免疫抑制された炎症性腸疾患患者におけるCOVID-19ワクチン誘発抗体反応の低下と腸内細菌叢およびメタボロームが関連する

2023年1月11日 13:38

論文|第88巻104430号2023年2月1日発行
免疫抑制された炎症性腸疾患患者におけるCOVID-19ワクチン誘発抗体反応の低下と腸内細菌叢およびメタボロームが関連する
ジェームズ・L・アレキサンダー
ベンジャミン・H・マリシュ
ネイサン・P・ダンカート
劉志剛
マートン L. オルベー
アーミル・サイフディン
他
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脚注を表示するオープンアクセス公開日:2023年1月10日DOI:https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.104430

論文概要
背景
抗TNF療法を受けた炎症性腸疾患（IBD）患者は、SARS-CoV-2ワクチン接種に対する体液性免疫応答が減弱することが知られている。IBDでは腸内細菌叢とその機能的代謝産物が障害され、宿主の免疫反応の形成に重要な役割を果たすと考えられている。我々は、腸内細菌叢とメタボロームが、免疫抑制されたIBD患者における抗SARS-CoV-2ワクチン接種応答のばらつきを説明できるかどうかを調べた。
研究方法
CLARITY-IBD試験でインフリキシマブ治療を受けたIBD患者の糞便および血清サンプルを前向きに採取し、SARS-CoV-2のワクチン接種を行った。抗体反応は、ChAdOx1 nCoV-19またはBNT162b2ワクチンを2回接種した後に測定された。患者は、CLARITY-IBDの幅広いコホートの幾何平均を上回る、または下回る反応を示したものとして分類された。糞便サンプルについて、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンス、核磁気共鳴（NMR）分光法、超高速液体クロマトグラフィー質量分析（UHPLC-MS）による胆汁酸プロファイリングを実施しました。単変量解析、多変量解析、相関解析を行い、ワクチン接種に対する反応に関する腸内細菌およびメタボローム予測因子を明らかにした。
所見
インフリキシマブ治療を受けたIBD患者43名（クローン病30名、潰瘍性大腸炎12名、分類不能IBD1名、チオプリン治療併用26名）を募集した。8人の患者がSARS-CoV-2感染の既往を有していた。17人（39.5%）の患者の血清反応は幾何平均値以下であった。腸内細菌叢の多様性は、平均以下の反応者では低かった（p = 0.037）。ビロフィラの多さは血清学的反応の良さと関連し、ストレプトコッカスは反応の悪さと関連した。糞便中のメタボロームには、平均値以上の人とそれ以下の人の間で違いが見られた（OPLS-DA R2X 0.25, R2Y 0.26, Q2 0.15; CV-ANOVA p = 0.038）。トリメチルアミン、イソ酪酸、オメガムリコール酸は良好な反応と関連し、コハク酸、フェニルアラニン、タウロリトコール酸、タウロデオキシコール酸は反応不良と関連していた。
解釈
我々のデータは、免疫不全患者におけるSARS-CoV-2ワクチン接種に対する腸内細菌叢と血清反応の変動との間に関連性があることを示唆している。トリメチルアミンを含む微生物代謝産物は、抗TNFによる免疫反応の減弱を緩和する上で重要である可能性がある。
資金提供
JLAは、インペリアル・カレッジ・ロンドンとThe Joyce and Norman Freed Charitable Trustから資金提供を受けたNIHR Academic Clinical Lectureship（CL-2019-21-502）の受領者である。BHMはNIHR Academic Clinical Lectureship (CL-2019-21-002)の受給者である。インペリアル・カレッジ・ロンドンの消化器疾患部門は、インペリアル・カレッジ・ヘルスケアNHSトラストおよびインペリアル・カレッジ・ロンドンに拠点を置くNIHR Imperial Biomedical Research Centre（BRC）から資金およびインフラの支援を受けている。メタボロミクス研究はインペリアル・カレッジ・ロンドンのMRC-NIHR National Phenome Centreで行われた。この研究は、Medical Research Council（MRC）、National Institute of Health Research（NIHR）（助成番号 MC_PC_12025）、インフラ支援はNIHR Imperial Biomedical Research Centre（BRC）により支援されていた。NIHR Exeter Clinical Research Facilityは、Exeter大学医学部医学科とRoyal Devon and Exeter NHS Foundation Trustのパートナーシップによるものです。このプロジェクトは、National Institute for Health Research (NIHR) Exeter Clinical Research Facilityの支援を受けています。記載された見解は著者のものであり、必ずしもNIHRや英国保健社会福祉省のものではありません。
キーワード
腸内細菌叢
メタボローム
SARS-CoV-2
炎症性腸疾患
抗TNF療法
インフリキシマブ
ワクチン
ChAdOx1 nCoV-19
BNT162b2
COVID-19
研究の背景
はじめに
SARS-CoV-2に対するワクチン接種は、COVID-19による感染、入院、死亡を抑えるための有効な戦略である1,2。しかし、SARS-CoV-2ワクチンの免疫原性は、一部の免疫抑制グループにおいて低下している。抗TNF療法を受けた炎症性腸疾患（IBD）患者は、SARS-CoV-2ワクチン接種に対する血清反応が減弱しており、これは突破感染のリスク上昇と関連しています3, 4, 5, 6 しかし、抗TNF患者においてさえ、ワクチン誘発抗体反応は非常に不均一なのです。このような変動は、年齢、ワクチンの種類、免疫調節剤の併用など、ワクチン反応の既知の修飾因子では説明できないことから3、他の未定義の因子がワクチンの免疫原性に影響を及ぼすことが示唆されます。
