防御常在菌を標的とするバクテリオファージは、人工授精マウスにおけるサルモネラ・チフスムリウム感染に対する抵抗性を低下させる

2023年9月8日 11:00

研究論文
防御常在菌を標的とするバクテリオファージは、人工授精マウスにおけるサルモネラ・チフスムリウム感染に対する抵抗性を低下させる

https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1011600

Alexandra von Strempel, Anna S. Weiss, Johannes Wittmann, Marta Salvado Silva, Diana Ring, Esther Wortmann, [...view 3 more...], Bärbel Stecher

バージョン2
要旨
腸内微生物群集は、ヒトの様々な主要消化管病原体から宿主を守っている。バクテリオファージ（ファージ）は自然界に遍在し、食物や飲料水を介して頻繁に摂取される。さらに、宿主への深刻な悪影響が知られていないことから、マイクロバイオーム工学にとって魅力的なツールである。しかしながら、消化管マイクロバイオームにおけるファージの機能的役割については、まだ十分に理解されていない。ここでは、ヒト腸内病原体Salmonella enterica serovar Typhimurium（S.Tm）の感染に対する微生物指向性ファージの効果を、colonization resistance（CR）のためのgnotobioticマウスモデル（OMM14）を用いて調べた。我々は、大腸菌と腸球菌を標的としたファージカクテルが株特異的に作用することを示した。これらのファージは、それぞれの標的の個体密度を一過性に減少させた後、最長9日間共存を確立した。S.Tmに対する感染感受性は、両ファージカクテルによるチャレンジ後の早い時点で著しく上昇した。驚くべきことに、OMM14マウスは、1回のファージ接種から7日後、標的細菌集団がファージ投与前の密度に戻った時点でも感受性を示した。結論として、我々の研究は、腸内細菌叢の保護細菌の密度を動的に調節するファージが、特にファージ投与後の早い時点で、細菌性病原体の侵入の機会を提供する可能性があることを示している。このことは、微生物叢の保護メンバーを標的とするファージが、サルモネラ菌感染のリスクを高める可能性を示唆している。

著者による要約
メタゲノム研究により、ヒト腸内では細菌とその特異的ウイルスであるバクテリオファージ（ファージ）が最も豊富で多様な微生物群集であることが明らかになった。しかし、腸内細菌群集の形成におけるファージの役割を明らかにするための機能的研究はまだ不足している。腸内細菌叢の基本的な機能は、サルモネラ菌などの腸内病原体の侵入に対するコロニー形成抵抗性（CR）である。ここでは、簡略化したgnotobioticマウスモデルと2種類のファージカクテルを用いて、細菌群集におけるファージの影響、標的株への影響、CRへの影響を調べた。その結果、ファージを経口投与すると、サルモネラ菌に対するCRが低下することがわかった。従って、ファージの摂取は細菌感染の素因となる危険因子であり、感染感受性の対人変動を説明できる可能性がある。我々は、消化管感染症に対するCRの低下に関連する、これまで予想されていなかったファージの影響について報告する。

引用：von Strempel A, Weiss AS, Wittmann J, Salvado Silva M, Ring D, Wortmann E, et al. (2023) 保護常在菌を標的とするバクテリオファージは、gnotobioticマウスにおけるサルモネラ・チフスムリウム感染に対する抵抗性を損なう。PLoS Pathog 19(8): e1011600.

編集者メアリー・X・オリオーダン、ミシガン大学医学部、米国

受理された： 2022年9月28日受理：受理：2022年9月28日；受理：2023年8月4日；掲載：2023年8月21日 2023年8月21日発行

データの利用可能性 OMM14コンソーシアム(51)の12株のゲノムは、DDBJ/ENA/GenBankから以下のアクセッション番号でアクセスできる： CP022712.1（E. faecalis KB1）、NHMR02000001-NHMR02000002（B. animalis YL2）、CP021422.1（A. Muris KB18）、CP021421.1（M. intestinalis YL27）。intestinalis YL27）、NHMQ01000001-NHMQ01000005（F. plautii YL31）、NHTR01000001-NHTR01000016（E. clostridioformis YL32）、CP021420.1（A. muciniphila YL44）、NHMP01000001-NHMP01000020（T. muris YL45）、CP022722.1（C. incocuum I46）、NHMU01000001-NHMU01000019（B. caecimuris I48）、NHMT01000001-NHMT01000003（L. reuteri I49）、CP022713.1（B. coccoides YL58）、CP028714（E. coli Mt1B1）、KR364761.1（E. muris JM40）。大腸菌Mt1B1ファージのゲノムは、以下のGenbank Accession番号でアクセスできる： MT496969 (Mt1B1_P3), MT496971 (Mt1B1_P10), MT496970 (Mt1B1_P17). E. faecalis KB1ファージのゲノムは、NCBI Accession Numberでアクセスできます： PRJNA972641: SAMN35084619 (vB_efa_Str1), SAMN35084620 (vB_efa_Str2) SAMN35084621 (vB_efa_Str6).

資金提供本研究は、ドイツ研究財団（プロジェクト番号395357507、B.S.およびT.C.へのサブプロジェクトP14）、欧州研究会議（EVOGUTHEALTH、B.S.への助成金番号865615）、DFG-ANRプロジェクトPhaStGut（STE 1971/11-1、B.S.への助成金番号865615）、PRCI ANR-20-CE-1371（B.S.への助成金番号395357507）の支援を受けた、 PRCI-ANR-20-CE92-0048からL.D.へ）、DFG優先プログラムSPP2330（B.S.へ）、ドイツ感染研究センター（DZIF）（TTU 06.712からB.S.へ、TTU 06.709からB.S.へ）、消化管マイクロバイオーム研究センター（CEGIMIRからB.S.へ）。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と解析、発表の決定、原稿作成には関与していない。A.v.S.、A.S.W.およびE.W.は、ドイツ研究財団（プロジェクト番号395357507、P08およびP14）の助成による共同研究センターCRC1371から給与を受けた。M.S.S.は欧州研究会議（EVOGUTHEALTH；助成金番号865615）から給与を受け取った。

競合利益：著者らは、競合する利益は存在しないことを宣言する。

はじめに
ヒトの腸は複雑で非常に動的な微生物生態系であり、細菌を中心とする数兆個の微生物から構成されている[1]。他の重要な機能に加え、腸内細菌叢は、サルモネラ菌、クロストリジオイデス・ディフィシル（Clostridioides difficile）、多耐性グラム陰性菌（MRGN）などのヒト病原体に対する防御バリアを形成しており、コロニー形成抵抗性（CR）と呼ばれている。CRの基礎となるメカニズムには、基質競合、バクテリオシンや毒性代謝産物の産生、宿主免疫応答の開始などがある [2]。コロニー形成抵抗性（CR）は、複雑な微生物叢を有する宿主において高く、一般に薬剤 [3]、食事要因 [4,5]、疾患 [6]によって破壊されるが、健康なヒト個体においても非常に多様であることが示されている [7,8]。その他の危険因子が存在する可能性もあるが、現在のところまだ解明されていない。

