PUFAおよびカロテノイドを産生するスラストキトリウムとその抗微生物活性および抗酸化活性

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オリジナル研究論文
フロント Mar. サイエンス, 10 May 2023
マリンバイオテクノロジーとバイオ製品
第10巻 - 2023年｜https://doi.org/10.3389/fmars.2023.1126452
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海洋微生物のバイオテクノロジー

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PUFAおよびカロテノイドを産生するスラストキトリウムとその抗微生物活性および抗酸化活性

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmars.2023.1126452/full

Kalidasan Kaliyamoorthy1* Suchana Chavanich1,2 Kathiresan Kandasamy3 Mohanchander Ponnuvel4 Niyom Kamlangdee5 Yousuke Taoka6 Voranop Viyakarn1,2* 1．
1タイ、バンコク、チュラロンコン大学理学部海洋科学科、礁生物学研究グループ
2チュラロンコン大学水圏資源研究所、タイ、バンコク
3インド・タミル・ナードゥ州パランギペッタ、アンナマーライ大学海洋科学部海洋生物学高等研究センター（CAS）
4インド・タミル・ナードゥ州チェンナイ、イースト・タンバラム、マドラス・クリスチャン・カレッジ（自治大学）動物学科
5タイ、バンコク、トンブリ、モンクット王工科大学理学部微生物学科
6宮崎大学農学部海洋生物環境科学科海洋環境微生物学研究室（日本、宮崎、学園木花台西
マングローブ生態系の微生物相に寄与しているトラウストキトリウムは、多価不飽和脂肪酸（PUFA）、抗菌剤、抗酸化剤の供給源として、医薬品、水産養殖、ヒトの健康分野への応用が期待されている。しかし、インドのマングローブ生態系におけるスラス トキトリウムのPUFAsと生物活性については、これまで適切に研究されてこなかった。そこで本研究では、PUFAsを豊富に含むスラス トキトリウムを単離し、その色素、抗菌、抗酸化特性を調べた。本研究では、インド南東海岸のPichavaramに生育するマングローブの腐葉土から、PUFAsを産生するThraustochytridsを分離・同定した。形態学的および分子生物学的特徴から、Thraustochytrium sp.とAurantiochytrium mangroveiの2種が同定された。Thraustochytrium sp.は、総脂質42.36%、ドコサヘキサエン酸（DHA）32.69%を含む4.72 g L-1のバイオマスを生産し、A. mangroveiは、総脂質49.81%、DHA44.71%を含む6.25 g L-1のバイオマスを生産した。さらに、有機溶媒で抽出したバイオマスを、アンピシリンの陽性対照とともに、7 種類の臨床病原体に対する抗菌活性を試験した。Thraustochytrium sp.は、黄色ブドウ球菌に対して78.77％の阻害域で最も高い抗菌活性を示し、肺炎桿菌に対しては20.95％と最も低かった。また、Thraustochytrium sp.は最小発育阻止濃度（MIC）40 µg L-1を示し、黄色ブドウ球菌の発育を阻止した。A. mangroveiの抗酸化活性を6つのアッセイ法で試験したところ、フリーラジカル消去活性が最も高く（87.37 ± 1.22%）、一酸化窒素ラジカル消去活性が最も低かった（75.12 ± 2.22%）。従って、Thraustochytrium sp.およびA. mangroveiの抽出物は、バイオ医薬品および食品産業用のリード化合物の有望な供給源であることは明らかである。

はじめに
Thraustochytridsは、単細胞の油脂性、真核の斜視原生生物で、王国-Stramenopilesの下にあり、それらは菌類と珪藻類から構成されている（Bongiorni, 2012; Dellero et al.） スラストキトリウム類は当初、二鞭毛胞子の存在に基づいて分類され（Huang et al.、2003）、後に形態学的特徴、分子配列研究、多価不飽和脂肪酸、色素プロファイルに基づいて分類された。Thraustochytriaceaeには11属35種が存在し、15種以上がThraustochytrium sp.に属している（Kalidasan et al.） それらは、沿岸水域や河口域の生息環境、特に藻類、植物、腐敗したマングローブの葉を含む砕屑水や堆積物に豊富に存在する（Marchanら、2018；Wangら、2019）。Thraustochytridsは一次分解者であり、マングローブ生息地において、リターを腐敗させることによって栄養塩のリサイクルとデトリタス摂食生物への餌の供給において重要な役割を果たしている（Raghukumar、2002；Kathiresanら、2011；Taokaら、2017）。

トラウストキトリウムは、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、エステラーゼ、ホスファターゼなど、様々な加水分解性の細胞外酵素を分泌することが知られている（Taoka et al.、2009；Taoka et al.、2017；Lin et al.、2020）。細胞壁などの有機基質やタンニンなどのフェノール化合物を分解し、沿岸海域の炭素循環に大きく貢献している（Raghukumar, 2017）。マングローブや河口域の環境では、栄養分を豊かにし、土壌の肥沃度を高める（Kathiresan et al.） また、スラストキトリウムは抗菌作用や抗酸化作用を持つナノ粒子（Kalidasan et al.

Thraustochytridsは、エクトプラズム・ネットワークと呼ばれる膜の拡張を作り出すことができる。栄養不足の条件下で生育すると、このネットワークがより広範囲に産生され、周囲の環境から直接栄養を吸収しやすくなる（Hamamoto and Honda., 2019）。エクトプラズム・ネットは餌に付着することで餌を認識し、厚くなる。その間に消化酵素の分泌と消化された物質の吸収が行われる（Iwata and Honda, 2018）。エクトプラズム・ネットにはリン脂質が必要であり、トリアシルグリセロールやスラストキトリウムの細胞内の中性脂質を犠牲にして生産される（Jainら、2007；Raghukumar、2017）。ドコサヘキサエン酸（DHA）は、飢餓時の迅速なエネルギー源として役立つ。その結果、DHAはThraustochytridsの飢餓時に減少し、移動性のライフステージでエネルギーを供給する（Jainら、2007）。