腸内細菌叢は、宿主の免疫反応の形成に重要であり、細菌叢の機能はワクチン接種に対する反応の調節因子となる可能性が提案されています。乳幼児では、糞便中の微生物叢の構成が経口ロタウイルスワクチンに対する反応と関連しています7,8。成人では、インフルエンザワクチン接種前に広域抗生物質による介入を行い、H1N1特異的中和抗体価、IgG1およびIgA結合抗体価の低下が観察されています9。抗体価の低下は、細菌およびメタボローム表現型、特に血清二次胆汁酸の1000倍低下と相関していた。インフルエンザワクチンに対する抗体反応は、抗生物質処理した無菌マウスやTlr5-/-マウスでは、同腹のコントロールと比較して低下していた。10 このような効果は、不活化ポリオウイルスでも見られたが、B型肝炎や黄熱病に対する他のワクチンでは見られなかった10。SARS-CoV-2ワクチン接種者の最近の研究では、腸内細菌叢の組成および短鎖脂肪酸（SCFA）レベルと、免疫抑制されていない健康なボランティアにおける中和抗体応答との関連が示されています12,13。
炎症性腸疾患は、腸内細菌叢の組成および機能の擾乱と関連しています14,15。腸内細菌叢の組成は、IBDにおける免疫抑制療法の治療反応とも関連しており16、腸内細菌の代謝産物は抗TNF療法への反応を予測することができます17,18。IBD、腸内細菌叢、免疫抑制療法の三者間相互作用を考慮し、我々は、腸内細菌叢の組成と機能が、免疫抑制下のIBD患者のSARS-CoV-2ワクチン接種に対する免疫反応に影響するという仮説を検証するために、前向き観察研究を実施しました。
研究方法
患者募集とサンプリング
12週間以上のインフリキシマブ治療が確立されたIBD患者を2つのセンター（Imperial College Healthcare NHS TrustおよびLondon North West University Healthcare NHS Trust）で募集した。参加者はすべてCLARITY-IBD試験(https://www.clarityibd.org/)に参加しており、18歳以上でSARS-CoV-2のワクチン接種を受けている者であった。参加者は、募集から6週間以内に抗生物質を投与された場合、スクリーニング時に除外された。すべての被験者は、文書によるインフォームドコンセントを提供した。
糞便および血液サンプルは、患者がインフリキシマブを投与されるために病院の輸液部門に出席したとき、または抗SARS-CoV-2ワクチンの初回接種を受けるために病院のワクチンセンターに出席した日に、患者から採取された。糞便サンプルの大部分は、ワクチンの初回投与直前に採取され、81%の糞便サンプルは初回投与から4週間以内に採取された。血液サンプルは、CLARITY-IBD試験プロトコル（https://www.clarityibd.org）に従って、8週間間隔で採取された。
全便は糞便収集器（FECOTAINER®, AT Medical BV, The Netherlands）で収集された。新鮮な糞便サンプルは、採取後6時間以内に実験室に移送し、ホモジナイズして分注し、分析まで-80℃で保存した。実験スキーマをFig.1aに示す。
図サムネイルgr1
図1（a）研究の実験スキーマ；（b）ChAdOx1 nCoV-19（黒い点）またはBNT162b2（ピンクの四角）を受けた患者における抗SARS-CoV-2スパイクRBD抗体濃度。各ポイントは、抗体濃度を測定した2回目のワクチン投与から日数をプロットした1人の患者を表す。
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抗SARS-CoV2血清学的検査
抗SARS-CoV-2血清学実験室分析は、Royal Devon and Exeter NHS Foundation Trustの血液科学学術部門で実施された。このダブルサンドイッチ電気化学発光免疫測定法は、SARS-CoV-2に対する抗体測定のための抗原として、スパイクタンパク質上の受容体結合ドメイン（RBD）のリコンビナントタンパク質を使用している。サンプルの電気化学発光シグナルは内部検量線と比較され、定量値は単位（U）/mLで報告されます。社内での検証実験については、以前に記述しています3。
すべての参加者は、Roche Elecsys anti-SARS-CoV-2 (N) immunoassayを使用して、SARS-CoV-2感染の既往を検査された。0.12U/ml以上の濃度を閾値とし、それ以下では参加者に感染の証拠がないと判断された。ワクチン接種前のいずれかの時期に、SARS-CoV-2感染を確認するPCR検査を受けたと報告した参加者は、抗体検査の結果に関係なく、過去の感染の証拠があるとみなされた。
この研究のすべての参加者は、ワクチン接種の時期にかかわらず、8週間間隔で血清学的分析を受けた。したがって、参加者の血清学的結果は、様々な時点で入手可能であった。CLARITY-IBD試験では、SARS-CoV-2感染歴の有無にかかわらず、インフリキシマブ治療を受けた患者のローリング幾何平均データを作成した。これらのデータは、幾何平均抗体濃度が感染歴のある患者で高く、抗体濃度は時間の経過とともに減少することを示しています。解析を標準化し、先行感染の影響と2回目のワクチン投与から血清分析までの時間のばらつきを考慮し、2回目のワクチン投与後（ただし2回目のワクチン投与から14日以内）の最初の測定時点における抗S RBD抗体濃度を測定した。この濃度は、インフリキシマブ治療を受けたCLARITY-IBDコホートで測定された関連時点の幾何平均と比較されました（ワクチンの種類、事前の自然感染の有無に特有のもの）。参加者は、血清学的反応がワクチン型、感染症特異的幾何平均値以上または以下であるものとして分類されました。