細菌だけでなく、ヒトのマイクロバイオームにはウイルスも含まれており、中でも細菌を捕食するウイルスであるバクテリオファージは非常に豊富である [9,10]。これまでの研究で、ファージは細菌群集に影響を与え [11,12]、宿主細菌と相互作用することで細菌集団の構造、機能、メタボロームに影響を与えることが報告されている。メタゲノム研究により、腸内細菌叢には主に温和なファージが同定され [13]、その活性化は食事を含む様々な環境誘導物質によって引き起こされることが示された [14,15]。病原性ファージは哺乳類の腸内細菌[16]にも存在し、長期間にわたって宿主細菌と共存し[17]、細菌群集に機能的な影響を与えることもある[11]。メタゲノム研究では、腸内におけるファージの存在量、多様性、個体性、安定性が研究されているが [18]、腸内マイクロバイオーム機能の制御における病原性ファージの役割についてはほとんど知られていない。

本研究では、大腸菌（Escherichia coli）と腸球菌（Enterococcus faecalis）を標的とした2種類の病原性ファージカクテルが、腸内微生物群集とヒト病原性サルモネラ菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium：S.Tm）に対するCRに及ぼす影響を調べた。我々は、機能的マイクロバイオーム研究のための合成細菌群集であるOligo-Mouse-Microbiota（OMM12）に基づく、CRのためのgnotobioticマウスモデルを使用した[19]。OMM12は、マウス腸内の5つの主要な門を代表する12の細菌株から構成されており、最近in vitroで特徴づけられ[20]、細菌株によって機能を付加的に拡張することができる。ここでは、OMM12に大腸菌Mt1B1と二次胆汁酸産生菌Extibacter muris DSM 28560の2株を追加し、消化管病原体に対するCR（OMM14）を強化した[21]。最近の研究では、大腸菌Mt1B1とE. faecalis KB1が、群集環境においてS. Tmに対するCRの仲介に関与していることが示された。これら2つの細菌種は、環境中に存在し、飲料水や食品を介して腸内に到達する可能性のある病原性ファージに頻繁に感染している[22,23]。われわれは、大腸菌とフェカリスを標的としたファージが、in vivoおよびin vitroのマイクロバイオーム機能に与える影響と、合成腸内細菌群集のメンバーに対するグローバルな影響に取り組んだ。S.Tmに対するCRを仲介する役割を果たす細菌を標的とすることで、ファージがCRを損ない、病原体の侵入を促進することを示した。

研究結果
ファージの単離と特性解析
大腸菌Mt1B1を標的にするため、我々は3つの病原性ファージ、Mt1B1_P3、Mt1B1_P10、Mt1B1_P17（略称：P3、P10、P17）を選択した。これらのファージは以前に特性解析され、gnotobioticマウスにおいて宿主株と安定的に共存することが示されている[17]。P3とP10はポドウイルスであり、それぞれTeseptimavirus属とZindervirus属に属するが、P17はミオウイルスの特徴を示している（表1）。Lourencoら[17]と同様に、3つのファージはそれぞれin vitroで大腸菌Mt1B1の増殖を阻害し、同時に加えると最も強い阻害効果を示した（S1A Fig）。以前の研究で、個々のファージの宿主域が、いくつかの異なる大腸菌株に対して試験された[17,24]。その結果、P17ファージはかなり広い宿主範囲を示したが、P3とP10の宿主範囲は狭かった。

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表1. 本研究で分離されたファージの特徴
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さらに、下水からE. faecalis KB1（DSM 32036）を標的とする3つのファージ：vB_EfaS_Strempel1（略称：Str1、DSM 110103）、vB_EfaP_Strempel2（Str2、DSM 110104）、vB_EfaS_Strempel6（Str6、DSM 110108）を単離し、分類学的および機能的に特徴付けた。Str1とStr6はそれぞれEfquatrovirus属とSaphexavirus属に属し、サイホウイルスの特徴を示し、Str2はポドウイルスでCopernicusvirus属に属する（表1）。液体培養では、各ファージは異なる溶解プロファイルでE. faecalis KB1の増殖を阻害した。3つのファージを一緒に添加すると、ほとんどがStr1の溶解挙動に類似した（S1B Fig）。Str1は株特異性が高く、他の12のEnterococcus faecalisおよびEnterococcus faecium株に対して試験した場合、E. faecalis KB1上に目に見えるプラークを形成したのみであった（S1C図）。対照的に、Str6は最も広い宿主範囲を示し、12株中5株を標的としたのに対し、Str2は12株中3株を溶菌した（S1C図）。さらに、6つのファージはいずれも、以下の実験で使用したサルモネラ菌に感染しなかった。

ファージはin vitro細菌群集の中で宿主株を特異的に標的とする。
次に、2種類のファージカクテル（3ΦMt1B1と3ΦKB1）が、in vitroで大腸菌Mt1B1とフェカリス菌KB1を保有する合成群集に及ぼす影響を調べた。この目的のために、大腸菌Mt1B1とE. muris JM-40（DSM 28560）をOMM12群集に加えた[19,25]（S2A Fig）。後者は二次的な胆汁酸産生菌であり、元のOMM12群集に欠けていた腸内細菌叢の機能である。14の群集メンバー（OMM14）を等比数（OD600）で嫌気培地（AF培地、[20]）に添加し、バッチ培養で24時間ごとに希釈（1:100）した。3日目、希釈から12時間後、ファージを大まかな感染多重度（MOI）0.01でバッチ培養に導入し、24時間ごとに希釈しながら3日間培養を続けた（図1A）。

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図1. ファージは生体内で宿主を特異的に標的とする。
(A）バッチ培養の実験セットアップ。OMM14株を単培養し、同じOD600比で混合し、AF培地で毎日1：100に希釈した。3回目の継代から12時間後、ファージカクテル3ΦMt1B1または3ΦKB1を24ウェルマイクロタイタープレートのウェルに添加した。各希釈の前に、プレーティングとqPCRのためのサンプルを採取した。Biorender.comで作成したスキーム。(B)大腸菌Mt1B1および(C)フェカリス菌KB1の負荷量は、プレーティングにより決定した（Log10 CFU/ml）。(D) ファージ負荷量は、それぞれ宿主株大腸菌Mt1B1またはE. faecalis KB1のスポットアッセイにより決定した。(E）ファージ添加12時間後と36時間後の群集組成を、株特異的qPCRを用いて各菌株の絶対量を決定し、ml培養あたりの16S rRNAコピー数としてプロットした。統計解析は、処理群（N = 10）と対照群（N = 10）を比較するMann-Whitney検定を用いて行った（* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001）。各ドットは1ウェル、黒線は中央値、点線は検出限界（DTL）を示す。実験は2生物学的反復で行い、合計10テクニカルレプリケートで行った。

