発熱は冷血脊椎動物における抗菌防御、炎症制御、組織修復を統合する

2023年7月14日 12:54

免疫学と炎症
発熱は冷血脊椎動物における抗菌防御、炎症制御、組織修復を統合する

https://elifesciences.org/articles/83644

ファラ・ハダド
アムロ・M・ソリマン
マイケル・E・ウォン
エミリー・H・アルバース
ショーナ・L・センプル
デボラ・トレルバ
ライアン・D・ハイムロス
アシフ・ナシリー
キース・B・ティアニー
ダニエル・R・バレダ
他、著者リスト
カナダ・アルバータ大学
エモリー大学（米国
ら、著者リストを展開
2023年3月14日
https://doi.org/10.7554/eLife.83644
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エミリー・H・アルバース
ショーナ・L・センプル
デボラ・トレルバ
ライアン・D・ハイムロス
アシフ・ナシリー
キース・B・ティアニー
ダニエル・R・バレダ

(2023)
寒冷血脊椎動物における発熱は、抗菌防御、炎症制御、組織修復を統合する

eLife 12:e83644.
https://doi.org/10.7554/eLife.83644
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2023年3月14日（本バージョン）
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要旨
宿主の生存に中等度の発熱が重要であることを裏付ける証拠は複数あるが、そのメカニズムについては不明な点が多い。中核体温を制御する厳密なプログラムや、その乱れから生じる生理的ストレスを考えると、温血動物モデルでこれを立証するのは困難である。そこでわれわれは、発熱の誘発と調節に自然な動態を示し、耐容温度範囲が広い冷血の魚類を利用した。特注のスイムチェンバーと高忠実度の定量的位置追跡を組み合わせることで、魚の行動に顕著な一貫性が見られ、発熱ウィンドウが定義された。発熱している動物は、中枢神経系における病原性サイトカイン遺伝子プログラムに関与し、免疫チャレンジ部位への白血球のリクルート効率を高め、感染細菌がより高い温度でよりよく増殖する場合でも、in vivoでの病原体クリアランスを著しく改善した。免疫の全体的なアップレギュレーションに関する以前の推測に反して、発熱によって活性化される防御免疫機構に選択性があることが確認された。発熱は炎症を抑制し、創傷の修復を著しく改善した。発熱のモデルとしてよく用いられる人工的な機械的高熱療法は、自然な宿主主導の動的体温調節によって達成される利点の一部を再現したが、すべてではなかった。これらの結果を総合すると、発熱は急性炎症の誘発と収束を制御する統合的な宿主反応であることが明らかになり、この統合的な戦略は進化の過程で内温に先行して出現したことが実証された。
編集部による評価
本研究は2つの重要な進歩をもたらした：第一に、著者らは魚類における体温の行動制御を研究するための新しい実験系を開発した。第二に、この実験パラダイムを用いて、体温調節が免疫防御と組織修復に与える影響を明らかにしたことである。この研究は、保存された防御機構に関する重要な新知見を提示するものであり、幅広い関心を集めるものと思われる。
https://doi.org/10.7554/eLife.83644.sa0
決定書
サイエティのレビュー
イーライフの査読プロセス
はじめに
発熱は急性炎症の要である（Rosenberg and Gallin, 1999）。古典的な反応は、免疫白血球の表面にあるパターン認識レセプターが損傷関連分子パターンや病原体関連分子パターンを認識することで始まる。この感知反応により、チャレンジ部位に常在する骨髄系細胞が活性化され、発熱性プロスタグランジンE2（PGE2）および腫瘍壊死因子α（TNFA）、インターロイキン-1β（IL1B）、インターロイキン-6（IL-6）などのサイトカインが急速に産生される（Engel et al.）発熱カスケードの複数のレベルでの寄与が観察される。例えばIL-6は、初期活性化イベント、中核体温の早期上昇、およびその後のリンパ球のリンパ系器官への輸送の組織化を促進する（Evansら、2015）。インターロイキン-8（IL-8）のように、感染部位で局所的に産生され、循環、末梢貯蔵、造血区画からの炎症性白血球の動員を管理するものもある（Deniset and Kubes, 2018）。視床下部の正中視索前核内でのシクロオキシゲナーゼ2（COX-2）の合成増加は、発熱において支配的な発火性の役割を果たすPGE2の追加産生を促進する（Caoら、1996）。中枢神経系（CNS）内でのIL1BやIL-6などの内因性発熱性サイトカインの産生は、発熱の誘発中に末梢組織で生成されるサイトカインの活性を補完する可能性もある（Evansら、2015）。血管拡張、血管透過性、白血球の動員における全身的な生理的変化は、最初の侮辱から数時間後に明らかになる（Mackowiak, 1998）。このように、早期の自然免疫認識により、中枢神経系と末梢神経系のニューロン回路に関与する高度に組織化された反応が開始され、体温調節経路の活性化が引き起こされる。
発熱と疾病の関連は、少なくともヒポクラテス（2500年）までさかのぼる（Atkins, 1985）。体温の上昇は炎症反応と密接に関連しており、熱（熱量）は炎症の4大徴候のひとつである。非重症型の発熱が感染時の宿主生存率を高めることはよく知られているが（Evans et al., 2015; Covert and Reynolds, 1977; Kluger et al. 宿主保護の向上は、侵入病原体に対する温度上昇の直接的な影響と、抗菌免疫機構のグローバルなアップレギュレーションに起因すると仮定されている（Evans et al.）温度制限については、病原体の最大耐熱温度に達するか、それを超えると、病原体の生存と複製が直接的に損なわれる可能性がある（Casadevall, 2016）。このことは多くの微生物についてよく知られており、抗生物質が登場する以前には、神経梅毒や淋病のような疾患に対する効果的な治療法として機能していた（Klugerら、1975）。しかし、多くの病原体は、発熱がもたらす高い温度ではほとんど影響を受けないか、よりよく増殖することが知られている（Casadevall, 2016; Shapiro and Cowen, 2012）。また、もともと寛容な生物であっても、ウイルス、古細菌、細菌、真菌、寄生虫が利用できる耐熱メカニズムのレパートリーが豊富であることから、温度制限の効果は病原体と宿主の最初の遭遇に限られる可能性がある（Casadevall, 2016; Shapiro and Cowen, 2012）。また、代謝率や自然免疫・適応免疫の複数のエフェクターやレギュレーターに対する温度上昇の影響が報告されていることから、免疫防御のグローバルな促進も提案されている（Evans et al., 2015; Bennett and Nicasrti, 1960）。しかし、この誘導のグローバルな性質は、宿主がエネルギー保存と付随する炎症に伴う組織損傷の管理に重点を置くことが知られていることと矛盾する（Steiner and Romanovsky, 2019; Wang and Medzhitov, 2019）。その結果、宿主の健康に対する発熱の純価値に関する議論が文献に浸透し続けている（Atkins、1985；Greisman and Mackowiak、2002；Bernheim and Kluger、1976；Wrotekら、2021；Nielsenら、2013）。このことは、利用可能な実験モデルの中で、発熱反応を促進し持続させる自然の生理学的プロセスを適切に再現する限界があることによって、さらに深刻になっている。例えば、発熱の有益性に関する初期の評価では、感染前に人為的に発熱を誘発するなど、時間的なずれが生じていた（Klugerら、1975；Bennett and Nicasrti、1960）。他の例では、発熱によって通常誘発される温度範囲外の温度が用いられたり、ピーク温度が長時間維持されたりした(Kluger et al., 1975; Bennett and Nicasrti, 1960)。発熱域温熱（FRH）のin vitroおよびin vivo哺乳類モデルは、貴重な知見を提供し続けており、中核体温の上昇により宿主の生存率が向上し、微生物負荷が減少することが確認されている（Evansら、2015；HasdayおよびSingh、2000）。残念なことに、外因性の機械的温度操作は生理的ストレスを引き起こすこともよく知られており、自然発熱時に誘発される宿主の体温調節機構を再現することができない（Bernheim and Kluger, 1976）。解熱鎮痛薬（非ステロイド性抗炎症薬[NSAIDs]など）の投与に基づく薬理学的モデルも広く用いられているが、炎症経路の多点阻害やその他の標的外影響によって妨げられている（Bernheim and Kluger, 1976; Earn et al.）その結果、発熱は急性炎症過程の中で最も理解されていない。
