肺胞マクロファージにおけるSARS-CoV-2ウイルスの持続性は、IFN-γとNK細胞によって制御されている
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出版：2023年11月02日
肺胞マクロファージにおけるSARS-CoV-2ウイルスの持続性は、IFN-γとNK細胞によって制御されている
https://www.nature.com/articles/s41590-023-01661-4
Nicolas Huot, Cyril Planchais, ...Michaela Müller-Trutwin 著者一覧を見る
ネイチャー免疫学 (2023)この記事を引用する
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指標詳細
概要
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）のRNAは、一般に感染後数日から数週間後には上気道では検出されなくなる。今回われわれは、サルにおけるウイルス感染モデルを用いて、SARS-CoV-2が体内に持続するかどうか、またその持続性を制御する機構は何かについて検討した。気管支肺胞洗浄（BAL）マクロファージでは、感染後6ヵ月を過ぎても複製コンピテントウイルスが検出された。BALマクロファージにおけるウイルスの増殖は細胞から細胞へと起こり、インターフェロン-γ（IFN-γ）によって抑制された。IFN-γ産生は、BAL NKG2r+CD8+ T細胞とNKG2Aloナチュラルキラー（NK）細胞で最も強く、スパイク蛋白刺激後はNKG2Alo NK細胞でさらに増加した。しかし、ウイルスが残存しているマカクのNK細胞では、IFN-γの産生は低下していた。さらに、IFN-γはBALマクロファージ上の主要組織適合性複合体（MHC）-Eの発現を増強し、おそらくNK細胞を介した殺傷を阻害した。ウイルスの残存が少ないマカクは、MHC-E依存性の阻害を免れた適応性NK細胞を獲得した。この結果から、マクロファージにおけるSARS-CoV-2の持続性を制御するNK細胞とマクロファージの相互作用が、IFN-γによって媒介されていることが明らかになった。
主な研究テーマ
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は上気道と下気道の両方で複製され、ウイルスRNAは症状の数日前から検出可能で、最初の1週間でピークに達し、宿主の抗ウイルス反応により徐々に減少する1。しかし、細胞性および体液性免疫反応、神経経路の活性化は、複合的に遠隔炎症作用に寄与する可能性がある2。さらに、一部のSARS-CoV-2感染者では、ウイルスの完全な排除は長期にわたって起こらないようである3,4。
マクロファージ（Mac）とナチュラルキラー（NK）細胞は、病原体に対する最前線の自然免疫細胞である。Macは、炎症分子を産生し、病原体を貪食し、組織の修復を促進することによって、微生物の脅威に対応する。SARS-CoV-2感染時に観察されるように、調節不全に陥ったMacは、感染によるMac活性化症候群のように、宿主に害を及ぼす可能性がある5。Macは肺の白血球総数の約70％を占め6、呼吸器合胞体ウイルスを含む様々なウイルスによって播種、長期間の組織持続、ウイルス複製に利用される可能性がある7。SARS-CoV-2は異なる経路で単球やマック細胞に感染するが、これらの細胞でウイルスがライフサイクルを完結できるかどうかはまだ議論されている8,9。
NK細胞はウイルスクリアランスを担う重要な自然免疫応答細胞であり、適応T細胞やB細胞の応答を調節することができる10,11。しかし、SARS-CoV-2免疫に対するNK細胞の寄与は不明である12,13。血中NK細胞レベルの高さはウイルス量の急速な減少と相関するが、SARS-CoV-2感染初期には血中NK細胞頻度がしばしば減少し、NK細胞は疲弊表現型を示す14。健常人のNK細胞はin vitroでSARS-CoV-2感染細胞を直接殺傷することができるが、中等症または重症患者のNK細胞は細胞傷害活性に障害を示す15,16,17。
非ヒト霊長類（NHP）モデルは、特にヒトの感染症を研究する際に、組織における免疫細胞の機能や反応を理解するために不可欠なツールである18。我々は、SARS-CoV-2（野生型またはオミクロン株）感染に対する肺常在Mac細胞およびNK細胞の応答を調べるために、NHPモデル（カニクイザル）を用いた。気管支肺胞液（BALF）中の複製コンピテントSARS-CoV-2を感染後18ヶ月まで検出した。インターフェロン-γ（IFN-γ）はこれらのBALF MacにおけるSARS-CoV-2の複製を阻害した。しかし、一部のマックのNK細胞ではIFN-γ産生が低下していた。IFN-γは、気管支肺胞洗浄（BAL）マックの細胞表面上の主要組織適合性複合体（MHC）-Eのアップレギュレーションを通じて、NK細胞を介した殺傷に対する抵抗性を促進し、感染細胞の持続性を促進した。
結果
SARS-CoV-2はMacの表現型を長期的に変化させる
自然免疫に対する長期的なSARS-CoV-2の影響を調べるため、25頭のカニクイザルに野生型（以下WTM、n = 15）、オミクロンBA.1（n = 6）およびオミクロンBA.2（n = 4）変異体（以下OM）を感染させ、6頭の非感染マカクを対照（HC；図1aおよび拡張データ表1）とした。ウイルスRNA量は、WTMおよびOMでは感染後3日目（p.i.）に鼻腔および気管スワブでピークに達した（それぞれ7.9×108および2.78×107コピー/ml；図1a）。ウイルスRNAは、OMよりもWTMの鼻腔ぬぐい液の方が高かった（Extended Data図1a）。21日目までに、すべてのマカクが鼻腔および気管スワブでSARS-CoV-2 RNA陰性と判定され、18ヵ月後まで陰性であった（図1a）。免疫応答はp.i.221日目（中央値）で評価され、解析は479日目まで及ぶ可能性があった（補足表1）。スパイクおよび受容体結合ドメイン（RBD）に対する血漿中免疫グロブリンG（IgG）およびIgA反応性は、WTMとOMで同等であった（図1bおよび拡張データ図1b）。炎症性サイトカイン（インターロイキン（IL）-6、IL-18、IL-23、CXCL10）は、HCと比較して221d.p.i.の時点でWTMとOMで高値を示し（Extended Data図1c）、炎症の持続を示唆した。
図1：SARS-CoV-2感染サルのBALF MacにおけるMHC-EおよびIL-10の発現の増加。
図1
a, SARS-CoV-2野生型（WTM, n = 15）またはオミクロン変異型（OM, n = 10）に感染した25匹のマカクにおける気管および鼻腔スワブのウイルス量のPCRによる定量（中央値221日後） b, WTMおよびOMにおけるスパイクおよびRBD IgGおよびIgAの血漿力価（中央値221日後）。c、p.i.221日後の中央値におけるHC、WTMおよびOMのBALF中のリンパ球、単球およびマクロファージの割合および比率 d、p.i.221日後の中央値におけるHC、WTMおよびOMのBALF Mac中のタンパク質のlog2 z score発現を表示した階層的クラスタリングヒートマップ。f、cと同じBALF MacにおけるMHC-E（上）およびIL-10（下）の発現。g、cと同じBALF MacにおけるMHC-E、CD11c、IL-10およびCD16の頻度。h、cと同じ感染マカクから分離した8時間のLPS刺激後のBALF Macにおけるサイトカインの細胞あたりの発現の中央値。i,j、cと同様に単離したBALF Macの生存率、LPS刺激の有無にかかわらず培養したもの。 k、cと同様のBALF Macにおける細胞内IFN-γ発現とLPS曝露後8時間および12時間における生存率との間のスピアマン相関分析。各記号は個々のマカクを示す。すべてのグラフにおいて、バーは中央値を示し、四分位範囲は表示されている。統計検定： Mann-Whitney (b)、Kruskal-Wallis with Dunn's post hoc test (c,g,h)、ノンパラメトリックWilcoxon signed-rank test (k)。相関分析では直線回帰線と信頼区間を示す。
出典データ
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221 d p.i.（中央値）におけるBALF細胞のマルチパラメーターフローサイトメトリーでは、WTMではHCよりもCD45+CD64+Mac（以下Mac）の頻度が高く、CD45+リンパ球の頻度が低いことが示された（図1cおよびExtended Data図1d）。Macおよびリンパ球頻度は血漿中のCXCL10、IL-23およびIL-6と相関しており（Extended Data Fig. WTMとOMのBALF CD45+CD64+ Macは、HCとは異なるクラスタリングを示した。それらはHCと比較して、CD206、CD4、CD11c、MHC-E、IL-10の発現が高く、CD16とCXCR4の発現が低いことを示した（図1d,eおよびExtended Data図1f,h）。また、MHC-E、CD11cおよびIL-10の発現頻度も高く、WTMおよびOMでは、HCと比較してCD16+ Macの発現が少なかった（図1f,g）。このことは、肺胞Macの代替活性化を示唆しており、肺挫傷や肺炎を示唆している可能性がある19。
リポ多糖（LPS）刺激から8時間後のBALF Macによるサイトカイン産生を定量化したところ、WTMではHCよりもIFN-γが少なかった（図1hおよびExtended Data Fig.2）。WTMのBALF Macはまた、LPSの有無にかかわらず、8時間培養後の生存率がHCに比べて低下していた（図1i,j）。Macの生存率は、LPS刺激後8時間および12時間におけるIFN-γ産生と正の相関を示し（図1k）、SARS-CoV-2感染Mac、特にWTMにおける活性化の変化を示唆した。これらの所見は、SARS-CoV-2に誘導されたBALF Macの表現型が、HCと比較して、細胞頻度の増加、MHC-E、IL-10、CD11cの発現の増加、およびLPSに応答したIFN-γ産生の障害によって、持続的に変化していることを示している。
BALFマックでは複製能を持つSARS-CoV-2が検出された。
BALFマックの持続する炎症と表現型の変化を考慮し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を用いてBALF細胞におけるウイルスRNAの持続性を調べた。SARS-CoV-2 RNAはWTM15人中12人、OM10人中5人から検出された（図2a）。ウイルスRNAレベルは、24時間後のBALF Macの生存率と逆相関していた（図2a）。ウイルスRNAレベルに基づいて、マカクを高発現群（＞1ΔΔCt、6匹のWTM（以下WTMhi）と2匹のOM（以下OMhi））、低発現群（＜1ΔΔCt、6匹のWTMloと3匹のOMlo）、および無発現群（3匹のWTMnegと5匹のOMneg；Extended Data Fig. このクラスタリングにより、WTMhiとOMhiはHCと比較してIL-18、CXCL10、sCD14レベルが高いことが明らかになった（Extended Data Fig.）
図2：SARS-CoV-2は221日以上経過したWTMおよびOMのBALF Macで発現している。
図2
a、WTM（n＝15）およびOM（n＝10）のBALF全細胞におけるSARS-CoV-2 RNAの中央値221 d p.i.でのPCR分析（左）、および24時間マクロファージ生存率（図1iと同様）とウイルスRNA発現との相関（右）。b、aのWTMおよびOMのBALF Macにおける細胞内スパイクSARS-CoV-2発現をフローサイトメトリーで評価したもの。 c、aのWTMおよびOMのSpike+ BALF Macの頻度（左）、およびSpike+ Macの頻度と24時間後の生存率との相関（右）。d, 8時間培養し、DAPI、アクチン-ファロイジン、dsRNAおよびNSP3 Absで染色した、221日齢のWTM（n = 15）およびOM（n = 10）から単離したBALF Macの共焦点顕微鏡像。青矢印はトンネルナノチューブ（TNT）を示す。e, 221 d p.i.以上のWTM（n = 15）とOM（n = 10）から単離したBALF Macを12時間培養し、DAPI、ファロイジン、スパイクおよびNSP3 Absで染色したエピ蛍光画像。f, HC（n=6）、WTM（n=15）、OM（n=10）≥221d p.i.から分離したBALF Macにおけるスパイクタンパク質のMFI。すべてのグラフにおいて、中央値と四分位範囲を示した。統計解析： Mann-Whitney検定（aおよびg）およびKruskal-Wallis検定とDunnのpost hoc検定（cおよびf）。線形回帰はスピアマン相関分析で表す。記号は個々のマカクを表す。
