イオンチャネル発現による細胞電気生理の巨視的制御

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研究論文
計算・システムバイオロジー生命システム物理学
イオンチャネル発現による細胞電気生理の巨視的制御

cell electrophysiology
マリオ・ガルシア＝ナバレテ 他
2022年11月9日
https://doi.org/10.7554/eLife.78075

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図とデータ
概要
細胞は、電気信号を化学的出力に変換することで、より大きな距離の情報の能動的な輸送を促進する。この電気から化学への変換には、厳密に制御されたイオンチャネルの発現が必要である。イオンチャネルの発現の変化は、不整脈、てんかん、癌などの多くの病的疾患の目印となる。イオンチャネルの活性は、光や化学的な刺激によって局所的に制御することができますが、イオンチャネルの発現を時空間スケールで調整することは困難です。そこで、化学物質の濃度を読み取り、カリウムチャネルの動的な発現に変換する酵母Saccharomyces cerevisiaeを作製しました。植物ホルモンであるオーキシンとサリチル酸を介し、合成二重フィードバック回路がカリウムチャネルの発現を制御し、巨視的に調整された細胞膜電位のパルスを生成することを明らかにした。本研究は、真核生物の細胞集団において、遺伝子発現によって電気的活動を制御するコンパクトな実験モデルを提供し、様々な細胞工学、合成生物学、そして潜在的な治療への応用のための基盤を提供する。

編集部からの評価
本研究の重要な貢献は、遺伝子回路を操作して細胞膜電位を制御できるようにしたことである。本研究のデータの提示は説得力があり、電気生理学的な変化が外部からの化学的刺激によって生じることを示すための制御がなされている。この研究は、非神経系の生体電位に取り組む人々、特に合成生物学者や生体工学者にとって興味深いものであろう。

https://doi.org/10.7554/eLife.78075.sa0
決定書
Scietyに関するレビュー
eLifeのレビュープロセス
はじめに
電気信号は、ノイズの多い細胞や組織間で情報を迅速に伝達するためのアクティブなメカニズムを提供します。王国にまたがるこの現象の顕著な例には、興奮性ニューロン回路（Aron and Yankner, 2016）、植物防御シグナル伝達（Masatsugu, 2018）、バイオフィルム増殖の代謝調整（Prindle et al, 2015）などがあります。これらの一見異なる電気信号の形態には、イオンチャネルが関与している。外向き整流性カリウムチャネルは、細胞内リザーバーから細胞外空間へカリウムを放出し、それによって隣接する細胞間のカリウム交換を可能にする（Debanne et al.、1997）。細胞内におけるイオンチャネルの迅速なゲーティングは、細胞の電気生理の中心である細胞膜電位（PMP）のバランスを維持します（Naundorfら、2006年）。

カリウムチャネルの活性は、電圧ゲーティング、機械的または光刺激、および外部リガンドによって局所的に調節されることがあります。過去10年間で、イオンチャネルのオプトジェネティクスと化学生物学の進歩は、生命を脅かす主要な疾患を治療するという究極の目標を持つ、生細胞の電気活性の局所制御による多数の医療アプリケーションに力を与えた（Gradinaru et al, 2010; Häfner and Sandoz, 2022; Snyder, 2017; Montnach et al, 2022）。興味深いことに、最近の研究では、イオンチャネルの発現と膜電位の状態の空間的・時間的な制御が、心不整脈、てんかん、または様々な種類の癌などの病態の目印として重要であることが示されています（Rosati and McKinnon, 2004; Lastraioli et al, 2015; Zsiros et al, 2009; Niemeyer et al, 2001; Biasiotta et al, 2016）。しかし、大きな課題は、拡張された空間-時間スケールでのイオンチャネルの合理的な制御を実現することである。このような戦略は、てんかん、慢性疼痛、不整脈、あるいは潜在的に様々な種類の癌の治療における高度なアプリケーションの基礎基盤を提供するものである。しかしながら、イオンチャネルの発現を調節することによって真核細胞の電気生理を誘導的に調節できるような実験モデルは存在しません。

そこで、我々はモデル真核生物であるサッカロミセス・セレビシエの細胞集団において、環境変化に応じてイオンチャネルの発現を制御できる合成遺伝子制御機構を構築した。マイクロ流体デバイスを用いたライブセルイメージングとコンピュータモデリングを組み合わせることで、生きた細胞集団におけるイオンチャネルとPMPのマクロなリアルタイム変調に適した真核生物モデルを検証した。

結果および考察
植物ホルモンによる巨視的なイオンチャネル発現の制御
化学メッセンジャーや光は、細胞膜上のイオンチャネルの局所活性を選択的に制御できる（Gradinaru et al., 2010; Häfner and Sandoz, 2022; Snyder, 2017; Montnach et al.） これに対して、我々は、マクロなレベルでイオンチャネルの発現を化学的に調整することで、イオンチャネル調節の代替システムを実現しようとした。この概念を検証するために、我々はモデル真核生物である酵母S.cerevisaeを用いました。以前、我々は植物ホルモンであるオーキシンとサリチル酸による化学的刺激に基づいて、細胞集団全体の遺伝子発現を制御する合成2成分回路を開発しました（Pérez-García et al.、2021）。この回路は、オーキシン（IAA）とサリチル酸（SA）によってそれぞれ抑制される、人工のMar型細菌制御因子（Will and Fang, 2020）；IacR転写活性化因子とMarR転写抑制因子（Pérez-Garcíaら, 2021；図1A）から構成されています。この回路は、酵母の遺伝子発現を時空間的に拡大調整できるため、私たちのアプリケーションに理想的であると考えました（Pérez-García et al.）

図1、5つの補足

開ループ回路によるイオンチャネル発現の制御。
(A) 構成的に開口するKcsA*細菌カリウムチャネルの発現を駆動する開ループシステムの模式図。アクチベーターIacRとリプレッサーMarR（ODCデグロンでタグ付け；Takeuchi et al... 詳細ページへ

図1-ソースデータ1
図 1H, I のソースデータ。

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酵母でカリウムチャネルTOK1を過剰発現させると、PMPが過分極することが知られている（Sesti et al.、2001）。したがって、理論的には、我々の戦略は、遺伝子発現レベルの協調的な調節を通じてイオンチャネル活性を直接制御し、PMPのグローバルな変化をもたらすことが可能である。我々のシステムでは、チャネル発現の変化は、主に環境中の植物ホルモンの時間的な状態に基づいて、PMPに関連した変化を引き起こすだろう（図1A）。重要なことは、内部代謝プロセスに依存する電位依存性チャネルの開口は、構成的に開口しているイオンチャネルを使用することによって減衰する可能性があることである（図1B）。そこで、合成回路の出力モジュールとして、開放型細菌カリウムチャネルKcsA*（Doyle et al., 1998; Cuello et al., 2010; Sun et al., 2020）を使用した（図1B、図1-図1）。ダイナミックな環境を作り出すために、我々はマイクロ流体チップ上で制御された条件を採用し、酵母はSAとIAAの反合パルスを調節可能な周波数で刺激する連続培地灌流下で増殖できるようにした（図1C）。PMPの変化をモニターするために、DIBAC4（3）、DIS-C3（3）、および陽イオン色素チオフラビンT（ThT）（Peñaら、2020）など、酵母で一般的に使用されるいくつかの色素をテストし、ThTが安定性、蛍光レベル、低疎水性（Peñaら、2020）およびカリウムクランプ実験のほぼ線形応答の点で他の色素より優れていることがわかった（図1の図解2A〜C）。最後に、ThTのこれらすべての特徴は、PDMSにおける安定性、蛍光性、低吸収性が重要となる長期のマイクロ流体実験に理想的であった。

