酸性哺乳類キチナーゼはマウス消化器官におけるプロテアーゼ耐性グリコシダーゼである

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公開日：2016年11月24日
酸性哺乳類キチナーゼはマウス消化器官におけるプロテアーゼ耐性グリコシダーゼである

https://www.nature.com/articles/srep37756

大野 美沙, 木村 正博, ...大山 文隆 著者を表示する
Scientific Reports 6巻 記事番号：37756（2016） Cite this article

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概要
キチナーゼは、β-1, 4結合N-アセチル-D-グルコサミン（GlcNAc）のポリマーであるキチンを加水分解する酵素である。キチンは長い間、哺乳類の消化器官では消化されない食物繊維の供給源と考えられてきた。ここでは、酸性哺乳類キチナーゼ（AMCase）が、マウスの消化管環境において、キチンを基質として構成的に分解し、(GlcNAc)2フラグメントを産生する主要な消化酵素として機能しうることを証明する。AMCaseは内因性のペプシンC消化に耐性があり、pH2.0のマウス胃抽出液中で活性を維持していた。AMCaseのmRNAレベルは、4つの主要な胃タンパク質および2つのハウスキーピング遺伝子よりもはるかに高く、マウス胃組織におけるペプシノーゲンCのレベルに匹敵した。さらに、AMCaseは胃のペプシノーゲン合成主任細胞で発現していた。この酵素は、ペプシノーゲンCが完全に分解されるpH7.6のトリプシンやキモトリプシンの存在下でも安定に活性を示した。マウスAMCaseは消化管環境において、タンパク質分解酵素の存在下で高分子コロイド状および結晶状のキチン基質を分解した。従って、AMCaseは胃や腸の条件下でプロテアーゼ耐性の主要なグリコシダーゼとして機能し、キチン基質を分解して炭素、窒素およびエネルギー源である(GlcNAc)2を産生することができる。

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はじめに
β-1,4結合N-アセチル-D-グルコサミン（GlcNAc）の直鎖ポリマーであるキチンは、自然界で2番目に多い天然多糖であり、真菌類、甲殻類、昆虫の主要な構造成分として機能している1。キチンは、バクテリアなどのキチナーゼを産生する生物にとって、炭素、窒素、エネルギーの主要な供給源として重要な役割を担っている2。キチンは哺乳類の消化器官では分解されないと考えられてきたため、食物繊維として飼料に配合されることもある3。

キチナーゼはキチンのβ-1, 4グリコシド結合を加水分解する。マウスやヒトはキチンとその合成酵素を合成しないが、2つの活性キチナーゼ、キトトリオシダーゼ（Chit1）と酸性哺乳類キチナーゼ（AMCase）を発現している1,4。常染色体劣性ライソゾーム貯蔵障害であるゴーシェ病患者の血漿中では、Chit1の濃度が著しく上昇している5。この酵素は、精製されクローニングされた最初の哺乳類キチナーゼである6,7。AMCaseは2番目のキチナーゼで、その酸性等電点からこの名がついた8。

AMCaseは、喘息、アレルギー性炎症、眼アレルギー、ドライアイ症候群、胃がんなどの特定の病態下で発現が変動することから、大きな注目を集めている9,10,11,12,13,14,15,16。AMCaseは、オバルブミン、病原体、寄生虫に対するTヘルパー2（Th2）細胞を介した免疫応答において、インターロイキン13刺激の下流エフェクターとして重要な働きをする9,17。AMCaseはまた、腸内線虫に対する2型防御応答の重要なイニシエーターとしても機能している18。さらに、AMCaseのいくつかの遺伝子変異は、ヒトの気管支喘息と関連している19,20,21,22。

マウスAMCaseはpH28,23,24,25付近で最も活性が高い。マウスの胃は大量のAMCase mRNAとタンパク質を産生する26,27。従って、AMCaseはマウスの胃でキチンを含む摂取物を分解する消化酵素として機能しているようである。しかし、消化管（GIT）全体でこのような役割を担っているかどうかはわかっていなかった。ここでは、AMCaseが胃の主要なキチナーゼであり、ペプシンやトリプシン／キモトリプシン消化に抵抗性であること、また胃腸の他の部位でも条件下で消化酵素として機能することを示す。