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次に、細胞内フローサイトメトリーを用いてBALF CD45+CD64+マックのスパイクタンパク質を定量することにより、マックがウイルス源であるかどうかを評価した（図2b）。WCM15人中12人、OCM10人中8人にスパイク＋マックが検出された（図2c）。Spike+ Macの頻度は、WTMhiとOMhiで41％、WTMloとOMloで25％、WTMnegとOMnegで8.6％であった（図2c）。Spike+ Mac頻度は、全BALF細胞中のウイルスRNAと正の相関を示し、培養中のBALF Mac生存率とは負の相関を示した（図2c）。
MacにおけるSARS-CoV-2の複製をさらに評価するために、18時間の培養期間にわたってBALF Macにおける二本鎖RNAと非構造蛋白質3（NSP3）蛋白質の発現を調べた（図2d-f）。培養8時間で、ウイルスdsRNAとNSP3タンパク質は、WTMhiまたはOMhiの8人全員、WTMloまたはOMloの9人中5人、WTMnegまたはOMnegの8人中3人のBALF Macで増加した（図2fおよび拡張データ図3a）。WTMhi/OMhiおよびWTMlo/OMloのすべてでスパイク蛋白が経時的に増加したが、OMnegの8頭中4頭では増加しなかったことから、SARS-CoV-2がMacで複製能力を持つことが示唆された。また、培養期間中にBALFマックの合胞体の数が増加し、おそらくスパイクが介在していること（Extended Data 図3b）、培養8時間目にBALFマックの糸状伸展が見られ（Extended Data 図3b）、マック間の連結が促進された（図2g）。共焦点画像では、これらの突起のいくつかにNSP3タンパク質が確認され（図2dおよびExtended Data図3b）、細胞間伝播によるBALF Macでのウイルス複製が示唆された。
マックにおけるウイルス複製の影響を調べるため、無作為に選んだWTM5人、OM10人、HC6人のBALF CD45+CD64+マックのトランスクリプトームを解析した。MacはSARS-CoV-2タンパク質の発現を可能にするために8時間培養した。我々は、培養中のウイルス複製中のMacのトランスクリプトームを推定するために、免疫応答に関与する753のNHP遺伝子をターゲットとしたNanoString nCounter codeSetを使用した（図3a）。主成分分析（PCA）は、WCM、OCM、HCの分離を示した（図3b）。WTMとOMは、HCと比較して138の異なる制御遺伝子を示した（図3cおよび拡張データ図4a,b）。遺伝子セット濃縮解析（GSEA）では、HCマックと比較して、すべてのWTMマックおよびOMマックにおいて、有意に濃縮された遺伝子セットが1つ（脂質結合）、減少した遺伝子セットが10個（サイトカイン活性、ケモカイン活性、シグナル伝達受容体活性、サイトカイン受容体結合など）示された（図3dおよび拡張データ図4c,d）。Macで減少した遺伝子セットは走化性とサイトカイン（CXCL1、CXCL6、IFNG、TGFB1）に関連し、一方、増加した遺伝子にはFN1、CD1b、S100A8、S100A9が含まれた（図3eおよび拡張データ図4a,b）。これらの観察から、SARS-CoV-2は感染したサルのBALF Mac内で長期間持続し、活発に複製していることが示唆された。
図3: SARS-CoV-2がin vitroでMacに複製されると、Macのトランスクリプトーム・プロファイルが変化する。
図3
a, HC 5匹、無作為に選んだWTM 5匹およびOM 10匹 > 221 d p.i.から単離したBALF CD64+ MacにおけるmRNA発現のヒートマップ、8時間培養し、nanoString nCounter Systemでプロファイリングした。b, a.と同様に、BALFマクロファージにおける遺伝子発現のPCA。 c, WTMおよびOMのBALF MAC（図2aと同様）において、HCと比較して一般的に発現低下および発現上昇した遺伝子を示すベン図。d, 図2aの差次的に制御された遺伝子に基づいて濃縮された遺伝子セットを示すGSEAホールマーク解析。赤いバーはFDR < 25%で有意な濃縮を示し、灰色のバーはFDR > 25%で公称P値 < 5%の遺伝子セットを示す。正のNES値はWTMとOMでの濃縮を示し、負のNESはHCでの濃縮を示す。e, PCAとボルケーノプロットは、示された比較について、アップレギュレートされた遺伝子とダウンレギュレートされた遺伝子を示す。各ボルケーノプロットにおいて、横の点線はPadj = 0.05を表し、縦の点線はlog(fold change) >2または<-2を表す。NES, 正規化濃縮スコア。
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IFN-γ+NK細胞はWTMおよびOM BALFで減少している。
BALFのウイルス複製を抑制する免疫機構の関与の可能性を探るため、BALF中のリンパ球の詳細な表現型解析を行った。WTM、OM、HCの全BALF細胞に対して20色のマーカーフローパネルを用いたところ、不偏的なクラスタリングにより、9つの異なるリンパ球集団が明らかになった（図4aおよびExtended Data図4e）。WTMとOMのBALFは、HCと比較してLin-NKG2R+ NK細胞の頻度が高かった（Extended Data図4f）。具体的には、WTMはNKG2R+CD8+ T細胞とCD3+CD4-CD8- T細胞の数が多かった。Lin-NKG2R+NK細胞およびNKG2R+CD8+T細胞のこの高い頻度は、HCと比較してWTMの全BALF細胞におけるNKG2RおよびEOMESの高い発現と相関していた（Extended Data Fig.） 対照的に、OMではCD34+細胞が豊富であり（Extended Data Fig. OMの全BALFリンパ球は、HCと比較してIFN-γの発現が増加していた（Extended Data図4g）。CD3+CD8+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD20+B細胞、CD3+CD4+CD8+T細胞、Lin-HLA-DR+細胞など、BALF全CD45+細胞中の他の免疫細胞タイプの有病率は、WTMとOMのいずれにおいても、HCと比較して変動は認められなかった（Extended Data図4f）。全BALF細胞中のSARS-CoV-2ウイルス量に基づいてWTMとOMを層別化すると、ウイルス量が多い人（WTMhiとOMhi）は、HC（3.59±1.18％；図4b）と比較して、NKG2R+ NK細胞の頻度が高かった（7.03±1.86％）。対照的に、WTMnegおよびOMnegマカクでは、NKG2R+CD8+T細胞の頻度がHC（3.06±1.42％；図4b）と比較して高かった（12.3±5.11％）。
図4：IFN-γ+ NKG2R+細胞の頻度は、Spike+ Macの頻度と負の相関を示す。
図4
a, WTM（n=15）、OM（n=10）、およびHC（n=6）のBALFから分離した、一重、生、CD45+CD14-リンパ球のUMAP次元削減アルゴリズムによる教師なし解析。細胞はゲーティングされ、1サンプルあたり3,000細胞までダウンサンプリングされ、バーコード化され、連結された。CD45はUMAP実行パラメータリストから除外した。サルの各グループの密度プロットを示す。手動でゲーティングしたリンパ球集団をUMAPプロット上に対応する色で示した；解析に用いた各マーカーの強度をUMAPプロット上に示した。 b, 少なくとも221日後のWTM、OMおよびHCのBALF細胞におけるNKG2R+リンパ球の頻度。c-e、WTM、OMおよびHCのBALFからのNKG2R- T細胞、NKG2R+ NK細胞およびCD3+NKG2R+ T細胞におけるIFN-γ（c）、グランザイムB（d）およびCD107a（e）のヒストグラム（左）および頻度（右）。f, NKG2R+細胞中のIFN-γ+、GzmB+、CD107a+細胞の頻度とBALF細胞中のSpike+ Macの頻度のスピアマン相関分析。すべてのグラフにおいて、中央値と四分位範囲を示した。P値はKruskal-Wallis検定とDunnのpost hoc検定を用いて決定した。相関分析において、黒い実線は線形回帰を表し、点線は信頼区間（95％）を表す。
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NKG2R+細胞の機能的プロファイルをより深く掘り下げるため、特殊なフローサイトメトリーパネルを用いてIFN-γ、GzmB、CD107aを評価した。WTMhiおよびOMhiのBALFにおけるIFN-γ+ NKG2R+NK細胞の頻度はHCよりも低かったが、IFN-γ+ NKG2R+CD8+T細胞の頻度はHCと比較してWTMnegおよびOMnegで高かった（図4c）。一方、GzmB+およびCD107a+のNKG2R+ NK細胞およびNKG2R-T細胞の頻度は、HCまたはWTMneg/OMnegと比較して、WTMhiおよびOMhiで増加した（図4d,e）。これに伴い、GzmB+およびCD107a+ NKG2R+ NK細胞および/またはNKG2R+CD8+ T細胞の頻度は、Spike+ Macの頻度と正の相関を示したが、IFN-γ+ NKG2R+ NK細胞および/またはNKG2R+CD8+ T細胞の頻度は、Spike+ Macの頻度と負の相関を示した（図4f）。BALFにおけるリンパ球表現型の解析から、IFN-γの発現低下とBALF MacにおけるSARS-CoV-2の持続性との関連が示唆された。
IFN-γはマックにおけるSARS-CoV-2の複製を抑制する
Macにおけるウイルス複製に対するIFN-γの影響を測定するために、すべてのWTM、OMおよびHCから単離したBALF Macを100 U ml-1のrIFN-γで培養し、ウイルスの細胞障害作用が出現する前に、培養8時間後のMacにおけるSARS-CoV-2 dsRNAレベルを評価した。IFN-γ処理は、未処理のMacと比較して、処理したWTMおよびOMにおいてウイルスdsRNAレベルの有意な減少をもたらし（図5aおよび拡張データ図5a,b）、この短期間におけるrIFN-γによるBALF MacにおけるSARS-CoV-2複製の効果的な阻害を示した。注目すべきことに、IFN-γ処理は、培養開始から12時間後のWTMおよびOM Mac細胞の生存率も改善した（図5b）。in vivoでのBALF NK細胞におけるIFN-γの発現とBALFにおけるSpike+ Macの頻度との間には負の相関があり（図5c）、BAL Macにおけるウイルスの持続性に対するIFN-γの影響がさらに強調された。
図5：IFN-γはSARS-CoV-2の複製を阻害し、MHC-Eの発現を増加させる。
図5