環境中のIAAとSAを協調的に変化させた場合、合成回路を持たない対照株（図1A）では、ThT蛍光の規則的な経時変化が見られない（図1D、E、図1-図3A、図1-ビデオ1）。一方、酵母のKcsAチャネルを駆動する開ループ回路（図1A, B）では、累積自己相関解析により検出されたコロニー間の弱いカップリングにより、ThT蛍光のノイズはあるが認識可能な揺らぎを示した（図1F、G、図1-図3B、図1-動画 2）。ThT蛍光の周期は、植物ホルモン刺激期を中心に幅広い分布を示した（図1H、図1-図3C）。また、振幅には大きなばらつきがあったが（図1-図3E）、ピーク幅にはあまりばらつきがなかった（図1-図3D）。自己相関解析を補完するために、我々は1Rと定義される「同期性指数」という定量的指標を開発した。ここでRは、細胞集団間のその後のThTピーク位置の差（位相）の期待周期に対する比である。この指標は、酵母のコロニーが共通の環境因子によってどの程度同期しているかを示すものです。その結果、約50%の酵母コロニーがThT蛍光の同期性を示すことが分かりました（図1I）。これらのデータから、このオープンループシステムは、マクロなスケールで電気活動を誘導するための十分強固なPMPの変化を提供しないと結論づけられた。

二重フィードバック制御を組み込むことで、酵母の集合体における応答の速度と頑健性が向上する
我々のシステムの性能をさらに向上させるために、我々は、（フィードバックによる）高速応答性などの特徴をコード化し、興奮系のノイズフィルター能力を実証できる閉ループフィードバック回路を設計しようとした（Lindner et al.、2004）。そのために、我々はIacRとMarRをデュアルフィードバック合成遺伝子回路の正と負のフィードバックループを介して結合させた（図2A）。設計した回路の頑健性とダイナミクスを解析するために、まずこのIacR-MarRフィードバック系のコンピュータモデルシミュレーションを行い、興奮性ダイナミクスが顕著に現れる領域を特定した（図2Bおよび図2-補遺1）。モデル予測により、定常状態（図2-図1A）、興奮性（図2B、図2-図1B）、振動（図2-図1C）の間の移行に必要な最低限の前提条件が明らかにされた。これらの条件は、主にIAAとSAの変化に依存するIacR-MarRの不活性化の比率に直接関係している（図2D, 図2-図1A-C）。

図2および9の補足

合成デュアルフィードバック回路は、酵母の共同体におけるイオンチャネル発現を調整する。
(A) 細菌カリウムチャネルKcsA*の下流発現を制御するデュアルフィードバック回路の模式図。このシステムのすべての構成要素は、同じプロモーターによって制御されているため、統合的な制御が可能である。

図2-ソースデータ1
図2H, Iのソースデータ。

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我々のコンピュータモデルを初期にテストするために、単純ヘルペスウイルスのトランス活性化ドメイン (VP64) を持つ IacR (Hagmann et al., 1997) 、抑制 Mig1 サイレンシングドメイン (Ostling et al., 1996; 図 2A, 図 2-図 2) と不安定 dEGFP 蛍光レポーター (Dantuma et al., 2000) からなる合成フィードバック回路を実装した。回路の3つの構成要素はすべて、MarRおよびIacRオペレーター部位を有する同じ合成プロモーターの制御下に置かれた（Pérez-García et al, 2021）。我々は、この二重フィードバック回路がSA-IAA勾配に鋭敏に応答し、周期的なホルモン刺激がない場合に一過性の応答ピークを特徴とする興奮様ダイナミクスを示すことを見出した（図2-図3、図4）。さらに、動的マイクロ流体セットアップでIAAによる長いステップ状の刺激を与えると、IAA除去後のdEGFPシグナルの不応性ダイナミクスが生じ（図2C）、静的環境（図2-図4）や我々のコンピュータモデルシミュレーション（図2B）で観察されたものと同様の過渡応答ピークで特徴付けられることが確認された。

次に、IAAとSAを周期的に投与し、酵母のコロニー全体に遺伝子発現パターンを誘導した。2時間、1時間、30分の様々な植物ホルモン刺激下でdEGFPの空間的に協調したパルスが観察され（図2E、F、図2-図5、図2-ビデオ1）、コンピュータモデルシミュレーションとよく一致した（図2D）。遺伝子発現の協調性は、累積dEGFP信号の自己相関（図2G）、周期分布（図2H、図2-図6A）、ピーク特性解析（図2-図6B、C）によって確認された。重要なことは、全コミュニティの約95%がdEGFP蛍光の協調的なピークを示すことを定量的に確認したことである（図2I）。最後に、植物ホルモンの変化がイオンチャネルの動態を直接制御していることを確認するために、観察された回路の動態が実際にイオンチャネル発現を制御しているかどうかを検証した。そのために、我々はKcsA*カリウムチャネル（図1B）とEGFPを融合し、フィードバック回路の制御下でチャネルの寿命を直接モニターした。実際、植物ホルモンの刺激により、KcsA-EGFPの蛍光はdEGFP蛍光マーカーと同様に協調的にスパイクすることから、我々の回路は植物ホルモンの誘導により細胞内の異種イオンチャネルの量を特異的に制御していることがわかった（図2-図7、図2-ビデオ2）。

つまり、この化学的興奮回路は、酵母細胞集団における巨視的に調整されたイオンチャネル発現を工学的に制御するための、もっともらしい制御モジュールを提示しているのである。

カリウムチャネルを用いた集団レベルでのフィードバック回路とPMPの変化の連関
我々は、二重フィードバック回路が、酵母細胞集団におけるイオンチャネル発現を頑健に制御する興奮系の特徴を示すことを示した。次に、このイオンチャネルの存在の変化がPMPの変化にどのように反映されるかを、ThTカチオン色素の蛍光ダイナミクスを測定することで検証した。特に、クローズループ系（図3A）が我々のオープンループ系（図1A）より優れているかどうかを尋ねた。

図3 6つの付録付き

植物ホルモンを介した酵母コミュニティにおけるイオンチャネル発現と細胞膜電位（PMP）のグローバルな調節。
(A) 2時間のホルモン刺激下でのコミュニティごとのチオフラビンT（ThT）蛍光の代表的な時間トレース（n = 56 yeast communities）。平均的な傾向を黒で示す。SAとIAAのピークは...続きを見る

図3-ソースデータ1
図3D, Eのソースデータ。

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次に、二重フィードバック回路を搭載した人工酵母を、異なる頻度でSAとIAA刺激を与えたマイクロ流体デバイスで培養した（それぞれ3、2、1時間）。図3A, B, 図3-動画1-3）。この実験では、ThT蛍光の周期的なバーストが観察され、細胞集団間で驚くほど一貫していた。また、累積自己相関と同期性解析により、マクロスケールでの時間応答の頑健性がさらに確認された（図3C, D）。環境変化のスピードが速くなると、短時間でのイオンチャネルのアップレギュレーションによる毒性作用のためか、応答が弱くなった（図3D、図3-図1、図3-ビデオ3）。興味深いことに、ピーク幅と周期は異なる酵母コロニー間で非常に一貫していたが、ThT蛍光の振幅には目に見えるほどのばらつきが観察された（図3E）。これらは、我々の実験データ（図2-図7）で観察されたように、各細胞が産生するKcsA*チャネルの相対レベルの微妙な違いによる可能性があるが、遺伝子発現の固有のノイズの性質による可能性もある。しかし、今回の実験から、私たちが独自に開発したオープンループ回路にデュアルフィードバックを組み込むことで、イオンチャネル制御の頑健性が大幅に向上し、その結果、真核生物の細胞集団全体でイオンチャネルの発現を協調的に調節し、PMPを組織的に変化させることができることが明らかになりました。