結果
AMCaseは内因性ペプシンC消化に抵抗性である
ペプシンCは、胃液の酸性条件下で、分泌された不活性酵素ペプシノーゲンCから自己触媒的に変換される28,29。まず、マウス内因性AMCaseが、pH2.0、37℃の人工的に作成したマウス胃環境において、内因性ペプシンCによる消化に抵抗性を示すかどうかを調べた。プロテアーゼ阻害剤非存在下でマウス胃組織から可溶性タンパク質画分を調製し、pH7.6またはpH2.0で60分間までインキュベートした。

pH7.6では、60分間のインキュベーション中、バンドのパターンと強度に顕著な変化は見られなかった（図1aおよびb、左パネル）。pH7.6の条件とは対照的に、pH2.0では、60分間インキュベートしてもいくつかのバンドは変化しなかったが、わずか5分後には著しい減少を示し、時間依存的な可溶性タンパク質の減少が観察された（図1aおよびb、右パネル）。ウェスタンブロット解析によると、ペプシノーゲンCからペプシンCへの変換は、pH 2.0でのインキュベーション開始から5分以内に起こった（図1c、右上パネルおよび補足図S1）。可溶性タンパク質であるβ-アクチンは、pH7.6で60分間インキュベートしている間、安定に存在していた（図1cおよび補足図S1）。一方、pH2.0では、時間0ではわずかに検出されるだけで、インキュベーションの最初の5分間で完全に分解された（図1c）。

図1
図1
AMCaseはペプシンでは分解されない。

マウスの胃から得た可溶性タンパク質を、pH7.6または2.0において、37℃で0、5、10、20、40、60分間インキュベートした。(a)クマシーブリリアントブルー（CBB）染色による総タンパク質分析、(b)総タンパク質量の定量、(c)ウェスタンブロット、(d)pH2.0で測定したキチノリン分解活性アッセイをMethodsに記載したように行った。(b)と(d)の値は、3連で行った1回の実験からの平均値±SDを表す。*p < 0.05. P値はStudent's t-testを用いて決定した。

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マウスAMCaseは、N末端の触媒ドメイン（CatD）とC末端のキチン結合ドメイン（CBD）から構成されている8（補足図S2およびS3）。CBDがキチンを認識し、CatDがキチンを分解することが示唆されている30。抗N末端AMCase抗体（補足図S3）は、50kDaと41kDaの2つのバンドを認識した。50 kDaのバンドは、pH 7.6で60分間インキュベートしても有意な影響を受けなかったが、pH 2.0でインキュベートするとわずかに減少した（図1cおよび補足図S1）。41kDaのバンドはpH2.0に存在し、その強度は10分以降徐々に増加した（図1および補足図S1）。抗C末端AMCase抗体（Supplementary Fig. S3）は50 kDaのバンドを認識したが、いずれのpH条件でもインキュベーション中にわずかに減少した（Fig.） 抗C末端AMCase抗体はCBDフラグメントを検出しなかった（補足図S4）。この結果は、ペプシン耐性の41 kDaのバンドがCatD25を表し、得られたCBDがペプシンによって分解されたことを明確に示している。このことは、他の可溶性タンパク質とは対照的に、AMCaseはpH2.0のペプシンCの存在下では、部分的に切断されてCatD断片を放出しても安定であることを示唆している。さらに、pH2.0（AMCaseの至適pH）でのキチン分解活性は、いずれのpH条件でも60分間のインキュベーション中ほとんど変化せず（図1d）、キチン分解活性がペプシン耐性であることを示している。

AMCaseは主要な胃タンパク質であり、ペプシノーゲンC合成主任細胞で産生される
胃では、胃内在性因子31、ムチン32、ガストリン33、H+/K+-ATPase34など多くの胃粘膜タンパク質が様々な腺細胞で合成されている。我々は、AMCase mRNAの発現量を、胃粘膜タンパク質およびハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）およびβ-アクチンの発現量と、以前に報告した定量的PCRシステムを用いて比較した26,27。その結果、AMCaseは胃組織でペプシノーゲンCに次いで2番目に多く発現しており、そのレベルはChit1や他の検査した胃粘膜およびハウスキーピング遺伝子のmRNAよりも有意に高いことがわかった（図2a）。これらの結果は、AMCaseがマウスの胃における主要な転写産物であることを示している。