ト ラウストキトリウムは脂肪酸、特にエイコサペンタエン酸（EPA）やDHAといったオメガ3系PUFA の有望な供給源である（Raghukumar, 2008; Pawar et al.） これらの脂肪酸は水生生態学的プロセスにとって重要であり、魚類にとっても必須栄養素である（Song et al.） 甲殻類の動物プランクトンは、脂肪酸を合成する能力が限られているか、まったくないため、成長と繁殖のために脂肪酸を必要とする（Nichols and Nichols, 2008）。ス ラウストキトリウムは、EPAよりもDHAを多く必要とする海産魚の仔稚魚の生餌となるワムシやアルテミ アのPUFA含量を高めるために使用される (Barclay and Zeller, 1996; Castillo et al., 2009)。近年、DHAとEPAは、脳や網膜の発達を促進する（Ratledge, 2004）、高血圧を軽減する（Boyer-Diazら, 2020）、抗心血管作用（Liaoら, 2022）、抗がん作用（Kalidasanら, 2022）など、薬理学的および栄養学的特性が注目されている。それゆえ、PUFAを産生するスラス トキトリウムの培養は、PUFAを豊富に含むバイオマスやオイルを供給するために注目されている（Raghukumar, 2008; Raghukumar, 2017; Pawar et al.） 現在、DHAの主な生産源は魚と魚油である。しかし、魚油に含まれるDHAのレベルは低く、魚油からDHAを大規模に生産することは困難である（Kalidasan et al.） 魚資源の乱獲と魚の個体数の減少という状況の中で、DHAの需要と供給のフロー・チェーンは乱れている（Liangら、2022）。オメガ3 PUFA市場は、2019年には約43億米ドルと評価されている（Aasenら、2016年）。微生物の脂肪酸プロファイルは安定しており、より安全で再生可能なベジタリアンオイルであり、医薬品や栄養補助食品、産業における幅広い商業的有用性を持つDHA生産の代替源として適している（Mariamら、2021年）（Paliwalら、2019年）。

Thraustochytridsは、様々な国の様々な沿岸、河口、マングローブ環境で調査されてきた： 中国（Mohanら、2022年）、ベトナム（Hienら、2022年）、タイ（Ainiら、2022年）、日本（Taokaら、2017年）、スウェーデン（Patelら、2021年）、イタリア（Russoら、2021年）、韓国（Sainiら、2023年）、台湾（Chauhanら、2023年）である。しかし、ゴア（Raghukumar, 2017）、ケララ（Jaseera et al., 2018）、ムンバイ（Pawar et al., 2021）、アンダマン諸島（Kalidasan et al., 2021b）、タミル・ナードゥ（Kalidasan et al., 2021a）のス ラウストキトリウムについて研究されているのは、インドの限られたマングローブ地域のみである。広範に生息しているにもかかわらず、ピチャヴァラムのマングローブ地域から得られる海産ス ラウストキトリウムのバイオマス、PUFA、カロテノイド産生、生物活性についてはあまり理解されていない。そこで、本研究では、マングローブ由来のトラウストキトリウムの単離、同定、特性評価に加え、バイオマス、PUFA、カロテノイドの生産と生物活性のための培養条件の最適化について検討した。

材料と方法
マングローブの葉の収集と加工
インド南東沿岸に位置する Pichavaram マングローブ生息地（北緯 11° 25' 38.4、東経 79° 47' 35.5）から、Rhizophora mucronata Poir.と R. annamalayana Kathir.の老化したマングローブの葉（SML）を採取した。SMLは無菌のジップロックカバーに入れられ研究室に運ばれ、さらに処理するまで4℃で保管された。

単離、スクリーニング、維持
SMLは滅菌した自然海水（NSW）で洗浄し、直接プレーティング法でスラス トキトリウムを分離した（Kalidasan et al.） その後、SMLを無菌的に0.5 cm2の断片に切断し、抗菌剤（アンピシリン100 µg L-1、硫酸ストレプトマイシン50 µg L-1）および抗真菌剤（フルコナゾール150 µg L-1）を入れたNSW（Himedia,Mumbai）を入れたシャーレに移した。SMLサンプルは、汚染を避けるため、グルコース（5 g L-1）、ペプトン（2.5 g L-1）、酵母エキス（1.25 g L-1）、寒天（12 g L-1）（GPYA）からなる培地（NSW）に置き、30℃、pH 7.2で24時間培養した。培養後、培養プレートを明視野顕微鏡（Nikon Eclipse Ni-U microscope, Nikon Corporation, Tokyo, Japan）で2～7日間毎日観察した。スラストキトリウムは、クリーム色、淡い白色、淡いオレンジ色で、表面は滑らか、粗い、凹凸が観察された。さらに、プレートの成長、発育、コロニーの汚染を毎日チェックした（図1）。母培地の純粋なコロニーは、将来の使用のために20％グリセロールストックとして-80℃で凍結保存した。

図1
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図1 Thraustochytridsの分離、スクリーニング、精製プロセス。

形態学的および顕微鏡的同定
スラストキトリウムの形態学的同定は、色や形を含め、生活環の発達の過程で行われた。例えば、植物細胞の存在、外部プラスミドネットワーク、クラスター形成、二分裂、動物胞子、アメーバ状細胞などを光学顕微鏡で観察した。さらなる分析には、Kalidasanら、2021bに記載されている走査型電子顕微鏡（SEM）技術を用いた。凍結乾燥したスラス トキジラミ細胞をスライドグラスにのせ、2.5% v/v グルタルアルデヒドで 4℃、2 時間固定した後、0.1M カコジル酸緩衝液、pH 7.2 中、0.1M ショ糖で 4 分 30 秒間、3 回洗浄した。その後、フローフード下で2％OsO4で1時間30分保持し、蒸留水で5分間ずつ3回洗浄した。固定後、さまざまなグレードのエタノール（10、20、40、60、80、90、100%）で脱水し、酢酸イソアミルで代用した。アルミニウムの支柱にカーボンテープを貼り、CO2で乾燥させた。表面に金コーティングを施した後、SEM装置（JSM-IT500, JEOL InTouchScope™ Tokyo, Japan）を用いてサンプルを観察した。

18S rRNA遺伝子配列分析による分子同定
Thraustochytridsの分子同定は、Mo and Rinkevich (2001)の記載に若干の変更を加えた方法で行った。48時間培養した細胞5mLを12,000×g、4℃で5分間遠心した。細胞を回収し、200μlの溶解バッファー（0.1M EDTA、0.25M Tris-HCl；pH8.2）、0.1M NaCl、2％ドデシル硫酸ナトリウムで再懸濁し、55℃のウォーターバスに65分間保ち、ホモジナイズした。その後、DNAをクロロホルム-イソアミルアルコールで抽出し、冷やしたイソプロパノールで沈殿させた。精製したDNAを30μlのTEバッファーに溶解し、使用するまで-20℃で保存した。この遺伝子は、以前の文献（Honda et al., 1999）から入手したプライマー（18S001-5'-AACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3'、および18S13-5'-CCTTGTTA CGACTTCACCTTCCTCT-3'）を使用して増幅した。さらに、分子量マーカーを用いて分子量を測定した（100bpラダー）。アンプリコンは1.2%アガロースゲルでの電気泳動で調べ、臭化エチジウム染色で可視化した。PCR産物の精製とDNA配列決定は、MegaBace高出力シーケンサー（Yaazh Xenomics, Coimbatore, India）を用いて行った。受け取った生配列はMEGA 6.0 software (Mega Version 6, Pennsylvania, United States)を用いて電気泳動ピークの明瞭度を分析することにより連結し、信頼性の低いピークは分析に含めなかった。増幅された18S rDNA遺伝子の配列は、NCBIウェブサイトのBLASTプログラムで類似のパーセンテージを計算した。参照配列と比較して類似度が高ければ高いほど（95～100％）、種同定の証拠となった。すべての配列はNCBIの手順に従って、Bankit経由でGenbankに提出された。Thraustochytrid rDNAの塩基配列の決定に成功し、NCBI Genbankの完全なデータベースに対してブラストを行い、CLUSTAL W Multiple Sequence Alignment Program (Thompson et al., 1994)を用いてアラインメントと解析を行った。系統樹は、参照ス ラウストキイトリウム遺伝子配列とともに最尤法を用いて作成し、1000ブートストラップ複 製の統計解析を用いて種の関係を評価し、Crypthecodinium cohnii 属をアウトグループとした。