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ファージカクテル処理36時間後に大腸菌CFUの有意な低下が観察され、その後60時間後に大腸菌密度が上昇した（図1B）。ファージで処理した培養液中のE. faecalisレベルも、36時間後には対照レベルより約2桁も有意に低下し、60時間後には再増加した（図1C）。すべてのファージ力価は36時間後に増加し、宿主細菌数の減少と一致した（図1D）。さらに、ファージをqPCRで追跡したところ、3つの大腸菌ファージとE. faecalisファージStr1およびStr2はバッチ培養で複製されたが（S1D図）、ファージStr6は60時間後には検出されなくなった（S1E図）。

群集組成はqPCRでモニターされ、6日間にわたって、また複製間で安定したままであった（図1EおよびS1F）。大腸菌とBlautia coccoides YL58の2種が、1ml培養あたりの16S rRNAコピーの絶対量で群集を支配していたことは、以前に観察されたとおりである[19-21,26]。Bifidobacterium animalis YL2、Acutalibacter muris KB18、Limosilactobacillus reuteri I49を除くすべての菌株が検出され、ファージ処理前後での絶対量の変化はわずかであった（図1E）。OMM12コミュニティメンバーの全体的な安定性は、2種類のファージカクテルのいずれを添加しても影響を受けなかった（図1EおよびS1F）。このことから、これらのファージは、コミュニティ操作のための菌株特異的ツールとして使用できることが示唆された。

大腸菌Mt1B1とE. faecalis KB1はOMM14マウスのファージカクテルによって特異的に標的化される。
次に、ファージカクテル（3ΦMt1B1と3ΦKB1）がin vivoで宿主細菌に及ぼす影響を調べた。この目的のために、我々はgnotobiotic OMM14マウスの安定コロニーを樹立した。14個の細菌のうち12個は、qPCRによって糞便中に定量されたように、数世代にわたってマウスの腸内に安定的にコロニー形成した（S2B図）。B. longum subsp. animalis YL2とA. muris KB18は、以前にOMM12マウスで示されたように検出されなかった[24,26]。これらの菌株はコロニー形成しないか、糞便レベルがqPCRの検出限界以下であった。

OMM14マウスモデルを用いて、3ΦMt1B1または3ΦKB1（100μl PBS中の各ファージの1×107プラーク形成単位（PFU）、またはファージを含まないコントロールとしてのPBSのみ）をOMM14マウス（n = 4-6、図2A）に単回経口投与したときの微生物群集組成を調べた。ファージチャレンジ（p.c.）後1日目から4日目までと7日目の糞便中の標的細菌とそのファージの絶対量を、株およびファージ特異的qPCRでモニターした。3ΦMt1B1による処理は、1～4日目の大腸菌Mt1B1負荷を有意に減少させたが、菌株16S rRNA遺伝子コピー数は7日目には再び基本レベルに達していた（図2C）。E. faecalis KB1負荷量の減少は、3ΦKB1を投与したマウスでは2日目のp.c.でより顕著であったが、7日目のp.c.までに集団も回復した（図2D）。他の12種類のOMMメンバーの絶対量は、ファージ投与によって有意な影響を受けず（図2EおよびS3A）、バッチ培養と比較してより安定していた。

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図2. 大腸菌Mt1B1とフェカリス菌KB1は、OMM14マウスを用いたin vivoで、ファージコックテールによって特異的に標的化される。
(A）実験セットアップ、OMM14コミュニティで安定にコロニー形成されたマウスに、ファージカクテル3ΦMt1B1または3ΦKB1、あるいはコントロールとしてPBS（ファージあたり107 PFU）を経口投与し、毎日糞便を採取した。ファージチャレンジ後7日目（p.c.）にマウスを犠牲にした。(B）ファージ負荷量（PFU/g糞便）をスポットアッセイで測定した。(C)大腸菌Mt1B1および(D)E.faecalis KB1の負荷量は、異なる時点（p.c.）の糞便サンプルでqPCRにより測定した。 (E)菌株特異的qPCR（16S rRNAコピー/g糞便）による、p.c.2日目のOMM14コンソーシアムの他の全メンバーの絶対定量。統計解析は、治療群（N = 6）と対照群（N = 4）を比較するMann-Whitney検定を用いて行った（* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001）。各ドットは1匹のマウスを表し、黒線は中央値、点線は検出限界を示す。

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PFU/g糞便として測定された総ファージ量は、3ΦMt1B1と3ΦKB1で同程度であり、1日目p.c.に約107 PFU/g糞便で最大に達し、その後7日目p.c.まで105 PFU/g糞便〜106 PFU/g糞便の間で安定した（図2B）。バッチ培養とは対照的に、糞便中のqPCRでは、3つの大腸菌ファージのうち1つ（ファージP10）のみが高レベルで検出された（S3B図）。ファージP10は経時的に約108コピー/g糞便で安定していたが、ファージP3は1日目と2日目のp.c.でのみ検出され、その後はqPCRアッセイの検出限界以下に減少した。ファージP17もマウスの半数（6匹中3匹）で初期の時点で検出されたのみで、qPCRの検出限界に近い非常に低い量（105コピー/g糞-106コピー/g糞）であった。一方、3つのE. faecalisファージはすべて、実験7日目までqPCRで糞便中に検出可能であった（S3C図）。Str2とStr6は高濃度（107コピー/g糞-109コピー/g糞）であったが、Str1は低濃度であったものの、ほとんどのマウスで検出限界以上であった。

ファージ処理がマウスの腸内に炎症性変化を引き起こすかどうかを調べるため、炎症マーカー（zit）であるリポカリン-2（LCN2）の糞便中濃度をELISA法で定量した。LCN2レベルの経時的あるいは投与群間での上昇は認められず、LCN2レベルは検出限界未満を維持した。

さらに、ファージ処理による胆汁酸代謝への潜在的な副次的影響を評価するため、実験期間中の糞便中の短鎖脂肪酸（SCFA）レベルも定量した（S4図）。測定されたすべてのSCFA（2-メチル酪酸、酢酸、酪酸、イソ酪酸、イソ吉草酸、乳酸、プロピオン酸、吉草酸）について、処理群と対照群で差は認められなかった。