図2
図2
マウス胃におけるペプシンCおよびAMCaseの発現、局在および活性。

(a）9遺伝子のmRNAレベルをqPCRで定量した。上段は実測値、下段は対数スケール。Y軸は全RNA10ngあたりの分子量を示す。図中の数字はGAPDHを1.0とした相対発現量を示す。Pep CはペプシノーゲンC；Gifは胃内在性因子；ATPaseはH+/K+-ATPase。(b）抗ペプシンC（緑）および抗ヒトAMCase（赤）を用いた免疫組織化学によるマウス胃切片でのペプシンCおよびAMCaseタンパク質の発現と共局在。スケールバー、1,000μm（上のパネル）；50μm（下のパネル）。(c）ペプシンとAMCaseのpHプロファイル。(a)と(c)の値は平均値±SD。**p < 0.01. P値はStudent's t-testを用いて決定した。

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ペプシノーゲンCは胃主任細胞で合成される28,29。すべてのペプシンC陽性細胞がAMCaseに免疫反応するわけではないが、二重免疫染色を用いて、AMCaseもこれらの細胞で発現していることがわかった（図2b）。

成熟タンパク質であるペプシンCは、pH2.028,29で最大活性を示す。ペプシンCの最大活性はpH 2~3で観察され、pH 5.0を超えると消失する（図2c、左）。AMCaseもまたpH 2.0で最大活性を示したが、ペプシンCとは対照的に、より中性（pH 7.0まで）の条件下でも一定レベルの活性が維持された（図2c、右）。このように、AMCaseはマウスの胃環境において、キチン分解活性とペプシンCに対する抵抗性を持つ主要な胃タンパク質である。

AMCaseはトリプシンおよびキモトリプシンによる消化に抵抗性である。
胃はペプシンCとAMCaseを含む内容物を腸管内腔に排出し、そこで炭酸水素ナトリウムによって酸が中和され、トリプシンとキモトリプシンが分泌される。ここで消化されたタンパク質は、さらに小さなペプチドに分解される。我々は腸内環境を人工的に作り出し、トリプシンとキモトリプシンの存在下でのAMCaseの安定性を調べた。マウスの胃から採取した可溶性タンパク質画分をpH2.0、37℃で1時間インキュベートした後、腸のような中性条件下（pH7.6）で、トリプシンおよびキモトリプシンの存在下、37℃で3時間、同程度か50倍高いレベルでインキュベートした。前の実験（図1）と一致し、pH 2.0での培養中に総タンパク質量は急激に減少した。その後、トリプシンおよびキモトリプシン存在下、pH7.6でインキュベートすると、総タンパク質はさらに分解された（図3a）。ペプシンCは完全に消化されたが、AMCaseレベルは等量のトリプシンとキモトリプシンの存在下では影響を受けなかった（図3bおよび補足図S5）。抗C末端AMCase抗体は50 kDaのバンドを認識し、このバンドは胃のpH条件下でインキュベートする間に減少した。しかし、両酵素を等量あるいは50倍過剰に添加しても、AMCaseレベルは低下しなかった（図3bおよび補足図S5）。抗N末端AMCase抗体を用いると、50 kDaのバンドに加えて41 kDaのバンドも検出されたが、これらはトリプシンやキモトリプシンによって大きく変化することはなかった（図3cおよび補足図S5）。さらに、キチン分解活性はどの培養条件でも有意な影響を受けなかった（図3d）。これらのデータは、AMCaseとその切断型CatDは、pH7.6でトリプシンやキモトリプシンの存在下でも安定であることを示している。