a, 少なくとも 221 d p.i.で単離した WTM (n = 15) および OM (n = 10)の BALF Mac を、IFN-γを添加または無添加で 8 時間培養した後、DAPI および dsRNA Abs で染色した代表的な共焦点画像。各細胞におけるdsRNAの蛍光強度は、細胞分割後に測定した。c, WTMおよびOMのBALFにおけるIFN-γ+ NKG2R+ NK細胞およびSpike+ Macの頻度（221d p.i.の中央値）のスピアマン相関解析。d, 少なくとも 221 d p.i.で単離した WTM および OM の BALF Mac の代表的な共焦点画像で、IFN-γ とともに、または IFN-γ なしで 8 時間培養した後、DAPI、dsRNA、MHC-E Abs で染色した。 e, BALF Mac の細胞あたりの MHC-E の MFI で、Fig. f、図3kと同様に測定したBALF MacのMHC-E MFIと、WTMおよびOMのBALFで測定したIFN-γ+CD8+NKG2R+ T細胞の頻度のスピアマン相関分析。すべてのグラフにおいて、中央値と四分位範囲を示した。P値はKruskal-Wallis検定を用いて決定した。すべての相関分析において、すべての動物にラベルが貼られているわけではなく、黒い実線は線形回帰、点線は信頼区間（95％）を表す。
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IFN-γ処理により、BALFマックでは、高度に保存された非古典的MHCクラスIb分子であるMHC-Eの細胞表面発現が増強されたが、未処理のマックでは、予想通り、主に細胞内コンパートメント内にMHC-E分子が保存された（図5dおよび拡張データ図5c）。さらに、IFN-γ処理により、WTMおよびOM Macでは、未処理のBALF Macと比較して、総MHC-E発現が増加した（図5eおよび拡張データ図5d）。BALFマック上のMHC-Eの平均蛍光強度（MFI）は、BALF中のIFN-γ+NKG2R+CD8+ T細胞の頻度と正の相関があり（図5f）、IFN-γがin vivoでマック上のMHC-E発現を誘導している可能性が示唆された。これらの結果から、IFN-γはSARS-CoV-2産生を抑制し、BALF Mac上でMHC-E発現を誘導することが示された。
SARS-CoV-2感染はNK細胞のトランスクリプトームに影響を与える
MHC-EはNK細胞レセプターNKG2AおよびNKG2C20と相互作用する。この相互作用は通常、NKG2Aを介してNK細胞を抑制し、NKG2Cを介して活性化する21,22。サルのNKG2Cに対する特異的抗体は入手できず、既存のNKG2A抗体はシミアン細胞のNKG2Cと交差反応するため23、サルのNKG2AとNKG2Cの区別は、一般にmRNA配列に依存している。MHC-E発現亢進がNK細胞活性に及ぼす影響を調べるため、我々はWTMおよびHCのBALFから約221 d p.i.でNKG2R+NK細胞を単離し、マカク用NanoString nCounter codeSetを用いてKLRC1（NKG2A）およびKLRC2（NKG2C）mRNAを含む753個のNHP免疫応答関連遺伝子のin vivoトランスクリプトームを解析し、HCと比較した（図6a）。トランスクリプトーム解析の結果、BALF NKG2R+ NK細胞は、WTMとHCの両方で、KLRC1（NKG2A）の転写レベルに比べ、KLRC2（NKG2C）の転写レベルが一貫して低いことが示された（図6a）。
図6：BALF NKG2R+ NK細胞ではFoxJ1の発現が上昇している。
図6
a, nanoString nCounter SystemによるmRNAカウントをzスコアで正規化したものに基づく、WTM15人およびHC5人のBALFからのNKG2R+ NK細胞における遺伝子発現プロファイルのヒートマップ。点線は有意閾値（Padj = 0.05; log(fold変化) >1または< -1）を示す。 c, 図4aと同様にzスコアに基づき、12個のペアWTMサンプルからの血液NKGR+ NK細胞と比較したBALFにおける遺伝子発現のヒートマップ。点線は有意閾値を示す。 e、特定の細胞集団および組織において、様々なマーカーおよび受容体に対して有意に変化したmRNAのヒートマップ。 f、WTM、OMおよびHCのBALFからのCD45+CD14-CD3-CD20-NKG2R+リンパ球のUMAP解析。g, 461 d p.i.以上におけるWTM、OMおよびHCのBALF NKG2R+NK細胞における表面マーカーおよびサイトカインのMFI。 h,i 461 d p.i.以上におけるHCおよびWTM（OMとして）における明瞭なNKG2R/CD16 NK細胞亜集団の等高線図（h）および頻度（i）。すべてのグラフについて、記号は個々のマカクを表し、バーは中央値を示す。四分位範囲は中央値を示す。P値はKruskal-Wallis検定とDunnのpost hoc検定により決定した。
出典データ
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遺伝子発現に基づくPCA解析では、15頭のWTMのうち14頭のBALF NKG2R+ NK細胞が、HCのBALF NKG2R+ NK細胞と明確に分離していることが示された（図6b）。調整P値(Padj = 0.05)およびmRNA log2(fold変化)>2の有意閾値を用いると、T細胞24における核因子κB(NF-κB)活性化およびIFN-γ分泌の阻害因子として知られるFOXj1のみが、HCと比較してWTM由来のBALF NKG2R+NK細胞で有意に発現上昇していた(図6b)。非調整P値（P = 0.05）およびWTMとHCの比較におけるlog2(fold change) > 1を含むより厳密でない基準で、WTM由来のNKG2R+ NK細胞においてHCと比較して差のある調節を示すいくつかの遺伝子（CD36、GzmB、GNLY、PIGR、CD38、SERPING1、KCNJ3、KLRC3、CLU、C3、MUC1およびFOXJ1）を同定した（Extended Data Fig.）
WTMの血液およびBALFから分離したNK細胞内で発現した遺伝子を解析するためにNanoString nCounter codeSetを用いると、BALF NKG2R+ NK細胞は、PCAで確認されたように、血液由来のNK細胞とは明確に分離されたクラスターを形成していることが観察された（図6c,d）。合計448遺伝子が、血液NK細胞と比較してBALFで差次的に発現していた（208遺伝子が発現上昇、240遺伝子が発現下降）（図6d）。特に、NK細胞受容体（KLRD1、KLRC3、CD247、KLRB1、KLRK1）、NK細胞の発生と成熟を制御する転写因子（TCF1、ID2、T-BET、EOMES、PRDM1、GATA3）、細胞傷害活性遺伝子（GzMファミリーメンバー、PERF、IFNG）のmRNAは、WTMの血中NK細胞と比較してBALF NK細胞で発現低下していた（図6e）。逆に、NK細胞の活性を抑制するマクロファージ抑制因子受容体CD74、Fcγ受容体、Toll様受容体（TLR）、インテグリン、炎症性分子、および適応性NK細胞25に関連する転写因子IRF8をコードするmRNAは、血中と比較してBALFのNKG2R+ NK細胞で発現上昇していた（図6e）。これらの所見から、WTMのBALF NKG2R+NK細胞は、SARS-CoV-2の複製を制御する能力が低下している可能性が示唆され、これらのトランスクリプトーム変化は、中央値461d p.i.後も持続した。
NK細胞がWTMおよびOMでどのような影響を受けているかをさらに評価するため、20色マーカーフローサイトメトリー解析を用いて、BALF NKG2R+NK細胞のNK細胞活性マーカーを評価した（図6fおよび拡張データ図6b-e）。WTM由来のBALF NKG2R+NK細胞は、OMと比較して、NKG2R、CD16およびGzmBの高発現を示した（Extended Data Fig.） バルクNK細胞上のNKG2R発現は、BALF中のSpike+ Macの割合と相関していた（拡張データ図6c）。BALF細胞全体のウイルス負荷量に応じてマカクをクラスタリングすると、WTMhiおよびOMhiはWTMnegおよびOMnegと比較して、NKG2R、NKP30、CD16、GzmBおよびCD107aの発現が高かったが、CD226（DNAX Accessory Molecule-1（DNAM-1））の発現は低かった（図6g）。NKG2RとCD16の発現に観察された変化は、GzmBの発現の違いと共に、NK細胞の成熟の変化を強く示唆していた。
次に、CD16とNKG2Rの発現に基づいてBALFのNK細胞成熟プロファイルを解析したところ、WTMとOMはともに、HCと比較してBALF中の成熟NKG2RloCD16+ NK細胞の頻度が低いことが示された（図6h）。BALF細胞全体のウイルス量に基づいてクラスタリングすると、WTMhi、OMhi、WTMlo、OMloのバルクNK細胞は、HCと比較して、NKG2R発現の低いNK細胞サブセット（NKG2RloCD16-およびNKG2RloCD16+）の頻度が減少していた（図6i）。全NK細胞中のNKG2RloCD16-およびNKG2RloCD16+サブセットの頻度は、BALF中のSpike+ Macの割合と負の相関を示した（Extended Data Fig. 全体として、トランスクリプトームおよび表現型プロファイルは、NK細胞に対するSARS-CoV-2感染の長期にわたる深刻な影響を示しており、NK細胞の抗ウイルス活性の遮断と適応的NK細胞プロファイルを反映している可能性がある。
SARS-CoV-2スパイクはNK細胞の機能を調節する
次に、SARS-CoV-2粒子がNK細胞を直接修飾するかどうかを解析した。SARS-CoV-2 Nおよびスパイクタンパク質は、それぞれTLR2およびTLR4（参考文献26,27）に関与する。TLR2とTLR4はNK細胞表面に発現することが知られており28、WTMのNK細胞で増加していた。BALFのNK細胞がSARS-CoV-2スパイクタンパク質と結合できるかどうかを調べるため、WTM、OM、HCの全BALF細胞をビオチン化リコンビナント3量体スパイクタンパク質（rtSpike）と1時間インキュベートした（Extended Data Fig.） OMのBALF CD20+B細胞は、HC（2.79±0.87％）と比較して、強いSARS-CoV-2スパイクタンパク質結合（19.65±12％）を示した（Extended Data Fig.） WTMとOMのBALF Spike+CD20+ B細胞レベルは、血漿中のRBD IgG力価と相関しており（拡張データ図7c）、CD20+ B細胞が3量体スパイク蛋白と効果的に結合できることが示唆された。おそらく、感染の急性期にSARS-CoV-2特異的メモリーB細胞が出現した結果であろう29。NK細胞はスパイクタンパク質結合に対して強固な結合を示し（Extended Data 図7b）、HC、WCM、OCMのNKG2R+ NK細胞ではそれぞれ中央値で25.8%（±8.78）、23.3%（±14.61）、16%（±13.87）であった（Extended Data 図7d）。したがってB細胞への結合よりは低いが、CD4+またはCD8+ T細胞への結合よりは顕著に高い（Extended Data 図7d）。
スパイクのNK細胞への結合がNK細胞の機能に及ぼす影響を評価するために、BALF NKG2R+NK細胞をrtSpike、単量体S1（RBDを含む）、三量体S2ドメイン、ジメチルスルホキシド（DMSO）（陰性対照）またはLPS（陽性対照）に24時間暴露した（図7aおよび拡張データ図8a）。WTMまたはOM BALF NK細胞をrtSpikeに曝露すると、GzmB+NKG2RhiおよびIFN-γ+NKG2Rlo NK細胞の頻度は、DMSOに比べて増加した（図7b,c）。IFN-γ産生は主にNKG2Rlo NK細胞（16.4 ± 10.14%）で観察され、GzmB産生は主にNKG2Rhi NK細胞（17.2 ± 10.7%）に起因した（Extended Data Fig.） スパイクタンパク質刺激後、WTMnegおよびOMneg由来のNKG2Rhi NK細胞は、WTMhiおよびOMhi由来のNKG2Rhi NK細胞よりも高いGzmB発現を示したが、WTMnegおよびOMneg由来のNKG2Rlo NK細胞は、WTMhiおよびOMhi由来のNKG2Rlo NK細胞よりも高いIFN-γ発現を示した（図7d）。これらの結果から、NK細胞はSARS-CoV-2スパイクタンパク質と結合することができ、このことがNK細胞の機能、特にNKG2RhiおよびNKG2Rlo NK細胞サブセットにおけるGzmBおよびIFN-γの産生に影響を及ぼすことが示された。