大腸菌およびE. faecalisを標的としたファージカクテルは、S. Tmに対するOMM14マウスのコロニー形成抵抗性を低下させた。
ファージがコロニー形成抵抗性に及ぼす影響を調べるため、腸にコロニー形成するが、III型分泌系1および2が機能しないため炎症を誘発しない無病性Salmonella enterica serovar Typhimurium株（S. Tmavir）を用いた[19]。OMM14マウス（n = 6-8）にS. Tmavir（1x107 CFU）を直接経口感染させた後、3ΦMt1B1または3ΦKB1ファージカクテル（PBS中の各ファージの1x107 PFU）またはファージを含まないPBSコントロールのいずれかを投与した（図3A）。糞便サンプルは、S. Tm.感染（p.i.）の1日後と2日後に採取した。前の実験で確認されたように、大腸菌Mt1B1およびフェカリス菌KB1の負荷量は、感染1日目（p.c.）に約1桁（大腸菌）および2桁（フェカリス菌）有意に減少した（図3Bおよび3C）。ファージは2日間腸内で検出可能で、負荷量は4.2x104 PFU/g糞便から7.07x107 PFU/g糞便の間であった（図3D）。(図3D）。日目のS. Tm負荷量は対照群間で差がなかった（中央値： 4.4x104cfu/g（図3E）、中央値： 1.5 x104 cfu/g（図3F））とファージ処理群（中央値： 4.9 x104 cfu/g（図3E）、中央値：2.9 x104 cfu/g（図3F）： 2.9 x104 cfu/g（図3F））。驚くべきことに、2日目のp.i.において、S. Tm負荷はファージカクテルで処理したマウスで有意に増加した（中央値：5.5x105 cfu/g（図3E）、中央値：2.9x104 cfu/g（図3F））： 5.5x105cfu/g（図3E）、中央値： 1.1x107（図3F））、対照群（中央値： 1.5x105cfu/g（図3E）、中央値：1.1x107（図3F）： 1.8 x104（図3F））。このことは、3ΦKB1を投与したマウスでより顕著であり、E. faecalis特異的カクテルは、S. Tmの負荷を2桁増加させた（図3F）。さらに、S. Tmavirとファージを一緒に添加しても、他の細菌の絶対量には影響しないことをqPCRで確認した（S3D Fig）。

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図3. 大腸菌とフェカリスを標的としたファージカクテルで処理すると、OMM14マウス感染後にS. Tmの負荷量が増加する。
(A）実験セットアップ、OMM14コミュニティで安定にコロニー形成されたマウスにS. Tmavir（5x107 CFU）を感染させ、直接経口的にファージカクテル3ΦMt1B1または3ΦKB1（ファージあたり107 PFU）またはコントロールとしてPBSをチャレンジした。(B)大腸菌Mt1B1および(C)フェカリス菌KB1の糞便中負荷量（CFU/g糞便）は、プレーティングにより測定した。(D）ファージ負荷量（PFU/g糞便）はスポットアッセイにより測定した。(E、F）ファージチャレンジ後1日目および2日目（＝感染後1日目および2日目（p.i.））のS. Tmavir負荷量。統計解析はMann-Whitney検定を用いて行った（* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, N = 6-8）。各ドットは1匹のマウスを表し、黒線は中央値、点線は検出限界を示す。

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次に、両方のファージカクテルを同時に適用した場合に、コロニー形成抵抗性に相加的な効果があるかどうかを調べることを目的とした。このために、OMM14マウス（n = 5）にS. Tmavir（1x107 CFU）を直接、続いてすべてのファージを一緒に（3ΦMt1B1と3ΦKB1、各ファージのPBS中1x107 PFU）、またはPBS対照を経口感染させた（S5A図）。p.c.1日目と2日目の大腸菌Mt1B1とE. faecalis KB1レベルの有意な低下（S5BとS5C図）は、個々の細菌を標的とするファージカクテルを用いた結果（図3）と同等であり、ファージ負荷も同等であった（S5E図）。さて、1日目のp.i.におけるS. Tmの負荷はすでに有意に増加しており（中央値：2.4x106 cfu/g、対照中央値：1.1x105 cfu/g）、これは単一のファージカクテルによる処理では観察されなかった（S5D図）。2日目には、処理群におけるS. Tmの負荷はさらに増加した（中央値：6.3x107 cfu/g、対照中央値：1.7x106 cfu/g）が、単一ファージカクテルによる処理と比較して、総負荷量と対照群との差は顕著ではなかったことから、2つのファージカクテルの明確な相加効果はないことが示された。興味深いことに、両方のファージカクテルを同時に投与したマウスでは、投与2日後に他のOMM株（C. innocuum I46、L. reuteri I49、B. coccoides YL58、E. muris JM40）の負荷量がqPCRで有意に増加していることが観察された（S5F図）。

次に、宿主株がないためにOMM14マウスで増幅しないファージが、S. Tm感染感受性を変化させるかどうかを検証した。OMM14マウスに、黄色ブドウ球菌（EMRSA-15株）を標的にした単一ファージ株（vB_SauP_EBHT、100μL PBS中1x107 PFU）または100μL PBSを経口投与し、S. Tmavirに感染させた（S6A図）。vB_SauP_EBHTがin vitroでOMM14株のいずれをも標的としないことは、以前に確認していた。対照群（p = 0.42）とファージvB_SauP_EBHTで処理した群（S6B図）との間で、S. Tmavirの負荷量に有意差は認められなかったことから、ファージ処理自体はコロニー形成抵抗性を変化させないことが示唆された。ファージ負荷量はS. aureusのスポットアッセイで測定したが、1日目のp.c.では低い数しか検出できなかった（S6E図）。

E. faecalis KB1を標的とするファージによる処置は、OMM14マウスにおけるS. Tm誘発性大腸炎の発症を促進する。
観察された結果から、OMM14マウスにおいてファージを介したコロニー形成抵抗性の破壊が、S. Tm誘発大腸炎の症状も増強させるかどうかを検証することが提案された。そこで、OMM14マウスにS. Tmwt（1x107CFU）を感染させ、さらに3ΦMt1B1または3ΦKB1ファージカクテル（PBSまたはPBSコントロール中、各ファージ1x107PFU）を感染させた（図4A）。感染1日後と2日後に糞便を採取した。ファージレベルは前回のin vivo実験と同程度で、腸内の炎症にもかかわらず、4日目のp.c.まで安定していた（S7A図）。この実験では、大腸菌Mt1B1の負荷はp.c.1日目に有意に減少し、E. faecalis KB1の負荷はp.c.1～4日目に有意に減少した（図4Bおよび4C）。S.Tmwt負荷量は、E. faecalis 3ΦKB1ファージカクテルで処理した群では、対照群と比較して、2日目および3日目のp.c.で有意な増加を示した（図4D）。驚くべきことに、この群では、3日目のp.i.における糞便中リポカリン-2レベルの上昇によって決定されるように、S. Tm炎症が亢進していた。4日目のp.i.では、リポカリン-2レベルおよび糞便組織学的に差は見られなかった（図4Eおよび4F）。一方、大腸菌3ΦMt1B1ファージカクテルで処理した群では、S. Tm炎症に変化は見られなかった。OMM14コンソーシアムの全メンバーとファージの絶対量をqPCRで測定した（S7C図）。一般に、全体的な細菌量は3日目まで安定していたが、4日目にはすべての処理群で存在量が大きく変動した（S7C図）。この効果は、重篤なS. Tm誘発腸内炎症が重なったためと思われる。結論として、3ΦKB1ファージカクテルの場合、ファージ処理が病原体の侵入だけでなく発病も促進することが確認された。