pH、塩分、温度耐性の影響
Thraustochytrid 株を温度、pH、塩分といった異なるストレス条件に曝露した (Kalidasan et al., 2021b)。pH耐性は、pH2～11のGPYブロスで培養し、塩分濃度を30 g L-1、温度を30℃に維持して調べた。塩分耐性は、GPYブロス中で、温度30℃、pH7.2を維持し、塩分濃度0～100 g L-1の範囲で5 g L-1間隔で培養することにより検討した。温度耐性は、塩分濃度を30g L-1、pHを7.2に維持し、GPYブロス中で0～50℃の範囲で5℃間隔で培養することによりスクリーニングした。

バイオマス生産と乾燥細胞重量の測定
スラストキトリウム菌株の純粋培養は、GPYS 生産ブロス培地を用い、180 rpm、pH 7.2 で振盪培養した（Orbitek Shaker, Scigenics Biotech, Chennai, Tamil Nadu, India）。汚染を防ぐため、各培養フラスコの栓には滅菌綿を使用した。バイオマス生産用 5 L フラスコで、滅菌した 1 L のグルコース（12 g L-1）、ペプトン（3 g L-1）、グルタミン酸ナトリウム（1.25 g L-1）、酵母（2.5 g L-1）、チアミン（1 g L-1）ブロス培地に接種し、pH を 7.2、温度を 28℃に保ち、2～7 日間培養してスケールアップした。

ス ラウストキトリウムのバイオマスは、50 mL の円錐底遠心チューブ（Hi media, Mumbai, India）に入れ、10000 × g で 5 分間遠心分離して回収した。細胞ペレットを滅菌蒸留水で 3 回洗浄し、バイオマスから未使用培地成分を除去した。その後、細胞ペレットサンプルを-49℃で凍結乾燥し、バイオマス量を1リットルあたりの乾燥重量バイオマス量として測定した。バイオマスは密閉容器に入れ、-80℃で保管し、今後の研究に役立てた。

全脂質抽出と脂肪酸メチルエステル分析
凍結乾燥したバイオマス 200 mg のアリコートを、Folch ら（1957）の記載に従って、クロロホルム-メタノール（2：1、v/v）法を用いた総脂質の抽出に用いた。全脂質を密閉バイアルに移し、窒素ガスを用いて溶媒から解放し、乾燥させた。乾燥した脂質に1 mlの4%メタノール性塩酸を加え、十分に混合した後、混合物をクロマトグラフィーバイアル内で80℃のオーブン中で18時間インキュベートし、トランスエステル化反応を行った(Kashiwagi et al., 1997)。上層の有機相を慎重にクロマトグラフィー・バイアルに移し、窒素ガスを用いて蒸発乾固した後、酢酸エチル1mlをバイアル内容物に加え、GC-MS（Agilent 7890A - 240 MS with Ion Trap）を用いて脂肪酸メチルエステル（FAME）を分析した。GC-MSには、MSDに接続されたシリカキャピラリーカラム（Agilent J&W, HP-5ms, 30 m x 0.250 mm x 0.25 µm）を装着した。キャリアガスはヘリウム（1 ml/min）、移動相は窒素（35 ml/min）を使用した。オーブン温度は、初期温度140℃で1分間、その後最終温度220℃に達するまで2℃/分の速度で昇温し、1分間保持するようにプログラムした。インジェクター温度は260℃に設定し、サンプル量は1μl、スプリット比は100:1に保った。FAMEの組成を標準化するために、外部標準混合物（FAME Mix C4 - C24, Sigma Aldrich, Burlington, MA, USA）を使用した。MSの取得方法は、溶媒遅延を5分、トラップ温度を176℃、マニホールド温度を70℃、トランスファーライン温度を270℃、イオン源温度を205℃に維持するように設定した。GCで示された個々の成分およびその相対濃度は、NISTおよびWilleyライブラリーの標準化合物と比較することにより同定された。

カロテノイド分析
Thraustochytrids（Thraustochytrium属、A. mangrovei）を培地中、20℃、光源間隔12時間の最適条件で培養した。バイオマスは、50 mL コニカルボトム遠心チューブ（Himedia, Mumbai, India）を用いて 8000 × g で 10 分間遠心分離し、滅菌二重蒸留水で 2 回洗浄して培地成分を除去した。その後、細胞を凍結乾燥（-49℃）し、重量を測定した。バイオマスは-80℃で密閉容器に保存し、さらに分析を行った。カロテノイド抽出はジメチルスルホキシドで行い、その後アセトンで抽出した。Pawarら(2021)記載の方法で色素を分析した。抽出したカロテノイド色素は-49℃で遮光保存し、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（Nova-Pak silica, 60 Å, 4-m, 150 mm long × 2.1 mm diameter, Waters Inc, Milford, Massachusetts, USA）を用いて分析した。各色素の定量には、市販の-カロテン、カンタキサンチン、アスタキサンチン（Sigma-Aldrich, Burlington, MA, United States）を標準物質として用いた。

溶媒抽出による二次代謝産物の調製と抽出
1000mgの凍結乾燥バイオマスを5mlのn-ブタノール、クロロホルム、メタノール、石油エーテルでそれぞれ細胞内代謝物を抽出した。抽出物を8000×gで12分間遠心分離し、上清を回収して40℃の回転式真空エバポレーターで乾燥させ、in-vitro抗菌活性を測定した（Kalidasan et al.）

in vitro抗菌活性
A. mangroveiとThraustochytrium sp.の抗菌効力を、インド・タミル・ナードゥ州チダンバラムにあるアンナマライ大学Rajah Muthaiah医科大学病理部から入手した、Klebsiella pneumonia、Bacillus subtilis、Salmonella typhi、Escherichia coli、Staphylococcus aureus、Proteus mirabilis、Vibrio choleraなどのヒト臨床細菌病原体に対して試験した。