図3
図3
AMCaseはトリプシンおよびキモトリプシンによる消化に抵抗性である。

マウスの胃から抽出した可溶性タンパク質画分を胃様条件下でインキュベートした後、トリプシンおよびキモトリプシンを可溶性タンパク質の量に対して等倍または50倍過剰に含む腸様条件下でインキュベートした。サンプルは、(a)CBB染色、(b,c)ウェスタンブロット、(d)キチン分解活性の測定により分析した。インキュベーションはすべて37℃で行った。数値は平均値±SDを表す。**p < 0.01 P値はStudent's t-testを用いて決定した。

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AMCaseは消化管環境において、タンパク質分解酵素の存在下でキチン基質を分解する
最後に、AMCaseが胃と腸の両方の環境でキチンポリマーを分解できるかどうかをテストした。キチン基質をマウス胃抽出液とインキュベートし、得られた単糖およびオリゴ糖を還元末端基を蛍光剤で共有結合標識し、Methodsに記載したように高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）8,24,25,35で分離した。内因性AMCaseは、pH2.0ではコロイド状と結晶状のキチンの両方を、1時間インキュベートすると早くも分解し、主に(GlcNAc)2断片を生成した（図4a）。基質はトリプシンおよびキモトリプシンの存在下でも、その後のインキュベーション（pH 2.0でのプレインキュベーション）とpH 7.6での1回のインキュベーションの両方で同様に消化された（図4bおよびc）。両キチン基質からの(GlcNAc)2のレベルは、胃の条件下と比較して、腸内環境でのインキュベーション後ではやや高かった（図4bおよびc）。これらの結果から、マウスAMCaseは胃および腸のいずれの環境においても、結晶性キチンと同様に高分子コロイド状キチンを(GlcNAc)2に分解することが確認された（図4d）。

図4
図4
キチンは胃と腸の環境で分解される。

(a)コロイド状および結晶状のキチン基質は、AMCaseを含む胃抽出液によって1-3時間のインキュベーション中に分解された。(b)および(c)コロイド状(b, 左)および結晶性キチン(c, 左)を、pH2.0で1時間、その後同量のトリプシンおよびキモトリプシンを添加した後pH7.6で3時間、マウスの胃の抽出液とインキュベートする間に分解生成物が生じた。さらに、等量のトリプシンとキモトリプシンを添加後、pH7.6で3時間反応させると、コロイド状(b, 右)と結晶状(c, 右)のキチンが分解された。インキュベーションはすべて37℃で行った。(d）本研究の結果の要約。マウスAMCaseは、胃と腸の両方の環境において、キチンを(GlcNAc)2に分解する。

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考察
ここで我々は、AMCaseがpH2.0のペプシンC、pH7.6のトリプシンおよびキモトリプシンのタンパク質分解活性に対して耐性であり、両方の条件下でキチンの分解能力を保持していることを示した。AMCaseのmRNA発現は、Chit1、4つの主要な胃タンパク質および2つのハウスキーピング遺伝子の発現よりもかなり高い（次いでペプシノーゲンC）。この結果は、AMCaseがマウスの胃腸全体において消化酵素として機能していることを示している。

β-アクチンを含む胃の可溶性タンパク質は、内因性ペプシンCによってpH2.0、37℃で分解されたが、AMCaseは抵抗性であった。さらに、ペプシンCは腸内環境でトリプシンやキモトリプシンによって分解されたが、全長AMCaseとそのCatDは、過剰濃度のこれらの酵素によってほとんど影響を受けなかったことに注目すべきである。重要なことは、AMCaseのキチン分解活性はこれらの条件下でも維持されていたことである。われわれの以前の研究で、CatDの一次構造は、CBD25の非存在下で、キチン分解活性、基質認識、分解に必要な三次構造を形成するのに十分であることが示された。したがって、全長AMCaseとそのCatDは、異なるGIT部分で効率的に機能することができる。