16S rRNA遺伝子配列の決定
DNAは、DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用い、Bullet Blender Stormビーズビーター（Chemio, St Albans, UK）でサンプルを均質化するという修正を加えたメーカーの指示に従い粗糞サンプルから抽出された。DNAはQubit Fluorometer (ThermoFischer, UK)を用いて定量し、下流で使用できるようになるまで-80℃で保存した。サンプルライブラリーは、イルミナの16Sメタゲノムシーケンスライブラリー調製プロトコル20に従い、特別に設計したV1/V2超可変領域プライマーを用いて調製した21。プールしたサンプルライブラリーのシーケンスには、イルミナ MiSeqプラットフォーム（イルミナ社、サフランウォルデン、英国）とMiSeq Reagent Kit v3（イルミナ）を用いてペアエンド 300-bp 化学反応を使用した。配列データの処理は、SILVA細菌データベースVersion 138.1 (https://www.arb-silva.de/ (accessed on 08/10/2021)) を用いて、以前に説明したようにDADA2パイプライン (v1.18) を介して行われた22。ASVデータセットは、10%の閾値でトリミングされました（つまり、サンプルの10%未満に存在するASVは含まれません）。
1H NMRを用いたメタボロームプロファイリング
各糞サンプル600 mgを1200 μlの水と混合し、5分間ボルテックスした後、20,000 gで10分間、4℃でスピンさせた。540 μlの上清を集め、1.5 M KH2PO4, 1 mM NaN3 および1‰ TSPを含む60 μlのリン酸塩緩衝液と混合した。570 μlの混合物を5 mm NMRチューブに移し、分析に供した。一次元プロトンNMRスペクトルは、標準NOESYパルスシーケンス（緩和遅延-90°-t1-90°-tm-90°-取得）を採用し、300KでBruker 600MHzスペクトロメーター（Bruker、Rheinstetten、ドイツ）を使用して取得されました。緩和遅延は4秒に設定し、t1とtmはそれぞれ4μsと100msに設定した。32スキャンを64Kデータポイントに行い、スペクトル幅は20ppmとした。NMRスペクトルのフーリエ変換、位相およびベースライン補正、TSPのδ0.0での校正はTopspin V3.0 software (Bruker Biospin)で実施した。データはMATLAB R2014a (MathWorks Inc., Natick, USA) に0.0005 ppmの分解能で取り込み、さらに処理した。水ピーク (δ 4.7-4.9) と TSP ピーク (δ -1-0.6) を除去した後、ピークシフト効果を低減するために recursive segment-wise peak alignment (RSPA) アルゴリズムを用いてスペクトルを自動調整し25 、サンプル間の濃度変動を軽減するために probabilistic quotient 法で正規化した26。代謝物の同定には、Chenomx NMR Suite 8.31 (Chenomx Inc., Edmonton, Canada) と公開文献24 を使用しました。また、代謝物同定の補助として統計的全相関分光法 (STOCSY) 分析を行いました27。
UHPLC-MSを用いた胆汁酸プロファイリング
糞便サンプルは、胆汁酸のプロファイリングのために超高速液体クロマトグラフィー質量分析計 (UHPLC-MS) を使用して分析されました。糞便抽出物の調製とサンプル取得に使用したプロトコルは、以前に説明したとおりです。21,28,29 簡単に説明すると、各サンプルから 75 μL のアリコートを採取し、取得中のデータ品質を監視するために安定同位体標識内部標準の混合物を加えて水で 1:3 v/v に希釈したものです。保持時間のドリフトを評価するため（およびその後の胆汁酸アノテーションのため）、胆汁酸標準物質の混合物も分析実行の一部として取得されました。品質管理（QC）と前処理のために、各試料を等量ずつ組み合わせてプールしたQC試料を調製し、試料分析中に一定の間隔で取得しました。さらに、分析対象物質の反応を評価するため、QC サンプル希釈液を作成し、サンプル分析の開始時と終了時に分析した30。
サンプル分析は、ACQUITY UPLC 装置 (Waters Corp., Milford, MA, USA) と Xevo G2-S Q-TOF 質量分析計 (Waters Corp., Manchester, UK) を組み合わせ、ネガティブイオンモードで動作する Z-spray エレクトロスプレーイオン化 (ESI) 源で実施されました。ターゲットとなる胆汁酸は、LC-MS データから事前に定義された代謝物を検出、統合、報告するための自動パイプラインである peakPantheR を使用して抽出されました31。前処理には、潜在的なランオーダー効果の除去や、高い分析品質（相対標準偏差、プールQCのRSD<30%、プールQCの希釈系列の希釈係数に対するピアソン相関>0.7、試験サンプルのRSD>1.1*プールQCのRSD）で測定した特徴/代謝物のみを残す特徴フィルタリングが含まれています。これらの手法により、50種の胆汁酸の相対存在量が得られました。
統計解析
糞便微生物シーケンスデータの解析および可視化には、Phyloseq、33 Vegan、34 および ggplot 2 などの R パッケージを組み合わせて使用した35。α多様性の特徴の変化を評価するため、混合効果モデル36により、シャノンの多様性指数および Chao 1 豊かと平均抗体濃度（つまり、幾何平均値以上または未満）を比較した。共変量（年齢、ワクチンタイプ、IBDサブタイプ、病院、免疫調節剤使用、性別、民族、肥満度（BMI）、合併症）で調整し、幾何平均値以上または以下、カテゴリー別に比較した。） Aitchison距離は、中心対数比データ変換（CLR）38後のβ多様性分析37に使用され、主座標分析（PCoA）は、グループ間の（非）類似性を可視化するために作成された。ASV の差分存在量解析は、Holm-Bonferroni p 値補正を行った ANCOM-BC39 と、偽発見率（FDR）補正を行った混合効果モデル（前述の共変量を調整）を用いて計算した36。