抗菌活性は寒天ディスク拡散法で評価した（Kalidasanら、2014；Kalidasanら、2015a）。100μlの新鮮な細菌培養液を栄養ブロスに接種し、37℃で24時間培養した。各細菌株について、24時間培養した細胞懸濁液100μlを栄養寒天プレートに注ぎ、無菌的にガラススプレッダーを用いて栄養寒天全体に薄く広げた。A. mangroveiとThraustochytrium sp.の抽出液100 μlを別々に、標準アンピシリン抗生物質とともに直径6 mmの滅菌ディスク（Himedia, Mumbai, India）に注ぎ、溶媒蒸発のために30℃で30分間保持した後、ディスクを栄養寒天プレートに無菌的に含浸させた。その後、ディスクを植菌した培養プレートに移植し、37℃で24時間培養した。抗菌活性は、ペーパーディスクの直径を除いた阻止帯の直径として算出した。実験はすべて3連で行った。

最小発育阻止濃度
抗菌活性に基づき、石油エーテル抽出物のみがThraustochytrium sp.に感受性があり、n-ブタノール抽出物はA. mangroveiに感受性があることが判明したため、最小発育阻止濃度（MIC）測定にはこれらの溶媒抽出物を選択した。抽出物のMICは、Seedeviら（2013）の方法を用いて臨床病原体に対して測定した。1 mg mL-1原液を調製し、25、50、75、100 μg mL-1および標準アンピシリン1 mg mL-1（Himedia, Mumbai, India）の異なる濃度に連続希釈した。各希釈液50 µlに栄養ブロス2.0 mlを加えた試験管を用意し、0.5 mlの古い細菌培養液を接種した。対照試験管は、培養ブロス培地と細菌細胞のみで維持した。対照試験管とサンプル試験管は37℃で一晩静置した。化合物のMICは、培養期間後に増殖の観察可能な証拠を示さなかった最低濃度の抽出チューブを選択することによって決定した。

抗酸化アッセイと推定
100mgの凍結乾燥バイオマスを抽出するために、2mlのメタノールを使用した。サンプルを28℃で150rpmで60分間インキュベートした後、5000×gで10分間遠心分離した。3回の抽出後、すべての上清を合わせ、抽出物を40℃のロータリーエバポレーターで真空下に濃縮した。次に、抽出物を5つの異なる濃度（50、100、150、200、250μg mL-1）で調製し、総フェノール含量（Singleton et al、 1999）、過酸化水素ラジカル阻害アッセイ（Govindarajanら、2003）、DPPHラジカル消去アッセイ（Narwalら、2014）、総抗酸化活性（Yuら、2017）、還元力（Venusteら、2013）、一酸化窒素ラジカル消去アッセイ（Govindarajanら、2003）。抗酸化特性はL-アスコルビン酸の百分率で表した。各実験は3連で行った。

統計分析
データ解析には統計ソフトIBM-SPSS（version-16）を使用した。すべてのin vitro結果は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて分析し、平均値±SDとして算出した。0.05未満のp値は平均値間の統計的有意性を示す。

結果と考察
スラストキトリウムの単離と同定
直接播種法を用いて MSL から合計 36 株のスラストキトリウムを分離した。48時間培養後、白色、淡白色、油状、オレンジ色で、表面は平滑、粗面、凹凸が観察された。新鮮な培地に無菌的に継代培養し、2〜7日間に1回、3回継代培養した結果、生き残ったのは8株のみであった。その結果、Thraustochytrium sp、 本田ら（1999）；Leander and Porter（2001）；およびMarchanら（2018）のキーに従って光顕微鏡および走査型電子顕微鏡で可視化したところ（図2A、B）、色、形、大きさ、外膜ネットワークの形成、クラスター形成、植物細胞の存在、二分裂、動物胞子形成、アメーバ状細胞産生などの形態学的特徴に基づいて、Thraustochytrium sp.とAurantiochytrium mangroveiと同定された。Thraustochytrium sp.の植生細胞は直径7.3～16.8 µmの円形に見え、A. mangroveiのそれは直径6.2～20.38 µmの球形に見えた。Thraustochytrium sp.の細胞質は胞子嚢として機能し、沈降後に多数のアメーバ状細胞を発達させ、運動性の胞子を放出した。A. mangroveiの植物細胞は順次二分裂し、細胞群を形成した。動物胞子形成の際、外形質網はあまり発達せず、増殖体が描出された。

図2
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図2 (A a) Thraustochytrium sp.の形態学的、(b) 光および(c) 走査電子顕微鏡像、(B a) Aurantiochytrium mangroveiの形態学的、(b) 光および(c) 走査電子顕微鏡像。

Thraustrochytridsは朽ちたマングローブの葉の表面に生育することが知られている（Kalidasan et al.） 本研究と同様に、いくつかの報告がある。以前の研究では、インド・ケララ州のマングローブ生息地から11株のスラストキトリウムが分離され、A. mangroveiが最も優勢であった（Jaseera et al.） 同様に、アンダマン諸島の腐敗したマングローブの葉から12株のThraustochytridsが分離され、それらは2つの属（ThraustochytriumとAurantiochytrium）に分類されている。両属ともアンダマン諸島のマングローブ生息地で初めて報告され、Aurantiochytrium sp.が最も豊富な種で、ほとんどのサンプリングステーションで偏在していた（Kalidasan et al.） 別の研究では、Thraustochytrium sp.が、連続希釈と花粉媒介を用いて、南インドのマングローブの腐敗した葉から分離された（Kabilan et al.） さらに本研究では、マングローブ由来のスラストキトリウム分離株から18S rDNA領域によって確認された分子系統関係を分析し、NCBI blast解析による最終的なアラインメントを採用した。その結果、マングローブ由来のトラウストキトリウム属株（Accession No.KT716335）は、Thraustochytrium sp. S7 (KF683340)と100%類似しており、Thraustochytrium (KT598545)と93.91%、Thraustochytrium sp. Yonez6-8 (AB810969)と93.43%類似していた。一方、A. mangrovei (Accession No. KT716337)はA. mangrovei Sk02 (JF260953)と100％、A. mangrovei BT3 (OP175985)と98.17％、Aurantiochytrium sp. MBT02A (MH595608)と98％の近縁種であった（図3）。系統学的解析の結果、93.43%から100%までスラス トキジラミ属の分類学的位置が確認された。全長18S配列の同一性が92%未満の2株は別属に分類される可能性があるが、92%から97%の同一性は近縁種であり、97%以上の同一性は種レベルの同定を検証した（Dellero et al.） 種レベルでの同定を確立するためには、全ゲノム配列に基づく明確な分類学的特徴の再定義について、thraustochytrids分類学のさらなる研究が必要である。