酵母のPMPは、外向き整流子チャネルTOK1などの電位依存性カリウムチャネルを介して制御されている（Martinac et al.） TOK1は、いくつかの毒素や揮発性麻酔薬（Ahmedら、1999）の主な標的であり、カリウムイオンの無秩序な開口と細胞外空間への漏出を引き起こします。TOK1の過剰発現は膜の過分極（PMPがより負になる）を引き起こし、一方、TOK1の変異は膜の脱分極を引き起こし、しばしば細胞死を伴う (Sesti et al., 2001)。従って、TOK1は酵母細胞からのカリウム放出を制御し、PMPのバランスを保っていると考えられる。次に、私たちが開発した二重フィードバック回路を、このネイティブなTOK1カリウムチャネルの制御に組み込めるかどうかを調べた。この方法は、真核生物のあらゆるネイティブなカリウムチャネルに合成回路を接続することを可能にする可能性がある。

そこで、TOK1のc末端にデグロンドメインを付加し、KcsAチャネルと同様に半減期を短くしたTOK1チャネルを構築し、そのダイナミクスを調べた。次に、TOK1の発現量をマクロなレベルで制御するために、フィードバック回路を組み込んだ（図3F）。IAAとSAのパルス照射下でThTの蛍光の経時変化を記録した。KcsAと同様に、独立した酵母コロニーの数だけThTパルスを観測し（図3G、H、図3-ビデオ4）、パルス周期の持続性とシンクロニシティに例示された（図3-図解2）。また、自己相関解析により、酵母コロニー間でモニタリングされたThTの変化の支配的なパターンが明らかになった（図3-図2）。これらのデータから、我々の二重フィードバック回路は、実際にネイティブチャネルの発現も制御し、細胞内で利用可能なTOK1*の転写産物の数を制御することでその活性を調節できることが示された。このように、私たちの発見は、環境リズムを通してカリウムチャネルとPMPを制御する、人工的なデュアルフィードバックシステムを含む戦略の一般性を浮き彫りにするものである。

まとめ
過去10年間、光や化学的なシグナルを用いたイオンチャネル活性の局所的な制御法の開発に多くの努力が払われてきた。一方、イオンチャネルの発現を制御する機構は、心疾患、神経疾患、様々な癌において重要であるにもかかわらず、あまり注目されてこなかった。本発表では、真核生物の細胞集団におけるカリウムチャネルの発現を巨視的スケールで制御する合成生物学的モデルを実証する。また、細胞電気生理を集団レベルで制御するための本手法の一般的な適合性を調べるため、酵母を用いた化学的駆動機構による概念実証試験を行った。その結果、合成遺伝子回路が、環境からの入力と選択的な頻度によって、個々の細胞のイオンチャネル量を制御することを実証した。イオンチャネルの発現量の変化は、カチオン色素の細胞内部への移動と蛍光の増加によって示されるように、PMPの変化と相関している。異種チャネルとネイティブチャネルの両方を、酵母細胞のPMPを制御するデュアルフィードバックシステムのエフェクターとして使用した。一方、フィードバックがない場合、PMPの制御はノイジーになり、PMPを強固に制御するためのデュアルフィードバック制御の強い利点が浮き彫りになった。

この研究により、細胞間の結合を必要とせず、時計仕掛けの化学的な合図をイオンチャネルの協調的な発現に変換することが可能になり、合成生物学や細胞工学の分野に新たな道を開くことができました。本研究では、イオンチャネル発現のコヒーレントな変化により、成長する細胞集団の電気活動を、より長い空間・時間スケールで調整できることを提案する。さらに、この回路は、時間的プロセスによって回路の構成要素を内因的に制御し、回路の出力を本来のイオンチャネルの用量に接続する、ネイティブな文脈に接続することができる可能性がある。しかしながら、我々の初期の概念実証研究では、応答振幅に若干のばらつきが生じた。したがって、今後、時限入力に対する応答の頑健性を向上させたシステムを確立し、生命の木全体のマクロな電気生理を制御するための強力なツールボックスを作成するための研究が必要である。実際、イオンチャネルの局所的・全体的な発現制御は、様々な疾患において異常細胞の電気的状態を制御する、より効果的な治療法設計の鍵を握っていると考えられます。

材料と方法
株およびプラスミド構築
詳細なプロトコルはこちら
等温Gibsonアセンブルクローニングにより構築物をクローニングした。タンパク質濃度を高め、内在性分子ノイズの影響を緩衝するため、ミドルコピー(~10-30 コピー)のエピソーマルプラスミドpGADT7 (Takara Bio Inc) を用い、異なる補助栄養選択マーカー (ロイシン、ウラシル、ヒスチジン) を用いて選択した。Iacro/MarRoプロモーターと標準的なCYC1またはADH1酵母ターミネーターのいずれかをアクチベーターまたはリプレッサープラスミドにクローニングした（図1-図1）。MarR、IacR、およびKcsAは酵母用にコドン最適化し、Integrated DNA Technologies（IDT）が提供するサービスを利用して合成された。レポータープラスミドは、以前に同定されたMarRまたはIacRオペレーター（Alekshunら、2001；Shuら、2015）配列上流のTATA-boxおよび最小CYC1プロモーターと高速分解性UBG76V-EGFP（dEGFP）（Dantumaら、2000）と合成最小プロモーター（IDTと合成される）を含む。KcsA細菌カリウムチャネルは、以前に記載されたように開配置変異を含むように操作され（Cuelloら、2010；Sunら、2020）、細胞膜局在シグナルおよびc末端のマウスODCデグロンシグナルを含むようにさらに修正された（Takeuchiら、2008）。KcsAまたはTOK1*は、それぞれレポータープラスミド上のdEGFP遺伝子に置き換わる（図1-図1および図2-図2）。PCR反応はQ5 high fidelity polymerase (New England Biolabs)を用いて行った。正しいPCR産物はDpnI（New England Biolabs）で消化して鋳型を除去し、続いてDNAクリーンアップキット（Zymo Research）でクリーンアップしてからGibsonアセンブリーした。構築物は、標準的なプロトコルを用いて大腸菌DH5a株からウルトラコンピテントセルで形質転換した。すべてのプラスミドはコロニーPCRで確認され、配列決定で検証された。また、Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit (Zymo Research) を用いて、コンピテントセルとプラスミドの形質転換を行うために、mCherryレポーターを集積したBY4741実験用酵母株（Luis Rubio博士からの親切な贈り物）を使用した。本研究で使用した DNA 配列は、Supplementary file 1 にまとめてある。酵母株はKey Resource Tableに埋め込んだ。

マルチウェルプレートと顕微鏡による蛍光測定
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2%スクロース低蛍光培地（Formedium, UK）で培養した酵母の一晩培養液を100倍に希釈し、2%スクロースとSAおよびIAAの濃度勾配を含む96ウェルプレートに直接ピペッティングした。プレートは30℃で一晩インキュベートし、測定を行う前に振盪してよく混合した。測定は、24時間後にThermo Scientific VarioskanTM LUXマルチモードマイクロプレートリーダーで行い、または10分ごとに記録して、dEGFPとOD600のタイムラプス・プロファイルを生成した。OD600は波長600nmの吸光度、dEGFPは波長488nmと517nmの蛍光励起光と蛍光放出光とした。染色後24時間後にカリウムクランプ実験により色素発現を測定し、PMPレポーター活性を解析した。一晩培養したものを、OD600 が 0.1 になるように希釈した。希釈した培養液に異なる濃度のKClを添加した。これらの希釈培養物から200μlのアリコートを、異なるKCl濃度（0、50、100、200、400mM）と10μM Thioflavin T、10μM DIBAC4（3）、10μM DIS-C3（3）の入ったマルチウェルプレートに採取し、直接比較検討した。プレートは30℃で一晩インキュベートした。翌日、各ウェルを微分干渉コントラスト（DIC）とGFP（λEx = 488 nm; λEm = 515 nm）の2種類のチャンネルで画像化した。画像取得はソフトウェアμManagerとLeica DMI9で制御し、画像は×10乾式対物レンズ（NA = 0.32）を用いて撮影した。