1H NMR および UHPLC-MS データは、SIMCA (v17) および R (v4.0.3) を用いて解析した。1H NMRデータのパレートスケーリング後、教師なし主成分分析（PCA）および教師あり潜在構造判別分析（OPLS-DA）、さらにSプロットを用いたデータ調査、CV-ANOVAを用いた教師ありモデルの検証を実施した。混合効果モデル40 は、多重検定補正後のq値<0.2 で報告された代謝物の群間差を評価した（Benjamini-Hochberg 偽発見率）。最後に、corrplotを用いて、統計的に有意なASVと代謝物のSpearman相関を行いました（偽発見率のp値補正後、q < 0.2が有意とみなされます）。
ネットワーク解析
フィルタリングされたスピアマン相関行列は、重み付けされたエッジリストに変換され、R言語パッケージigraphを使用して無向きの相関ネットワークを生成するために使用された。得られたネットワークは、Cytoscape（バージョン3.8.2）41で処理され可視化され、analyze networkオプションを使用してノードの次数が計算された。
倫理的配慮
この研究プロジェクトで使用されたヒトのサンプルは、Imperial College Healthcare Tissue Bank (ICHTB)から入手した。ICHTB は、Imperial College Healthcare NHS Trust と Imperial College London を拠点とする National Institute for Health Research (NIHR) Biomedical Research Centre から支援を受けている。ICHTBはウェールズREC3により、研究用のヒト材料を公開することが承認されている（17/WA/0161）。すべての参加者はCLARITY-IBD研究（20/HRA/3114）から共同募集された。
資金提供者の役割
原稿の執筆や出版に際して、資金提供者はいかなる役割も担っていない。著者は、本試験のデータへのアクセスを妨げられることはなく、投稿の責任を負うものである。
結果
2021年1月25日から3月15日の間に43名のIBD患者を募集した。人口統計学は表 1 に示す。
表 1参加者の特徴（合計 n = 43）。
特徴 N
男性：女性 27：16
年齢中央値（範囲）40（19-67）
BMI中央値（IQR） 24.8 (22.1-27.3)
エスニック
白人 33 (76.7%)
アジア系 6 (13.9%)
ミックス 2 (4.7%)
その他 2人(4.7%)
ワクチン
オックスフォード／アストラゼネカ（ChAdOx1 nCoV-19） 15
ファイザー／バイオテック（BNT162b2） 28
IBD治療薬
インフリキシマブ 43 (100%)
チオプリン 26 (60.5%)
IBDのサブタイプ
クローン病 30
潰瘍性大腸炎 12
IBD-分類不能 1
併存疾患
心臓病 0 (0%)
糖尿病 0 (0%)
肺疾患 5 (11.6%)
腎臓病 0 (0%)
SARS-CoV-2感染の既往 8 (18.6%)
糞便カルプロテクチン中央値（IQR） 196 (56-485)
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COVID-19ワクチン2回接種後の抗SARS-CoV-2（S）抗体レベル
抗SARS-CoV-2スパイク抗体は、2回目のワクチン接種後14日から100日の間に測定した（図1b）。コホート全体では、25人（58.1%）の患者が、ワクチンの種類と過去の感染状況に特有の幾何平均を上回る抗体値を示し、18人（41.9%）の患者は幾何平均を下回る抗体値であった。年齢、IBDサブタイプ、ワクチンの種類、免疫調節剤の使用、患者の性別で層別化した場合、幾何平均値以上と以下の患者の割合に有意差はなかった（補足図1a-e）。
腸内細菌叢の構成は抗SARS-CoV-2ワクチン接種に対する反応と関連する
ベースラインの腸内細菌叢組成は、平均抗体濃度の高いワクチン接種者と平均抗体濃度の低い接種者とで異なることが分かった。Chao 1やShannon alphaの多様性指標には群間で有意差はなかったが（図2a、b）、Permutational multivariate analysis of variance（PERMANOVA）でも、β多様性解析により、平均以下の群では平均以上の群に比べサンプル間Aitchison距離の分散が減少していた（図2c； Constrained Correspondence Analysis, Redundancy Analysis and Constrained Analysis of Principal Coordinates p = 0.037 の Permutation Test ）。BNT162b2ワクチンとChAdOx1 nCoV-19ワクチンの両方に対する平均値以上と以下における優勢な系統は、BacteroidotaとFirmicutesであった（図2d）。Bacteroidotaの比率は、両ワクチンとも平均以下の応答者では低かったが、これは統計的に有意ではなかった(Fig. 2d)。IBDのサブタイプ、ワクチンの種類、免疫調節剤の使用、患者の年齢、性別、BMI、民族、合併症、病院を含む共変数を考慮した結果、合計16のASVが平均以上の人と平均以下の人の間で豊富に存在した（図2e）。特に、Bilophila (coefficient 1.34 [95% CI 0.04-2.63]), Alistipes (1.11 [0.11-2.11]) and Butyricicoccus (0.72 [0.004-1.44]) は平均以上の反応と関連があった。平均以下の反応を示したのは、Streptococcus（-1.33 [-2.39 to -0.28]）とParabacteroides（-1.45 [-2.36 to -0.53]）など13種のASVであった。