これまでの研究で、マウスAMCaseはpH28,23,24,25付近で最も活性が高く、胃に多く発現していることが示されている8,23,26,27。二重免疫染色を用いて、AMCaseがマウス胃組織のペプシノーゲンC合成主任細胞で産生されることを示した。これは、in situハイブリダイゼーション23,36や単一抗体染色37を用いた先行研究と一致する。野生のマウスは昆虫のようなキチンを含む食物を食べるが、実験用マウスは細胞壁にキチンを含む乾燥ビール酵母を含む人工飼料を与えられる。AMCaseは、キチンを含む節足動物を食べる食虫性のコウモリでも見つかっている38。コウモリのAMCaseは胃の主任細胞で合成され、コウモリの胃環境で最も活性が高い（pH5.0からpH6.0の間で最も高い）38。したがって、マウスもコウモリもAMCaseは胃組織で消化酵素として機能することができる。

ここでは、GIT条件下で消化酵素として働くAMCaseの主要な生理的役割を示す。最近、AMCaseはキチン含有線虫に対する2型免疫の開始に重要な役割を果たすことが示された18。このように、AMCaseは消化酵素としてだけでなく、マウスGITにおいてキチンを含む病原体に対する宿主防御の一部としても機能する。

キチンは天然に存在する多糖類の中で2番目に多い。消化器官では分解されないと考えられてきたため、食物繊維とみなされ、動物飼料に含まれてきた3。我々の結果は、AMCaseがペプシンC、トリプシン、キモトリプシンの存在下でもキチンポリマーを消化できることを明確に示している。主な分解産物である(GlcNAc)2は、マウスの消化管に取り込まれ、炭素、窒素、エネルギーの主要な供給源となる。従って、キチンはマウス飼育用の飼料に使用できる39。

方法
マウス胃タンパク質抽出物の調製
理研脳科学総合研究センター動物実験施設でC57BL/6 Jマウス（日本クレア）を飼育した。すべての動物実験は施設ガイドラインに従って行われた。理研脳科学総合研究センター動物実験倫理委員会の承認を得た（承認番号H19-2B013）。手術はすべてジエチルエーテルによる全身麻酔下で行い、苦痛を最小限に抑えるよう努めた。3ヵ月齢のC57Bl/6 Jマウスから単離した胃組織を、氷冷したTS緩衝液［20 mM Tris-HCl (pH7.6), 150 mM NaCl］10容量中で、テフロン/ガラス製ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジネートを17,000g、10分間、4℃で遠心し、上清を保存した。Tris-HClバッファー（pH7.6）またはGly-HClバッファー（pH2.0）を最終濃度0.1Mで添加した。37℃で0、5、10、20、40または60分間プレインキュベートした後、タンパク質阻害剤（Complete Mini、Roche）を添加した。37℃でpH2.0の条件下でインキュベートした後、1M Tris-HCl（pH7.6）を加えて溶液を中和した。次に、トリプシン（Sigma-Aldrich）とキモトリプシン（Sigma-Aldrich）の1:1混合物の等量または50倍過剰量（6μgと304μg）を反応混合物に加えた。反応混合物を37℃で3時間、pH7.6でインキュベートした。

抗体の調製
マウスN末端AMCaseに特異的なウサギポリクローナル抗体をEurofins Genomics社により作製した。Cys-ペプチドは、C末端またはN末端のシステインをkeyhole limpet hemocyanin (KLH)に結合させた。免疫ウサギの血清は、Sulfolink（Pierce）に結合したCys（マウスN末端AMCase、CAFNDLKNRNSKL）を抗原としてアフィニティー精製した。各抗体の特異性はウェスタンブロットで確認した。

SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、CBB染色、ウェスタンブロット
得られたタンパク質画分を標準的なSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を用いて分析し、その後クマシーブリリアントブルーR-250（Sigma-Aldrich）染色またはウェスタンブロットを行った。分子量マーカーとしてAll Blue（Bio-Rad Laboratories）とDual Xtra（Bio-Rad Laboratories）を用いた。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜（Immobilon-P、Millipore）に移し、ポリクローナル抗ヒトC末端AMCase27、抗マウスN末端AMCase、抗マウスC末端AMCase27、ポリクローナルヤギ抗ペプシンC（I-19）抗体（Santa Cruz）、またはモノクローナル抗β-アクチン（クローンAC-15）（Sigma-Aldrich）でプローブした、 その後、ペルオキシダーゼ標識AffiniPure F (ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories)、AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch laboratories)、またはAffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch laboratories)を添加した。結合した抗体は、Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) を用いて検出した。イムノブロットは、Luminescent Image Analyzer (ImageQuant LAS 4000, GE Healthcare)を用いて、製造元の指示に従って分析・定量した。