図7：スパイク刺激後のNK細胞IFN-γ産生。
図7
a, 代表的なGzmBおよびIFN-γ発現プロット。WTM（n = 15）およびOM（n = 10）から単離したNKG2RloおよびNKG2Rhi NK細胞（221 d p.i.以上、スパイクタンパク質を添加または無添加で培養）、 d,WTMneg、WTMlo、WTMhi、OMneg、OMlo、OMhiから単離したNKG2RhiおよびNKG2Rlo NK細胞におけるGzmBおよびIFN-γ発現。四分位範囲は中央値を示す。すべてのグラフにおいて、P値はKruskal-Wallis検定とDunnのpost hoc検定によって決定した。
出典データ
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MHC-Eは回復期のサルにおいてNK細胞を制限する
NKG2RのリガンドであるMHC-Eは、主にMHCクラスIaシグナルペプチド（SP）30,31,32のペプチドと結合するが、SARS-CoV-2ペプチドのような病原体由来のペプチドとも結合できる16,33。NKG2R-MHC-EがどのようにNK細胞の活性を調節するかを調べるために、私たちは正規のMHC-E結合ペプチド34に似たSARS-CoV-2由来のペプチドを検索した。インシリコ解析では、プロテアーゼ・シグナルペプチド・ペプチダーゼ（SPP；Extended Data Fig.） ノナマーペプチドであるV3-11は、スパイクタンパク質内（3-11位）で同定され、in vivoでHLA-A02:01によって提示されることが報告されている35 (Extended Data Fig. 9b,c)。ウイルスのペプチドの中には、古典的なMHC-I分子と非古典的なMHC-E分子の両方に結合するものがあり、MHC-E結合ペプチドがHLA-A02:01に結合するペプチドと似ているトランスポーター抗原プロセッシング（TAP）欠損ウイルス感染に関連する可能性がある（文献35,36）。結合スコアの予測値が低かったにもかかわらず（Extended Data 図 9d,e）、MHC-E01:01（K562-E01）を形質導入した K562 細胞上で V3-11 ペプチドを用いた MHC-E 安定化アッセイでは、VL9 や HSP60 ペプチドと同様に、V3-11 が細胞表面で MHC-E を安定化することが示されました（図 8a,b）。
図8：スパイクリーダー配列ペプチドはNK細胞の溶解を阻害する。
図8
a,MHC-E（MHC-E01:03）を導入したK562細胞における、ペプチド負荷（VL9、HSP60、V3-11）後、12時間培養後のMHC-EのMFIを示すヒストグラム（左）、およびペプチド負荷（VL9、HSP60、V3-11ペプチド）後のMHC-E01:03細胞におけるMHC-Eの発現を、12時間培養後、ペプチド無添加の対照条件と比較したグラフ（右）。b, MHC-E01細胞にビオチン化ペプチド(VL9, HSP60, V3-11)をロードし、ストレプトアビジンとのコンジュゲーションにより明らかにした、12時間培養後のMFIを示すヒストグラム(左)と、MHC-E01におけるビオチン化ペプチド(VL9, HSP60, V3-11)の発現を示すヒストグラム(右)： ペプチド負荷後のMHC-E*01: 03細胞におけるビオチン化ペプチド（VL9、HSP60、V3-11）の発現（VL9、HSP60、V3-11ペプチド）。c、NKG2A及びNKG2C発現に基づく、2019年以前に採取された13個のヒトPBMCからの血中NK細胞の分布を示すドットプロット（左）、及び2019年以前に採取されたヒトPBMCにおけるNKG2C＋NKG2A-、NKG2C＋NKG2A＋及びNKG2C-NKG2A＋細胞サブセットの頻度（右）。d、cと同様に、8時間の共培養中にVL9およびHSP60ペプチドを負荷したK562-E-01細胞に曝露したヒトNKG2C+NKG2A-、NKG2C+NKG2A+、NKG2C-NKG2A+およびNKG2C-NKG2A-NK細胞サブセットにおける脱顆粒の阻害。e,ヒトNKG2C+NKG2A-、NKG2C-NKG2A+およびNKG2C+NKG2A+ NKサブセットにおける、VL9、HSP60およびスパイク由来ペプチドV3-11との8時間の共培養中の脱顆粒抑制。g, V3-11ペプチドによるNKG2R+ NK細胞の脱顆粒抑制と、図2aで測定したウイルス量とのスピアマン相関解析。2a、図2cで測定したSpike+ Mac頻度、および図7bで測定したスパイク刺激24時間後のWTMの全BALF細胞中のNKG2Rhi NK細胞におけるGzmB発現。各記号は個体数を表し、バーは中央値を表す。四分位範囲を示す。すべてのグラフにおいて、P値はKruskal-Wallis検定とDunnのpost hoc検定によって決定した。
出典データ
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次に、MHC-Eを介してV3-11ペプチドを提示する標的細胞に対するNK細胞活性を解析した。ドナーがSARS-CoV-2ナイーブであることを確認するため、2019年前に採取した凍結ヒト末梢血単核球（PBMC）から全Lin-CD56+CD16+ NK細胞を単離した（図8cおよび拡張データ図9f）。30μMまたは300μMのV3-11ペプチドでパルスしたK562-E*01との共培養において、8時間後のCD107a発現によって評価したNK細胞の脱顆粒を、VL9（NKG2A+ NK細胞を阻害することが知られている）およびHSP60（NKG2A+を阻害しない）対照ペプチドでパルスした後のものと比較した。予想通り、VL9はNKG2C+NKG2A-NK細胞よりもNKG2A+NK細胞を阻害したが、HSP60はNKG2C+とNKG2A-NK細胞を同様に阻害した（図8d）。NKG2C+NK細胞の脱顆粒はV3-11によって阻害されなかったが、NKG2C-NKG2A+NK細胞の脱顆粒は阻害された（図8d）。V3-11によるNKG2C-NKG2A+ NK細胞の脱顆粒抑制は、VL9と同様であり、HSP60よりも高かった（図8e）。
HCマカク由来のBALF NKG2R+ NK細胞の脱顆粒活性は、VL9とV3-11によって同様に阻害されたが、HSP60では阻害されなかった（図8f）。しかし、V3-11はVL9よりもWTMのBALF NKG2R+ NK細胞の脱顆粒を抑制した（図8f）。V311はWTMhi由来のBALF NKG2R+ NK細胞の脱顆粒を強く抑制したが、WTMneg由来のBALF NKG2R+ NK細胞の脱顆粒は抑制しなかった（図8f）。V3-11による阻害は、Spike+ Macの頻度およびWTM由来の全BALF細胞中のウイルスRNA量と正の相関があり（図8g）、WTMloおよびWTMneg、ならびにOMloおよびOMneg由来のNKG2R+ NK細胞は、MHC-Eによる阻害を回避したことが示唆された。このように、スパイクタンパク質由来のV3-11ペプチドは、WTMhiおよびOMhi由来のNKG2R+ NK細胞のMHC-E依存性脱顆粒活性を強く阻害したが、WTMlo、WTMneg、OMloおよびOMneg由来のNKG2R+ NK細胞はあまり阻害されなかった。
考察
この研究では、武漢型またはオミクロン型のSARS-CoV-2を用いて、6ヵ月後の時点で、25頭の感染マカク中17頭のBALFからウイルスRNAを検出し、25頭中20頭のBALF Macからウイルス抗原を検出した。WTMhiおよびOMhiのBALF Macは、LPSで刺激したときにIFN-γ産生の減少を示し、WTMおよびOMのBALF NKG2R+NK細胞は、HCと比較してIFN-γ発現の減少を示した。BALF NKG2Rlo NK細胞におけるIFN-γ発現の抑制は、SARS-CoV-2スパイク蛋白質で刺激することにより回復した。スパイク蛋白由来のペプチドV3-11は、MHC-Eに結合してNK細胞の脱顆粒活性を阻害し、V3-11による阻害の程度は、ウイルス量およびBALF中のSpike+ Macの存在と有意に相関していた。WTMloとOMloのNK細胞は、V3-11の抑制効果に対して高い抵抗性を示した。
WTMはOMに比べて急性感染時のウイルス量が多かったことから、武漢株とオミクロン株による感染がヒトのSARS-CoV-2急性感染を模倣していることが示唆された37。その他にも、初感染から数ヵ月後に全身性の炎症が持続するなど、いくつかのパラメータがヒトの所見と類似していた38。注目すべきは、BALF Macに残存するウイルスの頻度が、WTMではOMよりも高かったことである。われわれのデータは、SARS-CoV-2ウイルスリザーバが活発に持続していることを示しており、ヒトにおける持続性ウイルスリザーバの知見と一致している5。ウイルスが残存しているマカクの頻度は、ヒトよりも高い可能性があることは注目に値する。
In vitroの研究では、SARS-CoV-2がヒトのマカクに侵入することが示されている9,39,40。アンジオテンシン変換酵素2（ACE-2）の発現は、COVID-19患者のマックで報告されており、ウイルスタンパク質は死後のさまざまな組織のマックで観察されている4。このことは、Macが生体内でSARS-CoV-2に直接感染している可能性を示唆している。マックにおけるウイルス抗原とRNAの検出は、感染した肺胞上皮細胞の貪食に起因する可能性もある。SARS-CoVや中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）感染で見られるように、抗体依存的な細胞感染の増強もMac感染のメカニズムである可能性がある42。肺には他にも細胞リザーバーが存在する可能性があるが、我々のデータはSARS-CoV-2がMacを播種と長期持続のための重要な貯蔵庫として利用していることを示唆している。
SARS-CoV-2のヒト単球およびMacへの侵入は報告されているが、Macからの感染性ウイルス粒子の放出については不明な点が多い。我々の研究は、SARS-CoV-2がBALF Macの初代培養で産生されることを示している。培養中のウイルス量の増加は、進行中のウイルス複製に対応しており、ウイルスによる細胞の形態学的変化と遺伝子発現の変化を伴っていた。この形態学的変化には、膜の隆起や、培養中の複数のMacを連結する糸状の伸長部の存在が含まれ、これらの伸長部内にウイルスタンパク質が検出された。このことは、SARS-CoV-2の拡散におけるトンネル状ナノチューブに関する報告43と一致しており、細胞間メカニズムによるウイルスの拡散を示唆している。このようなメカニズムにより、免疫系の感知から逃れることができ、SARS-CoV-2が組織内に留まるためのさらなる手段となる可能性がある。一部のサルでは、BALF中のウイルスRNAが生体外で検出されなかった場合でも、BALF Mac培養後にSARS-CoV-2の産生が検出されており、再活性化可能な潜伏感染の存在を示唆している。
培養したBALF Macのトランスクリプトーム・プロファイルから、FN1（フィブロネクチン）の発現が増加していることが明らかになり、観察された形態学的変化に寄与している可能性がある。S100A8/S100A9（カルプロテクチン）の発現も上昇しており、これは感染したヒトにおける報告と同様であった38。S100A8/S100A9は、長期のCOVID/SARS-CoV-2感染後遺症（PASC）44における慢性的なTLR4/RAGEシグナル伝達およびIL-1b、IL-6、腫瘍壊死因子の慢性的発現に関連しており、WTMおよびOM血漿におけるIL-6発現の上昇を説明できる可能性がある。CD36を介してNK細胞を活性化する非多型MHCクラスI様糖タンパク質であるCD1bは、HCと比較してin vitroのBALF WTMおよびOM Macで増加していた。CD1とMHC-E結合リガンドの抗原プロセシング経路は主にエンドソームコンパートメントで起こる32,45。エンドソームの操作がCD1やMHC-Eペプチドのプロセシングに与える影響については、まだ十分に解明されていない47。BALFマックにおけるMHC-EおよびCD1b発現の増加を示す我々のデータは、非カノニカル抗原提示経路のアップレギュレーションを示唆している。
