SARS-CoV2 mRNAまたはベクターワクチン接種後の末梢血顆粒球および単球におけるPD-L1表面発現の増加

哉百名

2022年10月18日
SARS-CoV2 mRNAまたはベクターワクチン接種後の末梢血顆粒球および単球におけるPD-L1表面発現の増加
Lorin Loacker ORCIDロゴ , Janine Kimpel , Zoltán Bánki , Christoph Q. Schmidt , Andrea Griesmacher and Markus Anliker EMAILロゴ
Clinical Chemistry and Laboratory Medicine（CCLM）誌より
https://doi.org/10.1515/cclm-2022-0787
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キーワード：免疫チェックポイント、プログラムデスリーガンド1（PD-L1）、SARS-CoV-2、ワクチン接種
編集部へ

免疫反応は、免疫活性化経路と抑制経路の非常に複雑なネットワークの活性化を伴っている。免疫防御反応は自己寛容を維持する反応と共存しており、これらのプロセスのバランスは極めて重要である。このネットワークの制御には、免疫チェックポイントが重要な役割を担っている。抑制性免疫チェックポイント分子は、付随的な組織損傷を最小限に抑え、自己免疫疾患の予防に不可欠である[1]。重要な抑制性チェックポイント受容体の一つがプログラム細胞死タンパク質1（PD-1、CD279）であり、通常T細胞や成熟B細胞などの他の細胞に存在する[2]。PD-1のリガンドであるprogrammed death-ligand 1 (PD-L1) およびPD-L2は、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞上で恒常的に発現しており、単球や顆粒球の活性化後にPD-1のアップレギュレーションが観察されています[3, 4]。

SARSコロナウイルス2型（SARS-CoV-2）のパンデミックの発生以来、核酸ワクチンやベクターワクチンなど、いくつかの有効なワクチンが開発され、世界中で適用されています[5]。これらのワクチンは、被接種者の細胞内でウイルスタンパク質を合成させ、ウイルス感染を模倣させるものです。最近、mRNAワクチンとベクターワクチンを組み合わせたワクチン接種に関する研究が数多く行われています。

私たちは、ワクチンによる免疫系の活性化が、例えばPD-L1発現の増加など、測定可能な調節効果をも引き起こすかどうかに関心を持ちました。そこで、現在進行中の大規模なワクチン研究の一環として[6]、健康なワクチン接種患者とワクチン非接種対照群の末梢血単球および顆粒球におけるPD-L1発現を比較しました。並行して、インターフェロンガンマ（IFN-γ）放出アッセイを実施し、T細胞誘導を判定した。

SARS-CoV-2ワクチン接種後の健康なボランティアからの62検体が分析された。このグループ内の白血球PD-L1発現のばらつきが非常に小さかったため、免疫を受けていない健康なプロバンドからなるコントロールグループは12名のみであった。参加に先立ち、書面によるインフォームドコンセントとインスブルック医科大学の倫理委員会の承認が得られた。AZD1222（AZ, Astra Zeneca）とBNT162b2（BNT, BioNTech-Pfizer）のワクチンを含む3種類の混合ワクチンが投与されました。ワクチン接種を受けた各個人から、2回目のワクチン接種後2日目に試料を採取した。PD-L1表面発現は、最近記載されたようにフローサイトメトリーによって決定された[7]。回目のワクチン接種の10日後に、SARS-CoV-2特異的抗体およびT細胞反応を、以前に記載されたように測定した[6]。血球からのSARS-CoV-2特異的インターフェロン-γ放出は、製造者の説明書に従ってQuantiFERON（QFN）SARS-CoV-2 RUO IGRA（Qiagen）により測定された。手短に言えば、スパイク抗原（S1 S2 RDB）からの特異的CD4（Ag1）およびCD4＋CD8（Ag2）SARS-CoV-2ペプチドプールでコーティングしたQFNチューブ上に試料をロードした。陰性および陽性対照（Mitogen）を含むQFNチューブは、対照として機能した。37℃で24時間インキュベートした後、上清を採取し、使用するまで-80℃で保存した。インターフェロン-γの放出は、製造者の説明書に従ってQFNヒトIFN-γELISAキット（Qiagen）により測定し、刺激指数（刺激対非刺激IFN-γ濃度の商）を算出した。