外温動物（魚類、両生類、爬虫類、無脊椎動物）と内温動物（哺乳類、鳥類）は感染すると発熱を引き起こし、どちらも強い行動的要素を示す（Terrien et al.）しかし、外温動物は、内温動物が利用できる代謝ツールキットがないため、行動によって発熱を誘導する（Evansら、2015；Kluger、1979；Hasdayら、2014）。感染すると、魚類は水温の高い場所に移動し、爬虫類は日光で温められた陸上環境に横たわる（Kluger, 1979）。ミツバチのような社会性動物はさらに進んで、感染に反応して巣の温度を共同で上昇させるために、集団レベルで行動的な体温調節を行う（Starks et al.）生理学や体温調節戦略は異なるものの、寒帯・温帯脊椎動物に共通する生化学的経路が発熱を調節しているようだ（Evans et al., 2015; Boltaña et al.）系統を超えた発熱の保存は、5億5,000万年にわたる後生動物の進化にまたがっている（Kluger, 1979）。その正味の結果は生存優位性であり（Evans et al., 2015; Earn et al., 2014）、長年にわたる発熱反応の自然選択に基づくと、報告されている代謝コスト（Kluger, 1979; Muchlinski, 1985）、捕食の可能性の増加（Otti et al., 2012）、繁殖成功率の低下（Graham et al.）このようなコミットメントのレベルは、いくつかの病原体がそれを阻害するために示すものと同じである。例えばヘルペスウイルスは最近、感染時に可溶性のおとりTNFレセプターを発現し、行動熱を遅延させ、ウイルス複製を増加させることが示されている（Rakus et al.）
本研究では、発熱の免疫生物学に関する新たな知見を得るために、冷血動物である脊椎動物のモデルを用いた。宿主主導の動的な体温調節のもとで発熱反応を調べ、暖房と冷房の自然条件をより忠実に模倣した。これによって、外因性薬物投与で起こりがちな注意点、本来の体温調節プログラムからの時間的逸脱、発熱によって通常誘発される体温範囲を超える動物への強制などを回避することができた。in vivoのアエロモナス皮膚感染モデルは、重篤な病理学的発熱ではなく、この自然な生物学的プロセスの最も一般的な中等度の自己解決型に焦点を当てるように調整された。使用した実験条件下では、発熱は一過性で自己限定的であったため、急性炎症の誘発期と消失期における発熱の潜在的な寄与を調べることができた。これらの結果から、発熱は急性炎症の副産物ではなく、その誘導と制御の重要な調節因子であることが示された。外温動物における発熱は、炎症の制御と創傷修復の促進と相まって、感染に対する自然抗菌プログラムの早期かつ選択的な誘導を促進する。このように、発熱は病原体に対する自然免疫の微調整メカニズムとして機能している。
研究結果
高解像度モーショントラッキングにより、近交系個体群における予測可能な発熱プログラムを同定
魚の行動を調べるための従来のシャトルボックスアプローチは、群れ行動、縄張り行動、優位性に基づく回避行動などの社会的行動に加え、隠れ場所への嗜好性、泳ぐ深さ、活動レベルの違いによって、個体間で大きなばらつきが生じることがよく知られている（Brown et al.）このような不均質性を減らし、行動結果の分析深度を深めるため、物理的な障壁の代わりに流体力学を利用し、異なる温度環境を構築する環状温度選好性水槽（ATPT）（Myrick et al.、2004）をカスタマイズした（図1）。このセットアップのもとでは、水生動物は照明、知覚されるカバー、エッジ効果、水深、流れなど、位置行動に影響を与える他の変数とは無関係に、自由に環境温度を選択することができた。異なる温度設定点（16℃、19℃、21℃、23℃、26℃）が選ばれ、10℃の範囲にまたがるバリアフリーの環境収容温度勾配を作るために使用された（図1A-C）。水の投入量と流量は、14日間の連続評価を通して安定した勾配が得られるように最適化した（図1C）。スイムチャンバーを横切る方向の流量も、各主温度帯間でより小さな一貫した温度勾配を作るように調整した（図1B）。我々の目標は、隣接するサーマルゾーン間を移行する動物の選択に影響を与える可能性のある、急激な収容水温の境界を避けることであった。次に、この更新されたATPTを、昼と夜のサイクルを通して効果的に魚を追跡するために、秒単位の時間分解能を持つ自動モニタリングシステムに連結した（図1D）。これにより、これまでの行動熱分析よりも高い分析ロバスト性と時間分解能が得られた。次に、個体化されたteleost fish (Carassius auratus; 金魚)にin vivoでAeromonasの皮膚感染を試みた。温熱性外温動物である金魚は、熱ストレスの可能性を最小限に抑えながら、免疫チャレンジに対する温度選好性の絶対的な変化を調べる機会を与えてくれた。というのも、これらの魚の自然な環境温度の許容範囲（1.3～34.5℃）は、発熱反応で予想される温度よりも広かったからである。私たちの選択はまた、急性炎症の誘導期と消失期の変化を調べることができる、以前に最適化されたin vivo自己回復動物モデルへのアクセスを提供した（Havixbeckら、2017；Havixbeckら、2016）。
図1
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環温度嗜好性水槽（ATPT）の設計、検証、および魚の追跡。
(A）ATPTは、物理的な障壁の代わりに流体力学によって分離された異なる温度環境を提供する連続的なリング状の遊泳槽を確立した。(B)染料フローテストは、... もっと見る
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行動学的検査により、生体内でAeromonas veroniiに暴露された魚の群間で、発熱反応の4つの異なる段階が同定された（図2A）。チャレンジした魚の熱選択パターンは、環状スイムチャンバーに個体ごとに入れた場合でも、驚くほど再現性があった（図2B）。感染後1～8日（dpi）には、アエロモナス感染魚が模擬感染（生理食塩水）対照魚と比較して2～3℃の温度嗜好の上昇を示す明確な期間が現れた（図2B）。分散分析により、この1～8dpiの時間枠内で個体が選択する環境温度に一貫性があることが確認された（図2B）。このウィンドウの外では、チャレンジした個体とコントロールの個体間の温度選択に有意差は見られず、アエロモナス感染群と生理食塩水処理群の両方が、時間的にも個体間でも大きな変動に移行していた（図2B）。
図2
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発熱を誘発した魚の温度嗜好性と疾病行動の均一性。
(A) Aeromonas veroniiに感染した魚は、環温度選好性水槽（ATPT）内で環境温度の範囲を自由に選択した。動画静止画では、集団的... もっと見る
図2-ソースデータ1
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私たちの行動解析はさらに、外温性発熱と内温性発熱の間の類似性を補足するような、測定可能な2つの新たな嗜眠関連結果をテレスト魚類において同定した。1つ目は、アエロモナスに感染した魚の遊泳速度（V）の低下である（1-8dpi；図2C）。対照的に、対照魚の速度は同じ期間中、個体間で変動があり、高いままであった（図2C）。2つ目の嗜眠パラメーターは、魚がATPTの異なる温度帯の間を移動する割合で定義される温度探索行動の変化に基づくものであった。対照の生理食塩水を投与した魚は、1時間あたり100以上のゾーン遷移（ZT）を示し続けたのに対し、アエロモナスを投与した魚は、同じ1～8dpiの間にZTの数が劇的に減少した（図2D）。温度嗜好性や速度測定と同様に、この発熱行動ウィンドウ内のZT値は、アエロモナスに暴露された個体間で驚くほど一貫しており、8dpiを過ぎると分散が増加した（図2D）。対照的に、対照魚は全観察期間を通じて著しい不均一性を示した。これら2つの新たな無気力関連指標は、ヒトや他の内温動物における代謝性発熱の確立された疾病行動（無動、疲労、倦怠感）（Harden et al.