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図4. E.フェカリスを標的としたファージカクテルの投与は、OMM14マウスにおいてS.Tmによる大腸炎を促進する。
(A）実験セットアップ、OMM14コミュニティで安定にコロニー形成されたマウスに、ファージカクテル3ΦMt1B1または3ΦKB1、あるいはコントロールとしてPBS（ファージあたり107PFU）を経口投与し、S. Tmwt（5x107CFU）に感染させた。(B)大腸菌Mt1B1、(C)大腸菌フェカリスKB1および(D)S. Tmwtの糞便中負荷量(CFU/g)をプレート法で測定した。(E）4日目の盲腸の病理組織学的スコア。(F）炎症レベルは、特異的ELISAを用いて糞便中のリポカリン-2（ng/mg糞便）レベルを測定することにより決定した。統計解析はMann-Whitney検定を用いて行った（* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, N = 6-8）。各ドットは1匹のマウスを表し、黒線は中央値、点線は検出限界を示す。

doi:10.1371/journal.ppat.1011600.g004

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ファージカクテルは、保護細菌の存在量の変化とは無関係にコロニー形成抵抗性を損なう
ファージがコロニー形成抵抗性にも長期的な影響を及ぼすかどうかを調べるため、OMM14マウス群に3ΦMt1B1または3ΦKB1ファージカクテル（またはPBSコントロール）を接種し、7日目にS. Tmavir（1x107CFU）をp.c.感染させた。感染（p.i.）後1日目と2日目に糞便サンプルを採取したところ（図5A）、大腸菌Mt1B1やE. faecalis KB1の負荷量に群間で有意差は認められなかったが（図5Bと5C）、ファージは依然として糞便中に安定した数で存在していた（図5D）。さらに、全体的なOMM14の組成は、グループ間およびタイムポイント間で差は見られなかった（S3A図）。興味深いことに、8日目と9日目のp.c.（1日目と2日目のp.i.に相当）におけるS. Tmavirの負荷量は、ファージ処理した両群で有意に増加した（図5E）。このことは、ファージが標的菌や微生物叢全体の構成に検出可能な影響を与えることなく、コロニー形成抵抗性をも損なう可能性があることを示唆している。

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図5. ファージは、保護細菌の存在量の変化とは無関係に、遅い時点でコロニー形成抵抗性を損なう。
(A）実験セットアップ。OMM14群集で安定にコロニー形成されたマウスに、ファージカクテル3ΦMt1B1または3ΦKB1（ファージあたり107 PFU）またはコントロールとしてPBSを経口投与し、7日目のp.c.でS. Tmavir（5x107 CFU）に感染させた。p.c.1、2、7、8、9日目に糞便を採取し、p.c.9日目（p.i.2日目に相当）にマウスを犠牲にした。(B）大腸菌Mt1B1および（C）フェカリス菌KB1の糞便中負荷量（CFU/g）をプレーティング法により測定した。(D）3ΦMt1B1ファージおよび3ΦKB1ファージの負荷量（PFU/g糞便）を、異なる時点p.c.の糞便サンプル中のスポットアッセイにより測定した。 E）p.c.8日目および9日目（＝p.i.1日目および2日目）のS. Tmavir負荷量。統計解析はMann-Whitney検定を用いて行った（* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, N = 4-6）。各ドットは1匹のマウスを表し、黒線は中央値、点線は検出限界を示す。

doi:10.1371/journal.ppat.1011600.g005

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考察
ファージは腸内で最も流行しているウイルスであり[27,28]、長期間にわたって宿主細菌と共存している[17]。ファージは微生物群集の組成、動態 [29] 、進化 [30] を形成する上で重要な役割を果たしている [31]。多剤耐性菌や炎症性腸疾患の病因に関与する細菌による腸内コロニー形成に対して、ファージを治療的に使用することが認識されつつある [32]。とはいえ、細菌群集に対するファージの機能的な影響は完全には解明されていない。我々は、14種の常在細菌からなる細菌群集に安定に関連したマウスを用いて、細菌群集中の特定の菌株を標的とする病原性ファージが、コロニー形成抵抗性を損ない、ヒト腸内病原体によるマウスの経口感染感受性を高めることを示す。

OMM14マウスにおける大腸菌とフェカリス菌のファージ感染は、大きく2つの段階に分けられる：急性感染期（1-4日p.c.）では、高い初期ファージ負荷と平行して、標的細菌集団が一過性に減少する。その後、第二段階として、ファージと宿主細菌は7日目まで共存した。これまでの研究で、共存は、粘膜のファージがアクセスできない部位が宿主細菌集団の一部の空間的避難所として機能していることで一部説明できることが示された［17］。さらに、宿主細菌は腸内で、ファージと細菌の共存を促進する遺伝子を発現している [33]。ファージ特異的qPCR分析により、個々のファージを定量することができた。その結果、各カクテルに含まれる3つの異なるファージの糞便中の存在量が著しく異なることが明らかになった。例えば、大腸菌ファージP10はすべての時点で優勢であったが、ファージP3とP17の量は接種後急速に減少し、検出限界以下となった。興味深いことに、E. faecalisファージの存在量も異なっていたが、3つのファージはいずれも7日後まで検出可能であった。ファージの存在量が異なるのは、バーストサイズ、共存の安定性、そしておそらくファージ耐性変異体の選択によるもので、個々のファージの存在量や感染・増幅能力が異なるためと考えられる。

ファージ処理により、S. Tmに対する急性ファージ感染段階でのCRが阻害された。OMM12モデルにおけるCRは、C5/C6糖、酸素、嫌気性呼吸のための電子受容体を含む基質に対する競合によって媒介される[21]が、S. Tmの競合菌であるE. coli Mt1B1またはE. faecalis KB1を欠損させたOMM12マウスはCRの喪失を示した。したがって、ファージ処理によってこれら2つの菌種が一過性に減少すると、基質利用能が短期的に増加し、標的となる菌株が弱体化するため、病原体侵入の窓口が開かれると考えられる。この考えを裏付けるように、急性期における標的株群の減少の程度は、病原体負荷の増加に等しい。注目すべきは、両方のファージカクテルを同時に適用した場合、大腸菌Mt1B1とフェカリス菌KB1の両方が減少したが、その結果、1日目のS. Tmがわずかに増加しただけで、2日目の負荷には強い影響を与えなかったことである。全体として、このシステムでは、コロニー形成抵抗性に対するファージカクテルの効果は非相加的であることが示唆された。ファージによる微生物叢の変化以外にも、抗生物質による微生物叢の破壊は、病原菌が利用できる遊離糖のレベルを一時的に増加させる [34]。さらに、胆汁酸の放出と微生物叢の変化を増加させる高脂肪食が、病原体の侵入を促進することも示されている。

驚くべきことに、ファージとその標的株が腸内で安定的に共存している場合、マウスはファージチャレンジ後7日目にもCR障害を示した。このことは、競合する細菌の負荷を減らすメカニズムが独立して作用していることを示唆している。ファージが局所的に標的株数を減少させ、S. Tmの侵入を可能にしているのかもしれない。さらに、ファージの存在は宿主株の転写変化を誘導し、ファージ感染に対する抵抗性を高めるかもしれない。このような変化には、抗ファージシステムの発現や細菌代謝のリプログラミング [35]、ファージレセプターのリプログラミング [33]などがある。このような潜在的な変化は、S. Tmに対するCRに直接的または間接的に影響する可能性がある。この相互関係を明らかにするためには、さらなる研究が必要である。

