRef][Googleスカラー]。

  23. López-Varela S, Sánchez-Muniz F, Cuesta C. Decreased food efficiency ratio, growth retardation and changes in liver fatty acid composition in rats consuming thermally oxidized and polymerized sunflower oil used for fries. Food Chem Toxicol. Food Chem Toxicol. 1995;33(3):181-189.doi: 10.1016/0278-6915(94)00133-9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  24. Lippi G, Mattiuzzi C, Cervellin G. Fried food consumption and ischemic heart disease（揚げ物の消費と虚血性心疾患）: 系統的な文献レビュー。Int J Cardiol. 2015;190:210-211. doi: 10.1016/j.ijcard.2015.04.178. [PubMed] [CrossRef][Googleスカラー]を参照してください。

  25. Prentki M, Madiraju SM. 健康や病気におけるグリセロ脂質の代謝とシグナル伝達。2008;29(6):647-676.doi: 10.1210/er.2008-0007.Endocr Rev. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  26. HGNC, 2016. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/23175.
    27.ド・ラ・セールCB、エリスCL、リーJ、ハートマンAL、ラトリッジJC、レイボルドHE. ラットの高脂肪食誘発性肥満への傾向は、腸内細菌叢の変化と腸内炎症と関連している。Am J Physiol-Gastr L. 2010;299(2):G440-G448. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [Google Scholar].

  27. シンプソンH、キャンベルB.レビュー記事：食物繊維-微生物叢の相互作用。Aliment Pharm Ther. 2015;42(2):158-179. doi: 10.1111/apt.13248. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  28. Qin J, Li R, Raes J, Arumugam M, Burgdorf KS, Manichanh C, et al. メタゲノムシーケンスによって確立されたヒト腸内細菌遺伝子カタログ. Nature. 2010;464(7285):59-65.ドイ: 10.1038/nature08821. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  29. Amato KR, Yeoman CJ, Cerda G, Schmitt C, Cramer JD, Miller MEB, et al. Variable responses of human and non-human primate gut microbiomes to a western diet（西洋食に対するヒトおよび非ヒト霊長類の腸内微生物の可変反応）。Microbiome. 2015;3:53-61. doi: 10.1186/s40168-015-0120-7. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  30. Wu GD, Chen J, Hoffmann C, Bittinger K, Chen YY, Keilbaugh SA, et al. Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes（長期的な食事パターンと腸内細菌の腸型との関連性）。Science. 2011;334（6052）:105-108.DOI：10.1126/科学.1208344. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  31. 高脂肪食を摂取したラットの脂質代謝に対する2種類のラクトバチルス・プランタラム菌株の効果。Scientific World Journal. 2013;66(11):1653–1656. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [Google Scholar].

  32. Xie N, Cui Y, Yin YN, Zhao X, Yang JW, Wang ZG, et al. 高コレステロール食を与えたラットの脂質代謝と腸内細菌叢に対する2種類の乳酸菌の効果。BMC Complem Altern M. 2011;11（1）：53から63まで。[PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  33. ヘルウェグP、クラマー・ルカスS、ストラッサーA、ゼンテックJ.成犬の免疫系と腸内細菌叢に対する牛ラクトフェリンの効果。2008;62（8）:152-161。[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  34. Lactobacillus plantarum NCU116 は、高脂肪食誘発非アルコール性脂肪肝疾患ラットの肝機能、酸化ストレス、脂質代謝を改善する。Food Funct. 2014;5(12):3216-3223. doi: 10.1039/C4FO00549J. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  35. Gao XY, Si ZM, You XX, Zheng L. Electrochemical Analysis for Rapid Quality Assessment of Used Soybean Oil（使用済み大豆油の迅速な品質評価のための電気化学分析）. Food Sci. 2013;34:220-223. [Google Scholar].

  36. Kuligowski J, Carrión D, Quintás G, Garrigues S, de la Guardia M. Sample classification for improved performance of PLS models applied to the quality control of different botanic origins analyzed using ATR-FTIR spectroscopy. Anal Bioanal Chem. 2011;399(3):1305-1314. doi: 10.1007/s00216-010-4457-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  37. Livak KJ, Schmittgen TD. リアルタイム定量PCRと2-ΔΔCT法を用いた相対的遺伝子発現データの解析。Methods. 2001;25(4):402-408. doi: 10.1006/meth.2001.1262. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  38. このような場合、「RNA-seq 実験の遺伝子および転写産物発現の差分解析」を TopHat および Cufflinks を用いて行った。Nat Protoc. 2012;7(3):562-578. doi: 10.1038/nprot.2012.016. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  39. Bokulich NA, Mills DA. 真菌群の定量的超高速プロファイリングを可能にする内部転写スペーサー特異的プライマーの選択改良。Appl Environ Microbiol. 2013;79(8):2519-2526. doi: 10.1128/AEM.03870-12. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  40. Caporaso JG, Lauber CL, Walters WA, Berg-Lyons D, Lozupone CA, Turnbaugh PJ, et al. 16S rRNA diversity の Global patterns at a depth of millions of sequences per sample. この論文では、「16S rRNAの多様性のグローバルパターン」「16S rRNAの多様性のグローバルパターン」「16S rRNAの多様性のグローバルパターン」について解説しています。[PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  41. マゴックT、サルツバーグSL。このような場合、「FLASH：Fast Length Adjustment of Short Reads to improve Genome assemblies. バイオインフォマティクス. 2011;27(21):2957-2963. doi: 10.1093/bioinformatics/btr507. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
    ご意見をお聞かせください

この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？