図サムネイル gr2
図2抗SARS-CoV-2ワクチン2回接種に対する血清反応と関連する腸内細菌叢の構成。(a) Chao 1および(b) Shannon Diversity指標。平均的なワクチン反応者以上（赤）と未満（青）の間でα多様性に差がないことを示す（クラスカル・ウォリス検定 p = ns）; (c) Aitchison距離の主要座標分析（PCoA）プロットは平均反応者以上（赤）と未満（青）で（ポイント上の数字は研究番号；制約付き対応分析、重複分析、主要座標の制約分析の Permutation Test p = 0.03）。 037; PERMANOVA検定 p = ns）；（d）オックスフォード／アストラゼネカ（ChadOx-nCoV-19）ワクチン（左）およびファイザー／バイオテック（BNT162b2）ワクチン（右）に対する平均以上の応答者および平均以下の応答者の門レベルの相対存在量棒グラフ。(e) 平均以上のワクチン反応者と平均以下のワクチン反応者の間で発現量が異なると同定されたASVの一変量解析。点は係数を、水平のエラーバーは95%信頼区間を示す。
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腸内メタボロームと抗SARS-CoV-2ワクチン接種の反応との関連性
1H NMRプロフィールは、まず、平均以上の反応者と平均以下の反応者のグローバルな代謝物プロフィールを照会するために使用されました。多変量解析では、ワクチン接種に対する平均以上の反応者の糞便メタボロームは、平均以下の反応者のものとは異なっていました (Fig. 3a ; PCA R2X 0.42, Q2 0.12; OPLS-DA model R2X 0.25, R2Y 0.26, Q2 0.15, CV-ANOVA p = 0.038)．1H NMR から、5 つの短鎖脂肪酸、11 のアミノ酸、3 つの呼吸性化合物を含む、合計 36 種類の代謝物の特徴が同定されました。50種類の胆汁酸がターゲットUHPLC-MSで割り当てられた。単変量解析（図3b-c）では、ワクチン接種に対する反応が平均以上の患者の糞便メタボロームにおいて、トリメチルアミン（係数0.11 [95% CI 0.04-0.18]）、イソブチレート（0.10 [0.01-0.18] ）とオメガムリホス酸（0.17 [0.08-0.26] ）がより高レベルで検出されています。ワクチン反応が平均以下では、コハク酸（係数 -0.33 [95% CI -0.59～-0.06] ）、フェニルアラニン（ -0.32 [-0.48～-0.15] ）、タウリン（ -0.13 [-0.25～-0.02] ）が豊富に含まれていることが特徴的であった。胆汁酸のタウロリトコール酸（係数-0.05［95％CI -0.07～-0.02］）とタウロデオキシコール酸（-0.06［-0.10～-0.03］）も平均以下のレスポンダーで高いレベルで存在した。
図サムネイル gr3
図3糞便メタボロミクスによる、腸内細菌機能とワクチン接種に対する血清反応との関連性。(a) 1H NMRプロファイルに基づく参加者のクラスタリングを示す主成分分析（2 PC、R2 = 0.42, Q2 0.12; OPLS-DAモデル（図示せず）R2X 0.25, R2Y 0.26, Q2 0.15; CV-ANOVA p = 0.038). (b) 1H NMRにおいて、平均以上のワクチン反応者と平均以下のワクチン反応者の間で異なる豊富さとして同定された代謝産物の一変量解析。(c) UPLC-MSで、ワクチン反応陽性者と陰性者の間で差次的に多く存在することが確認された胆汁酸の一変量解析。点は係数を、横のエラーバーは95%信頼区間を示す。
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図のサムネイルgr4
図4腸内細菌叢と代謝産物の関連を示すスピアマン相関ヒートマップとネットワーク解析。ASVは、ワクチン接種に対する反応が平均以上または平均以下であることと、（a）1H NMRから同定された代謝物および（b）胆汁酸と相関があることが確認された。色のついた円はq値＜0.2の相関を示す。 (c) ネットワーク解析。ASVは黒、1H NMRで同定された代謝物は紫、胆汁酸は濃い緑で色分けされている。ラベルの大きさはノードの次数に対応し、エッジの色と幅は相関係数に対応する（マッピング関数は「V」字型：強い正または強い負の関連はより強い色/幅を持ち、ゼロに近い弱いものはより狭く/より微小である）。
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マイクロバイオームデータと代謝物データの統合
最後に、相関分析とネットワーク分析を行い、有意なASVと関連する代謝物を決定しました（図4）。溶連菌はアミノ酸のフェニルアラニンと正の相関があり（r = 0.25）、両者は先の独立した解析でワクチン接種に対する反応が平均以下であったことと関連していた。Streptococcusはタウロコール酸（r = 0.31）、タウロヒオコール酸（r = 0.32）、タウロオメガムリコール酸（r = 0.26）とも相関があった。ビロフィルはメチルアミンおよびトリメチルアミン（それぞれr = 0.37 & 0.23）、チェノデオキシコール酸（r = 0.22）と正の相関があった。短鎖脂肪酸の酢酸はStreptococcusおよびBifidobacteriumのASVと負の相関を示し（それぞれr = -0.22 & -0.27）、バレレートはBilophilaと負の相関を示した（r = -0.30 ）。