図3
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図3 18S rDNAを用いたスラストカイガラムシ分離株（TSKK5とTSKK7）の最尤法系統樹解析、アウトグループとしてCrypthecodinium cohnii属を用いた。

ストレス耐性
Thraustochytrium sp.とA. mangroveiは、塩分、温度、pHを様々なレベルにして生育試験を行った（表1；補足表1）。両種ともpH 5.5と8.5ではまずまずの生育を示し、pH 6と8では中程度の生育、pH 6.5～7.5では良好な生育を示した。両種ともpH5.5と9の範囲では正の成長を示したが、pH3～5と9.5～12では負の成長が観察された。本研究では、以前の報告（Jaseera et al., 2018, Kalidasan et al., 2021b）と同様に、中性pHがスラストキトリウム類の生育に理想的であることが確認された（表1）。Thraustochytridsはアルカリ性pH環境でも生育し、高いバイオマスを生産することが報告されており、pHの低下は生育とバイオマス生産に深刻な影響を及ぼす（Taoka et al.、2009）。

表1
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表1 最適な培養条件とアスタキサンチン生産のための物理的パラメーターの許容範囲のスクリーニング。

温度はスラストキトリウムの成長に影響を与えた。Thraustochytrium sp.とA. mangroveiは10℃から35℃で生育を示し、最適温度範囲は25-30℃であった。Thraustochytrium sp.は5℃と10℃では増殖せず、A. mangroveiは10℃と15℃で中程度の増殖を示した。両菌株とも5℃、40℃、45℃、50℃では増殖しなかった（表1）。驚くべきことに、A. mangroveiの培養液の色は15℃と20℃で変化し、色素産生が明らかになった。温度もまた、スラストキトリウムのバイオマスやDHAの生産に重要な役割を果たしている。高温は高いバイオマス生産に関連し（Leanoら、2003）、一方低温は高いDHA生産に関連する（Caamanoら、2017）。本研究では35℃までの最高温度耐性を記録したが、これは以前の研究者（Jaseera et al.） しかし、Thraustochytridsは、菌株が分離された生息地の温度に合わせて、培養条件では10～35℃の温度範囲で生育・生存することが知られている（Kalidasanら、2021b）。

Thraustochytridsは25～35 g L-1の塩分濃度でよく生育した。A. mangroveiは15～20および40～45 g L-1で中程度に、10～15および50～60 g L-1でかなり、0および65～100 g L-1でマイナスに生育した。一方、Thraustochytrium sp.は、20、40～50 g L-1で中程度に生育し、5～15と60～70 g L-1でかなり生育し、0と75～100 g L-1でマイナスに生育した。Thraustochytridsは幅広い塩分濃度（0～100 g L-1）で生育することが知られているが、20～30 g L-1で最もよく生育し、塩分濃度は脂質蓄積に重要な役割を果たす（Kalidasanら、2021b）。興味深いことに、Thraustochytrid 菌株は低塩濃度でも生育することが記録されているが、バイオマス量と脂質収量はともに有意に減少しており、Thraustochytrium（Kalidasanら、2021b）、Aurantiochytrium（Jaseeraら、2018）、およびSchizochytrium（KamlangdeeとFan、2003）に関する先行研究を裏付けている。一般に、河口域やマングローブ生息地から分離された微生物は、本来の生息地では塩分濃度が変動するため塩分耐性を示し（Kalidasan et al.

バイオマス生産
Thraustochytridsは、塩分濃度28 g L-1、pH7.2、温度28℃、グルコース12 g L-1、ペプトン3 g L-1、グルタミン酸ナトリウム1.25 g L-1、酵母2.5 g L-1、チアミン1 g L-1の最適条件で、150×gの攪拌下で4日間培養した。A. mangroveiが生産したバイオマスの最大量は6.25 g L-1であり、Thraustochytrium sp.が生産したバイオマスの最大量は4.72 g L-1であった（図4A）。これらの結果はRussoら（2021）の結果と一致しており、A. mangrovei株RCC893は28℃で最も高い増殖を示した。スラウストキトリウムは、栄養塩（0.8～48 g L-1）、温度（25～28℃）、pH（4～9）、培養時間（4～12日）などの培養条件に加えて、バイオマス生産、脂質およびDHA蓄積のために炭素源および窒素源を必要とすることが報告されている（Changら、2014；Sahinら、2018）（Yaguchiら、1997；Jaseeraら、2018）。

図4
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図4 (A)ピチャバラムスラウストキトリウム分離株のバイオマス、(B)総脂質、主要オメガ3脂肪酸生産量。

バイオマス生産量はト ラウストキトリウムの種によって異なる。一般に、Schizochytrium は Thraustochytrium よりもバイオマス生産量が高いと報告されている。例えば、Schizochytrium aggregatumは0.9 g L-1のバイオマスを生産するが（Vazhappilly and Chen, 1998）、Aurantiochytrium sp.は10日間の成長で7～11 g L-1を生産する（Jaseera et al.） 炭素は、バイオマス、脂質、脂肪酸の生産に重要な調節成分である（Mariam et al.） 本研究では、先行研究者（Abad and Turon, 2015）に基づき、グルコースを炭素源として選択した。窒素もまた、スラストキトリウムの成長、発育、脂質およびDHA産生にとって重要な栄養源である（Marchanら、2018；Pawarら、2021）。本研究では、先の報告（Heggeset et al., 2019）に基づき、バイオマスおよび総脂肪酸産生を高めるために、適切な窒素源として酵母エキスとペプトンを用いた。

A. limacinum SR21は、給餌バッチ培養下で3.4±0.4 g L-1のバイオマスを生産することが記録されているが、最適化された培養条件下では、同じ株が7日間の培養後に14.3±0.5 g L-1の乾燥重量という高いバイオマスを生産することが判明している（Aini et al.、2022）。したがって、培養条件と栄養源を最適化することで、ス ラウストキトリウムのバイオマスは最大となる。