エアロモナスチャレンジング群と生理食塩水対照群の1時間ごとの値を、設定された発熱ウィンドウ（1～8dpi）と、より広い14日間の観察期間にわたって同時に評価した。1～8dpiの間に、これら2つのグループの魚が引き起こす反応に顕著な分離が確認された（図2E）。アエロモナス・チャレンジングを受けた魚では、発熱期間中、VとZTの値はもっぱら低いままであった（図2E）。対照的に、生理食塩水対照魚は、高いV値とZT値を中心に、より幅広い運動プロファイルを示した（図2E）。
アエロモナス感染後の中枢神経系と全身性の発熱プログラムの活性化
発熱を介した中枢神経系への古典的な関与を確認し、機械的FRHとの潜在的な違いを評価するために、視床下部組織をアエロモナスに感染した魚から単離し、病原性サイトカインの局所発現を調べた。選択された遺伝子、il1b、tnfa、il6は、魚がATPT内で設定された10℃の温度勾配の中を自由に泳ぐことができた動的発熱条件下（TD群）において、より強固な遺伝子発現の局所誘導を示した（図3A）。さらに、2つの細胞保護要素（hsp70とhsp90）は、これらの動的熱条件下で視床下部において最高レベルの発現を示した。全身循環中のPGE2濃度を評価したところ、TD魚では感染後24時間（hpi）に早期のピークを示し、発熱の主要な発熱メディエーターとしての役割と一致した（Evansら、2015；図3B）。これらの反応は、感染後26℃（TS26；機械的FRH）または16℃の静的温度条件下（TS16；基礎馴化温度）に置かれた魚とは異なっていた。TS26 FRHはサイトカインおよび細胞保護遺伝子のアップレギュレーションを促進したが、動的な発熱を与えた魚よりも低いレベルであった（図3A）。循環中のPGE2濃度は、TS26 FRH群とTS16群の両方で基礎レベルに近いままであった（図3B）。病原体刺激を伴わない高体温療法だけでは、中枢神経系におけるこれらのサイトカインと細胞保護遺伝子を活性化するのに十分ではなかった（図3-図1）。
図3-補遺1
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アエロモナス感染後、魚熱が中枢神経系（CNS）および全身の病原性シグナルに関与することが確認された。
魚類を接種し、16℃の静的温度（基礎馴化温度）、26℃の静的温度（機械的高体温；魚類が行動性発熱の際に選択した最高温度）、または26℃の動的温度（動的高体温；魚類が行動性発熱の際に選択した最高温度）に置いた。
図3-ソースデータ1
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図3-図1
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中枢神経系（CNS）に働きかけ、免疫制御遺伝子や細胞保護遺伝子を刺激するには、熱の上昇だけでは不十分である。
アエロモナス感染魚または模擬感染魚を、接種後26℃の静置温熱条件下に置いた。定量的リアルタイムPCRにより、感染後の視床下部における遺伝子発現を評価した（n ... 続きを見る
図3-図1-ソースデータ1
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解熱剤の投与は、外温動物と内温動物で発熱を導く生化学的経路が共有されていることをさらに裏付けるものであった。COX-1とCOX-2を阻害するNSAIDとしてケトロラクを選んだ（Vadivelu et al.）この薬剤は、さまざまな動物種で成功裏に使用されており（Rooks, 1990）、注射が可能である（Vadivelu et al., 2015; Baevsky et al., 2004）ため、一貫した投与が可能である。ヒトでは、0.5mg/kgの投与が有効であり、15～20分で効果が発現し、作用時間は6～8時間である（Vadiveluら、2015）。同様に、アエロモナス感染魚にケトロラクを注射すると、0.5 mg/kgの用量で発熱が抑制された（アエロモナス対AVK実験群；図3C）。ケトロラク投与前後のAVK群内の変化を調べると、この非ステロイド性抗炎症薬は、発熱に伴う熱嗜好性と嗜眠行動の増加を抑制した（図3C）。
発熱はアエロモナスのクリアランスを著しく改善すると同時に、活性酸素種と一酸化窒素の抗菌性防御の誘導に選択性を示す。
感染の過程で、アエロモナス種によって引き起こされる癤は、魚類において1時間あたり最大107個の細菌を排出する可能性がある（Roseら、1989）。そこで、病原体負荷と排出可能性の指標として、癤表面のA. veroniiの存在を評価した。16℃の静熱条件下（TS16）で飼育された感染魚は、感染後最初の4日間に大量の菌量を示したが、7dpiと10dpiではそれぞれ70±23 CFUと28±10 CFUまで減少し、その後14dpiまでには検出可能なレベル以下まで進行した（図4A）。動熱群（TD）の魚も初期の細菌負荷は大きかったが、TS16 の魚に比べて著しく早く減少した（4dpi で 40 ± 27 CFU、7dpi では検出可能レベル以下）。機械的温熱療法（TS26）では、感染から10日後にアエロモナスが消失し、中間の反応が得られた（図4A）。このように、動的に発熱させた魚は、16℃の静的条件下で飼育した魚の半分の時間でA. veroniiを除去した。注目すべきことに、培養温度が16℃から26℃に上昇するにつれて、A. veroniiはより速い増殖を示したため、このクリアランスの促進は現在の温度制限モデルでは説明できなかった（図4B）。
図4 補足資料1
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発熱は、活性酸素種（ROS）と一酸化窒素（NO）の抗菌性防御の誘導において選択性を示しながら、病原体のクリアランスを促進する。
魚類をアエロモナスに感染させ、16℃静置、26℃静置（機械的温熱療法）、または動的な宿主主導型発熱条件下に置いた。(A)細菌負荷と病原体排出能...続きを見る
図4-ソースデータ1
図4に寄与する数値データ。
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図4-ソースデータ2
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図4-ソースデータ4
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図4-図1
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アエロモナス感染魚における皮膚創傷への白血球の動員を促進する熱。
ヘマトキシリンとエオシンを用いて、16℃静置、26℃静置、または動的な宿主主導型発熱条件下で魚を飼育した後、皮膚感染部位から切り取った組織を染色した。時点 ... もっと見る
発熱の免疫細胞機能への寄与を評価するため、まず免疫細胞の粘膜感染部位への動員を定量化した。TDおよびTS26の両魚は、16℃の静止熱条件下で飼育されたアエロモナス感染魚と比較して、同等の浸潤促進動態を示した（図4Cおよび図4-図1）。この促進が抗菌病原体殺傷機構の活性化と対になっているかどうかを調べるため、次に、顕著で効果的で進化的に保存されている自然防御機構として、浸潤白血球による活性酸素種（ROS）の産生を調べた（Fang, 2004; Neumann et al.）私たちや他の研究者によって以前に示されたように（Havixbeckら、2017；Havixbeckら、2016；Neumannら、2001）、熱的に静的な条件下で飼育された魚（本研究ではTS16魚）由来の白血球は、活性酸素の強力な生成能力を示す；A. veronii in vivo皮膚チャレンジモデルでは、腹膜白血球の75％以上が活性酸素生成陽性であった（図4D）。機械的温熱療法（TS26）も同様の反応を示し、顕著な活性酸素産生は36時間後にピークに達した（図4D）。驚くべきことに、ROS産生白血球の数と割合は、上述の白血球の動員における動態の亢進にもかかわらず、宿主主導の動的体温調節条件下（TD；図4D）では大幅に減少した（図4C）。
発熱が宿主の生存に寄与することは古くから知られていることから（Evansら、2015；Klugerら、1975；Earnら、2014）、発熱は強力な活性酸素産生成分を含まない、生得的な抗菌応答を促進する可能性があると我々は仮定した。そこで、病原体の攻撃に対する進化的に保存された自然反応として、白血球の一酸化窒素（NO）産生も評価した（Neumann et al.）活性酸素の結果とは対照的に、発熱条件下ではNO産生の全体的なレベルが高くなり、速度も速まることが確認された（図4E）。TD魚の癤に浸潤した白血球は、24 hpiにNO産生のピークが観察されるなど、顕著なアップレギュレーションを示した（図4E）。これはさらに、免疫NOの産生に必要な誘導性一酸化窒素合成酵素（iNOS；nos2）をコードする遺伝子の顕著な、より早い発現上昇によって支持された（図4F；Neumannら、2001；Bogdan、2015）。これとは対照的に、TS16とTS26の魚はともにnos2の発現レベルが低く、NO産生能力も全体的に低かった（図4E-G）。このように、発熱はアエロモナスに感染した魚の活性酸素とNOの白血球抗菌機構を異なる形で制御した。