野生型のS. Tm株を用いると、感染後3日以内に腸炎を引き起こすが [21]、マウスをE. faecalisのカクテル3ΦKB1で処理すると、CRが損なわれ、腸炎の発症が早まることが観察された。しかし、3ΦMt1B1カクテルはS. TmWt感染の経過に影響を与えなかった。S.Tm感染に対するファージのこのような効果の差は、S.Tmと大腸菌の正常腸内と炎症腸内における異なるニッチを利用しているためかもしれない［36］。

ファージ治療の重要なセールスポイントは、ファージカクテルが種特異的に作用し、全体的な（細菌）マイクロバイオーム構成を乱さないことである [10,37,38]。我々の研究では、大腸菌Mt1B1とフェカリス菌KB1の両方を同時に標的とした場合、細菌群集構造全体の変化を観察できることを示し、複数の細菌を標的としたファージカクテルが、gnotobioticマウスにおいて他の特定の細菌集団の全般的な変化を引き起こす可能性があることを示唆した。さらに、大腸菌Mt1B1とフェカリス菌KB1を特異的に標的とするファージカクテルは、別々に添加した場合には細菌群集構造全体に影響を及ぼさないが、in vitroモデルとマウスでは安定した合成細菌群集の特定のメンバーを一過性に減少させることを確認した。このシステムは、「脱落」群集に関連するgnotobioticマウスを作製するよりもはるかに手間がかからない。将来的には、この「ファージ・ツールボックス」を他のコミュニティ・メンバーをターゲットに拡張し、コロニー形成抵抗性だけでなく、コミュニティ生態学、代謝産物、宿主-免疫相互作用などの他の機能における役割も調べることができるようにする予定である。さらに、ファージカクテルは、病原体（この場合はヒト病原性S. Tm）の侵入を防ぐ窓を作ることができる。我々のデータに基づくと、ファージカクテルの将来的な応用例として、菌株交換戦略を促進し、ヒトマイクロバイオームにおける有益な菌株と有害な菌株の交換を仲介することが考えられる[39,40]。

結論として、我々は、病原体に対する防御を媒介するために機能的に重要な菌株を標的とするファージカクテルが、病原体（および潜在的には非病原性細菌）が腸内に侵入するためのニッチを開く可能性があることを示している。我々は、病原菌に汚染された食物や水と一緒にファージを摂取することで、病原菌の侵入が促進され、サルモネラ菌感染の危険因子となる可能性があると考えた。水中のコリファージ含量は、廃水で8x104 PFU/100mLから河川水源で30 PFU/100mLであり[41]、腸内の防御細菌を標的にするには十分かもしれない。最終的には、多剤耐性大腸菌やフェカリス菌に対するファージカクテルの治療的適用が、ヒト宿主のCRを損なう可能性があるかどうかを明らかにするための今後の研究が必要である。

方法
菌株および培養条件
本研究では以下の菌株を用いた： Enterococcus faecalis KB1（DSM 32036）、Bifidobacterium animalis YL2（DSM 26074）、Acutalibacter muris KB18（DSM 26090）、Muribaculum intestinale YL27（DSM 28989）、Flavonifractor plautii YL31（DSM 26117）、Enterocloster clostridioformis YL32（DSM 26114）、Akkermansia muciniphila YL44（DSM 26127）、 Turicimonas muris YL45（DSM 26109）、Clostridium innocuum I46（DSM 26113）、Bacteroides caecimuris I48（DSM 26085）、Limosilactobacillus reuteri I49（DSM 32035）、 Blautia coccoides YL58（DSM 26115）、Escherichia coli Mt1B1（DSM 28618）[26]、Extibacter muris JM40（DSM 28560）[25]、S. Tmwt SL1344 (SB300) [42]、S. Tmavir M2707 [43]、Staphylococcus aureus RG2 (DSM 104437)。

OMM14の培養は、すべてのin vitro実験に先立ち、10ml培養で個々のグリセロールクライオストックから調製し、細胞培養フラスコ（フラスコT25、Sarstedt）でサブカルチャーした。培養は、厳密に嫌気的な条件下（ガス雰囲気7％H2、10％CO2、83％N2）で、振盪せずに37℃で行った。OMM14菌の培養は、嫌気性培地（AF培地、18 g.l-1 brain-heart infusion（Oxoid）、15 g.l-1 trypticase soy broth（Oxoid）、5 g. l-1酵母エキス、2.5g.l-1 K2HPO4、1mg.l-1ヘミン、0.5g.l-1 D-グルコース、0.5mg.l-1メナジオン、3％熱不活性化ウシ胎児血清、0.25g.l-1システイン-HCl×H2O）。

マウス感染実験のために、S. Tm株をストレプトマイシン（50μg/ml）を含むMacConkey寒天プレート（Oxoid）上で37℃で培養した。コロニー1個を0.3M NaClを含む3mlのLBに再懸濁し、ホイールローター上で37℃で12時間培養した。サブカルチャー（1:20希釈）を0.3M NaClを含むLBで調製し、4時間培養した。細菌を氷冷滅菌PBSで洗浄し、ペレット化してPBSに再懸濁し、経口投与した。

スポットアッセイ
ファージ宿主を含む指数関数的に増殖する細菌培養液1mlを、エバンスブルー（1%）とフルオレセインナトリウム塩（1%）を含むEBU寒天平板上に塗布し、細菌の溶解を可視化した。余分な液体を除去し、プレートを層流キャビネット下で15分間乾燥させた。ファージ溶解液を滅菌PBSで連続希釈し、各希釈液5μlを細菌芝生上にスポットした。プレートを37℃で一晩培養した。翌日、透明なプラークと細菌の溶解が検出された。プラークを数え、プラーク形成単位（PFU）を定量した。

下水からのE. faecalis KB1ファージの単離
エンテロコッカス・フェカリスKB1に特異的なファージを単離するために、さまざまな供給源からの汚水をろ過し（0.22μm）、等量の2×LB培地と混合した。次に、細菌一晩培養液を最終希釈率1/100で加え、37℃で一晩振盪せずに培養した。翌日、培養液を遠心分離（6,000×g、10分）し、ろ過（0.22μm）した後、EBUプレート上のE. faecalis KB1の芝生上に連続希釈でスポットし、37℃で一晩培養した。透明なプラークが観察された場合、個々のプラークを摘出し、100μlのSMバッファー（100mM NaCl、8.1mM MgSO4 x H2O、50mM Tris-HCL（pH7.5））で希釈し、10mlのLB培地中の新鮮な細菌のサブカルチャーに加え、一晩インキュベートした。この培養液を遠心分離して濾過すると、無菌のファージ懸濁液が得られ、これを4℃で保存し、in vitroおよびin vivoの実験に使用した。