脂質と脂肪酸のプロファイル
Thraustochytridsの脂肪酸プロファイルをGC-MSを用いて分析し、NIST Version-Year 2005 MS Libraryを用いてピークの同定と定量を行った（表2；補足図1、2）。総脂質（TL）はThraustochytrium sp.で42.36％、A. mangroveiで49.81％であった。主要なオメガ3系PUFAの割合は種によって異なっていた。例えば、エイコサペンダエン酸（EPA C20:5）はThraustochytrium sp.で7.92%、A. mangroveiで5.08%、ドコサペンタエン酸（DPA C22:5）はThraustochytrium sp.で3.16%、A. mangroveiで5.89%であった（図4B）。ドコサヘキサエン酸（DHA C22:6）はThraustochytrium sp.で32.69%、A. mangroveiで44.71%であった（表2）。A. mangroveiではパルミチン酸（16:0）が最も多く、全脂肪酸の28.23％を占めたが、Thraustochytrium sp.では31.76％であった。一般に、両種ともパルミチン酸とDHAの含量が高いことが記録された。両種とも脂肪酸のプロフィールは類似しており、主に14:0、16:0、20:5、22:5、22:6で構成され、全脂肪酸の最大割合を占めた。

表2
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表2 Thraustochytrium sp.およびAurantiochytrium mangroveiの脂肪酸組成（全脂肪酸に対する割合）。

一般に、脂質とDHAの生産量は、微生物株、培養条件、培地に使用する栄養素によって異なる。Thraustochytridsの脂肪酸組成は、炭素源や窒素源によって変化することが知られている (Laddha et al., 2021)。Thraustochytrid の G13 株では、炭素と窒素を多く含むと脂質と DHA の蓄積が増加すると報告されている (Bowles et al., 1999)。A. mangroveiのインド株は、総脂肪酸の22～60%という高いDHAを蓄積している(Jaseera et al., 2018)。トラウストキトリウムはPUFAに富むバイオマスや油の供給源として注目されており（Raghukumar, 2008）、それゆえ魚類の幼生用の生餌にPUFAを濃縮するために使用されている（Sprague et al.） さらに、スラストキトリウムが産生する有毒化学物質や病気に関する報告はない（Kalidasanら、2015b）。DHAとEPAは、神経発達の促進（Ratledge, 2004）、高血圧の低下（Boyer-Diazら, 2020）、抗心血管（Liaoら, 2022）、抗がん作用（Kalidasanら, 2022）において有用価値がある。現在、DHAの主な供給源は魚と魚油である。しかし、魚油のDHA含有量は低く、魚油からDHAを大量生産することは困難である（Kalidasan et al.） 魚資源の乱獲と地球温暖化は魚の個体数を減少させ、DHAの需要と供給のフロー・チェーンに混乱を引き起こすことが知られている（Liangら、2022）。これに関連して、魚油よりも多くのDHAとEPAを含むことから、魚油の代替品としてスラストキトリウムが最大の可能性を秘めている（Songら、2015年）。Thraustochytridsのバイオマスには10～50%の総油分があり、そのうち30～70%はDHAである（Ward and Sing, 2005）。Thraustochytridsの脂肪酸プロファイルは安定しており、再生可能で、安全性が高く、これらの要因から、製薬および栄養補助食品産業における幅広い商業的応用が可能なDHAの生産源として適している（Paliwalら、2019；Mariamら、2021）。本研究では、Thraustochytrium sp.は32.69%、A. mangroveiは44.71%のDHAを蓄積することがわかった（図4）。オメガ3系PUFAに対する市場の需要は高まっており、2019年には43億米ドルとなった（Aasen et al.） PUFAの商業的生産のために、スラストキトリウムの培養成長条件を最適化するための広範な研究が必要である。

アスタキサンチンの生産
カロテノイドは商業的に重要な脂溶性の天然食品着色料であり、胚発育、視覚機能、細胞シグナル伝達、抗酸化活性などの健康上の利点がある（Stahl and Sies, 2005; Leyton et al.） Thraustochytridsは様々な色素を生産することができるが、主にアスタキサンチンとβ-カロテンである。これはカロテノイド色素の同時合成とオメガ3脂肪酸の酸化によるものである。カロテノイドの量と組成は、その種と成長培地の温度と組成に依存する。光合成生物におけるカロテノイドの役割はよく知られているが、スラストキトリウムのような非光合成生物におけるその機能は不明である。極端に変動する物理化学的条件下では、カロテノイドの抗酸化能が微生物細胞を環境ストレスから保護するのに寄与している可能性がある。ピチャヴァラムのマングローブ林から分離されたスラストキトリウムは、20℃で4～5日間培養すると、培地が淡いオレンジ色やオレンジ色に変化し、カロテノイドを蓄積することが記録された（図5）。低温とLED光照射も、Schizochytrium sp.のカロテノイド生産にプラスの影響を与えることが報告されている（Park et al.） 30℃の培養フラスコでは、アスタキサンチン生産に負の影響が見られ、温度がアスタキサンチン生産に重要な役割を果たしていることが確認された（Pawar et al.） Aurantiochytrium sp.の変異株ではカロテノイド生産が高い（Watanabe et al.） スラストキトリウムにおけるアスタキサンチン生産は、主に光供給、酸素レベル、栄養組成、および様々なストレス因子の影響を受ける（Park et al.） 本研究では3.2 µg L-1のアスタキサンチン生産を記録したが、A. mangroveiではβ-カロテンは検出できないレベルであった（補足図3）。これはカロテノイド経路におけるβ-カロテンからアスタキサンチンへの変換効率、ならびに遺伝的および培養に関連する要因に起因すると考えられる（Kumari et al.）

図5
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図5 20℃におけるA mangrovei (TSKK7)のアスタキサンチン生産 (A) 初期24時間後、(B) 72時間後、(C) 120時間後。

抗菌活性
スラストキトリウムは、他の腐生性微生物とともにマングローブの葉裏に存在する（Kalidasan et al.） 生存と増殖のために他の微生物と競争するために、スラストキトリウムは抗菌物質を産生する必要がある（Kalidasan et al.、2015a）。しかし、スラウストキトリウムの抗菌活性に関する報告はわずかである（Vu et al.） マングローブ由来のスラウストキトリウムのn-ブトノール抽出物は、黄色ブドウ球菌に対する阻害域（21.66±1.52 mm）で最も高い抗菌活性を示したと報告されている（Kalidasan et al.） Thraustochytrium striatumの細胞外高分子物質は、グラム陽性およびグラム陰性細菌種に対して抗菌活性を有することが見出され、緑膿菌に対する阻害域が最大（30 mm）であった（Xiao et al.） この阻害活性は、スラウストキトリウム由来の加水分解酵素による細菌細胞壁の破壊に起因する（Kathiresan et al.） thraustochytridsから抽出された脂肪酸とその誘導体は、抗菌作用（Vuら、2022）、抗酸化作用（Kalidasanら、2015b）、抗ウイルス作用（Ramos-Vegaら、2018）、抗がん作用（Kalidasanら、2022）を有することが証明されている。