タイムラプスイメージング、成長条件、およびデータ解析
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ライブセルイメージングは、Micro-Manager v.2.0 (https://micro-manager.org/) で制御されたHamamatsu Orca Flash V3カメラを搭載した自動倒立型Leica DMi8蛍光顕微鏡で行われた。画像は、40倍の対物レンズNA = 0.8 (Leica Inc)で撮影した。細胞を含むトラップは10分ごとに3種類のチャンネルで撮像した（DIC, GFP Excitation: 488, Emission: 515, および mCherry Excitation: 583, Emission: 610）、CoolLed pE600 LED励起光源と標準的なChroma落射蛍光フィルターセットで10分毎に撮像した。実験は、マイクロ流体デバイスに栄養を継続的に供給しながら、最大72時間行った。取得した画像は、最初にFiji 2.0 (https://imagej.net/Fiji) でカスタムスクリプトを使用して処理し、指数関数的に成長する酵母細胞の位置を抽出した。指数関数的に成長する細胞を識別するために、定常的に発現するmCherryマーカーを使用し、正規化したdEGFP蛍光を導出するために使用された。死滅または非成長個体は、dEGFP または KcsA-EGFP 信号を dEGFP/(dEGFP + mCherry) の式に従って補正することで棄却された。各画像を25の関心領域に分割し、細胞が活発に増殖し、経時的に追跡可能な領域を分離して個別に解析した。事後解析は、カスタムR-studioスクリプトを用いて行った。まず、生データを'pracma' R-studio v4.0.3パッケージのdetrend関数でトレンド除去し、同じパッケージのSavitzky-Golay Smoothing関数（savgol）でフィルタ長15でスムージングして、信号を0と1の間で正規化して細胞トラップに渡るヒートマップを作成した。振幅は、Rパッケージ「pracma」の「findpeaks」関数を用い、nupsとndownsを6にしてプロセスデータ内のピークを見つけることで算出し、周期は連続するdEGFPピーク間の距離を算出することで算出した。位相ドリフトは、マイクロ流体デバイス内の細胞コミュニティ間で連続するdEGFPピークの時間差を比較することによって計算し、コミュニティ間の指標を導出した。累積自己相関トレースおよびパワースペクトル密度は、Matlab 2018b派生パッケージの自動補正および高速フーリエ変換（FFT）を用いた標準計算を使用して、n個の酵母コミュニティ（n＞20、〜10,000細胞ずつ）に対して計算したコロニーあたりの平均dEGFPトラジェクトリーについて計算された。同期性指数」の定量的指標は、1 - Rと定義され、Rは、細胞コミュニティ間のその後のThTピーク位置の差（位相）の予想周期に対する比である。この指標は、酵母コロニーが共通の環境因子によってどの程度同期しているかを示すものである。ThT蛍光ダイナミクス、自己相関関数、周波数応答の評価には、同一の画像解析手順を使用した。

数理モデルの説明
詳細なプロトコルを請求する
興奮回路の数学的モデル（図2Bおよび図2-図1）を導き出すために、我々は、以前の理論研究（Lindnerら、2004）から適応した結合常微分方程式系を使用した。簡単に言えば、IacRおよびMarRタンパク質濃度は、以下の式に従って経時的に変化する。

(1)
∂Sm_220t=a1+b1∂IacR2K2A+IacR2+(γ⋅MarR)2-d1⋅(1+ϵIIAA)・IacR
(2)
∂MarR∂IacR2K2B+IacR2-d2⋅(1+ϵM・SA)⋅MarR
ここで、a1、a2は基底状態のIacR、MarR生成速度、b1、b2はIacR依存のタンパク質生成速度である。KAとKBはハーフマックスヒル関数係数、γはMarR依存性抑制率。 d1とd2はそれぞれタンパク質ターンオーバー率。ϵIとϵMは、植物ホルモンがタンパク質の代謝に及ぼす影響の割合である。IAAとSAは矩形波とサイン信号発生器（Matlab Inc）を使ってモデル化されている。タンパク質回転率の比率d1d2（図2-図1A-C）は、系を振動系と興奮系に移行させる重要な分岐パラメータを表している。モデルパラメータは補足ファイル2にまとめてある。

ヌルクラインを計算するために、式1および2の左辺を0に設定し、ϵIおよびϵMを0に設定する。位相ポートレートの計算のために以下の項を導くことができる MarR*(IacR) および MarR**(IacR) (Figure 2-figure supplement 1A-C):

(3)
MarR＊=1γ・K2A・a1+a1・IacR2+b1・IacR2-d1・IacR3-K2A・d1・IacRa1-d1・IacR---------------√
(4)
MarR∗∗=a2+b2⋅IacR2K2B+IacR2d2
セルローディング手順
詳細なプロトコルを請求する
全てのチューブラインをエタノールで滅菌し、無菌状態でシリンジに差し込むか、ファルコンチューブに導入した。新鮮な酵母コロニーを、炭素源として2%スクロースまたは2%グルコース（K1毒素産生株）を含む低蛍光培地組成（Formedium, UK）で培養した。翌日、酵母培養液を約10-20倍に希釈してOD600を0.2-0.4とし、高濃度の細胞を得て、50mlファルコンチューブに移し、ローディングした。60mlの培地シリンジに25mlの誘導培地（2%スクロース+0.5%ガラクトース）を化合物を含むか含まないかで満たし、50mlの廃ファルコンチューブに10mlの蒸留脱イオン水を満たした。負荷の前に、デバイスを少なくとも20分間真空にし、チャネルとトラップからすべての空気を除去した。シリンジとファルコンチューブを高さ制御システムに設置し、以下のようにラインを接続した：培地シリンジを最初に差し込み、培地の汚染を防ぐために他のすべての入力よりも高い位置に保った。培地と廃棄物だけでなく、ファルコンチューブを含む細胞の高さを調節することは、トラップ内の細胞播種を制御するのに役立つ。多くの細胞はチップを通過して直接廃棄物ポートに向かうが、少数の細胞はマイクロバルブを介して捕捉され、トラップに播種された。各トラップ領域に10～20個の細胞が捕捉された時点で、補助廃棄物の場合と同じレベルまで高さを下げることにより、細胞ローディングポートからの流れを戻した。

マイクロ流体モールドの作製
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マイクロ流体デバイス（Pérez-García et al., 2021）の製造用モールドをInkscapeで設計し、Pérez-García et al., 2021に記載されているようにモノクロレーザープリンタでプラスチックシートに解像度1200dpiでプリントした。特徴高さを制御するために、Ink depositionの密度を使用した。プラスチックウェハーを切断し、160℃に設定した熱オーブンに移して元のサイズの3分の1に収縮させた後、再び10分間焼成してインクを平滑化および硬化させた。最後に金型を石鹸で洗浄し，イソプロパノールとDDI水でリンスして窒素ガンで乾燥させ，スコッチテープで固定してから使用した。各セルトラップは500×500×7μmサイズで、〜10,000個のハプロイド酵母細胞を収容する。

ソフトリソグラフィー
詳細なプロトコルはこちら
プラスチック製90mmシャーレにモールドを導入し、両面テープで固定した。Dowsil Sylgard 184 Polydimethylsiloxane（PDMS）をエラストマーと硬化剤の10：1（wt/wt）の割合で適切に混合し、均一な粘度になるまで攪拌した。均一な混合物の約27mlを各シャーレに注ぎ、8CFMの2段真空ポンプを用いて約20分間完全に脱気した。脱気されたPDMSを80℃で2時間硬化させた。硬化したPDMSをペトリ皿から取り出し、ウェハから分離し、個々のチップを取り出すために切断した。流体アクセスポートを直径0.7mmのWorld Precision Instruments（WPI）社製バイオプシパンチャーでパンチングし、エタノールでフラッシュして残存PDMSを除去した。個々のチップはエタノールとDDI水で洗浄し，スコッチテープで残った汚れの粒子を除去した．