ファージカクテルの作製
精製した滅菌ファージ懸濁液100μlを10mlのLB培地に加え、それぞれの宿主細菌の一晩培養液100μlとともに37℃で一晩培養した。翌日、培養液を遠心分離し（6,000 x g、10分間）、ろ過し（0.22 μm）、EBUプレート上のそれぞれの細菌宿主の芝生に連続希釈でスポットし、37℃で一晩培養した。翌日、ファージ懸濁液のプラーク形成単位を計算し（）、ファージをそれぞれ1x107 PFU/100μlの濃度で混合した。この研究では以下のファージを用いた： Mt1B1_P3, Mt1B1_P10, Mt1B1_P17 [17], vB_efaS_Str1 (vB_EfaS_Strempel1, DSM 110103), vB_efaP_Str2 (vB_EfaP_Strempel2, DSM 110104), vB_efaS_Str6 (vB_EfaS_Strempel6, DSM 110108), vB_SauP_EBHT (DSM 26856)。

ファージゲノム配列決定と解析
大腸菌Mt1B1を標的とする3つのファージの塩基配列の決定と解析は、以前に記述したように行った[17]。手短に言えば、シーケンシングはIllumina MiSeq Nanoを用いて行った。アセンブリーはGalaxy-Institut Pasteurに実装されたワークフローを用いて行い、ファージの末端はPhageTermで決定した。3つのE. faecalis KB1ファージもIllumina MiSeq Nanoを用いてシーケンスし、SPAdes（3.12.0）を用いてアセンブルした[44]。アノテーションはPROKKA [45]を用いて行い、分類学的分類は前述のようにVICTOR [46]を用いて行った[47]。

増殖測定
細菌の増殖は、96 ウェルプレート（Sarstedt TC-cellculture プレート）で Epoch2 プレートリーダー（GenTech）を用いて測定した。接種菌は一晩の培養とサブカルチャーから調製し、AF培地 [20]でOD600が0.01になるように希釈した。ファージの増殖と細菌の溶解を測定するため、各ウェルに150μlの細菌培養液を添加し、その後、コントロールとして10μlのPBSを添加するか、または活性ファージ濃度（PFU/ml）を規定した10μlの滅菌ファージ溶解液を添加し、MOIを0.01とした。連続測定の間、プレートはリーダー内で37℃に加熱され、毎測定前に30秒間の二重軌道振とうが行われた。測定は15分ごとに、合計20時間行われた。

OMM14コミュニティー培養
OMM14群集は、既述のように培養した[20]。一晩の培養とサブカルチャーから単培養株を調製し、AF培地でOD600 0.1に希釈した。次に、この希釈液から全 14 株が等価な比率で混合された群集接種液を調製した。24ウェルプレートに接種し、0.9mlのAF培地で1:10に希釈し、OD600を0.01とした（時間=0h）。24ウェルプレートは、嫌気条件下で振盪せずに37℃で培養した。24時間ごとにqPCR分析とスポットアッセイ用のサンプルを採取し、培養液をAF培地で1:100に希釈した。ファージは3回目の希釈から12時間後に、10μlのPBSにファージ1個あたり1*106 PFUの濃度で添加した。

動物実験
ジャームフリーマウスに、OMM12凍結ストック混合物およびE. murisとE. coli Mt1B1の凍結ストックを接種した。ストックは1% Virkon S (V.P. Produkte) 消毒液で解凍し、フレキシブルフィルムアイソレーターで無菌C57Bl/6マウスへの接種に使用した。マウスに2回（72時間間隔）、細菌混合物および2つの単一ストックを経口投与（経口50μl、直腸100μl）した。マウスはフレキシブルフィルムアイソレーター（North Kent Plastic Cages）内で無菌条件下で飼育・繁殖させた。実験のために、マウスはアイソケージ（IsoCage P system、Tecniplast）に移された。マウスにはオートクレーブしたddH2OとオートクレーブしたMouse-Breeding complete feed for mice（Ssniff）を自由摂取させた。以下の実験では、コンソーシアムの安定したコロニー形成を確実にするため、F1世代から始まるマウスのみを使用した。

すべての実験において、6～20週齢の雌雄マウスを使用し、雌雄と年齢を一致させて実験群に割り付けた。実験中、マウスは2～6匹/ケージで飼育された。すべての動物の健康状態は1日2回採点された。in vitro実験と同じ濃度のファージを含むファージカクテル（100μlのPBS中、ファージあたり107PFU）を経口経口投与した。マウスは、50μlの細菌懸濁液（約5x107 CFU）を経口投与してS. Tmに感染させた。すべてのマウスを頸椎脱臼により犠牲にした。糞便および糞便内容物を秤量し、500μlの滅菌PBSに溶解し、それぞれの抗生物質（大腸菌にはバンコマイシン7.5μg/ml、S. Tmにはストレプトマイシン50μg/ml）を添加したMacConkey寒天培地（Oxoid）上で数倍に希釈してプレーティングすることにより、S. Tmおよび大腸菌Mt1B1負荷を測定した。E. faecalis KB1の負荷量は、ポリマイシンB 50μg/mlを添加したBHI寒天培地（Oxoid）上で数倍に希釈してプレーティングすることにより測定した。溶解した腸内容物100μlを遠心チューブフィルター（0.22μm、Costar Spin-X）を用いて滅菌濾過し、EBU寒天プレート上の大腸菌とE. faecalisの芝生上にPBSで連続希釈してスポットし、ファージ負荷を測定した。リポカリン-2は、凍結した糞便内容物の上清から定量した。メタボロミクスのために、サンプルは液体窒素中で直接スナップ凍結し、さらに処理するまで-80℃で保存した。DNA抽出用サンプルは計量後-20℃で保存した。

腸内容物からのDNA抽出
gDNA抽出は、前述[48]のようにフェノール-クロロホルムベースのプロトコルを用いて行った。簡単に説明すると、糞便ペレットまたは糞便内容物を500μlの抽出バッファー（200 mM Tris-HCl、200 mM NaCl、20 mM EDTA in ddH2O、pH 8、オートクレーブ処理）、210μlの20 % SDS、500μlのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1、pH 7.9）に懸濁した。さらに、直径0.1 mmのジルコニア/シリカビーズ（Roth社製）を500μl加えた。細菌細胞をビーズビーター（TissueLyser LT、Qiagen）で4分間、50Hzで溶解した。遠心分離（14,000 x g、5分、RT）後、水相を新しいチューブに移し、500 μlのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1、pH 7.9）を加え、再びスピンダウンした。得られた水相を1 mlの96 %エタノールと50 μlの3 M酢酸ナトリウムと静かに混合した。遠心分離（30分、14,000 x g、4℃）後、上清を捨て、gDNAペレットを500 μlの氷冷70 %エタノールで洗浄し、再び遠心分離（14,000 x g、4℃、15分）した。得られたgDNAペレットを100 μl Tris-HCL pH 8.0に再懸濁した。その後、NucleoSpin gDNA clean-up kit（Macherey-Nagel）を用いてgDNAを精製し、-20℃で保存した。

細菌およびファージの定量的PCR
定量的PCRは、以前の記載に従って行った（OMM12株および大腸菌Mt1B1については[19]を参照、E. muris JM40については[25]を参照）。各菌株の 16S rRNA 遺伝子配列を含む直鎖化プラスミドを用いた標準曲線は、各菌株の 16S rRNA 遺伝子コピー数の絶対定量に用いた。