発熱は急性炎症の早期収束を促進する
これまで、発熱による宿主の生存の根拠を探る研究は、免疫防御機構の活性化に焦点を当ててきた。われわれの魚類モデルは自己回復型であるため、急性炎症の誘発期と消失期の間の免疫学的変化も明らかにすることができた。実際に、アエロモナス感染後の細胞応答を比較したところ、感染部位への白血球の動員制御に違いが見られた。TDとTS26の魚は24時間後に浸潤のピークに達し、その後減少し、48時間後には基底レベルに近づいた（図4C）。このことは、これらの魚における局所的なtnfa、il1b、およびcxcl8遺伝子の発現の誘導および制御の速い動態と一致していた（図5A）。対照的に、TS16魚は白血球の動員速度が遅く、48 hpiで遅れてピークを示し、さらに72 hpi以降も持続した（図4C）。これらの魚はまた、局所的なtnfa、il1b、およびcxcl8遺伝子の発現のアップレギュレーションと制御の遅れを示し、後者の2つの炎症性サイトカインはさらに顕著に高い発現レベルを示した（図5A）。最後に、抗炎症性サイトカイン（tgfb）と修復促進性の血管内皮増殖因子（vegf）の発現が、TDとTS26の魚でより早く、より顕著であることが確認された（図5A）。
図5
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発熱は炎症の制御を促進し、アエロモナス感染後の組織修復制御因子の早期関与を示す。
(A)皮膚創傷について、発火性サイトカインである腫瘍壊死因子α（TNFA）およびインターロイキン-1β（IL1B）、ケモカインであるCXCL8、および解熱促進因子をコードする遺伝子の発現を評価した。
図5-ソースデータ1
図5に寄与する数値データ。
https://cdn.elifesciences.org/articles/83644/elife-83644-fig5-data1-v1.xlsx
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実験的創傷の組織学的検査から、静的温度条件下（TS16）と動的温度条件下（TD）で飼育された魚の炎症制御過程における顕著な違いがさらに裏付けられた（図5B）。創傷のない対照群では筋繊維は正常で、炎症の徴候は見られなかったが、TS16ではアエロモナスによる皮膚感染から7日後の魚の皮下筋組織に顆粒球とマクロファージの大きな浸潤が残っていた（図5B）。炎症性浸潤の一群は、損傷した筋線維の上だけでなく、筋線維間の細胞外腔にも明らかであった。これは発熱させた魚とは対照的であった。これらのTD魚の7日目の傷は組織損傷が少なく、元の白血球浸潤の痕跡が残るのみであり（図5B）、それによって0日目の感染していない対照魚の傷に似ていた（図5B）。10日目までに、16℃の静置温熱条件下で飼育した魚の感染創は、筋繊維の顕著な壊死、浮腫、およびいくつかの免疫細胞浸潤を示した（図5B）。対照的に、発熱させた魚の傷には壊死部位はなく、炎症はほとんど消失していた（図5B）。このように、発熱は炎症促進期を早め、さらに白血球の動員抑制、炎症性サイトカインの発現制御、修復促進遺伝子の誘導、副次的組織損傷の管理に基づく、より効率的な炎症除去と対をなしていた。
発熱は創傷修復を促進する
感染部位の病理学的特徴から、TD魚のA. veroniiに関連した創傷治癒能力には著しい違いがあることが示された。皮膚感染から1日後のTD、TS26、TS16の癤では、同程度の炎症が見られた（図6）。しかし、白血球の動員動態の亢進（図4C）と一致して、TDおよびTS26魚は2dpiまでに膿性滲出液の形成動態が加速した。その後、動的発熱を起こした魚は最も急速に進行し、7dpiまでに組織修復と鱗再生の初期徴候を示し、14dpiまでに創傷治癒の進行段階を示した（図6）。比較的、TS26とTS16の癤は同等の創傷治癒段階には達しなかった（図6；緑枠）。
図6
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アエロモナス感染魚における組織病理の進行。
代表的な画像は、アエロモナス・ベロニイを接種し、16℃静置、26℃静置（機械的発熱域高熱）、または動的宿主駆動型... 詳細表示
このように、発熱させた魚は、機械的なFRHや16℃の静置条件下で飼育した魚よりも、アエロモナスの感染が早く治まり、関連する皮膚バリアーの損傷も早く修復された。
アエロモナスに感染した癤をマッソン三色染料で染色した病理組織学的検査では、TDおよびTS26実験群では、表皮基底層とその上のケラチノサイト層が早期に再形成された（3日目；図7）。T16群では、創傷の再上皮化は起こったが、遅れた。上述した表面病理学と同様に、TD魚由来の創傷ではその後組織修復がより早く進行し、デノボコラーゲン合成が早くも4dpiで明らかになった（図7）。これはさらに、7dpiまでには、より広範で組織化されたコラーゲンの沈着へと発展した（図7）。これに対してTS26とT16の創傷では、創傷部位のコラーゲン配列の豊富さと相対的な組織化に基づき、より遅い進行が観察された。皮膚バリア機能の再確立と一致する粘液分泌細胞の再生は、TD実験群でのみ観察された（14日目；図7）。このように、発熱は創傷の修復をより促進し、皮膚感染後の皮膚バリア機能の回復に必要な本来の構造的特徴を取り戻した。逆に、発熱がない場合は、炎症反応の消失、再上皮化、細胞外マトリックス成分の出現が遅れた。これらの結果を総合すると、この冷血動物である脊椎動物において、適度な自己回復性の発熱は、創傷治癒を促進するために身体に内在する修復機構を利用する自然な戦略を提供することを示している。
図7
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発熱は再上皮化とコラーゲン沈着を促進する。
アエロモナスに感染した魚の創傷組織を指定された時点で採取し、切片化し、マッソン三色染色で染色した（各時点につき各群n = 3）。病理組織学的 ... もっと見る
考察
誘導中心のモデルでは、高代謝状態の高いエネルギーコストと炎症に伴う組織損傷の意味を予測すると、5億5,000万年の後生動物の進化を通じて発熱が選択され続けたことを説明できない（Wang and Medzhitov, 2019; Kluger, 1979; Muchlinski, 1985）。最近、発熱の病理学的形態（最高体温または持続性高熱；重篤な疾患表現型）に重点が置かれている（Bone, 1996; Liu et al., 2012; Singer et al., 2016）ため、この自然な生物学的プロセスのより一般的な中等度形態（Evans et al., 2015; Hasday et al., 2014; Islam et al., 2021）からさらに焦点がずれている。そこで本研究では、一過性で自己限定的な急性炎症状態下での発熱について検討した。温帯魚モデルを用いることで、宿主主導の動的な体温調節を通じて発熱メカニズムを細かく制御することができ、より自然に近い状態で加温・冷却を行うことができる。特注の動物用エンクロージャーは、行動に影響を及ぼすことが知られている物理的バリアを使用することなく、数日間の温度勾配の安定性を実現した（Rakus et al.）動物モデル、囲いの設計、および発熱期の誘導期と解熱期の両方にわたる動物の運動パターンの自動化された1秒ごとの連続追跡を組み合わせることで、先行研究と比較して分析の頑健性と時間分解能が大幅に向上した。これらのデータを総合すると、中等度の自己解熱は、感染に対する生得的な抗菌プログラムをより強く誘導するのではなく、より早く選択的に誘導し、その結果、病原体の排除が著しく早くなることが示された。また、このことは、その後の迅速な炎症抑制と創傷部位の組織修復の促進にもつながる。この統合的アプローチは斬新であり、世界的な免疫誘導を仮定したり、侵入してくる病原体が好む温度からのシフトに依存したりする一般的な仮説に比べ、著しく洗練されたものである。この統合的な戦略は、内温が発達する以前からすでに確立されていたという我々の実証は、進化を通じて発熱が長年にわたって選択されてきたという、もっともらしいシナリオをさらに示唆している。