我々は、IFN-γがBALF MacにおけるSARS-CoV-2の複製を阻害することを見出した。WTMおよびOMのBALF MacおよびNK細胞では、HCと比較してIFN-γの発現が減少していた。回復期のサルのBALF Macでは、IL-10発現の増加がIFN-γを阻害する可能性がある。トランスクリプトーム解析により、WTMおよびOMのBALF NK細胞では、HCのBALF NK細胞と比較してFOXJ1 mRNAの発現が増加していることが示された。FOXJ1は、CD4+ T細胞24ではNF-κBの活性化とIFN-γの分泌を阻害することが知られているが、NK細胞におけるその機能は不明である。BALFのNK細胞およびMacにおけるIFN-γ産生障害は、非従来型NKG2R+CD8+T細胞におけるIFN-γ産生によって部分的に補われているかもしれない。さらに、より成熟したNKG2Alo NK細胞によるIFN-γ産生は、スパイクタンパク質によって刺激されるかもしれない。IFN-γはまた、BALF Mac上のMHC-Eのアップレギュレーションを誘導した。MHC-EはNKG2A+ NK細胞を阻害することから、そのアップレギュレーションはMacをNK細胞介在性溶解から保護するかもしれない。このように、IFN-γはウイルスの複製を阻害したが、同時にMHC-Eのアップレギュレーションを通して、SARS-CoV-2感染細胞をNK細胞による殺傷に対してより抵抗性にした。したがって、IFN-γはウイルスの複製を抑制するにもかかわらず、感染細胞の排除を阻害することによって、ウイルスの持続性を促進する可能性がある。
NK細胞の脱顆粒活性は、MHC-Eを介して提示されたV3-11ペプチドによって阻害されたことから、このスパイクペプチドがSARS-CoV-2の免疫反応回避に関与していることが示唆された。SARS-CoV-2のスパイクおよびNsp13タンパク質からのペプチドは、MHC-E16,33に結合することができる。MHC-Eを介してV3-11を提示した標的細胞は、SARS-CoV-2未発症のサルおよびヒトのNK細胞の脱顆粒を阻害したが、WTMnegおよびOMnegのNK細胞の脱顆粒は阻害しなかった。この観察は、WTMnegとOMnegにおいて、MHC-Eを介した阻害を免れる適応的NK細胞が誘導されていることを示し、さらにマック細胞とNK細胞の間の複雑な相互作用を浮き彫りにした。このような適応的機能を持つNK細胞が、なぜすべてのマカクではなく、一部のマカクで生じるのかは不明である。MHC-Eに制限されたNK細胞の適応活性の亢進は、初期感染イベント、サイトカイン環境、先行感染、ワクチン接種、および宿主の遺伝に関連している可能性がある。結論として、我々の研究は、SARS-CoV-2が肺マック内に持続し、細胞間チャネルを介して播種する可能性があることを示した。NKG2R+CD8+T細胞およびNKG2Rlo NK細胞によって産生されるIFN-γは、SARS-CoV-2の持続性を制御し、マック上のMHC-Eの発現を誘導した。一部のマカクのNK細胞は、MHC-Eによる阻害を回避することが可能であり、免疫療法やワクチンによるこのようなNK細胞の誘導性についてさらなる研究が必要である。
方法
ヒトサンプル
健康なドナーの血液サンプルは、パスツール研究所との契約の一環として、フランスの血液バンク（Etablissement Français du Sang）から入手した（C CPSL UNT, 15/EFS/023）。本研究は、イル・ド・フランス第7区の倫理審査委員会（Comité de protection des personnes）の承認を得た。匿名かつ無報酬の献血のため、参加者の性別、人数、年齢は不明である。12人のドナーから50ミリリットルの血液サンプルが得られた。すべての血液サンプルは2019年以前に採取され、PBMCはフィコール勾配を用いて単離され、直ちに凍結された。
マカク
37～60ヵ月のカニクイザル（Macaca fascicularis）をモーリシャスのAAALAC認定繁殖センターから調達した。本試験は、規制に従って適切な封じ込めレベルを有する感染症モデル（Infectious Diseases Models for Innovative Therapies：IDMIT）基盤施設で実施した。感染時、すべての動物は特定のウイルスに対して血清陰性であった。感染後、サルはバイオセーフティ施設で個別に飼育された。オスとメスのサルが研究に参加し、サンプル採取は無作為に行われた。研究プロトコルは、機関内の倫理委員会である'Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives' (CEtEA 44)の声明番号A20_011、20_066、21_069の承認を得た。本試験の承認は、APAFIS 24434-2020030216532863v1、APAFIS 29191-2021011811505374v1、APAFIS 33414-2021101115102064v1の登録番号のもと、「研究・革新・教育省」によって行われた。
盲検化と無作為化
サンプル収集中、研究者は盲検化されていなかったが、動物取扱者はグループ割り当てを知らなかった。データ収集手順は、潜在的なバイアスを最小化するために、注意深く無作為化または適切にブロックした。実験条件および刺激提示の構成に無作為化技術を用い、調査結果の信頼性と妥当性をさらに高めた。本研究に参加した動物はすべて研究に組み入れられ、研究期間中のいかなる時点においても除外されることはなかった。
SARS-CoV-2株
in vivoの研究では、以下の3つの異なるSARS-CoV-2株を用いた：ヒト野生型（武漢）株（hCoV-19/フランス/lDF0372/2020株）、オミクロンBA.1 VOC（hCoV-19/USA/GAEHC-2811C/2021, EPI_ISL_7171744）およびオミクロンBA.2 VOC（hCoV-19/Japan/UT-NCD1288-2 N/2022, EPI_ISL_9595604）。生体内で使用したウイルスストックは、マイコプラズマを含まないVero E6細胞で2回継代して作製した。ウイルスの滴定はVero E6細胞で行った。
実験群サイズの推定
動物研究の「3R」の原則に従い、実験動物の使用を最小限に抑えることを目指した。動物は、年齢、体重、遺伝子型が密接に一致するように選択した。サンプルサイズの計算は、有意水準5％の2標本のt検定（両側検定）における効果量、s.d.、1型過誤、80％検出力を考慮した検出力分析を用いて行った。これらの計算にはG power software version 3.1.9.7.を使用し、Dは（平均値の差）/（s.d.）として決定し、予備的結果から推定した。サンプルサイズの計算には、先行研究に基づき最大D値1.8を考慮した。
動物感染プロトコール
ウイルスの投与量および感染経路は、以前に記載されたプロトコールに従った48。チャレンジドマカクは、前投薬としてアトロピン（0.04 mg kg-1）、麻酔としてメデトミジン（0.042 mg kg-1）を含むケタミン（5 mg kg-1）を用い、鼻腔内および気管内経路の組み合わせにより、合計106 PFUのSARS-CoV-2に曝露された（0日目）。
組織の収集と処理
フィコール密度勾配遠心法を用いてPBMCを分離した。BALFサンプルは遠心分離を行い、単核球は標準的な密度勾配遠心分離を用いて分離した。
鼻咽頭および気管サンプル中のSARS-CoV-2ウイルスRNA定量化
上気道（鼻咽頭および気管）検体は、スワブ（ユニバーサル輸送培地、コパン；またはウイルス輸送培地、CDC、DSR-052-01）を用いて採取した。気管スワブは、喉頭蓋の先端から約1.5 cmの上部気管にスワブを挿入して採取した。採取した検体はすべて、分析まで2℃～8℃で保存した。ウイルスコピー数は、RdRp-IP4 RT-PCR標的配列を含むRdRp遺伝子断片を含むプラスミド標準濃度範囲を用いた定量的RT-PCRにより決定した。検出限界は460コピーと推定された。詳細なプロトコールは、世界保健機関（WHO）のウェブサイト（https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-paris.pdf?sfvrsn=3662fcb6_2）からも入手できる。プライマーセットの配列nCoV＿IP2（5′-ATGAGCTTAGTCCTGTTG-3′、5′-CTCCCTTTGTTGTGTTGT-3′）およびnCoV＿IP4（5′-GGTAACTGGTATGATTTCG-3′、5′-CTGGTCAAGGTTAATAGG-3′）。
BALF細胞におけるSARS-CoV-2ウイルスRNA定量化
ウイルスコピー数は定量的RT-PCRによって決定された。詳細なプロトコールはWHOのウェブサイトに掲載されている。ウイルスゲノムの相対定量は、RNA-to-CT 1 Step Kit（Applied Biosystems、4392938）を用いたワンステップRT-qPCRで行った。サーマルサイクリングは、Windows 10および7500 Fastソフトウェアバージョン2.3を搭載した7500リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）で実施した。2-ΔΔCtは、nCoV-IP4プライマーを用いたウイルスRNAの平均Ct値と、各サルについて得られた18S RNA Ctsに基づいて算出した。
SARS-CoV-2 ELISA
ELISAは既述の方法で行った49。光学濃度を 405 nm で測定し、曲線下面積を算出した。
Luminex (Bio-Plex) および ELISA による形質炎症メディエーターの測定
IFN-γ、IL-1β、IL-23、IL-6、IL-15、IP-10、IL-18およびCD14sを含む必須形質性抗炎症性および炎症性メディエーターのパネルを測定するために、LuminexおよびELISAアッセイを使用した。測定プロセスは、製造業者が提供するガイドラインに従った。測定にはBio-Plex 200システムを用いた。
NK細胞とMacの分離
ヒトCD56+ NK細胞の分離には、Miltenyi Biotec社の抗体コート磁気ビーズを用いたポジティブセレクションにより、PBMCから90%以上の純度を達成した。具体的には、抗NKG2A PE標識モノクローナル抗体（クローンZ199；ベックマン・コールター・ライフ・サイエンシズ社製）を用い、細胞の染色と選択の全工程をメーカーの説明書に従って綿密に行った。
同様に、Simian NKG2R+ NK細胞は、Miltenyi Biotec社の抗体コート磁気ビーズを用いたポジティブセレクションにより、BALFと血液サンプルの両方から90％を超える純度で単離された。この場合、抗NKG2A PE標識モノクローナル抗体（クローンZ199；ベックマン・コールター・ライフサイエンシズ社製）も使用し、細胞の染色と選択の全過程は、供給元の指示に従って厳密に行った。
BALFサンプルからのMacの分離には、抗CD64 PE標識モノクローナル抗体（クローン10.1；BD Biosciences）を用いたポジティブセレクション戦略を用いた。分離したMacを同定するために、Miltenyi Biotec社の抗PEマイクロビーズを用いた。これまでの単離と同様、Macの染色および選択手順は、供給元のガイドラインに従って行った。
細胞培養
K562（human HLA class I-negative erythroleukemia）細胞（ATCC、CCL-243）およびHLA-Eを導入したK562細胞を、10％熱不活性化ウシ胎児血清（FCS）、2mM L-グルタミン、100U ml-1 ペニシリンおよび100μg ml-1 ストレプトマイシンを添加したRPMI 1640（Life Technologies）で培養した。
NK細胞は、10％熱不活性化FCS、2mM L-グルタミン、100U ml-1 ペニシリン、100μg ml-1 ストレプトマイシン、100IU ml-1 IL-2、10ng ml-1 IL-15を添加したGlutamax（Life Technologies社製）入りRPMI1640で培養した。