その結果、ワクチン接種を受けた人の末梢血顆粒球と単球の両方で、ワクチン接種を受けていない健康な人の対照群（デルタMFI中央値0.65と0.51）と比較して、PD-L1発現が統計的に有意（p<0.01）に増加した（図1；デルタ平均蛍光強度［MFI］中央値がそれぞれ1.71と2.26）ことが実証された。異なるワクチンの組み合わせを用いても、結果には影響がなかった（補足図1）。PD-L1発現とマイトジェン誘発T細胞IFN-γ放出との間には中程度の逆相関が認められたが（図2）、PD-L1表面発現とSARS-CoV-2抗体レベルやSARS-CoV-2特異的T細胞反応との間には直接的相関は認められなかった（補足図2、図3）。

図1:
健常対照者（左箱ひげ図、n=12）とSARS-CoV-2ワクチン接種者（右箱ひげ図、n=62）の顆粒球（Gran）および単球（Mono）上のPD-L1 delta-MFI表面発現量。MFIは、抗ヒトPD-L1 Abまたはアイソタイプコントロールを用いたフローサイトメトリーによって決定された。PD-L1シグナルとアイソタイプコントロールシグナルのMFIの差を計算し、プロットした。横線は中央値およびIQRを示す。陽性対照として、AB0不適合赤血球で刺激した後の末梢血サンプルを使用した（デルタMFI Gran 0.69、デルタMFI Mono 2.22）。刺激はqPCRによりPD-L1 mRNAの発現上昇として確認された。統計解析にはMedCalc 19.6.1ソフトウェアを用いてMann-Whitney U testを行った。ワクチン接種者の顆粒球および単球のDelta-MFIは、健常対照者と有意に異なっていた（p<0.01）。
図1:
健常者（左箱ひげ図、n=12）およびSARS-CoV-2ワクチン接種者（右箱ひげ図、n=62）の顆粒球（Gran）および単球（Mono）上のPD-L1 delta-MFI表面発現を示す。MFIは、抗ヒトPD-L1 Abまたはアイソタイプコントロールを用いたフローサイトメトリーによって決定された。PD-L1シグナルとアイソタイプコントロールシグナルのMFIの差を計算し、プロットした。横線は中央値およびIQRを示す。陽性対照として、AB0不適合赤血球で刺激した後の末梢血サンプルを使用した（デルタMFI Gran 0.69、デルタMFI Mono 2.22）。刺激はqPCRによりPD-L1 mRNAの発現上昇として確認された。統計解析にはMedCalc 19.6.1ソフトウェアを用いてMann-Whitney U testを行った。ワクチン接種者の顆粒球および単球のDelta-MFIは、健常対照者と有意に異なっていた（p<0.01）。

図2:
SARS-CoV2ワクチン接種者全員（n=57）の（A）顆粒球および（B）単球における刺激指数で表される分裂促進インターフェロン（IFN）-γとPD-L1 delta-MFI表面発現の回帰/相関分析。相関係数は、Spearman rank法を用いて算出した。図間で被験者の数が若干異なっているのは、特定の被験者について分離した結果が得られなかったためである。
図2:
SARS-CoV2ワクチン接種者全員（n＝57）の（A）顆粒球および（B）単球における刺激指数で表される分裂促進インターフェロン（IFN）-γとPD-L1 delta-MFI表面発現との間の回帰／相関分析。相関係数は、Spearman rank法を用いて算出した。各図で被験者数が若干異なっているのは、特定の被験者について分離した結果が得られなかったためである。