中核体温の上昇は、好中球の蓄積、NADPHオキシダーゼ活性、有毒なスーパーオキシドアニオンの産生率を促進することがよく知られている（Souabni et al.） FRHのモデルは、これらの効果を、IL-1、TNF、およびIL-6の血清濃度の上昇（Jiangら、2000；OstbergおよびRepasky、2000）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）駆動による造血骨髄からの好中球の放出、Capitanoら、2012；Ellisら、2005循環好中球プールの拡大（Capitanoら、2012；Ellisら、2005）と結びつけている、 2012；Ellisら、2005）、血管内皮バリア透過性の増加（Shahら、2012）、感染局所における顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、細胞外HSP70、IL-8、および他のCXCケモカインのアップレギュレーション（Hasdayら、2003；Leeら、2012）などである。しかし、これらの熱による増加は、側副組織傷害を促進することも示されている（Hasdayら、2014；Lipkeら、2010；Riceら、2005）。このことは、免疫防御の誘導が間違いなく付随する炎症に関連した組織傷害を促進する、発熱の避けられない代償と広く見なされ続けている（Hasdayら、2003；Riceら、2005）。我々の結果は、自然な体温調節がない場合、FRHは急性炎症に対する発熱の調節能力を部分的にしか再現しない、という別の説明を提供する。我々は、発熱と機械的FRHの両方が、白血球の動員を促進し、炎症性サイトカインの発現を早期に制御することを見出した。しかし、解熱促進遺伝子の誘導には違いが認められ、発熱の方が最終的に創傷修復のレベルが高かった。我々はまた、発熱およびFRH条件下では活性酸素が支配的であった殺微生物反応が、発熱条件下ではNO産生が支配的であった。NOとその下流の活性窒素種は、広範な細菌、ウイルス、酵母、蠕虫、原虫に対して殺微生物活性または殺静微生物活性を発揮する（Wink et al.）しかし、一見したところ、この活性酸素産生の抑制は、病原体抵抗性における発熱の役割とは矛盾しているように思われた。注目すべきは、ROS活性の低下は必ずしも宿主の防御機能の低下をもたらすとは限らないということである。マウス緑膿菌感染症では、NOはIFN-γ活性を低下させ、活性酸素産生を抑制し、酸化ストレスを制限するAtg7を介した機序により細菌クリアランスを促進し、その結果、肺傷害が減少し、感染関連死亡率が低下した（Liら、2015）。感染中のROS応答に対する拮抗的なNO調節の例も増えており、そのいくつかは植物にまでさかのぼることができる（Fang, 2004; Wink et al., 2011; Clancy et al., 1998; Graham et al.）私たちの結果はこれらの観察と一致しており、発熱がNO-ROSバランスの変化を促し、微生物クリアランスの能力を維持して生きた感染を覆すと同時に、炎症制御と機能的粘膜バリアの再確立にも寄与するという自然なシナリオを提示している。
近年、体温調節と宿主防御の関連性に再び関心が集まっており、その関連性は現在では低温にも及んでいる（Steiner and Romanovsky, 2019; Wang and Medzhitov, 2019; Liu et al.）このため、発熱と低体温の間には機能的な二分法があると考えられてきた。どちらも感染時に体温調節を利用して体力を維持する動物の能力を反映しているが、発熱は殺微生物病抵抗性によって侵入微生物の排除を促進する一方、低体温はエネルギー保存と付随する炎症関連組織損傷の管理を促進する耐性を促進する（Steiner and Romanovsky, 2019; Wang and Medzhitov, 2019）。我々の結果は、この認識されている二分法の境界線をあいまいにしている。われわれは、組織の完全性の維持に寄与し、エネルギー保存を可能にする明確な発熱内在メカニズムを同定した。これらの寄与は、損傷に反応して現れるのではなく、急性炎症の初期誘導期とその後の消失期を通じて顕著な特徴であった。発熱は、免疫活性化の規模や持続時間を増大させるのではなく、白血球の動員動態を促進することによって、初期に疾患抵抗性を促進した。CNSにおける細胞保護遺伝子プログラムの関与は、最初の免疫チャレンジから数時間以内に起こった。免疫の全体的なアップレギュレーションよりもむしろ選択的なアップレギュレーションは、発熱にしばしば起因する副次的損傷の可能性をさらに減少させた。注目すべきは、発熱下でも殺微生物効果は依然として優れており、アエロモナスのクリアランスは、温度制限された基礎条件下（7日対14日）よりも著しく早かったことである。その結果、炎症制御の効率がより高いことが示された。このことは、炎症性損傷に対する回復力よりも、むしろ組織の修復を積極的に促進するという新たな貢献と対をなしていた。観察期間中のどの時点でも、低体温状態の誘導は見られなかった。その代わりに、高分解能位置追跡では、離散的で自己解決的な発熱反応のみが見られた。このように、発熱は、防御を強化すると同時に、病態を制限し、炎症を制御し、組織修復を促進するメカニズムに積極的に関与している。重要なことは、今回の知見は、病原体の負荷が高い状態で耐性への移行を誘導する免疫と他の維持プログラムとの間の競合メカニズムについて、以前に報告されていることに異論を挟むものではないということである（Liu et al.）その代わりに、感染症のあらゆる段階において、動物宿主のエネルギー配分と組織の完全性が、永続的かつ長年にわたって考慮されてきたことを浮き彫りにしている。
結論として、我々の結果は発熱の新たな特徴を明らかにし、発熱が感染に対する統合的な宿主反応であり、急性炎症の誘導期と終息期の両方を制御していることを実証した。発熱を介した免疫調節が、冷血脊椎動物と温血脊椎動物の間で、その生理機能の違いにもかかわらず、どの程度保存されているのかについては、まだ多くの研究が必要である。しかし、今回の発見が下流に及ぼす影響は、広範囲に及ぶ可能性がある。とりわけ、皮膚などの組織部位におけるバリア機能の再確立が促進されることで、二次感染の可能性が減少し、傷ついた組織を長時間管理する必要性から生じる生理的ストレスが抑制されることが予測される。また、集団レベルにおいても、病原体のクリアランスが顕著に向上することから、素朴な集団における感染率が低下し、感染症管理に新たな可能性がもたらされることが予想される。これらの可能性を検証するためにはさらなる研究が必要であるが、免疫調節における発熱の長年にわたる役割や、獣医学およびヒトの医療において中等度の発熱を抑制することの影響をよりよく理解するためには、これは極めて重要である。
材料と方法
主要資源表
試薬の種類（種）またはリソース指定ソースまたは参照識別子追加情報遺伝子試薬（金魚；Carassius auratus）WTAquatic輸入品体長10～15 cm；混合性株、株背景（Aeromonas veronii）分離されたWTFieldNCBI分類学ID：114517化合物、薬剤Ketorolac tromethamineATNAHS PharmaCat＃：21626440。 5 mg/kg体重化合物、薬剤TrizolThermo Fisher ScientificCat番号：15596026化合物、薬剤CellROX Deep Red ReagentThermo Fisher ScientificCat番号：C10491化合物、薬剤DAF-FM DAInvitrogenCat番号：： D23844Commercial assay, kitiScript cDNA synthesis kitBio-RadCat #: 1708891Commercial assay, kitProstaglandin E2 ELISA KitCayman ChemicalCat #: 514010ソフトウェア、アルゴリズムIDEAS Image Data Exploration and Analysis SoftwareIDEAS（https://www. luminexcorp.com/imagestreamx-mk-ii/#software)RRID:SCR_019195Software, algorithmEthovision XT softwareEthovision XT (https://www.noldus.com/ethovision)RRID:SCR_000441Software, algorithmR softwareR (http://www. r-project.org/)RRID:SCR_001905ソフトウェア、アルゴリズムImageJソフトウェアImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/)RRID:SCR_003070ソフトウェア、アルゴリズムGraphPad PrismソフトウェアGraphPad Prism (https://graphpad.com)RRID:SCR_002798
動物