マイクロ流体デバイスの接着
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使用する少なくとも1日前に、個々のチップとカバースリップをソニックバスで洗浄し、エタノール、イソプロパノール、水でリンスした。両表面をコロナSBプラズマ処理装置（ElectroTechnics Model BD-20AC Hand-Held Laboratory Corona Treater）に45秒から1分間暴露した後、表面を合わせ、80℃のオーブンで一晩導入し、強化された接着強度を得ることができました。

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付録1
付録1-主要資源表
試薬の種類（種）またはリソース 指定元または参照先 識別子 追加情報
菌株、BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 (Saccharomyces cerevisiae) sRedM Pérez-García et al., 2021 BY4741 pGK1:: mCherry Selection: KanMX (G418)
株、sRedM（Saccharomyces cerevisiae） cLPdGFP本研究 sRedM pMarOIacO:: IacR-VP64 (pEX1004, ADDGENE_194950) pMarOIacO::MarR-RD (pEX1005, ADDGENE_ 194951) pMarOIacO::dEGFP (UbG76V-EGFP) (pEX1006, ADDGENE_194952) Selection: KanMX (G418) -Leu, -Ura, -His
菌株, BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 (Saccharomyces cerevisiae) oLPKcsA* 本試験 BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 pGal7:: IacR-VP64 (pEX1001, ADDGENE_ 194713) pGal7::MarR-RD (pEX1002 ADDGENE_ 194714) pMarOIacO::KcsA*(pEX1003, ADDGENE_194949) Selection: -Leu,-Ura,-His
菌株, BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 (Saccharomyces cerevisiae) sEmpty (control strain) 本研究 BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 Empty insert plasmids pGADT7 (Takara Bio) backbone with auxotrophic markers Selection: 選択：-Leu, -Ura, -His
選択：-Leu, -Ura, -His 株 BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 (Saccharomyces cerevisiae) cLPKcsA* 本研究 sRedM p MarOIacO:: IacR-VP64 (pEX1004, ADDGENE_194950) pMarOIacO::MarR-RD (pEX1005, ADDGENE_ 194951) pMarOIacO::KcsA*(pEX1003, ADDGENE_194949) Selection: -Leu, -Ura, -His
菌株, BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 (Saccharomyces cerevisiae) cLPTOK1* 本研究ではpMarOIacO:: IacR-VP64 (pEX1004, ADDGENE_194950) pMarOIacO::MarR-RD (pEX1005, ADDGENE_ 194951) pMarOIacO::TOK1*(pEX1008, ADDGENE_194954) Selection: -Leu,-Ura,-His
選択： -Leu, -Ura, -His 株, BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 (Saccharomyces cerevisiae) cLPKcsA-EGFP* 本研究 sRedM pMarOIacO:: IacR-VP64 (pEX1004, ADDGENE_194950) pMarOIacO::MarR-RD (pEX1005, ADDGENE_ 194951) pMarOIacO::KcsA- GFP*(pEX1007, ADDGENE_194953) Selection.IacR-RD (pEX1005) pMarOIacO:KcsA- GFP* (pEX1006, ADDGENE_194951) KanMX (G418) -Leu, -Ura, -His
その他、PMP色素 Thioflavin T ThT Fisher Scientific, Thermo Scientific CAS: 2390-54-7
その他、PMP色素 Bis-(1,3-Dibutylbarbituric Acid)Trimethine Oxonol DIBAC4(3) VWR INTERNATIONAL EUROLAB, S.L CAS: 70363-83-6
その他、PMP色素 3,3' - ジ-n-プロピルチアカルボシアニン ヨウ化物 DIS-C3(3) FISHER SCIENTIFIC CAS： 53336-12-2
データの入手方法
すべてのデータは、原稿、図の補足、または補足ファイルに記載されています。プラスミドはAddgene labデータベース（https://www.addgene.org/browse/article/28233359/）に寄託されています。

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決定書
アーサー・プリンドル
査読者; ノースウェスタン大学, 米国
ナーマ・バーカイ
シニアエディター、ワイツマン科学研究所、イスラエル
ジョセフ・ラーキン
校閲者、ボストン大学、米国
(i)読者のためにプレプリントと一緒に掲載される公開レビュー、(ii)著者への修正依頼を含む原稿に対するフィードバックです。また、編集者が論文のどこが興味深かったか、あるいは重要であったかを説明するアクセプトサマリーも含まれます。

査読後の判定書

論文「Macroscopic control of synchronous electrical signaling with chemically-excited gene expression」をご投稿いただき、ありがとうございました。あなたの論文は、3名の査読者（うち1名は査読編集委員会のメンバー）によって査読され、査読編集者とシニアエディターのNaama Barkaiによって評価が統括されました。あなたの投稿論文の審査に関わった以下の人物は、身元を明らかにすることに同意しています。Joseph Larkin (Reviewer #3)。

査読者は互いのレビューについて議論し、査読編集者はあなたが修正投稿を準備するためにこれを起草しました。

必須修正事項

1）協調行動は外部化学刺激によるところが大きいので、タイトル・要旨はコミュニケーション／電気信号／同期を強調しないように再フォーカスする。外部化学刺激→膜電位変化の機構的な基礎が優先され、それだけで十分インパクトがある。

  1. その目標を念頭に置いて、興奮性ダイナミクスの根拠、および分子機構上の各ステップを明確にする必要がある。

a) なぜ、励起ダイナミクスがここで重要なのか？他の研究者による実装が複雑になるため、合成生物学的な応用の観点から、より明確に正当化されるべきです。構築された回路は本当に興奮性ダイナミクスを示すのか？これは、さらなる実験とともに、彼らの計算モデルを用いて検証されるべきです。例えば、他の非周期的な入力を試すとか、不応期を確認するとか。

b) 化学的刺激によって膜電位変化を起こすための分子イベントの明確な因果連鎖はどのようなものか。これは原稿の中心的な貢献であり、他の人がこのツールボックスを使用するために必要なものです。これは模式図によって明確に説明されるべきで、これらのメカニズムの各段階は、実験的なコントロールによって検証されるべきです。例えば、膜電位を追跡するために、より標準的な電圧色素（TMRMや電圧感受性タンパク質など）を使用し、イオンフラックスを追跡するためにK+選択色素を使用し、チャネルの発現寿命を実証するためにKCsAとGFP間の分解タグを一致させることによって。膜チャネルが遊離タンパク質よりも分解されにくいということはあり得るのだろうか？また、PMPに関連する他のイオンフラックスや細胞代謝が、興奮性回路の動態と相互作用している可能性はありますか？

査読者1名（著者への推奨コメント） 本文中にあるように、本論文の内容は非常に興味深いものです。

全体として、この論文は有望であり、以下に述べる機構的な制御を追加して結果を補足するために、若干の実験的修正を行った後に受理されるべきものだと思います。

具体的な質問・提案

  1. より標準的な電位感受性色素（TMRM など）または電位感受性タンパク質を使用す るべきである。ThT は正電荷を持つため、電位感受性色素として機能するが、非標 準的である。

2）電圧変化がK+フラックスによるものであることを確認するために、K+色素を使用する必要がある。

  1. KcsAとGFPは分解タグが異なる。KcsA系で同等の発現を示し、動態を追跡していることを示せますか？KcsAが常に存在し、他の細胞フィードバック（YMCなど）によりダイナミクスが生じる場合はどうでしょうか？酵母の代謝サイクルは、これらのダイナミクスに寄与しているのでしょうか？タイムスケールはどのように比較され、この設定でYMC振動を観察することができますか？