相関行列のネットワーク表現（図4c）では、Dorea ASV 1673、Faecalibacterium ASV 1354、UCG 005 ASV 2949が、それぞれ有意に関連する代謝物の30%、28%、27%に接続し、最高度のASVであることが示されました。Lachnospiraceae NK4A136 ASV 1937、UCG 005 ASV 2949、Collinsella ASV 2003 は、影響を受ける代謝物に関してほとんど重複はありませんが、有意な正の相関の 48% を駆動しています。負の相関は、主にFaecalibacterium ASV 1354とDorea ASV 1673によってもたらされ、有意な負の相関の43%に影響を及ぼしています。Norcholic Acid、nicotinate、Glycocholic Acidは、最も程度の高い代謝物で、この3つを合わせるとネットワーク内のASVの73%以上に達し、関連プロファイルは混在しています。酢酸とトリメチルアミンは最も一般的な正負の関連代謝物であり、それぞれASVの30%と26%に接続する。
考察
我々の知る限り、本研究は、脆弱な集団における腸内細菌叢の代謝機能とSARS-CoV-2ワクチン接種に対する免疫反応との関連を実証した最初の研究である。これらの知見は、ワクチン接種に対する免疫原性が低下していることが知られている免疫抑制コホートに関するものであり、このコホートではSARS-CoV-2の破たん感染の割合が増加しているため、特に重要であると考えられる。
腸内細菌叢がワクチン接種に対する免疫反応を調節する役割を果たすというヒト9および動物実験10,11からの証拠が増えつつあり、腸内細菌叢のベースライン組成がCOVID-19ワクチンに対する血清反応を予測することが最近示されている12。私たちの研究では、参加者の大多数がBNT162b2を受け、少数がChAdOx1 nCoV-19（アデノウイルスベクターワクチン）を受けた。この2つの研究は、異なる国（香港と英国）で実施されました。最も重要なことは、私たちの研究では、参加者全員がIBDで、infliximabを使用していたのに対し、Ngの研究では、主に健康な人が参加し、免疫抑制療法を受けている人は3％未満であったことです。このような違いはあるものの、両研究に共通する所見は、パラバクテロイデスがワクチン接種に対する血清学的反応の低さと関連するということであった。
我々の研究では、Bilophila属の多さがSARS-CoV-2ワクチン接種に対する血清学的反応の高さと関連した。Bilophila属の増加は、未治療のIBD患者において報告されており42、Bilophila wadsworthensisは、炎症性TH1反応の増強とIl10-/-マウスの大腸炎発症と関連している43。注目すべきは、BNT162b2によるワクチン接種が、TH1プロファイルを持つウイルス特異的CD4+ T細胞応答の誘導につながることである44,45。これは、Bilophilaが一部のIBD患者においてワクチンアジュバントとして働き、SARS-CoV-2に対する抗体の生成をサポートするために有益なT細胞の手助けをしていると想定されるかもしれない。
我々のデータは、腸内細菌叢由来の代謝物であるトリメチルアミン（TMA）が、抗TNF患者において見られるワクチン誘発免疫反応の減衰を改善するために作用している可能性を示唆している。TMAは肝臓でトリメチルアミンN-オキシド（TMAO）に代謝され、血漿中のTMAO濃度が高いと心血管疾患の発症につながるとされています47。興味深いことに、CD8+T細胞媒介免疫の促進を通じてがん免疫療法の効果を高めることから、免疫感作性という概念も最近明らかにされました48。
我々は、フェニルアラニン、タウリン、コハク酸などのいくつかの糞便代謝物を発見し、これらはワクチン誘発血清反応の低下と関連していることを明らかにした。フェニルアラニンの代謝は、BCGワクチンに対する免疫反応にも関連しています。52 コハク酸は、潰瘍性大腸炎患者の腸内で健常対照群と比較して高いレベルで検出されます53,54。逆説的ではありますが、コハク酸は小腸のタフト細胞を介して抗炎症活性を持つことも示されています56。腸内細菌叢の機能とワクチン接種に対する免疫反応を結びつけるもうひとつのもっともらしいメカニズムは、免疫調節性のSCFAsの生産によるものです。最近の研究では、ベースラインでのSCFAsの差は認められなかったが、ワクチン接種後のSCFAsレベルと血清反応の高さの間に正の相関があることが示されている13。我々は、平均以上の血清反応を示す患者において、酪酸産生Butyricoccus ASVとSCFAイソブチレートが豊富であったが、SCFA産生の潜在能力を持ついくつかのASVsは血清反応と負の相関があった。
我々は、本研究にいくつかの限界があることを認識している。また、比較的小規模なコホートであり、外部からの検証が行われていないため、この結果はより大規模な集団で確認することが有益である。この解析では、年齢、性別、IBDサブタイプ、IBD治療などの交絡因子を考慮しましたが、食事など腸内細菌叢やメタボロームに影響を与えることが知られている他の因子を考慮することは出来ませんでした。微生物叢の解析は、ショットガン・メタゲノミクスではなく、16S rRNAアンプリコンシーケンスによって行われたため、抗体高反応者と低反応者の腸内細菌叢の分類学的プロファイルの違いをASVレベルまで調べることができましたが、株レベルまではできませんでした。我々はメタボローム解析を糞便サンプルに絞って行ったが、将来的には血液を含む他の生体液の解析も行うことができれば、興味深い。さらに、我々の免疫学的解析は体液性免疫に限定されており、T細胞反応のデータがなければ、微生物相がワクチン誘発細胞媒介免疫とどのように相互作用するかについて結論を出すことはできない。最後に、本研究は観察研究であるため、同定された微生物叢やメタボロームとの関連が、ワクチン反応と因果関係があるのか、あるいは機構的に関連しているのかを判断することはできない。