体長10-15cmの金魚（Carassius auratus auratus）をMt. Parnell Fisheries（Mercersburg, PA）から購入し、Aquatic Imports（Calgary,Canada）を経由してカナダに輸入した。これらの魚は、アルバータ大学生物科学科の水生施設で、自然の光周期（明期12時間：暗期12時間）をシミュレートしたフロー・スルー・システムで飼育された。水質パラメーターは溶存酸素5.5-6.5PPM、pH7.2-8.0を維持した。魚には1日1回フローティングペレットを与えた。
環状温度選好装置の設計と検証
詳細なプロトコルを請求する
ATPTは、カスタマイズされた精密裁断アクリル板を3つの同心円状に成形・密閉したものである：外周を8等分した最外周の流入リング、物理的障壁のない中間の連続遊泳室、そして深度を制御するための内側の円。さらに内側の区画には流出と排水があった。外側の流入室には高い位置に、内側の流出室には低い位置に、等距離に開けられた小さな孔があり、周辺部から装置の中心部への水の流れを可能にした。このリング状の遊泳室は、水中動物の行動に影響を与えることが知られている要因である、水深、水流、被膜を終始一定に保つことができた。流体力学により、8つの異なる温度ゾーンが維持された。これらのゾーンの温度は、12ビットの温度センサーを備えたHOBOware U30データロガー（Onset Computer Corporation、マサチューセッツ州ボーン）を使って、14日間にわたって秒単位でモニターされた。
動物行動の定量化
詳細なプロトコルを請求する
魚の行動は、中央に設置した頭上赤外線カメラ（パナソニックCCTVカラーカメラ、WV-CP620、2倍レンズ可変焦点WV-LZ61/2S）と照明システムで記録した。これにより、昼と夜のサイクルをシミュレートし、魚の動きを連続的にデジタル・ビデオで記録することができた。映像はEthovision XT, Version 11 (Noldus, Wageningen, Netherlands)を用いて分析され、動物の自動追跡によって行動が定量化された。ダイナミック・サブトラクションを用いて、ATPT内の各動物の座標を1秒ごとにターゲットし追跡し、終了した追跡を手動で検証した。視野は16℃、19℃（L、R）、21℃（L、R）、23℃（L、R）、26℃に対応する8つのゾーンに分けられた（図1）。これを用いて、各温度帯に対する魚の嗜好性、移動速度、温度帯間の移動を算出した。データを集計し、1時間あたりの平均温度選好度、移動速度、温度帯間の移動回数を算出した。
生体内アエロモナス感染モデルと皮膚創傷における病原体負荷の定量化
詳細プロトコールを請求する
Aeromonas veronii biovar sobria（NCBI Taxonomy ID: 114517）は、我々の研究室が以前に金魚の皮膚病変から分離した（Havixbeck et al.）培養準備のため、細菌を5mlの滅菌トリプチカーゼ大豆培地（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ）に接種し、室温で一晩振盪培養した。魚はトリカイン・メタンスルホン酸溶液（02168510; Syndel, WA）で麻酔し、4×4パッチの鱗を取り除き、皮膚に小さな擦り傷をつけた。この皮膚創傷に10 µlのA. veronii対数相培養ブロス（4.1×108 CFU/ml）を接種し、魚を水に戻した。この接種量は、初期誘導期とその後の消失期を調べることができる、自己解決型の急性炎症プロセスを促進すると以前に決定されたものである（Havixbeckら、2017）。感染魚は無作為に異なる温度区分に割り当てられ、実験のために指定された時点で無作為に選択された。その後、癤表面のA. veronii数を評価し、病原体負荷および排出可能性の指標とした。表面細菌を採取し、2×反復トリプティック大豆寒天培地プレートにプレーティングした。CFUは室温で24時間培養後に定量した。ケトロラク（02162644; ATNAHS, Basildon, UK）を0.5 mg/kg体重で腹腔内投与したものを一部の実験に用いた。
遺伝子発現
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サンプルを採取し、直ちに液体窒素で凍結し、使用するまで-80℃で保存した。TRIzol (15596026; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)を用い、製造元の仕様書に従って全RNAを抽出した。RNAの濃度と質は、Nanodrop ND-1000（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）と、RNA 6000 Nano Kit（5067-1511; Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を装備したBioanalyser-2100を用いて評価した。cDNAは、iScript Kit（1708891; BioRad, Mississauga, Canada）を用いて、メーカーの仕様書に従って合成した。qPCRはQuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System（Applied Biosystems、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて行い、RQ値は各レプリケートタイムコースの0日目の遺伝子発現に対して正規化し、参照遺伝子としてβ-アクチンを用いた。使用したプライマーはSupplementary file 1に記載されている。相対定量は2-∆∆Ct法に従って行った。
活性酸素産生
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白血球単離および活性酸素産生評価は、既述の方法で行った（Havixbeckら、2016；Solimanら、2021）。単離後、500μlの細胞懸濁液を0.5μlのCellROX Deep Red Reagent (C10491; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)とともに暗所で30分間インキュベートし、細胞の取り込みを可能にした。細胞を1×PBS-/-で2回洗浄し、1%ホルムアルデヒド（47608; Sigma Aldrich, St.）サンプルを350×g、5分間、4℃で遠心した。データはImageStream Mk II Imaging Flow Cytometer（Amnis, Seattle, WA）を用いて取得し、IDEAS Image Data Exploration and Analysis Software（Amnis, Seattle, WA）を用いて解析した。細胞は、蛍光マイナス1サンプルの正規化頻度に基づいてゲーティングされた。
NO産生
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NOの産生は、4-アミノ-5-メチルアミノ-2′,7′-ジフルオロフルオレセインジアセテート（DAF-FM DA; D23844; Invitrogen, Waltham, MA）を用いて評価した。白血球分離後、500μlの細胞懸濁液を1μM濃度のDAF-FM DAとともに暗所で30分間インキュベートした。細胞を1×PBS-/-で2回洗浄し、1%ホルムアルデヒド（47608; Sigma Aldrich, St.）サンプルを350×g、5分間、4℃で遠心した。データはImageStream Mk II Imaging Flow Cytometer（Amnis, Seattle, WA）を用いて取得し、IDEAS Image Data Exploration and Analysis Software（Amnis, Seattle, WA）を用いて解析した。細胞は、蛍光マイナス1サンプルの正規化頻度に基づいてゲーティングされた。
金魚血漿中のプロスタグランジンE2
詳細なプロトコールを請求する
A. veroniiによる皮膚感染後、魚は16℃静置、26℃静置、または動的発熱のいずれかの温度条件に置かれた。感染後0、12、24、48、72時間に、各温熱条件について6個体からヘパリン化血液を採取し、2000×g、10分間、4℃で遠心分離した。得られた血漿上清を集め、分注し、使用するまで-80℃で保存した。Prostaglandin E2 ELISA Kit (514010; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)を用いて、血漿サンプルを1:30に希釈し、製造業者のプロトコールに従ってPGE2タンパク質濃度を測定した。プレートはSpectraMax M2eプレートリーダー（Molecular Devices, San Jose, CA）を用いて405 nmで読み取った。PGE2タンパク質産生の分析および定量は、製造業者の仕様書（Cayman Chemical, Ann Arbor, MI）に従って行った。