マック、陽性選択後、24ウェル組織培養プレート（Nunc）中で、FBSと10ng ml-1 Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor（GM-CSF）を添加したRPMI1640中で、5×105細胞/mlの濃度で24時間まで培養した。マクロファージ刺激は、無処置、100 ng ml-1 LPS（Sigma-Aldrich）または20 ng ml-1 IFN-γ（R＆D Systems）を選択し、1 mlあたり1 × 106細胞濃度で、指定された期間行った。
NK細胞刺激アッセイ
NK細胞は、RPMI培地1640（10％FBS、2mmol l-1 L-グルタミン、1％ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン、2-ME添加）中で、組換えヒトIL-2（50U ml-1）1ml当たり2.0×106細胞の濃度で増殖させた。LPSまたはスパイク化合物を以下の濃度で培養に添加した： LPS（Sigma-Aldrich）100 ng ml-1、スパイク化合物10 µg ml-1。その後、細胞を回収し、4％パラホルムアルデヒド （PFA）で固定し、フロー解析のために染色した。
蛍光定量と細胞セグメンテーション法
この研究では、一次培養中のマックにおける個々の蛍光を定量化するために、ロバストな方法論を用いた。このプロセスは、以前の研究50,51を応用したもので、正確で再現性のある結果を保証した。Fijiソフトウェア（バージョン1.53、Java1.8.0_322）を用いて実装した以下のワークフローで、画像のセグメンテーションを行った。このステップにより、その後の閾値処理が強化された。画像の彩度を最適化し、明瞭さと正確さを確保するために、最小と最大のスライダーが手動で調整された。(2) 閾値処理-前処理された画像から2値マスクを作成するために適用された。このステップで、背景から必要なオブジェクトを分離した。(3)マスクの作成と操作-閾値処理された画像に基づいて、分割された対象物を表すマスクが作成された。このマスクにより、分析に重要な領域が分離される。(4)選択範囲の転送-選択範囲はマスクから元の画像に転送された。このステップにより、選択された領域から定量データを抽出することができた。(5)データ解析-「Analyze Particles」ツールを使用して、選択に基づいて望ましいオブジェクトを抽出した。各チャンネルの個々のMFI統計が計算され、セグメント化されたオブジェクトについて報告された。これらのデータから、Mac内の蛍光レベルに関する洞察が得られた。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する抗体
ヒトモノクローナル抗体Cv2.31942は、COVID-19の回復期の患者からクローニングされ、組換えIgG1として産生され、精製された49。
SARS-CoV-2タンパク質の生産
三量体SARS-CoV-2およびBA.1スパイクエクトドメインの安定化バージョン、次いでC末端タグ（8xHis-tagおよびAviTag）をコードするコドン最適化ヌクレオチド断片を合成し、pcDNA3.1/Zeo(+)発現ベクター（Thermo Fisher Scientific）にクローニングした。糖タンパク質は、ポリエチレンイミン沈殿法を用いて、指数関数的に増殖するFreestyle 293-F懸濁細胞（Thermo Fisher Scientific）に一過的にトランスフェクションすることにより生産した。タンパク質は、製造者の指示に従ってNi Sepharose Excel Resin（GE HealthCare社製）を用いた高性能クロマトグラフィーによって培養上清から精製し、Slide-A-Lyzer透析カセット（Thermo Fisher Scientific社製）を用いてPBSに対して透析し、NanoDrop 2000装置（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて定量し、NuPAGE 4-12% Bis-Trisゲル（Life Technologies社製）を用いたSDS-PAGEによって純度を管理した。多色フローサイトメトリー免疫蛍光染色のために、SARS-CoV-2 tri-Sタンパク質は、Enzymatic Protein Biotinylation Kit（Sigma-Aldrich）を用いてビオチン化した。
MHC-Eに効率的に結合する可能性のあるSARS-CoV-2ペプチドの検索
IEDB予測ツール（バージョン2.27）を用いて、MHC-Eに結合する可能性のあるペプチドを同定した。最近の研究で、SARS-CoV-2 NSP13にはMHC-E16に結合できるペプチドが含まれていることが明らかになりました。これらのペプチドの多くは、最初にin silicoで同定され、その後in vitroで検証されたが、MHC-Eペプチドの提示は、特にTAPやインターフェロン調節因子1（IRF1）のようなMHCクラスIプロセッシング経路の構成要素に欠損がある細胞では、TAPとは無関係に起こりうることを認識することが重要である32,52,53。このような欠損はSARS-CoV-2感染時に生じる可能性があり、代替HLA-Eペプチドのレパートリーにつながる32,54。
興味深いことに、ほとんどのHLAクラスI分子は、非古典的なHLA-Eに結合するためにリーダー配列を提供しており、これらのシグナル配列の切断はSPasとSPP31,55,56によって媒介される。実際、これらのリーダーペプチドは、HLA-Eにとって支配的なペプチドの供給源となっている。シグナルペプチドの本質的な膜内タンパク質分解は、MHCクラスIシグナルペプチドを生成する上で極めて重要なステップである32,52。しかしながら、TAP非依存性シグナルペプチドのMHCクラスI分子への正確なローディング機構は、いまだ解明されていない57。
真核細胞では、分泌タンパク質や膜タンパク質には、小胞体（ER）へのタンパク質のターゲティングを誘導するのに重要なシグナル配列が含まれている58,59。タンパク質伝導チャネルに挿入された後、シグナルペプチドは通常シグナルペプチダーゼ（SPas）60によって前タンパク質から切断される。その後、シグナルペプチドは小胞体膜内に小さなドメインとして閉じ込められ、プレセニリン型アスパラギン酸プロテアーゼSPP32,61,62によって膜貫通領域内で切断され、膜内タンパク質分解を受ける。SPasとSPPによるプロセシングは、ペプチドローディング複合体の外側で起こると考えられていることから、この複雑な機構は、リガンドの長さと質を最適化し、新生MHCクラスI分子へのペプチドのローディングを促進するという極めて重要な役割を担っている。さらに、結合したペプチドのレパートリーを「編集」して、その親和性を最大にする。MHCクラスIの結合に適したペプチドリガンドは、ER膜からのシグナルペプチド断片の放出を促進するSPPによる膜内タンパク質分解を受けて生成されると考えられている32。
そこで、非古典的な経路でMHC-Eに結合する可能性のあるペプチドを探索することにした。そこで、SignalP 6.0（文献63）を用いてシグナルペプチドの構造解析を行った。SignalPソフトウェア（バージョン6.0）を用いて、MERS-CoV（A0A140AYZ5）、SARS-CoV-1（P59594）、SARS-CoV-2（P0DTC2）のスパイクタンパク質のN末端領域を精査した。この解析は、SARSスパイクタンパク質のシグナルペプチドがシグナルペプチダーゼ（SPas）とSPPによって切断されることを強く示している。通常、シグナルペプチドの配列は次の3つのドメインで構成されている：6-15個のアミノ酸からなる青色の疎水性コア（h領域）；小さな非荷電アミノ酸で特徴づけられる緑色の極性C末端（c領域）；正電荷を持つ赤色の極性N末端領域（n領域）。標準的な」分泌シグナルペプチドとして分類されるSec/SPIシグナルペプチドは、Secトランスロコンを通って輸送され、シグナルペプチダーゼIによって切断される。特にV3-11ペプチドの配列は、正規のMHC-E結合モチーフに最もよく似ている。
ペプチドと HLA-E 安定化アッセイ
ビオチン化された、あるいはされていない合成ペプチドはProimmune社から購入し、2 mg ml-1の濃度でDMSOに溶解した。使用したコントロールペプチドは、VL9（VMAPRTVLL）とHSP60（QMRPVSRVL）であった。K562およびK562-E*0101細胞を、無血清AIM-V培地（GIBCO BRL）中、37℃で15-20時間、1mlあたり1-3×106細胞の濃度で合成ペプチド（3-300μM）とインキュベートした。コントロールの培養は、ペプチドを加えずに37℃で16時間以上保持した。その後、細胞を回収し、PBSで洗浄した後、PE標識抗HLA-E抗体とインキュベートしてHLA-Eの細胞表面発現を測定し、PBSで2回洗浄し、100μlのCyto x（BD Biosciences）で固定した。細胞はDIVAソフトウェア（バージョン8.0）を搭載したFortessa（BD Biosciences）を用いて取得し、全ての解析にはFlowJoソフトウェア（バージョン10.4.2；Tree Star）を用いた。結果は直接MFIとして表した。
多色性フローサイトメトリー免疫蛍光染色
フローサイトメトリーおよび免疫蛍光染色に用いた抗体を補足表1に示す。PBMCおよびBALFリンパ球は、肺胞マクロファージの自家蛍光を最小化するためにクリスタルバイオレット65を用い、既述のように染色した64。抗NKG2A抗体は、シミアン細胞のNKG2A、NKG2CおよびNKG2Eを認識し、ヒト細胞のNKG2Aを認識する。フローサイトメトリーはLSRFortessa（BD Biosciences）を用いて行い、細胞内染色はBD Cyto x/Cytopermを用いて行った。データ解析は、FlowJoプラグインPhenograph（バージョン3.0）およびuniform manifold approximation and projection（UMAP；バージョン3.1）を使用し、FlowJo 10.4.2 software（FlowJo, LLC）を用いて行った。PhenographはK平均値を50とし、UMAPは最近傍値を25、最小値を0.25とした。
免疫蛍光染色では、様々な培養期間の後、Macを4％PFAで固定し、その後染色を行った。膜の透過化はTriton X-100で行い、一次抗体を適用した。2時間のインキュベーション後、未結合の一次抗体をPBSで洗浄した。蛍光色素と結合させた二次抗体（Thermo Fisher Scientific; 1:200）を用いて、37℃で1時間検出した。切片はDAPI（4′6-diamidino-2-phenylindole；Vector Laboratories）を含むVectashieldでマウントした。免疫蛍光分析は、CELENA X Explorer（バージョン 1.6.0）を搭載した CELENA X High Content Imaging System（Logos Biosystems）またはスピニングディスク型 Ti2E Microscope（Nikon-Yokogawa CSU-W1）を用いて行った。
NanoString NHP 免疫学 V2 パネル マルチプレックス遺伝子発現プロファイリング
NanoString nCounter解析システム（NanoString Technologies）を用いて、RNA Later Tissue（RLT）バッファー（20,000 cells per µl）中の全細胞溶解液を用い、サプライヤーの指示に従って遺伝子発現プロファイリングを行った。RNA転写物は、754遺伝子とデータ正規化のための16の内部参照遺伝子を含むnCounter NHP Immunology V2 Panelで解析された。データ解析にはROSALIND (https://rosalind.bio/)を使用し、ROSALINDによるHyperScaleアーキテクチャを用いた。品質管理には、リード分布パーセント、バイオリンプロット、同一性ヒートマップ、サンプルMDSプロットを用いた。正規化は、レーン内のカウントを同じレーンからのノーマライザープローブの幾何平均で割ることにより行い、geNormを介してハウスキーピングプローブを選択した。Fold changeとP値は、nCounter Advanced Analysis 2.0ユーザーマニュアルのfastメソッドを用いて計算し、偽発見率（FDR）についてはBenjamini-Hochberg法でP値を調整した。最終的なヒートマップへの差次的発現遺伝子のクラスタリングは、fpc Rライブラリを用いて、特にシグナル方向、遺伝子の位置、役割、タイプなどの因子を考慮し、メドイド周りのパーティショニング法を用いた。