本研究は、ワクチン接種者の末梢血顆粒球および単球のPD-L1発現が、ワクチン非接種者に見られる発現よりも有意に高いことを示している。さらに、PD-L1発現は、IFN-γ放出アッセイにおけるマイトジェン誘発T細胞刺激性と逆相関している。興味深いことに、インターフェロン-γ放出アッセイにおけるSARS-CoV-2特異的S-抗原による刺激性は、顆粒球および単球上のPD-L1表面発現と関連しなかった。この説明として考えられるのは、タンパク質やマイトジェンによるT細胞刺激は、異なる経路で起こるということかもしれない。抗原は特異的な結合受容体を介してのみB/T細胞を活性化することができるが（真の免疫反応）、マイトジェンは非特異的な刺激を引き起こす。ワクチン接種のような急性期において、抗原特異的反応はPD-L1の減衰効果の影響を受けにくく、エスカレートする傾向のある非特異的反応は抑制に敏感であるということは、生物学的に意味があると思われる。

免疫後のPD-L1発現の意義は現在のところ不明である。PD-L1の発現増加は、単に生理的な免疫調節を反映しているのかもしれないが、一方で、ワクチン接種の結果や副作用の発生率や種類に影響を与える可能性もある。実際、最近発表された症例報告では、ワクチン接種後のPD-L1の上昇とワクチン接種の副作用のいくつかに相関があることが示唆されており［8］、この知見はさらなる調査に値すると考えられています。自己免疫の付随的な損傷を避けるために、活性化した免疫系を制御する必要があるため、ワクチンに関連した強い活性化の後にPD-L1がアップレギュレートされることはもっともらしく思われる。このことは、PD-L1の高発現がワクチン接種の成功に影響を与えるかどうかという疑問を生じさせる。ワクチン接種には、一定期間持続する非特異的な免疫抑制効果があるのかもしれない（これはまだ解明されていない）。もしそうであれば、ワクチン接種間隔の調整やチェックポイントシステムの調節により、ワクチン接種反応を改善できる可能性があるかどうかを検討することは価値があると思われる。このことは，現在推奨されているSARS-CoV-2ブースターワクチン接種の接種間隔の短さに関して，特に重要であると思われる．

今回の研究では、PD-L1に焦点をあてて検討した。将来的には、抗腫瘍免疫反応に重要な役割を果たすことが示されている細胞傷害性Tリンパ球抗原-4（CTLA-4）など、他の免疫チェックポイント分子もワクチン接種研究に含める必要がある[9]。

さらに、入手可能なデータでは、PD-L1の過剰発現が一般的な好中球の活性化の兆候であるのか、それとも特定の受容体のアップレギュレーションの結果であるのかを区別することはできない。これを調べるには、エラスターゼのような顆粒球活性化マーカーを今後の研究に含める必要があります。

私たちの知る限り、これらはPD-L1表面発現とワクチン接種の関連で現在までに得られた最初の結果です。以上より、PD-L1などの免疫チェックポイントは、免疫系の重要な制御因子として、今後のワクチン接種研究において、接種成績や副作用への影響をさらに解明するために考慮されるべきであると考える。

対応する著者 Markus Anliker, 大学病院医学・化学検査診断中央研究所, Anichstr. 35, 6020 Innsbruck, Austria, E-mail: markus.anliker@tirol-kliniken.at
謝辞
Inge von Zabern博士には，本テーマについて有益な議論と原稿の校正をしていただいた。

研究資金。研究資金：なし。

著者の貢献 著者：本原稿の内容については、全著者が責任を負い、投稿を承認しています。

利益相反 著者らは、利益相反はないと表明している。

インフォームドコンセント この研究に参加したすべての人からインフォームドコンセントを得た。

倫理的承認 本研究は、施設倫理委員会の承認を得て実施した。

参考文献

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補足資料
本論文のオンライン版では、補足資料（https://doi.org/10.1515/cclm-2022-0787）を提供しています。

Received: 2022-08-10
受理済み：2022-09-22
オンライン公開：2022-10-18
印刷物での発行：2023-01-27
© 2022 Walter de Gruyter GmbH, Berlin/Boston

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