病理組織学的解析
詳細プロトコール
創傷組織を採取し、10％中性緩衝ホルマリン（SF98-4; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）で固定した。Leica TP1020 Benchtop tissue processor (Leica Biosystems, Concord, Canada)を用いてエタノール、トルエン、ワックスで一晩処理した後、Leica RM2125 RTS microtome (Leica Biosystems, Concord, Canada)を用いてパラフィン包埋し、スライド上で切片化した（厚さ7μm）。スライドを脱パラフィンし、トルエン（T324-1; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を2回（各5分間）、続いて100％、90％、70％、50％エタノールを2回（各2分間）用いて洗浄した。ヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色では、スライドをSurgipath Hematoxylin Gill III（3801542; Leica Biosystems, Concord, Canada）に2分間浸し、水道水で15分間、70％エタノールで2分間洗浄した後、Surgipath Eosin solution（3801602; Leica Biosystems, Concord, Canada）に30秒間浸した。Masson's Trichrome染色では、スライドをヘマトキシリンGill IIIに1分間浸し、流水で15分間洗浄した。スライドをポンソーフクシン（AC400211000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）で2分間染色し、蒸留水ですすぎ、1%ホスホモリブデン酸（19400; Electron Microscope Sciences, Hatfield, PA）の媒染剤で5分間区別した。その後、スライドをアニリンブルー溶液（A967-25；Thermo Fisher Scientific社、マサチューセッツ州ウォルサム）で3分間染色し、1％ホスホモリブデン酸、酢酸溶液（A38C-212；Thermo Fisher Scientific社、マサチューセッツ州ウォルサム）でそれぞれ5分間、3分間インキュベートした。最後に、H&EとMasson's Trichromeの両方について、スライドを一連のアルコールで脱水し、トルエンで洗浄後、DPX Mountant（50-980-370; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）でマウントした。画像はAxioScope A1顕微鏡（Zeiss, Oberkochen, Germany）を用いて得た。
統計
データはGraphPad v9.3.1（San Diego, CA）を用いて統計的に分析し、グラフ化した。各実験で使用した魚の数は、Canadian Council on Animal Careに基づく動物倫理・飼育ガイドラインを考慮しつつ、統計的有意性を検出するために必要な最小サンプルサイズ（n）に基づいて決定した。2群の平均値が有意に異なるかどうかを判定するために、Welchのt検定を用いた。両群のデータは正規分布母集団を持つが、同じ分散を持つとは仮定しなかった。一元配置分散分析(ANOVA)が、分析で1つの独立因子または変数を考慮し、3つ以上のカテゴリ独立グループの平均の分散を比較するために使用された。データは正規分布母集団を持ち、各標本は他の標本から独立して抽出された。さらに従属変数は連続変数でした。二元配置分散分析は、fold-changeのような従属変数での2つの独立カテゴリー因子の効果を比較するために利用されました。従属変数は連続的で、各標本は他の標本から独立して抽出されました。Šídákの多重比較検定は、2群間で比較する平均値の集合が選択され、各比較が他から独立していると仮定された場合に、選択されたケースで用いられた。行動データの平均値と相関はExcel（Microsoft, Redmond, WA）で計算した。R（version 3.3, The R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria）は、主成分分析（標準Rパッケージ）と距離行列（'vegan' community ecologyパッケージ）を用いた並べ替え多変量分散分析（permutational multivariate ANOVA）を含む多変量統計量の計算に使用した。Rコードは補足資料の一部として含まれている。
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データの利用可能性
本研究で作成されたすべてのデータは、原稿および補足資料に含まれている。ソースデータも提供されている。
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ハワード・ヒューズ医学研究所、イェール大学医学部、米国
カーラ V ロスリン
シニアエディター、イェール大学、米国
マーティン・F・フラジニク
査読者、メリーランド大学、米国
(i)読者の便宜を図るため、プレプリントと一緒に掲載されるようにデザインされた公開レビュー、(ii)以下に示す修正依頼を含む著者への原稿に対するフィードバック。また、編集者がその論文のどこを興味深く、あるいは重要だと感じたかを説明するアクセプトサマリーも含まれる。
査読後の決定通知
論文「A cold-blooded vertebrate shows integration of antimicrobial defenses and tissue repair through fever」を eLife に投稿していただき、ありがとうございます。あなたの論文は2名の査読者によって査読され、査読エディターとシニアエディターのCarla Rothlinによって評価が監督されました。あなたの投稿論文の査読に関わった以下の人物は、身元を明かすことに同意しています： Martin F Flajnik (Reviewer #1 )。
査読者は互いの査読について議論し、査読編集者はあなたが修正投稿を準備するのを助けるためにこれを起草しました。
査読者#2（著者への推薦）：
ユニークな方法とアプローチの組み合わせにより、著者による全体的な結論を裏付ける、非常に説得力のある原稿です。文献レビューと著者の原稿の書き方が本当に素晴らしい。
-タイトルは、"model "の部分を削除すれば、より効果的で直接的なものになるだろう。次のようなものを提案する：「(中等度の)発熱はteleostsにおける抗菌性防御と組織修復を統合／バランスさせる」。

152行目：biproductではなくbyproduct。
154-156行はあまり明確ではないが、原稿の全体的な結論にとって非常に重要である。外温動物における発熱は、抗菌性防御の早期かつ選択的な誘導に有利であり、炎症が抑制され、創傷の修復が促進される。
-213行目：疾病行動の記述には参考文献が必要である。
-図3と5：遺伝子名は大文字と小文字を区別すべきである。また、Y軸は、どのハウスキーピング遺伝子のフォールド変化を示すべきか？
-ディスカッション：ディスカッション："中等度 "の発熱モデルの文脈で、イントロダクションとディスカッションをリンクさせるコメントが不足している。内温動物では、極端な発熱と比較して、中間的な発熱を示すことがどの程度一般的なのでしょうか？また、ヒトにおける両タイプの発熱の間で何が知られているのでしょうか？
https://doi.org/10.7554/eLife.83644.sa1
著者からの回答
査読者同士で検討し、査読編集者が修正投稿の準備のために起草しました。
査読者2（著者への提言）：
ユニークな方法とアプローチの組み合わせにより、著者による全体的な結論を裏付ける、非常に説得力のある原稿です。文献レビューと著者の原稿の書き方が本当に素晴らしい。
ありがとうございました。本当にありがとうございました。
-タイトルは、"model "の部分を削除すれば、より効果的で直接的なものになります。次のようなものを提案します：「(中等度の)発熱は、teleostsにおける抗菌防御と組織修復を統合／バランスさせる」。
ご提案の通り、タイトルをより直接的なものに修正しました。現在はこうなっている：「発熱は冷血脊椎動物における抗菌防御、炎症制御、組織修復を統合する」。
152行目：biproductではなくbyproduct。
行目を修正（更新原稿では177行目）。
154-156行目はあまり明確ではありませんが、原稿全体の結論にとって非常に重要です。外温動物における発熱は、抗菌性防御の早期かつ選択的な誘導に有利であり、炎症が抑制され、創傷修復が促進され、全体として病原体に対する自然免疫の微調整メカニズムとして機能する。