本研究では、n-ブタノール、クロロホルム、メタノール、石油エーテルで抽出したThraustochytrium sp.とA. mangroveiの凍結乾燥物は、7つの臨床病原体に対して幅広い抗菌活性スペクトルを示した。Thraustochytrium sp.による阻害域は、黄色ブドウ球菌に対して最も高く（17.33 ± 2.08 mm）（図 6A）、肺炎桿菌に対しては最も低かった（4.61 ± 0.57 mm）。同様に、A. mangrovei抽出物による阻害域は、S. typhiに対して最大（14.75 ± 2.08 mm）（図6B）、B. subtilisに対して最小（5.78 ± 2.00 mm）であった。陽性対照として、アンピシリンは黄色ブドウ球菌（22 ± 2.00 mm）に対して活性を示し、枯草菌（15 ± 1.52 mm）に対しては最小の活性を示した（表 3）。

図6
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図6 (A, B) マングローブ由来菌株Thraustochytrium sp.およびA. mangroveiの黄色ブドウ球菌およびS. typhiに対するインビトロ抗菌活性。

表3
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表3 ヒト臨床病原体に対するThraustochytrium sp.およびAurantiochytrium mangrovei抽出物の抗菌活性。

石油エーテル抽出物は、黄色ブドウ球菌に対して最大の抗菌活性（17.33 ± 2.08 mm）を示した（表3）。この活性は、スラストキトリウムに含まれるPUFAに起因すると考えられる（Kalidasan et al.） 脂肪酸、特にDHAとEPAには、黄色ブドウ球菌、枯草菌、緑膿菌の病原微生物に対する殺菌活性がある（Shin et al., 2007; Desbois and Lawlor, 2013）。したがって、スラストキトリウムは、活性リード分子の精製と特性解析を行った後、臨床病原体を制御するための抗菌剤の有望な供給源として考慮されるべきである。

Thraustochytrium属の石油エーテル抽出物は、大腸菌、P. mirabilis、S. typhi、V. cholera、B. subtilisなどのヒト臨床細菌株に対して100 μg mL-1のMICを示し、K. pneumoniaに対しては60 μg mL-1、S. aureusに対しては40 μg mL-1であった。A. mangroveiのn-ブタノール抽出物のMICは、大腸菌、肺炎桿菌、P. mirabilis、黄色ブドウ球菌、コレラ菌に対しては100 μg mL-1であったが、枯草菌に対しては80 μg mL-1、S. typhiに対しては60 μg mL-1であった（表4）。これは、Schizochytrium limacinumの粗抽出物において、E. faecalis、S. aureus、B. cereusに対するMIC値がそれぞれ128、256、32 μg mL-1であったことを報告したVuら（2022）の先行研究と一致している。しかし、T. striatumの細胞外高分子物質は緑膿菌に対して10 mg mL-1までのMICを示さない（Xiao et al.）

表4
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表4 臨床ヒト病原体に対するThraustochytrium sp.およびAurantiochytrium mangrovei抽出物の最小阻害濃度（MIC）。

抗酸化活性
総抗酸化活性は、標準的なL-アスコルビン酸と比較して、Thraustochytrium sp.のメタノール抽出物で83.79±1.10％、A. mangroveiで80.92±2.10％であった（図7A）。メタノール抽出物の一酸化窒素ラジカル含量は、500 μg mL-1ではThraustochytrium sp.で75.22±2.09%、A. mangroveiで72.88±1.63%であったが、25 μg mL-1ではそれ以下であった（30.16±1.02%、31.04±1.70%）（図7B）。Thraustochytridsは、一酸化窒素との反応において酸素と直接競合することで、亜硝酸塩の開始を阻害した。メタノール画分の過酸化水素ラジカル消去活性は、Thraustochytrium sp.では80.28±1.75%、A. mangroveiでは79.24±1.58%と、高濃度の抽出液で最も高かった（図7C）。

図7
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図7 (A) 総抗酸化活性 (%) (B) 一酸化窒素ラジカル抑制率 (%) (C) 過酸化水素ラジカル抑制率 (%) (D) DPPHフリーラジカル消去率 (%) (E) 総フェノール (%) (F) 総還元力 (%) Thraustochytrium sp.およびA mangroveiの抽出物の濃度を変えた場合。

DPPHフリーラジカル消去活性は、A. mangroveiで88.24 ± 1.64%、Thraustochytrium sp.で86.74 ± 1.50%であった（図7D）。総フェノール含量は500 μg mL-1ではA. mangroveiで84.79±1.65％、Thraustochytrium sp.で83.45±1.37％であったが、25 μg mL-1ではThraustochytrium sp.で36.43±0.62％、A. mangroveiで37.11±1.76％と低かった（図7E）。総還元力活性は500μg mL-1ではThraustochytrium sp.で76.36±0.98%、A. mangroveiで75.16±1.32%であったが、25μg mL-1では活性が低かった（図7F）。

スラストキトリウムは天然の抗酸化物質の豊富な供給源である (Duan et al., 2006)。本研究でも、スラストキトリウム抽出物の濃度が高くなるにつれて抗酸化活性が上昇することが見出されたが、これはこれまでの報告（Kalidasanら、2015b；Yuら、2017）と一致している。Thraustochytrium striatumの細胞外高分子物質は、100μg mL-1で有望な総抗酸化能を有することが示されている（Xiaoら、2018）。Schizochytrium属の抽出物は、87.37±1.22%という最高の総抗酸化活性を有することが報告されている（Kalidasanら、2022）。抗酸化活性の予測には、化合物の還元能力が用いられる (Meir et al., 1995)。電子供与体およびフリーラジカルの不動態化能は、化合物の還元能に依存する(Singh and Rajini, 2004)。還元剤は、水素原子を供与することで脂質過酸化を抑制し、膜脂質の損傷を引き起こす連鎖反応を停止させる（Xing et al.、2005）。天然ポリフェノール化合物は、ポリフェノール濃度が高くなるほど増加する傾向にあるラジカルの消去を通じて、自然療法において重要な役割を果たす代謝産物群である。総フェノール含有量と抗酸化活性には強い関係がある (Kim et al., 2002)。フェノール類はSchizochytrium sp.の主要成分であり、抗酸化活性に寄与し、健康食品や化粧品への応用が期待されている（Yu et al., 2017）。

最も正確な抗酸化法はDPPHフリーラジカル消去アッセイである。本研究では、A. mangroveiで88.24±2.36%、Thraustochytrium sp.で86.74±1.29%の有意なDPPHラジカル消去活性を見出した。同様の観察は、Thraustochytrium sp.でも報告されており、最高の抗酸化活性は78.95%であった(Kalidasan et al., 2015b)。Aurantiochytrium sp.SC145のPUFA抽出物は、神経変性疾患の治療標的となりうるDPPH活性を有することが示されている（Hienら、2022）。Thraustochytrium kinneiから合成された銀および金のナノ粒子は、潜在的な抗酸化特性を有することが判明している（Kalidasanら、2021a）。