タンパク質濃度の測定
タンパク質濃度は、BioPhotometer Plus UV/Vis光度計（Eppendorf）を用いて、Bradford Protein Assay（Bio-Rad）により、ウシ血清アルブミンを標準として測定した。

キチナーゼ酵素アッセイ
キチン分解活性は、合成発色基質である4-ニトロフェニル N, N'-ジアセチル-β-D-キトビオシド（Sigma-Aldrich）を200μMの濃度で用いて測定した。各反応は3連で行った。すべての酵素反応は、Gly-HCl緩衝液（pH 1.0〜pH 4.0）またはMcIlvaine緩衝液（0.1 Mクエン酸および0.2 M Na2HPO4、pH 2.0〜pH 8.0）中のマウス胃の全タンパク質抽出物を含む50 μLの容量で行った。37℃で20分間インキュベートした後、20μLの1M炭酸ナトリウム溶液を直ちに反応混合物に加えた。放出された4-ニトロフェノラートイオンの吸光度を405 nmで測定した。

RNAおよびcDNAの調製
TRIzol Reagent（Invitrogen社製）を用いて、製造元の指示に従ってマウスの胃組織から全RNAを調製した。微量の汚染ゲノムDNAを除去するため、製造業者の推奨プロトコールに従って、全RNAサンプルをRQ1 RNase-Free DNase（Promega）で処理した。核酸の濃度は、260 nmでの吸光度を測定することにより決定した。各全RNAサンプル（3μg）を、プライマーとしてランダムヘキサマーを用いた逆転写に供した。反応混合物（15μl）には、酵素バッファー［50mM Tris-HCl（pH 8.3）、75mM KCl、3mM MgCl2］、100ngのランダムヘキサマー、10mMジチオスレイトール、0.5mMデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTPs）が含まれていた。溶液を60℃で5分間加熱し、混合物を37℃で5分間インキュベートした後、200Uの組換えマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Invitrogen）を加え、混合物を37℃で45分間インキュベートした。逆転写は95℃で5分間加熱して終了させた。

標準DNAの構築
胃の主要タンパク質の遺伝子を含む9遺伝子の標準DNAの構築は、以前に記述した27。胃内在性因子、ムチン、ガストリン、H+/K+-ATPaseのコード配列と鋳型DNAを合成し、Eurofins Genomics社によりpTAKN-2ベクターに挿入した。ライゲーション後、これらの遺伝子をフォワードプライマー5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′とリバースプライマー5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′を用いて増幅した。胃粘膜の4遺伝子と鋳型DNA26の5遺伝子をEcoRIで消化し、T4 DNAリガーゼを用いてライゲーションした。ライゲーションした断片を、フォワードプライマー5′-GTGGATTCTGTGCCGACAAAGCAGATGGCC-3′およびリバースプライマー5′-ATCATGGATACAAGTCCCGCAAAGCAGAGGCCACT-3′を用いて増幅し、pGEM-T Easyベクター（Promega）にクローニングした。標準DNA（1,349塩基；補足図S6参照）は、同じプライマーを用いてプラスミドDNAからPCR再増幅により調製し、以後標準DNAとして用いた。

リアルタイムPCR
リアルタイムPCR用の胃内在性因子、ムチン、ガストリン、H+/K+/-ATPaseのプライマーは、PrimerQuest Input（Integrated DNA Technologies）に基づいて設計し、市販のもの（Eurofins Genomics）を合成した（補足表1）。PCR反応は、2 x SYBR Green Master Mix (Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix, Agilent)、2.7 ngのマウスcDNAまたは外部標準の適切な希釈液(下記参照)、および補足表1に示したプライマー2.3 pmolを含む最終容量13 μlで行った。Mx3005P システム（Agilent）の標準的なリアルタイム PCR 条件を用いた：95 °C で 10 分間の初期変性とポリメラーゼ活性化ステップ、95 °C で 30 秒間の変性、55 °C で 30 秒間のアニーリング、72 °C で 10 秒間の重合を 40 サイクル繰り返した。増幅後、メルティングカーブを作成した。Chit1、AMCase、ペプシノーゲンC、GAPDHおよびβ-アクチンのプライマーは、以前に報告されている26。