  2. 図 1 では、周期の時間ヒストグラムが直感的ですが、なぜ、図 2/3 では、パワー スペクトルを使う代わりに、それを継続しないのでしょうか？周期ヒストグラムを用いれば、より信頼性の高い結果が得られると思うのですが。

5）文献データや著者らのデータから、TOK1チャネルは構成的に発現して いるのでしょうか？関連する拡散性シグナルとしての役割を確認するために、K1毒素のキレーターはあるのでしょうか？あるいは、K1毒素や他のチャネルブロッカーを外部からパルス的に投与することは可能ですか？

  1. スケールバーとスケール情報は、特にコロニー実験に有用であろう。さらに、Figure 3bの画像は改善され、KcsA発現とK1毒素の電圧応答と毒性の不均質性を示唆する（動画と合わせて）可能性がある。この戦略は、毒性によってどれくらいの期間維持できるのでしょうか？生物工学／合成生物学的な応用への課題でしょうか？

査読者2（著者への推薦コメント）：「これは良い仕事だと思います。

全体として、これは eLife に掲載されるべき良い研究だと思います。なぜなら、コミュニティの多く が合成生物学の新しいアプローチから恩恵を受ける可能性があるからです。著者らは、チャネルの発現を介した同期的な電気信号の制御という主張を裏付けていると私は考えています。しかし、全体として、何が達成されたかを明確に理解できるような表現に改善することができます。蛍光の同期が達成されていますが、これは、Vmemが細胞間で同一であることを意味するのでしょうか？あるいは、Vmemが同じ速度で変化しているということなのでしょうか？それとも、遺伝子の発現が同期しているということなのでしょうか？明示的には明らかにされていませんが、導入部や手法の重要な部分であるはずです。図1にチャネルの発現、チャネル機能、Vmemの変化、蛍光などのステップを描いた因果関係の連鎖を明確にすることが最大の付加価値となります。もし、真に他の人が使えるツールや道具箱が目的なら、これは必要なことです。さらに、電気的活性を特徴付ける厳密さが限られており、欠点／制限に関する議論が軽いため、「堅牢な合成転写ツールボックス」であるという主張のインパクトが弱くなっています。これは非常に素晴らしい仕事だと思いますが、もう少し考えて発表する必要があります。

総論。

  1. 単純な対照群（Sup2-2, B）ではなく、周期性の消失を求める形で化学的刺激物を投与したヌルモデルを実験して欲しいです。

  2. Figure 3Dでは、このK1->TOKの信頼性が前の2つの実験より若干低いようです。あまり同期していないようなコミュニティがいくつかあります。なぜでしょうか？これは議論されるべきでしょう。

  3. 周期が短いほど信頼性が落ちるようです（図S1、5参照）。このことはどこにも書いてありませんでした。

  4. (2)、(3)と同様に、欠点/限界/などについての議論が少ないです。- 追記をお願いします。

  5. 実験の難易度はわかりませんが、各実験を「少なくとも2回」繰り返したことを何度も挙げていますね。なぜ正確なサンプル数を示さないのでしょうか？N = 2は少ないように思えますが、おそらく著者は制限や困難が何であったかを述べたいのでしょう（これは、これがツールボックスであるという問題にも関係します-人々はNがいくつであれば妥当かを知る必要があるのです）。

    1. 位相差は良い尺度であるが、周期的信号の分析には多くの方法（波形、振幅など）があり、他の同期性の尺度も含まれる。これらの電気信号がどのように関連しているか、他の側面を測定／特性化することは有用かもしれない。図2Bや図3Cのように、平均的な暗線がデータの広がりをうまく表現していないようなことも、有用なのではないかと思います。

線の備考

  1. 50-51行目：イオン発現がノイジーである可能性があることには同意しますが、生物学的縮退に起因する可能性もあります。この点について、結果にどのような影響を及ぼすかについて言及することは興味深いことです。

  2. 69-71行目 なぜMar受容体を選んだのか、なぜそれが重要なのか、その長所・短所など、よくわかりません。これは「ツールボックス」であるという先ほどの主張により、これらの選択について、またどのような他の選択が可能であったのか、もっと詳しく教えてください。現状では、これは1つの「道具」です。

  3. 114-115行目：カリウムの放出に寄与するものは他にありますか？PMPがバランスを保つための他のメカニズムはありますか？もしあるとすれば、あなたの方法はそれらにどのような影響を与えるのでしょうか？

  4. 179-181行目 この方法が非侵襲的であるという主張が理解できません。化学物質で定期的に細胞を刺激する方法が必要ではないでしょうか？

  5. 186～187行目 電気通信を阻害する可能性について、著者の考えを論評してほしい。例えば、神経科学では、電気的シグナル伝達は、脳の適切な機能にとって最も重要です。時間的な電気通信に依存するシステムは、この方法の対象にはならないのでしょうか？

図の備考

全体的に、図にはもう少し工夫と注意が必要だと思います。また、図が分かりやすいとは限らず、せっかくの研究成果なのに残念です。

  1. 図1：なぜ細胞内にシアンのチャネルがあるのですか？

  2. 図1-最も重要なのは、全体として何が起こっているのかを説明する「流れ図」を追加することです。図A-Bは、私の想像に任せる部分が多すぎます。特に、このテーマに精通していない人にとっては。具体的には、化学物質による刺激の下流で、チャネル、PMP、そして最終的には蛍光に何が起こるのか、この回路で何が駆動しているのか、ブロック図（およびテキスト）を明示することです。

  3. 図1（その他）Cの上のSA/IAAと書かれた小さなボックスは、見ても何をしているのかわからない。この方法論を提示することがこの論文のポイントなので、ここでも方法論と結果の説明にもっと気を配るべきです。

    1. 図1Dは、何が起こっているかをよりよく説明する「流れの矢印」があってもよい。

  5. 5.図1-ヒートマップのY軸にラベルがなく、特定のコミュニティの番号を何度か参照しています。

    1. 図1E-色のついた破線のおかげで、読みにくすぎる。

    1. 図S1, 3-4: これらのグラフは直接比較することができますが、Y軸が反転しています。なぜでしょうか？

  8. 図2E - 私が間違っているかもしれませんが、PSDがおかしいようです。点線のピークは ~0.002 Hz で、約 8.3 分である。しかし、これは1時間の誘導期間です。これは10分の1ずれているのでしょうか？0.0002は1.3時間に近いです。

  9. 図2E-このグラフの全体のポイントは、与えられた周波数の信号を作ることができることを示すことです。しかし、そのピークが何であるかは、ラベルがないので知る由もないし、X軸は読者に推測させている。

  10. 図S1、6 A - ピークをマークするか、私がよりよく推測できるようなX軸を与えてください。

    1. 図 S1, 6 D - ここでのばらつきは小さいとは言えない。実際、この図のタイトルは誤解を招きそうです。そうですね、刺激周期や形状による変化はほとんどありませんが、実際の値はかなり変化しています。

小さな誤字。

  1. 37 行目、'which in turn provides (a?) power reservoir'（順番にパワーリザーバーを提供する）。

レビュアー3号（著者への提言）。

この論文に感銘を受け、熱中していることを改めてお伝えしたいと思います。

まず、私たちが挙げた 2 つの大きな問題に対処するための提案を紹介します。

  • この最初の問題に対処するために、本文中のシグナル伝達やコミュニケーションに関する言及を削除し、膜電位の化学的制御に焦点を当てることが可能であると考えます。繰り返しになりますが、この結果自体はインパクトがあると思います。本文と図では、このデータが、同じ駆動刺激に独立に反応する細胞群を示していることをより明確にする必要があります。これは工学的なコミュニケーションではありません。これは工学的なコミュニケーションではなく、その目標に向けた一歩なのです。