MHC-E依存性NK細胞ウイルス抑制アッセイ
NK細胞活性は、以前に記述されたように、細胞表面CD107aの発現を通して決定された66。K562-E0101細胞を30-300μMのペプチドとともに26℃で15-20時間インキュベートし、NK細胞をペプチドでパルスした2×104個のK562-E0101標的細胞とNK細胞/標的細胞比5:1で共培養した。標的細胞はNK細胞非存在下で並行して培養した。アッセイ開始時に抗CD107a抗体を添加し、刺激開始1時間後にGolgiStopとGolgiPlug（いずれもBD Biosciences）を添加した。8時間培養後、細胞懸濁液を染色して生存率を測定し、フローサイトメトリーでCD107a発現量を測定して細胞傷害活性を解析した。阻害率は以下のように計算した： 阻害率＝100-特異的溶解。特異的溶解は、以下の式を用いて66,67の記述に従って計算した： (E-S）／（M-S）×100（ここで、E＝ペプチドを負荷した標的細胞に対するNK細胞の脱顆粒、S＝自発的なNK細胞の脱顆粒、M＝ペプチドを含まない標的細胞に対するNK細胞の脱顆粒）。
統計
データ解析と統計検定は、GraphPad Prism 7（GraphPad Software、バージョン10.0.2）を用いて行った。図1b、4a、7で用いたMann-Whitney検定、図1c,g,h,2,3,4,5,6,7で用いたKruskal-Wallis検定とDunnのpost hoc検定など、様々な統計解析を行った。1c,g,h、2a,c、3、4a,g、5-7、8d,eではKruskal-Wallis検定とDunn's post hoc検定、図1kではノンパラメトリックWilcoxon Signed-Rank検定、図1b,3d,5c,6h,i,8fでは線形回帰、図1k,4f,5c,f,6h,i,7f,8lではSpearman相関分析を用いた。有意閾値はP < 0.05とした。多重比較にはFDRとPadj補正を適用した。
報告の要約
研究デザインの詳細については、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの入手可能性
著者らは、本研究の結果を裏付ける他のすべてのデータは、論文およびその生データファイル内で入手可能であるか、著者らの要請に応じて入手可能であることを宣言する。ソースデータは本論文とともに提供される。
コードの入手可能性
ソースコードおよび関連資料は、Gene Expression OmnibusのGSE243731、GSE243732、GSE243733、GSE243734の各レファレンスからアクセスおよびダウンロードが可能である。
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謝辞
IDMITセンターの獣医師およびスタッフ（B. Delache、E. Burban、J. Demilly、N. Dhooge、S. Langlois、P. Le Calvez、M. Potier、F. Relouzat、J. M. Robert、C. Dodan）には動物実験に、Q. Pascalには剖検に、F. DucancelおよびY. Gorinにはロジスティクスと安全管理に多大な協力をいただいた。C. PetitdemangeはPasteur-Roux Cantariniフェローシップ、Young Investigator Sidactionフェローシップ、米国国立衛生研究所（NIH）助成金（R01AI143457）の支援を受けた。A.O.R.とE.B.は、パリ・シテ大学とMinistère français de lʼEnseignement supérieur, de la Recherche et de lʼInnovationから博士研究奨学金を受けた。本研究は、Institut Pasteurの'URGENCE COVID-19'募金キャンペーンの支援を受けた。H.M.はInstitut PasteurとINSERMからコア資金を受け、ANR REACTing Covid19（20RR028-00）、欧州委員会Horizon 2020プログラム（RECoVERプロジェクト、101003589）、Institut Pasteur Task Force COVID-19（2019-NCOVTHERAMABプロジェクト）、Fondation de France（00106077）から助成金を受けた。さらに、R.K.R.に対するNIHの助成金R01DK130472およびR01AI143457の支援に感謝したい。Fortessa装置の購入については、Institut PasteurおよびGileadの支援に感謝する。また、IDMITのFlowCyTech施設に対するANR-11-INBS-0008助成金およびPIA助成金ANR-10-EQPX-02-01を通じたフランス政府-インフラストラクチャー（PIA）のための未来投資プログラムによるIDMITの支援に感謝する。また、Institut PasteurのUtechS Photonic BioImaging（Imagopole）とC2RT施設を支援するためのInvestments for Future助成金ANR-10-INSB-04にも同様に感謝する。
著者情報
著者および所属
パリ・シテ大学パスツール研究所、HIV・炎症・持続性ユニット、パリ、フランス
ニコラ・ユオ、ベアトリス・ジャクラン、キャロリーヌ・プティドゥマンジュ、マリー・ラゼリーニ、エマ・ボーモン、アウレリオ・オルタ・レセンディス、ミカエラ・ミュラー・トゥルトウィン
パリ・シテ大学パスツール研究所、INSERM U1222、体液性免疫学ユニット、パリ、フランス
シリル・プランセ、ピエール・ローゼンバウム、ユーゴ・ムーケ
パリ・サクレー大学、INSERM、CEA、ウイルス性・自己免疫性・腫瘍性・細菌性免疫学（IMVA-HB/IDMIT/UMR1184）、フォントネ・オ・ローゼズ＆クレムリン・ビセートル、フランス
ヴァネッサ・コントレラス＆ロジェ・ル・グラン
パリ・シテ大学パスツール研究所、構造ウイルス学ユニット、CNRS UMR3569、パリ、フランス
フェリックス A. レイ
米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部、ベス・イスラエル・ディーコネス医療センター、ウイルス学・ワクチン研究センター
R. キース・リーブス
自然免疫学・比較免疫学部門、ヒトシステム免疫学センター、外科、デューク大学医学部、ダーラム、ノースカロライナ州、USA
R. キース・リーブス
マサチューセッツ総合病院ラゴン研究所、マサチューセッツ工科大学、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
R. キース・リーブス
デューク大学ヘルスシステム、デューク・リサーチ・アンド・ディスカバリー・アットRTP（米国ノースカロライナ州ダーラム
R. キース・リーブス
貢献
実験のデザインはN.H.が行った。N.H.、B.J.、M.L.、C.Petitdemange、C.Planchais、E.B.、A.O.R.、P.R.が実験を行った。V.C.とR.L.は動物実験をコーディネートした。B.J.は倫理・安全プロトコールを担当し、サンプル輸送をコーディネートした。N.H.、C.Planchais、P.R.、E.B.およびC.Petitdemangeはデータを分析し、全著者と議論した。H.M.とC. Planchaisは抗スパイクAbsと組み換えスパイクタンパク質を提供した。M.M.T.は最初のプロジェクトをデザインした。M.M.T.、F.R.およびR.K.R.は資金を得た。原稿はN.H.とM.M.T.が執筆し、共著者全員が査読した。
共著者
Nicolas Huotまで。
倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature Immunology誌は、本論文の査読にご協力いただいた匿名査読者に感謝する。主担当編集者：Ioana Visan、協力：Nature Immunologyチーム。査読者レポートあり。
追加情報
出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
拡張データ
Extended Data 図1 回復期のサルにおけるウイルスおよび免疫学的パラメータ。
(a) 様々な時点（感染後2～265日（p.i.））で採取したWTMおよびOMの気管および鼻腔ぬぐい液中のウイルス量を、ウイルスゲノムRNA（gRNA）について分析した。曲線下面積（AUC）は、p.i.2～21日の間に排出された全gRNAを表す。 b）少なくともp.i.221日目に採取したWTMおよびOMの血漿中で、スパイクタンパク質全体またはRBDドメインに対してELISA法で測定した抗体価（IgGおよびIgA）。(c）少なくとも221日p.i.に採取したHC、WTMおよびOMの血漿中のサイトカイン（IL-23、-18、-6および-15）のLuminexアッセイおよびサイトカインIP-10およびsCD14のELISAアッセイ（d）少なくとも221日p.i.のBALF Macのフローサイトメトリー分析ゲーティング戦略、 サイズおよび造粒度パラメータ（FSC-A、FSC-H、SSC-A、SSC-H）ならびにCD45およびHLA-DRの表面発現を用いた。(e)少なくとも221日p.i.における、形質サイトカイン（bと同様）とBALF CD45+細胞中のリンパ球またはMacの割合との間のスピアマン相関(f)BALF Macの特徴決定に用いたゲーティング戦略。HCとWTMについて示したマーカーの代表的なドットプロット。(g)少なくとも221日p.i.のHC、WTM、OMのBALF Macにおける様々なマーカーの平均蛍光強度(MFI) (h)少なくとも221日p.i.のHC、WTM、OMのBALF Macで測定されたマーカーの頻度 各パネルでは、個々のマカクを表し、Spearman相関については、黒の全線は線形回帰を表し、点線は信頼区間(95%)を表す。各ポイントには対応するサルの名前を付けた。記号は個々のサルを表し、バーは中央値を示す。p-値は、マン・ホイットニー検定を適用したパネル(a)(左)を除き、Kruskal-Wallis検定とダンの事後検定によって決定した。
Extended Data 図2 HCと比較したWTMとOMのMac成分。
(a)細胞成分とウイルス成分を定量化するための、画像解析を用いた2次元細胞セグメンテーションプロセスの概要。(1)サンプル調製と画像取得、(2)エッジ検出精度向上のための画像前処理、(3)ImageJを用いた閾値ベースのセグメンテーション。詳細な方法論はMethodsのセクションにある。(b)221日目以降のWTMおよびOMから分離したBALF CD64+ Macの高倍率エピ蛍光画像とHC対照画像を示す。これらの細胞は、リポ多糖（LPS）と共に、またはリポ多糖（LPS）なしで8時間培養し、DAPI、IFN-γ、IL-23、IL-1β、IL-18、またはIL-10で染色した。スケールバーは10μmを表す。(c)p.i.221日以上のHC、WTM、OMのBALFから単離したマクロファージにおけるIL-10、IFN-γ、IL-23、IL-18、およびIL-1β発現について、(a)に記載したようにサイトカイン平均蛍光強度（MFI）を測定した。個々の細胞をグラフに示した。(d)各動物のp.i.221日以上における全BALF細胞中のウイルス量の測定値を表にまとめた。(e)LuminexおよびELISAアッセイを用いたサイトカイン分析により、p.i.221日以上における全BALF細胞中のウイルスRNAレベルに基づいてサルを分類した。中央値と四分位範囲を示した。統計的有意性は、パネルcではŠídákの多重比較検定補正を用いた2元配置分散分析検定（***=p < 0.0001, **=p < 0.001, *=p < 0.01）、パネルdではダンの事後検定を用いたクラスカル・ワリス検定を用いて評価した。