免疫組織化学
14週齢のマウスをPBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）で灌流した。胃をPBS中4％PFAで4℃で一晩後固定し、PBS中30％ショ糖に移した。胃をTissue-Tek O.C.T.コンパウンドに包埋し、ドライアイス冷却エタノールで凍結した後、クライオスタットを用いて切り出した。15μm厚の切片をオートクレーブで抗原回収し、前述の方法で免疫染色した40。免疫染色には以下の一次抗体を使用した：ウサギポリクローナル抗ヒトC末端AMCase 1:1,000希釈、ヤギポリクローナル抗ペプシンC 1:500希釈。以下の二次抗体を1:300希釈で使用した： Alexa Fluor 546抗ウサギIgGおよびAlexa Fluor 488抗ヤギIgG。画像は BIOREVO BZ-9000 (KEYENCE) および TCS SP5 共焦点顕微鏡 (Leica) で撮影した。

ペプシン酵素アッセイ
ペプシン活性は、ウシ血液由来ヘモグロビン（Sigma-Aldrich）を基質として測定した。総反応量150μl中、1.3%(w/v)のウシヘモグロビンを37℃で可溶性タンパク質と反応させた。5分後、トリクロロ酢酸（TCA）（Sigma-Aldrich）を最終濃度3.2%（w/v）になるように加えて反応をクエンチした。サンプルを遠心分離し、吸光度を280 nmで測定した。37℃で10分間処理したタンパク質画分を分析した。

可溶性タンパク質によるコロイド状および結晶性キチンの分解
Chit1を不活性化し、ペプシンを活性化するために、可溶性タンパク質を37℃で10分間プレインキュベートした。その後、可溶性タンパク質をコロイド状キチンおよび結晶性キチンと反応させた。コロイド状キチンは、既述のようにエビ殻キチン（Sigma-Aldrich）から調製し、キチナーゼ活性を測定する基質として用いた8,24。コロイド状キチン（最終濃度1 mg/mL）および結晶性キチン（1 mg/反応）を用いた胃の状態の酵素反応は、可溶性タンパク質を含む容量50 μL中、pH 2.0、37℃で1時間行った。胃の場合、Chit1を不活性化しペプシンを活性化するため、可溶性タンパク質を37℃で10分間プレインキュベートした。胃の状態で生成したキチン断片は、その還元末端基を8-アミノナフタレン-1, 3, 6-トリスルホン酸（ANTS、Sigma-Aldrich）で共有結合的に標識し、得られた蛍光誘導体をJackson35の記載に従って高分解能PAGEで分離した。腸様中性条件の場合、20μLの容量で胃条件の酵素反応に続いて、6μLの1M Tris-HCl（pH7.6）と6μgのトリプシン／キモトリプシンの1：1混合物を加え、pH7.6、37℃で3時間反応させた。生成したキチン断片は、ANTS標識の前に5μLの氷酢酸を加えた以外は、基本的に上記のように標識した。標準物質としてN-アセチルキトオリゴ糖（生化学工業株式会社）を用いた。

統計解析
生化学的データはStudent's t-testで比較した。

追加情報
この論文の引用方法 Acidic mammalian chitinase is a protease-resistant glycosidase in mouse digestive system. Sci. Rep. 6, 37756; doi: 10.1038/srep37756 (2016).

出版社注：シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権主張および所属機関に関して中立を保っています。

参考文献
Koch, B. E., Stougaard, J. & Spaink, H. P. 生物医学研究におけるキチンとその相互作用パートナーの生物学的機能の増加を追跡する。Glycobiology 25, 469-482 (2015).