また、空間的な信号伝搬を示す既存データの解析を提示するのも一案であろう。

我々は、空間的に伝播する興奮性信号の明確な観察がない限り、図2補足3を論文に含めるべきでないと考えている。

  • 我々は、励起ダイナミクスを論証するために、複数のアプローチを提案する。まず、著者らは、マイクロ流体システムを使って、興奮性モデルのいくつかの予測を実験的に検証することができます。不応期は観察されるか？植物ホルモンを1つだけ追加したり、取り除いたりした場合に、モデルから予想される挙動が観察されるか？図1の補足3および4は、いくつかのサポートを提供していますが、これらの結果は、特定の予測または非励起シナリオと比較されていません。

いくつか全体的な質問と提案があります。

  • デバイスをもっと詳しく説明してください。各ウェルは物理的にどれくらいの大きさですか？各ウェルに含まれる細胞の数は大体どれくらいですか？コロニーからの平均蛍光値を報告する場合、おおよそ何個の細胞を平均しているのでしょうか？

  • テキストでは、ノイズやシステムがどのようにノイズを緩衝しているかについてよく言及されています。しかし、図1のビデオでは、GFPの発現に顕著な不均一性が見られます。ある細胞はシグナルが低く、ある細胞は非常に高いのです。これは、興奮回路で予想されることなのでしょうか？同時に、図2のThTの動画は不均一性が少ないように見えますが、これは、この実験が同じ基礎回路を持つことを考えると、興味深いことです。これは、膜電位を維持する生理作用によるノイズの緩衝作用によるものなのでしょうか？また、細胞同士がカリウムを放出したり、取り込んだりする際の緩衝作用によるものなのでしょうか？著者らはこのことについてどう考えているのだろうか？あるいは、不均一性の観察について間違っているのでしょうか？本文では解析が示されていないので、ムービーを見て推測するしかない。

  • 質問（濱 純） 前述のように、野生型細胞と人工 KcsA* 株の共培養実験を行い、化学刺激で人工株 を駆動することは可能でしょうか。そうすると、人工細胞による集団的なカリウムリークが起こるのではないでしょうか。図2補足1は、これがWT細胞の膜電位を変調させる可能性を示唆している。図3の実験と似ているが、電気通信の実証に近いかもしれない。

  • 初期のTOK1に関する議論は散漫であった。TOK1は、図3とともに紹介できると考えています。

  • 酵母における膜電位の関連性について、私たちは何を知っているのでしょうか？また、このシステムは、酵母の生理機能を制御する方法を提供するものでしょうか？著者がこれに関して何か考えているのであれば、それを結語に含めると良いと思います。

コメント（小野 晃：産業技術総合研究所ヒューマンライフテクノロジー研究部門） 論文の中で強調されている部分がありますが、その重要性を十分には把握でき ていません。その重要性をもっと説明していただければと思います。以下に、その重要性を理解したい部分を列挙します。

  • 回答（小林 慶三） なぜ、興奮回路を作ることがこの結果の中心なのでしょうか？回答（小林 慶三） 細胞を同期させるため、あるいは空間的に伝播する波を作るため、といった理由 が考えられます。しかし、これまで述べてきたように、このシステムがこれらのことを行っているようにはデータ上では見えない。

  • 位相ドリフト計測の重要性は？刺激パターンの違いによる位相ドリフトの違いは、合成回路について何か教えてくれるのだろうか？

図について、いくつかコメントがあります。

  • 図 1A と図 1B は分かりにくい。図1Aは、論文のポイントであるイオンチャネルの制御を示していますが、図1とは異なります。これでは、図1の結果がイオンチャネルを用いたものであるかのような期待を抱かせてしまいます。図1Bは非常に読みにくい。回路の2つの部分の制御矢印を色分けすれば、もっとわかりやすくなるのではないでしょうか？あるいは、図2Aのような簡略化したものを見せるとか？このままでは、図1Bが示していることを理解するのに多くの検討と思考が必要です。

  • 植物ホルモンのパルスがタイムトレースのグラフのどこで起こっているのか、タイムトレース中の背景に陰影をつけて表示することはできないのでしょうか？今の図では、化学刺激に周期性があることがわかりにくい。

  • 自己相関のグラフで、ある曲線が太い黒線、他の曲線が淡い色の点線になっているのはなぜですか？これでは色のついた線が読みづらく、その条件と黒い線とでは根本的に何かが違うと読者に思わせてしまう。

  • 小さなコメントですが、ThTとGFPのヒートマップで異なるカラースケールを使用することは可能でしょうか？あるいは、ヒートマップに「GFP Intensity」や「ThT Intensity」のようなラベルをつけたカラーバー・スケールを追加することは可能でしょうか？

補足のパネルがメイン図に取り込まれる可能性があると思います。

  • 図1-補足1BとDは、回路の興奮ダイナミクスを説明するために、本文の図1に追加することができます。

  • 図2補遺2AおよびBは必須であり、細胞膜電位を動的に制御する能力を工学的に実現した、ここでの最も印象的な結果を支えています。おそらくACFは、この補足図にある2つの例についても計算され、比較される可能性があります。

https://doi.org/10.7554/eLife.78075.sa1
著者からの回答
重要な修正

コメント（小野 晃：産業技術総合研究所） 1）協調行動は外部化学刺激によるところが大きいので、タイトル・要旨は通信・電気信号・同期に重点を置かな い方が良いと思います。外部化学刺激→膜電位変化の機構的基盤が優先され、それだけで十分なインパクトがあります。

コメント（赤松 幹之：産業技術総合研究所ヒューマンライフテクノロジー研究部門） 3名の査読者の方々には、原稿の改善に間違いなく役立つ建設的なご指摘をいただき、 ありがとうございました。私たちのシステムでは、協調行動は外部刺激によって導かれるが、個々のコミュニティは、植物ホルモン刺激によって導かれる低位相ドリフトを時間的に維持することによって、互いに同期していることに同意する。この同期機構はノイズフィルタ機能を持ち、Marタンパク質に基づくものである（Perez-Garcia et al., Nat Comm, 2021）。これに対し、バクテリアで構築された古典的な駆動システム（すなわち、TetR、AraC、LacI）は、位相ドリフトの増大によって制限され、最終的に個々の細胞や集団の間で非同期を引き起こす（すなわち、Mondragón-Palomino et al, 2011, Science）。これは、これらの古典的な駆動系と、我々の研究で示された外部刺激によって誘導される協調系との重要な違いである。

また、この論文では、イオンチャネルの協調的な発現に対して、フィードバックを取り入れることで、開ループ系よりも有意に頑健な解が得られることも示しています。

真核生物モデル系において、PMPを巨視的スケールで制御可能なイオンチャネル発現の協調的制御という主要な発見を中心に、原稿の構成、キーメッセージ、タイトルなどを大幅に見直した。

  1. この目標を念頭に置きながら、励起ダイナミクスの根拠、および分子機構上の各ステップを明確にする必要があります。

a) なぜここで興奮性ダイナミクスが重要なのか？他の研究者による実装が複雑になるため、合成生物学的な応用の観点から、より明確に正当化されるべきです。構築された回路は本当に興奮性ダイナミクスを示すのか？これは、さらなる実験とともに、彼らの計算モデルを用いて検証されるべきです。例えば、他の非周期的な入力を試すとか、不応期を確認するとか。