行目を修正した（更新原稿では177行目）。
-213行目：疾病行動の記述には参考文献が必要である。
参考文献を追加した（更新後原稿259行目）。
-図 3 と 5：遺伝子名は大文字と小文字を区別すべきである。また、Y軸は、どのハウスキーピング遺伝子/sに対する倍数変化を示すべきか。
図3、4、5および補足ファイル1の遺伝子名を更新した。また、遺伝子発現データが示されている図の凡例では、ハウスキーピング遺伝子としてactinbが記載されるようになった（図3、4、5および図3-図1参照）。これは、Methods（遺伝子発現のセクション）における以前の記述を補足するものである。
-考察：中等度'発熱モデルの文脈で、序論と議論をリンクさせるコメントが不足している。内温動物では、極端な発熱と比較して、中間的な発熱を示すことがどの程度一般的なのでしょうか？ヒトにおける両タイプの発熱の間で何が知られており、原稿で作成されたデータが中間的な発熱状態の機能的有用性をどのように付加しているのでしょうか？
ヒトにおける中等度の発熱の有病率は、高熱（>39℃）と比較して、刺激（感染症の種類など）、罹患者の年齢、基礎疾患などの要因によって異なる。最近のCOVID-19パンデミックでは、中等度熱と高熱の有病率はそれぞれ82.49％対14.71％と報告されている（PLoS One. 2021; 16(4): e0249788). しかし、ほとんどの一般的な感染症（季節性インフルエンザや一般的な風邪など）では、中等度の発熱は比較的報告されていないため、この比較は貴重な機会である。したがって、373行目から376行目に示したような具体的な解説は避けることにした。他の温血動物では、正確な数値を把握するのはさらに難しい。しかし、文脈を追加することが有益であることには同意する。そこで、COVID-19（544行目、参考文献46）の中等度熱と高度熱の有病率の差の例として、上記の参考文献を掲載することにした。
https://doi.org/10.7554/eLife.83644.sa2
論文および著者情報
著者詳細
ファラ・ハダド
カナダ、エドモントン、アルバータ大学
貢献
概念化, データキュレーション, ソフトウェア, 形式分析, 監修, 資金獲得, 検証, 調査, 視覚化, 方法論, 原案執筆, プロジェクト管理, 執筆 - 査読と編集
共同研究者
アムロ・M・ソリマン
競合利益
競合利益なし
アムロ・M・ソリマン
カナダ、エドモントン、アルバータ大学
貢献
概念化, データキュレーション, ソフトウェア, 形式分析, 監修, 資金獲得, 検証, 調査, 視覚化, 方法論, 原案執筆, プロジェクト管理, 執筆 - 査読と編集
共同研究者
ファラ・ハダド
競合利益
競合利益なし
マイケル・E・ウォン
カナダ、エドモントン、アルバータ大学
貢献
概念化, 資料, 形式分析, 監修, 資金獲得, 調査, 可視化, 方法論, 原稿執筆, プロジェクト管理, 執筆 - 査読と編集
競合利益
競合利益なし
エミリー・H・アルバース
カナダ、エドモントン、アルバータ大学
貢献
概念化, 資料, 形式分析, 監修, 資金獲得, 調査, 視覚化, 方法論, 原案執筆, プロジェクト管理, 執筆 - 査読と編集
競合利益
競合利益なし
ショーナ・L・センプル
カナダ、エドモントン、アルバータ大学
貢献
概念化, 資料, 形式分析, 監修, 資金獲得, 調査, 視覚化, 方法論, 原案執筆, プロジェクト管理, 執筆 - 査読と編集
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものである。
デボラ・トレルバ
カナダ、エドモントン、アルバータ大学
貢献
概念化, 資料, 形式分析, 監修, 資金獲得, 調査, 視覚化, 方法論, 原稿執筆, プロジェクト管理, 執筆 - 査読と編集
競合利益
競合利益なし
ライアン・D・ハイムロス
エモリー大学, アトランタ, アメリカ合衆国
貢献
概念化, 資料, 形式分析, 監修, 資金獲得, 調査, 可視化, 方法論, 原案執筆, プロジェクト管理, 執筆 - 査読と編集
競合利益
競合利益なし
アシフ・ナシリー
カナダ、エドモントン、アルバータ大学
貢献
ソフトウェア, 形式分析, 可視化
競合利益
競合利益なし
キース・B・ティアニー
カナダ、エドモントン、アルバータ大学
貢献
概念化、リソース、監督
競合利益
競合利益なし
ダニエル・R・バレダ
カナダ、エドモントン、アルバータ大学
貢献
概念化, 資料, 形式分析, 監修, 資金獲得, 調査, 視覚化, 方法論, 原稿執筆, プロジェクト管理, 執筆 - 査読と編集
連絡先
d.barreda@ualberta.ca
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものです：0000-0003-4630-2840」。
資金提供
カナダ自然科学・工学研究評議会（RGPIN-2018-05768）
ダニエル・R・バレダ
アルバータ大学生物科学部（AMSおよびMEWへの大学院ティーチングアシスタントシップ）
アムロ・M・ソリマン
マイケル・E・ウォン
国立科学技術委員会（ポスドク奨学金）
デボラ・トレルバ
カナダ自然科学・工学研究審議会（ポスドク研究員）
ショーナ・L・センプル
資金提供者は、研究デザイン、データ収集、解釈、論文投稿の決定には関与していない。
謝辞
カスタムATPTの構築にご協力いただいたM Reichert、C Gerla、J Edgington、M Axelsson、J Johnston、実験魚の飼育にご協力いただいたScience Animal Support Services、統計と多変量解析についてご意見をいただいたA ShostakとZ Songに感謝する。本研究は、カナダ自然科学・工学研究評議会からDRBへの助成金（RGPIN-2018-05768）の支援を受けた。AMSとMEWはアルバータ大学生物科学科のGraduate Teaching Assistantshipの支援を受けた。DTはCONICYT-Chile postdoctoral fellowship (Becas Chile N° 74170029)の支援を受けた。SLSはカナダ自然科学・工学研究評議会のポスドク奨学金を受けた。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と解析、発表の決定、原稿の作成には関与していない。
倫理
すべての動物はCanadian Council on Animal Careのガイドラインに従って飼育された。すべてのプロトコールはUniversity of Alberta Animal Care and Use Committeeの承認を得た（ACUC-Biosciences protocols 706 and 355303）。魚は承認された手順で頸椎脱臼により絶命させた。動物のストレスを最小化し、終末処置が効率的に行われるよう努力した。
シニアエディター
Carla V Rothlin、イェール大学、米国
査読編集者
Ruslan Medzhitov, ハワード・ヒューズ医学研究所, イェール大学医学部, アメリカ合衆国
査読者
Martin F Flajnik, メリーランド大学, 米国
バージョン履歴
受領受理日：2022年9月22日
プレプリント掲載 2022年10月30日 (プレプリントを見る)
受理 2023年2月22日
記録版発行 2023年3月14日（バージョン1）
著作権
© 2023, Haddad, Soliman et al.
この記事はクリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの条件の下で配布されています。このライセンスは、原著者と出典のクレジットを条件として、無制限の使用と再配布を許可するものです。
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ダニエル・バレダによる、冷血動物が感染症と闘う仕組みについての説明をお聞きください。
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免疫学と炎症

微生物学と感染症
抑制性IL-10産生CD4＋T細胞はT-bet依存性であり、アルギナーゼ-1の共発現を介してサイトメガロウイルスの持続性を促進する。
マシュー・クレメント, クリスティン・ラデル... イアン・R・ハンフリーズ
研究論文 2023年7月13日
生化学・ケミカルバイオロジー

免疫学と炎症
ポリアミン・スペルミジンによるSrcキナーゼ活性調節の裏口的洞察
ソフィア・ロッシーニ、マルコ・ガルガロ... ジャダ・モンダネッリ
研究論文 2023年7月7日更新
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