本研究と同様に、S. variabilisの酢酸エチル抽出物のフリーラジカル消去活性は、0.05から5.0 mg mL-1まで濃度が増加するにつれて43.67%から82.86%の活性が増加することが示されている(Dholakiya et al., 2017)。また、亜麻の種子を0.05％および0.1％の濃度で培養液に添加すると、Schizochytrium属のメタノール抽出物の抗酸化活性が7.2～11.7μmol TE g-1に増加することが知られている。このように、DHAのレベルを向上させた必須脂肪酸を含有させることで、スラストキトリウムの栄養価が向上し、抗酸化作用が強化される（Gaffney et al.） オメガ3脂肪酸は、抗菌作用、抗酸化作用、抗老化作用、抗がん作用など、いくつかの薬理学的活性を持つことが証明されている（Schmitz and Ecker, 2008; Huang and Ebersole, 2010; Guedes et al.） スラストキトリウムに豊富に含まれるオメガ3脂肪酸は、おそらく抗酸化活性とフリーラジカル消去活性に関与しており、今回の研究で高い抗酸化活性をもたらした。さらに、天然ポリフェノールは、ポリフェノール濃度が高くなるほどラジカル消去活性が高まるという、天然医学において重要な役割を果たす代謝産物の主要グループである（Kim et al.）

Thraustochytridsは高いフリーラジカル消去活性を示す(Kalidasan et al., 2015b)。トラウストキトリウムの抗酸化仲介機構は、いくつかのヒト疾患における酸化ストレス防御に関連しており、抗酸化特性として酵素活性の増加と過酸化脂質の減少に寄与している。食餌性抗酸化物質は、フリーラジカルを消去することにより、酸化連鎖反応の開始や伝播を防止したり遅延させたりすることができ、脂質の酸化を遅延させる。粗抽出物に含まれる成分の中には、相加効果や相乗効果で抗酸化性を高めるものもあれば、抗酸化性を中和したり阻害したりするものもある(Kulkarni, 1997)。本研究により、マングローブ由来のA. mangroveiとThraustochytrium sp.は、有機抗酸化物質の豊富な供給源であることが証明された。生物学的に活性な代謝物を得るためには、Thraustochytridsの粗抽出物をさらに精製する必要がある。

結論
マングローブの腐葉土からPUFAを豊富に含む海洋性スラストキトリウムを単離し、形態学的および分子学的特徴からThraustochytrium sp.およびAurantiochytrium mangroveiと同定した。さらに、Thraustochytridsのバイオマス、総脂質、PUFAの生産量を調べた。その結果、A. mangroveiは6.25 g L-1のバイオマスを生産し、総脂質の49.81%、DHAの44.71%を含有していた。アスタキサンチン色素はA. mangroveiでは3.2 µg L-1まで蓄積したが、Thraustochytrium sp.では検出されなかった。Thraustochytrium sp.およびA. mangroveiの粗抽出物について、抗菌性および抗酸化性を評価した。Thraustochytrium sp.の石油エーテル抽出物はS. aureusに対して40 μg mL-1のMICで有望な抗菌活性（17.33±2.08 mm）を示し、A. mangroveiは最高のフリーラジカル消去活性（87.37±1.22%）を示した。オメガ3脂肪酸、色素、抗菌・抗酸化作用のある生物活性化合物の生産に有用であることが示唆された。

補足資料 本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/xxx/fmars./S1、図S1からオンラインで入手できる。Aurantiochytrium mangrovei由来FAMEのGC-MS分析。Thraustochytrium属のFAMEのGC-MS分析。Aurantiochytrium mangroveiのアスタキサンチン色素のHPLCクロマトグラムおよび表S1. スラストキトリウム培養物の物理的パラメータ耐性のスクリーニング 24時間および96時間の成長データ（OD値）。

データの利用可能性
本研究で提示したデータセットは、オンラインリポジトリにある。リポジトリ名とアクセッション番号は以下の通り： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, KT716335.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, KT716337.1。

著者貢献
KalKは本研究の立案、実験、原稿作成、データ解析、原稿執筆-校閲-編集を行った。VV、SCは、研究の計画、作業の監督、原稿の確認、編集、承認を行った。PMは実験室実験を行い、データ解析を行った。NKは原稿の査読、編集、承認を行った。KatK、YTは、研究の計画、レビュー、原稿の編集に協力した。著者全員が論文に貢献し、提出された原稿を承認した。

資金提供
本研究は、チュラロンコン大学Second Century Fund (C2F) Postdoctoral Scholarship, NRCT-JSPS Core to Core Program, CREPSUM JPJSCCB20200009, Thailand Science Research and Innovation Fund Chulalongkorn University (CU_FRB65_dis (3)_091_23_21)) の助成を受けた、 タイ国家研究評議会およびチュラロンコン大学（N42A650257）、タイ科学研究・イノベーション基金チュラロンコン大学（DIS66230010）、ムバダラ石油（タイランド）リミテッド。ムバダラ・ペトロレム（タイランド）は、研究デザイン、収集分析、データの解釈、本論文の執筆、および論文投稿の決定には関与していない。

謝辞
セカンドセンチュリーファンド（C2F）のポスドク奨学金およびチュラロンコン大学（タイ）当局に感謝する。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない中で実施されたことを宣言する。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmars.2023.1126452/full#supplementary-material に掲載されている。

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キーワード：マングローブ、トラウストキトリウム、バイオマス、PUFA、アスタキサンチン、抗菌剤、抗酸化剤

引用 Kaliyamoorthy K, Chavanich S, Kandasamy K, Ponnuvel M, Kamlangdee N, Taoka Y and Viyakarn V (2023) PUFAとカロテノイドを産生するThraustochytridsとその抗菌・抗酸化活性。Front. Mar. 10:1126452。doi: 10.3389/fmars.2023.1126452

Received： 17 December 2022; Accepted： 17 March 2023；
発行：2023年5月10日

編集者

ソフィア・レツィウ（西アッティカ大学、ギリシャ
査読者

Esra Imamoglu, エゲ大学, トルコ
トンモイ・ゴーシュ、インドール工科大学（インド
Chetan Paliwal, Centrum Algatech, チェコ
Copyright © 2023 Kaliyamoorthy, Chavanich, Kandasamy, Ponnuvel, Kamlangdee, Taoka and Viyakarn. これは、クリエイティブ・コモンズ 表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*文責 Voranop Viyakarn, Voranop.V@chula.ac.th; Kalidasan Kaliyamoorthy, marinedasan87@gmail.com

免責事項：本記事で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。

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