結論として、これらの結果は、免疫抑制者における腸内細菌叢の組成および機能とSARS-CoV-2ワクチン接種に対する血清学的反応の低下との間に関連性がある可能性を示唆するものである。これらのデータは、微生物叢の調整を目標とした治療法、あるいは有益な代謝産物の補充が、脆弱なグループにおけるワクチン誘発免疫原性の低下を改善する有効な戦略である可能性を示唆するものである。
寄稿者
JLA、BHM、TA、NPが研究をデザインし、JLA、AS、HP、MTが試料を収集した。JLA、NPD、JMBがマイクロバイオーム解析、JLA、ZL、BHM、VH、CSがメタボローム解析、MLO、TKがネットワーク解析を担当した。JLA、BHM、NPD、ZL、NPは原稿の第一稿を執筆した。最終原稿は全著者が執筆に参加し、承認した。JLAとNPはデータへのアクセスと検証を行い、JLAとNPは原稿提出の決定に責任を負った。
データ共有に関する声明
本研究で得られたシーケンスデータ（fastq形式）は、European Nucleotide Archive (ENA) データベースにて、研究アクセッション番号 PRJEB52928 (http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB52928) として、一般にダウンロード可能である。本研究で使用されたデータセットおよび/または解析されたデータセットは、対応する著者から入手可能であり、合理的な要求に応じて提供される。
利害関係の宣言
Dr. SaifuddinはJanssenから旅費の支援を受けています。Dr. Linは、ファイザーから非金銭的支援、フェリングから非金銭的支援を、提出された研究以外では報告している。Dr. KennedyはAbbVie, Biogen, Celgene, Celtrion, Galapagos, MSD, Napp, Pfizer, Pharmacosmos, Roche and Takedaから助成金を、Amgen, Bristol-Myers Squibb, Falk, Janssen, Mylan, Pharmacosmos, Galapagosからコンサルティング料を、TillottsはMSDから研究費を得ています。武田薬品、ティロッツから、また、アラガン、セルトリオン、フォーク、フェリング、ヤンセン、ファーマコスモス、武田薬品、ティロッツ、ガラパゴスから個人報酬を受け、アッヴィ、フォーク、ヤンセンから投稿研究以外の会議出席の支援を受けている。Sebastian教授は、武田薬品、アッヴィ、ティロッツファーマ、ヤンセン、ファイザー、バイオジェンから助成金を、武田薬品、アッヴィ、ヤンセン、ファーマココスモス、バイオジェン、ファイザー、ティロッツファーマ、ファルクファーマから投稿研究以外の個人報酬を受けたことを報告している。Hart博士は、AbbVie, AZ, Atlantic, Bristol-Myers Squibb, Celltrion, Falk, Galapogos, Janssen, MSD, Napp Pharmaceuticals, Pfizer, Pharmacosmosから講演、発表、スピーカービューロー、原稿執筆、教育イベントに対する支払いや謝礼を報告した。また、アッヴィ、武田薬品、ヤンセンからは会議出席の支援、アッヴィ、AZ、アトランティック、ブリストル・マイヤーズスクイブ、ガラポゴス、ヤンセン、ファイザー、武田のデータ安全監視委員会やアドバイザリーボードに参加したことがある。リーズ教授 Leesは、UKRIからFuture Leaders Fellow賞を受賞し、Galapagos、Abbvie、Takeda、Pfizer、Janssen、Iterative Scopesから個人顧問料、Trellus Healthから機関顧問料、Galapagosから個人顧問料を受け取っています。Abbvie、武田薬品、Pfizer、Janssen、GSK、Gilead、Fresnius Kabi、FerringおよびDr Falkから個人的な費用を、Galapagos、Abbvie、武田薬品、Pfizer、Janssen、GSK、Gilead、Fresnius Kabi、Ferringおよび Dr Falkから会議出席に対する支援を受けることができる。Dr. Goodhandは、F. Hoffmann-La Roche AGからの助成金、Biogen Incからの助成金、Celltrion Healthcareからの助成金、Galapagos NVからの助成金、Immundiagnostikからの研究実施中の非金銭的支援について報告しています。Ahmad教授は、本研究を実施するためにファイザーから研究機関への助成金、Celltrion、Roche、武田薬品工業、バイオジェン、Galapagosから助成金、武田薬品工業とRocheから講演の謝礼を受け取っており、提出した研究以外でも報告しています。Powell博士は、ブリストル・マイヤーズスクイブ社から研究助成金を受領しています。Powell博士は、武田薬品、Janssen、Pfizer、Bristol-Myers Squibb、Abbvie、Roche、Lilly、Allergan、Celgeneから個人的に報酬を得ており、Abbvie、Allergan、Bristol Myers Squibb、Celgene、Falk、Fering、Janssen、Pfizer、Tillotts、TakedaおよびVifor Pharmaでスピーカーまたは諮問委員を務めている。以下の著者は申告することはありません。Alexander博士、Ibraheim博士、Claire Bewshea、Rachel Nice、Liu博士、Mullish博士、Danckert博士、Melissa Torkizadeh、Jesús Miguéns Blanco、Lauren A Roberts、Hemanth Prabhudev、Caroline Sands、Verena Horneffer-van der Sluis、Matthew Lewis教授、Teal、 Martin Olbei、Tamas KorcsmarosおよびMarchesi教授。