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参考文献のダウンロード

謝辞
貴重な示唆をいただいた本田正太郎氏、水谷大輔氏、今村康忠氏、統計解析の助言をいただいた大山理恵子氏に感謝する。本研究は、日本学術振興会科学研究費補助金（15J10960および16K07699）、工学院大学科学技術研究所プロジェクト研究助成金、日本私立学校振興・共済事業団学術研究助成基金助成金、および文部科学省戦略的研究基盤形成支援事業私立大学等研究費補助金（S1411005）の一部を受けた。P.O.B.はALS協会およびMayo Clinic Center for Regenerative Medicineの支援を受けている。

著者情報
著者ノート
大野美佐、木村昌弘、宮崎晴子は本研究に等しく貢献した。

著者および所属
工学院大学化学生命科学部（〒192-0015 東京都八王子市八王子町1番地

大野美佐、木村昌宏、大川和明、大貫里穂、根本千幸、田畑恵理、脇田聡、樫村明徳、坂口正義、菅原康里、大山文隆

理化学研究所脳科学総合研究センター構造神経病理研究チーム（〒351-0198 埼玉県和光市和光

宮崎晴子・貫名信之

順天堂大学大学院医学研究科神経変性疾患神経科学講座（東京、〒113-8421

宮崎晴子・貫名信之

同志社大学大学院脳科学研究科構造神経病理学研究室（〒610-0394 京都府京田辺市桂川町

宮崎晴子・貫名信之

米国フロリダ州ジャクソンビル、メイヨークリニック神経科学科

ピーター・O・バウアー

貢献
実験の構想および設計： M.O.、M.K.、M.S.、Y.S.、P.O.B.、F.O. 研究実施： データ解析：M.O.、M.K.、H.M.、K.O.、R.O.、C.N.、E.T.、S.W.、A.K.、M.S.、F.O： 論文執筆：M.O.、M.K.、H.M.、E.T.、N.N.、P.O.B.、F.O.： M.O.、P.O.B.およびF.O.は論文の批判的評価に貢献し、最終版を承認した： M.O.、M.K.、H.M.、K.O.、R.O.、C.N.、E.T.、S.W.、A.K.、M.S.、Y.S.、N.N.、P.O.B.、F.O.

倫理申告
競合利益
著者らは、競合する金銭的利害はないと宣言している。

電子補足資料
補足情報
権利と許可
この著作物は、クリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下でライセンスされている。本記事に掲載されている画像またはその他の第三者の素材は、クレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれている。もし素材がクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない場合、利用者はその素材を複製するためにライセンス保持者の許可を得る必要がある。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

転載と許可

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この記事を引用する
酸性哺乳類キチナーゼはマウス消化器官におけるプロテアーゼ耐性グリコシダーゼである. Sci Rep 6, 37756 (2016). https://doi.org/10.1038/srep37756

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受領
2016年7月15日

受理
2016年10月31日

掲載
2016年11月24日

DOI
https://doi.org/10.1038/srep37756

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テーマ
動物生理学
食餌性炭水化物
ヒドロラーゼ
この論文の引用元
シオナ胚発生における水平転移型グリコシルヒドロラーゼ遺伝子GH6-1の発現と機能の可能性
李 昆龍 中嶋 啓介 佐藤 則幸
エボデボ（2023）

ブタ栄養における外因性繊維生体触媒としての2種類のプロセッシブエンドグルカナーゼのin vitro安定性の評価
ローレンス・チェン王偉俊明Z.ファン
サイエンティフィック・リポーツ (2022)

カニクイザル（Macaca fascicularis）酸性キチナーゼの幅広いpHおよび温度範囲における頑健なキチナーゼ分解活性
上原 麻衣子田畑 絵理大山 文隆
学術報告 (2021)

酸性キチナーゼの残基はブタペプシン製剤中のキトサンを分解するキチン分解活性を引き起こす
田畑 恵理脇田 聡大山 文隆
サイエンティフィック・リポーツ（2019）

食虫性霊長類コモンマーモセット（Callithrix jacchus）の胃における酸性キチナーゼの高発現とキチン消化率
田畑恵理樫村昭典大山文隆
サイエンティフィック・リポーツ（2019年）

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サイエンティフィック・リポーツ (Sci Rep) ISSN 2045-2322 (online)

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