出典データ
Extended Data 図3 培養BALFマクロファージにおけるウイルス化合物の検出。
(a)共焦点顕微鏡画像は、221日p.i.以上のWTMおよびOMから単離したBALF CD64+マクロファージにおけるSARS-CoV-2非構造蛋白質3（NSP3）および二本鎖RNA（dsRNA）の細胞内局在と蓄積を示す。免疫染色はDAPI（核；紫）、抗dsRNA（赤）、抗NSP3（緑）。黄色の矢印はマクロファージ内のdsRNAを強調している。(b) (a)と同様に、BALF CD64+マクロファージにおけるNSP3とdsRNAの細胞内局在を共焦点顕微鏡像で示したもので、マクロファージ内の突起を強調するためにファロイジン（白）染色を加えた。青矢印は突起の存在を示す。仮足およびTNT様構造の可視化を容易にするため、アクチンのみを表示するフィールドの閾値を高めた。(c）（b）と同様の共焦点顕微鏡像で、MAC培養で観察された合胞体を示す。a）のスケールバー＝45μm、（b）および（c）のスケールバー＝35μm。一部の画像は、可視化の3次元的側面を強調するために3Dレンダリング技術を使用している。
Extended Data 図4 BALFマクロファージのin-vitroトランスクリプトーム解析。
CD64+マクロファージは、少なくとも221日p.i.の5人のHC、5人の無作為に選んだWTM、および10人のOMのBALFから単離した。8時間の培養後、nanoString nCounterシステムを用いてプロファイリングした。(a）主成分分析（PCA）は、回復期のサルのクラスタリングパターンを示す。OMサンプルは紫色の三角形、WTMサンプルは赤色の四角形で表される。ボルケーノプロットは、WTMとOMの間で有意に発現が増加した遺伝子と減少した遺伝子を強調する。(b) (a)と同様に、ボルケーノプロットは、WTMとHCの間（上方）またはOMとHCの間（下方）で有意に発現が増加した遺伝子と減少した遺伝子を強調する。(c)ヒートマップは、(a)で得られたHallmark遺伝子セットに対して行ったGene Set Enrichment Analysis (GSEA)の結果、上位50遺伝子を表示する。(d)濃縮プロットは、(a)と同様にCD64+ MacのGSEA Hallmark解析で濃縮されたデータセットを示し、実行中の濃縮スコア(ES)とランク順リスト上の遺伝子セットメンバーの位置を表示する。(e)ゲーティング戦略により、少なくとも221日後のHC、WTM、OMのBALFにおける異なるリンパ球集団が定義される。(f）HC、WTM、OMのBALFにおける様々なリンパ球集団の比較。(g) (e)に記載したBALF CD45+リンパ球におけるマーカー発現の比較。各グラフにおいて、個々の記号は個々のサルを表し、棒グラフは中央値を示し、四分位範囲は四分位範囲を示す。
出典データ
Extended Data 図5 BALFマクロファージにおけるSARS-CoV-2の複製に対するIFN-CL263の影響。
(a)共焦点顕微鏡画像は、IFN-γの有無にかかわらず培養した221日p.i.以上のWTMおよびOM由来のBALF CD64+マクロファージにおけるSARS-CoV-2 dsRNAの細胞内蓄積を示す。DAPI（核）は紫色、抗dsRNA染色（SARS-CoV-2 dsRNA）は赤色。 (b) IFN-γを添加または無添加で培養した、221日p.i.以上のWTMおよびOMのBALFから単離したCD64+ MacにおけるSARS-CoV-2 dsRNA MFIの測定。(c)共焦点顕微鏡画像は、IFN-γ刺激の有無にかかわらず培養した、221日p.i.以上のWTMおよびOMのBALF CD64+ MacにおけるMHC-E局在を示す。DAPI（核）は青色、抗dsRNA染色（SARS-CoV-2 dsRNA）は赤色、抗MHC-E染色は緑色。(d)WTMのBALFから単離したCD64+ Macs、およびIFN-γを添加または無添加で培養した221日p.i.以上のOMにおけるMHC-E MFIの測定。p値は、Šídákの多重比較検定補正を用いた2元配置ANOVA検定を用いて決定した。
出典データ
Extended Data 図6 BALF NKG2R+ NK細胞のトランスクリプトーム解析。
(a)上：PCAはWTMとHCサンプルのクラスタリングパターンを示す。赤丸はWTM、灰色丸はHCを表す。各PCAプロットは実行された特定の比較を示す。下： 横線はp値=0.05を表し、縦線はlog2 fold change > 1または< -1を表す。(b)少なくとも221日齢のHC、WTM、OMから単離したBALF NKG2R+ NK細胞における様々なマーカーのMFIの比較(c)少なくとも221日齢のWTM、OMから単離したBALF NKG2R+ NK細胞におけるNKG2R MFIと、少なくとも221日齢のHC、WTM、OMから単離したBALF NKG2R+ NK細胞におけるNKG2R MFIの間のスピアマン相関分析。 d）少なくとも221日p.i.で分離したHC、WTM、およびOM由来のBALF NKG2R+ NK細胞で測定した、バルクNK細胞中のNKG2RloCD16-、NKG2RhiCD16-、NKG2RhiCD16+、およびNKG2RloCD16+集団の比較。 i.（e）バルクNK細胞中のNKG2RhiCD16-集団、NKG2RhiCD16+集団、およびNKG2RloCD16+集団の頻度間のスピアマン相関（（d）と同様）、および図2と同様に測定したSpike+ Mac。すべてのスピアマン相関について、黒い実線は線形回帰を表し、点線は信頼区間（95％）を示す。記号は個々のマカクを表し、バーは中央値を、四分位範囲は四分位範囲を示す。p値はKruskal-Wallis検定とDunnの事後検定によって決定した。
出典データ
Extended Data 図7 SARS-CoV-2スパイクタンパク質のリンパ球への結合。
(a) p.i.221日以上のHC、WTM、OMの全BALF細胞における3量体スパイク表面染色のゲーティング戦略を示す代表的フローサイトメトリープロット。(b) HC、WTM、OMのCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NKG2R+ NK細胞における表面三量体スパイク染色の割合を示すドットプロット。ドットプロットは明瞭化のため色分けされている。(c)左：221日p.i.以上におけるHC、WTM、およびOMの全BALF細胞における三量体スパイク表面染色陽性のCD20+ B細胞の割合を示すグラフ。右：BALF CD20+ B細胞のうち三量体スパイクで染色された細胞の割合と、図1と同様に血漿中で測定されたIgG抗RBD量との間の正のスピアマン相関。(d)221日p.i.以上におけるHC、WTM、OMのBALF細胞における三量体スパイク表面染色陽性CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞の割合を示すグラフ。各ポイントには対応するサルの名前を付した。各グラフにおいて、点、四角、または三角は個々のサルを表し、棒は中央値を、四分位範囲は四分位範囲を示す。 p-値はKruskal-Wallis検定とDunnの事後検定を用いて決定した。
出典データ
Extended Data 図8 SARS-CoV-2スパイクタンパク質暴露後のNK細胞応答。
(a) HC、WTM、およびOMのBALFから得たNK細胞における細胞内GzmBまたはIFN-↪Ll263の割合を示す代表的なドットプロット。ドットプロットの周りの赤と紫の四角は、それぞれWTM（n = 10）とOM（n = 10）の回復期サル群を示す。(b) NKG2Rhi NK細胞とNKG2Rlo NK細胞間の細胞内GzmBまたはIFN-↪Ll3↩の比較解析（三量体スパイクタンパク質に24時間暴露後）。各記号は個々のサルを表し、中央値と四分位範囲が描かれている。p値はWilcoxon matched-pairs signed rank testを用いて決定した。
図9 SARS-CoV-2シグナルペプチドにおけるHLA-E結合能の同定。
(a) TAP依存経路とTAP非依存経路を介したペプチド処理をまとめた文献ベースのスキーム。(b)シグナルペプチダーゼ(SP)とシグナルペプチドペプチダーゼ(SPP)による切断を示唆するSignalP 6.0ソフトウェアを用いた、スパイクタンパク質中のシグナルペプチドの存在とその切断部位を予測するインシリコ解析。シグナルペプチドは疎水性コア（h領域）、極性C末端（c領域）、極性N末端領域（n領域）からなる。(c)SARS-CoV-2シグナルペプチド(P0DTC2)の5'領域における4つの重なり合うノナマー、V3-11はMHC-E結合モチーフに似ている。MHCの制限と参考文献。(d)スパイク配列全体を対象とした、IEDB解析リソースを用いたHLA-E結合のインシリコ・エピトープ予測。グラフは、HLA-E01:01 結合スコア、プロテアソーム切断スコア、輸送スコア、および HLA-E 結合とプロセシングを組み合わせた合計スコアを示しています。赤い点は(c)のスパイクSPペプチドを表し、S269-277は既述のペプチドに対応する。(e) NetMHCpan - 4.1を用いて、SARS-CoV-2スパイクタンパク質全体を解析したHLA-EとHLA-Aへの結合確率の比較。複数のノナマーは黒い点で表され、点の位置は予測されるHLA-E結合能を示す。HLA-E01:01（y軸）と HLA-E02:01（x軸）のパーセンタイルランクが示されています。(f) NKG2A+およびNKG2C+ヒトNK細胞応答を示す代表的なドットプロット。(g)ペプチド(VL9、HSP60、またはV3-11)を負荷したK562-E01細胞、またはペプチドを負荷しないK562-E*01細胞と共培養した後、221日p.i.以上におけるHCおよびWTMから単離したCD107a+ NK細胞の割合を示すドットプロット。薄い四角は野生型感染回復期サルを、薄い灰色の四角はHCを示す。
Extended Data 表1 本研究に参加したカニクイザルのベースライン特性
フルサイズの表
補足情報
補足情報
補足表1 フローサイトメトリーおよび免疫蛍光染色に使用した抗体のリスト。
報告概要
査読ファイル
ソースデータ
ソースデータ
図1～8および拡張データ図2、4～7、図1～8および拡張データ図2、4～7に描かれたグラフのデータ。
権利と許可
オープンアクセス 本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合にその旨を示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
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Huot, N., Planchais, C., Rosenbaum, P. et al. 肺胞マクロファージにおけるSARS-CoV-2ウイルスの持続性は、IFN-γとNK細胞によって制御されている。Nat Immunol (2023). https://doi.org/10.1038/s41590-023-01661-4
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受領
2022年4月15日
受理
2023年9月26日
発行
2023年11月02日
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https://doi.org/10.1038/s41590-023-01661-4
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SARS-CoV-2
ネイチャー免疫学 (Nat Immunol) ISSN 1529-2916 (オンライン) ISSN 1529-2908 (印刷)
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