謝辞
JLAは、インペリアル・カレッジ・ロンドンとThe Joyce and Norman Freed Charitable Trustから資金提供を受けたNIHR Academic Clinical Lectureship（CL-2019-21-502）の受給者である。BHMはNIHR Academic Clinical Lectureship (CL-2019-21-002)の受給者です。インペリアル・カレッジ・ロンドンの消化器疾患部門は、インペリアル・カレッジ・ヘルスケアNHSトラストおよびインペリアル・カレッジ・ロンドンに拠点を置くNIHR Imperial Biomedical Research Centre（BRC）から資金およびインフラの支援を受けている。メタボロミクス研究は、インペリアル・カレッジ・ロンドンのMRC-NIHR National Phenome Centreで行われた。この研究は、医学研究評議会（MRC）、国立衛生研究所（NIHR）（助成番号MC_PC_12025）、インフラ支援はNIHR Imperial Biomedical Research Centre（BRC）により支援されていた。NIHR Exeter Clinical Research Facilityは、Exeter大学医学部医学科とRoyal Devon and Exeter NHS Foundation Trustのパートナーシップによるものです。このプロジェクトは、National Institute for Health Research (NIHR) Exeter Clinical Research Facilityの支援を受けています。記載された見解は著者のものであり、必ずしも NIHR や英国保健社会福祉省のものではありません。
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補足資料
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記事情報
出版履歴
掲載されました。2023年1月10日
受理されました。2022年12月16日
改訂版受理 2022年10月7日
受理：2022年10月7日 2022年6月16日
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DOI: https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.104430

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図1（a）本試験の実験スキーマ、（b）ChAdOx1 nCoV-19（黒丸）またはBNT162b2（ピンク四角）投与患者における抗SARS-CoV-2スパイクRBD抗体濃度を示したもの。各点は、抗体濃度を測定した2回目のワクチン投与から日数をプロットした1人の患者を表す。
図のサムネイル gr2
図2抗SARS-CoV-2ワクチン2回接種に対する血清反応と関連する腸内細菌叢の構成。(a) Chao 1および(b) Shannon Diversity指標、ワクチン反応者の平均以上（赤）と平均以下（青）の間でα多様性に差がないことを示す（Kruskal-Wallis検定 p = ns）; (c) Aitchisonの距離の主座標分析（PCoA）プロット、平均反応者の上（赤）と下（青）（ポイント上の数字は研究番号、制約付き対応分析、重複分析、主座標分析制約付きに関する順列検定 p = 0.037; PERMANOVA検定 p = 0.033）。 037; PERMANOVA検定 p = ns）；（d）オックスフォード／アストラゼネカ（ChadOx-nCoV-19）ワクチン（左）およびファイザー／バイオテック（BNT162b2）ワクチン（右）に対する平均以上の応答者および平均以下の応答者の門レベルの相対存在量棒グラフ。(e) 平均以上のワクチン反応者と平均以下のワクチン反応者の間で発現量が異なると同定されたASVの一変量解析。点は係数を、水平のエラーバーは95%信頼区間を示す。
図サムネイルgr3
図3糞便メタボロミクスによる腸内細菌機能とワクチン接種に対する血清反応との関連性。(a) 1H NMRプロファイルに基づく参加者のクラスタリングを示す主成分分析（2 PC、R2 = 0.42, Q2 0.12; OPLS-DAモデル（図示せず）R2X 0.25, R2Y 0.26, Q2 0.15; CV-ANOVA p = 0.038). (b) 1H NMRにおいて、平均以上のワクチン反応者と平均以下のワクチン反応者の間で異なる豊富さとして同定された代謝産物の一変量解析。(c) UPLC-MSで、ワクチン反応陽性者と陰性者の間で差次的に多く存在することが確認された胆汁酸の一変量解析。点は係数を、横のエラーバーは95%信頼区間を示す。
図サムネイル gr4
図4スピアマン相関ヒートマップとネットワーク解析による腸内細菌叢と代謝産物の関連性。ASVは、ワクチン接種に対する反応が平均以上または平均以下であることと、（a）1H NMRから同定された代謝物および（b）胆汁酸との相関が確認されたものを示した。色のついた円はq値＜0.2の相関を示す。 (c) ネットワーク解析。ASVは黒、1H NMRで同定された代謝物は紫、胆汁酸は濃い緑で色分けされている。ラベルの大きさはノードの次数に対応し、エッジの色と幅は相関係数に対応する（マッピング関数は「V」字型：強い正または強い負の関連はより強い色/幅を持ち、ゼロに近い弱いものはより狭く/より微小である）。
表
表1参加者の特徴(合計n=43)
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