ファージのプローブおよびプライマー設計は、ソフトウェア PrimerExpress を用いて行った。1500bpのファージ尾部繊維遺伝子またはファージ主要キャプシドタンパク質遺伝子を鋳型遺伝子として用い、細菌の16S rRNA遺伝子の代わりにプローブ、プライマー、プラスミドを設計した（S1表）。絶対定量は細菌のqPCRと同様に行った[19]。

リポカリン-2の定量
糞便中および糞便内容物中のリポカリン-2濃度は、R&D Systems社（DY1857、米国ミネアポリス）の酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）キットおよびプロトコルを用い、製造業者の指示に従って測定した。吸光度はOD405で測定した。

標的短鎖脂肪酸（SCFA）の測定
メタボロームプロファイリング用の糞便および腸内容物（約20 mg）を新鮮なままサンプリングし、セラミックビーズ（内径1.4 mmおよび2.8 mmセラミックビーズ）を充填した2 mlビーズビーターチューブ（CKMix 2 mL、Bertin Technologies社、Montigny-le-Bretonneux、フランス）で秤量し、直ちに液体窒素でスナップ凍結した。以下の手順と測定は、BayBioMS（TU Munich）で行った。1mLのメタノールを加え、Cryolys冷却モジュール（Bertin Technologies社製、液体窒素で冷却）付きビーズビーター（Precellys Evolution、Bertin Technologies社製）を用いて、10.000rpmの速度で20秒間、15秒間の休憩を挟んで各3回、ビーズビートにより試料をホモジナイズした。Eppendorf Centrifuge 5415R（Eppendorf, Hamburg, Germany）を用いて懸濁液を遠心分離（10分、8000rpm、10℃）した後、SCFAの定量には3-NPH法を用いた[49]。簡単に説明すると、40μLの糞便抽出物と15μLの同位体標識標準物質（約50μM）を、20μLの120mM EDC HCl-6%ピリジン溶液および20μLの200mM 3-NPH HCL溶液と混合した。40℃で30分後、エッペンドルフ・サーモミックス（Eppendorf, Hamburg, Germany）を用いて1000rpmで振とうした後、900μLのアセトニトリル/水（50/50, v/v）を加えた。13000 U/分で2分間遠心した後、透明な上清を分析に使用した。測定は、ExionLC AD（Sciex, Darmstadt, Germany）超高性能液体クロマトグラフィーシステムにQTRAP 5500トリプル四重極質量分析計（Sciex, Darmstadt, Germany）を接続して行った。エレクトロスプレー電圧は-4500V、カーテンガスは35psi、イオン源ガス1は55、イオン源ガス2は65、温度は500℃に設定した。MRMパラメータは、市販のSCFA標準物質を用いて最適化した。クロマトグラフィー分離は、100×2.1 mm、100 Å、1.7 μm、Kinetex C18カラム（Phenomenex、Aschaffenburg、ドイツ）を用い、溶出溶媒として0.1%ギ酸（溶出液A）およびアセトニトリル中0.1%ギ酸（溶出液B）を用いた。注入量は1μL、流速は0.4mL/minを使用した。グラジエント溶出は23%Bで開始し、3分間保持した後、4分後に30%Bに濃度を上げ、6.5分後に40%Bにさらに濃度を上げ、7分後に100%Bを使用して1分間保持し、8.5分後にカラムを開始条件で平衡化した。カラムオーブンは40℃に、オートサンプラーは15℃に設定した。データ取得と装置制御はAnalyst 1.7 software (Sciex, Darmstadt, Germany)で行った。

ヘマトキシリン・エオジン染色（HE染色）と病理組織学的スコアリング
HE染色は前述(48)と同様に行った。O.C.T.で直接凍結した頭蓋組織を、クライオトーム（Leica）を用いて5μmの切片に切り出し、Superfrost Plusスライドグラス（Hartenstein）にマウントした。切片を乾燥させ、Wollman溶液（95％エタノール、5％酢酸）で30秒間固定し、流水で洗浄（1分間）した後、dH2Oですすいだ。その後、スライドをVectors社のHämalaun（Roth）で20分間インキュベートし、流水で洗浄（5分間）、脱染液（70 %エタノール、1 %塩酸）に1回浸し、流水で再度洗浄（5分間）、dH2Oですすぎ、その後70 %と90 %のエタノールですすいだ。その後、スライドをフロキシン（Sigma-Aldrich）入りのアルコール性エオシン（90 %エタノール）に15秒間浸し、dH2Oですすいだ後、90 %エタノール、100 %エタノール、キシレンで脱水した。切片はRotimount（Roth）で直接マウントし、十分に乾燥させた。

盲腸組織の病理組織学的スコアリングは前述 [50] の方法で行った。粘膜下浮腫（0-3）、多形核好中球（PMN）の浸潤（0-4）、杯細胞の消失（0-3）、上皮の損傷（0-3）を評価し、個々のスコアを合計して最終的な病理スコアとした：0-3 炎症なし；4-8 軽度の炎症；9-13 深刻な炎症。

16S rRNA遺伝子に基づく系統樹の作成
OMM14コンソーシアム[51]の12株のゲノムをDDBJ/ENA/GenBank経由でアクセスし、Prokka（デフォルト設定）[52]を用いてアノテーションを行った。全菌株の 16S rRNA 配列を取得した。これらのrRNA FASTA配列をSINA Aligner v1.2.11[53]にアップロードし、SILVAデータベースに対して最低95%の同一性を持つ配列を整列させた。これにより、RAxML、GTRモデル、尤度のガンマレートモデルに基づく系統樹が再構築された。同一性が90%未満の配列は棄却された。得られたツリーは、Rのphytoolsパッケージ[54]のmidpoint.root()を用いてルート化し、iTOLオンライン[55]を用いて可視化した。

異なる腸球菌株のゲノムに基づく木の作成
試験したすべての腸球菌株と腸球菌科の選択した参照型株のゲノムは、以下のアクセッション番号を用いてDDBJ/ENA/GenBank経由でアクセスした： PRJEB50452, GCA_002221625.2, JABAFU000000000, VUMK00000000, VUML00000000. PhyloPhlAn3.0[56]を用いて最尤樹を作成した。樹形はNewick tree形式でエクスポートし、アノテーションはiTOL online [55]を用いて行った。

統計解析
各実験の統計的詳細は、図の凡例に示した。Mann-Whitney U検定およびKruskal-Wallis検定は、ソフトウェアGraphPad Prism version 5.01 for Windows（GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com）を用いて行った。0.05未満のP値は統計的に有意であるとみなし、その値のみを図に示した（*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001）。

データ解析と図
データの解析とプロットはGraphPad Prism（バージョン9.5.1）を用いて行った。図の一部はBioRender (https://biorender.com)とAffinity Designer (Version 1.10.4.1198)を用いて作成した。Affinity Designerは、GraphPad Prismで作成したオリジナルのグラフを使用して図を作成するためにのみ使用した。

参考情報
謝辞
参考文献
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