改訂版では、いくつかの新しい実験データセットを追加した。例えば、開ループ系（図1改訂版）と正負のフィードバックを組み込んだ閉ループ系（図2、図3改訂版）を比較しました。この制御の追加により、外部刺激を細胞の協調動作に変換するための回路アーキテクチャの重要性が明らかになりました。オープンループシステムはイオンチャネルの発現を制御できることを示したが、PMPの変化を制御することに関してはクローズドループシステムよりかなり劣るようで、この点は改訂版で議論されている（107-120行）。正負のフィードバックは、ノイズのフィルタリングを可能にし、システムの応答性を向上させ、酵母コミュニティの協調的なPMPの変化に反映されています（改訂図3）。さらに、オーキシンの長期パルスを用いて、推定される興奮性をテストしました。私たちのシステムは、他の興奮系で見られる不応性のダイナミクスを模倣することができ、私たちのシステムはその後の植物ホルモンのパルスに応答することができなかった（図2Bと2C、138-149行目）。一貫して、静的環境ではレポーター反応のパルスが観察された（図2-図4）。これらの観察から、我々の閉ループシステムの本質的な特性である仮説的興奮性が存在する可能性が示唆された。

b) 化学的刺激により膜電位変化を起こすための分子イベントの明確な因果連鎖は何か。インデューサー の取り込み、興奮回路の活性化、イオンチャンネルの発現、イオンフラックス、膜電位変化、そして最後に膜 電位レポーターの蛍光が含まれるか。これは原稿の中心的な貢献であり、他の人がこのツールボックスを使用するために必要なものです。これは模式図によって明確に説明されるべきで、これらのメカニズムの各段階は、実験的なコントロールによって検証されるべきです。例えば、膜電位を追跡するためにより標準的な電圧色素（TMRMや電圧感受性タンパク質など）を用い、イオンフラックスを追跡するためK+選択色素を用い、チャネルの発現寿命を実証するためKCsAとGFPの分解タグを一致させることによって、です。膜チャネルが遊離タンパク質よりも分解されにくいということはあり得るのだろうか？また、PMPに関連する他のイオンフラックスや細胞代謝が、興奮回路動態と相互作用している可能性はないのでしょうか？

ご指摘の通り、図中のシステム構成要素の表現を改善し、分子事象の順序を明確にしました。また、本研究で紹介したシステムは、真核生物におけるイオンチャネル発現とPMPの制御への第一歩であり、「すぐに使える」ツールボックスと見なすべきではないことを強調したいと思います。修正版には、次のような修正と実験が加えられている。

  1. MarRとIacRを統合した開ループ合成回路はKcsAチャネルの発現を制御し、この回路はIAAとSAの両方に感受性がある（図1修正）。異種KcsAチャネルまたはネイティブTOK1チャネルをそれぞれ制御する閉ループ合成回路（図2および図3）。

  2. イオンチャネル発現の周期的な変化は、カリウムチャネル発現の増減（図1A）と典型的にPMPの変化と関連しており、例えばカリウムチャネルの過剰生産は膜の過分極を引き起こし、チャネル変異体はPMPの脱分極を引き起こす（例: Ahmed, A. et al. 1999, Cell; Mackie, T. D. and Brodsky, J. L, 2018, Genetics; Sesti, F et al. 2001, Cell）.

  3. 酵母でよく用いられる細胞膜電位色素（Peña et al., 2020）、例えばDIBAC4(3)やDIS-C(3)3は、カリウム変化検出のシグナル強度、安定性、疎水性、直線性（ダイナミックレンジ）の点でThTに劣ることが分かった（図1図2、97～103行）。TMRMは主にミトコンドリア膜電位のモニターに使用し、本研究の範囲外である細胞膜電位のモニターには使用しなかった。

  4. ODC分解タグ（MarRとIacRに使用されたものと同じタグ）を持つKcsA-EGFP融合コンストラクトを構築した。KcsAチャネルは、マクロな文脈で調整された発現ピークを特徴とするdGFPやThT蛍光と同様のダイナミクスを示すことを示した（図2-図7、メインテキスト159165行）。したがって、我々が使用した分解タグは、dGFPレポーターとKcsAイオンチャネルの両方の半減期時間の確実な変化を提供する。ただし、dGFPの構築に用いた分解タグはN-末端のデグロンルールに基づいており、KcsAが適切な膜ターゲティングのためにN-末端のシグナルペプチドを必要とするため、KcsAの構築に用いることはできないことに注意が必要である。

  5. 我々は、酵母のネイティブカリウムチャネル（TOK1*）を人工的に構築し、我々の回路がTOK1の発現レベルを直接調節することによって、ネイティブな電圧感受性チャネルを制御できるかどうかをテストした（図3F、209-220行）。その結果、TOK1 の発現を制御することで、合成 KcsA* で観察されたのと同様の ThT 蛍光の組織的変化が得られ、イオンチャネル量の制御が PMP ダイナミクスを制御するためのより一般的な戦略であることが示された。

  6. 酵母の PMP 変化に細胞代謝や他のイオンが影響する可能性を完全に排除することはできない。しかし、今回、3種類の植物ホルモン刺激の期間（1時間、2時間、3時間）をテストし、イオンチャネル発現の変化に適応したThT蛍光のコヒーレントな変化を確認することができた。さらに、応答の頑健性は回路構成（開ループと閉ループ）に依存していた。私たちは、他の代謝過程やイオンが、私たちが操作した酵母集団で観察されたようなPMP変化の選択的制御を行う可能性は非常に低いと考えている。

  7. 酵母のK+フラックスの測定は、市販のイオンPotassium Green-2 AM, K+指標（Abcam）を用いて試みたが、これまで酵母で用いられたことはなかった。しかし、KCL で処理しても蛍光を検出することはできなかった。これは、色素が消光しているか、酵母が AM を加水分解するエス テラーゼを持っていない可能性がある。我々の知る限り、この色素は K+ の変化をモニターできる唯一の 蛍光色素であり、酵母の K+ 変化を確実に追跡するためには、 酵母における堅牢な K+ 色素の確立にさらなる取り組みが必要であ る。この点は、現在のところ、この研究の範囲外であると考え ています。

査読者1（著者への提言）：この論文は、全体として非常に優れた論文であ ると思います。

全体として、本論文は有望な論文であり、以下に述べる機構的な制御を追加して結果を補足するために、若干の実験的修正を行った後に受理されるべきものであると思います。

具体的な質問・提案

  1. より標準的な電位感受性色素（TMRM など）または電位感受性タンパク質を使用す るべきである。ThT は、その正電荷により電位感受性色素として働くが、非標準的であ る。

DIBAC4(3)やDIS-C3(3)など、酵母で最もよく使われるPMPマーカーを含むいくつかの色素をテストし（すなわちPeña et al.、2020）、ThTが他の色素と比較して安定性や蛍光強度、ダイナミックレンジ、低疎水性、吸収特性において際立っていることがわかった（図1-図の補足2、97-103行）。 これは以前の研究（すなわちPeña et al.,2020） と一致したものだった。TMRMはこれまでミトコンドリア膜の静的電位をモニターするために使用されていたため、細胞膜電位の長期ライブイメージングには適さない。この研究の初期段階において、我々は確かにArcLight (Walrati Limapichat, et al., 2020)などの電圧感受性タンパク質をテストしたが、シグナル強度はわずかで、ダイナミックレンジも非常に狭く、これらのマーカーはマイクロ流体デバイスでのタイムラプス細胞イメージングに適していない。

  1. 電圧変化がK+フラックスによるものであることを確認するために、K+色素を使用すべきである。

市販の K+指標である ION Potassium Green-2 AM（Abcam）を用いて、酵母で初めて K+フラックスの計測を試みた。しかし、KCL で処理しても蛍光を検出することができなかった。これは、色素が消光しているか、酵母がAMを加水分解するエステラーゼを持っていない可能性がある。我々の知る限り、この色素は K+の変化をモニターできる唯一の色素であ り、酵母の K+の変化を確実に追跡するために、酵母で機能する K+色素を確立するためにさらなる研究が必要である。現在のところ、この研究の範囲外であると思われる。

3）KcsAとGFPは分解タグが異なります。KcsA系で同等の発現をさせ、動態を追跡できることを示せますか？KcsAが常に存在し、他の細胞フィードバック（YMCなど）により動態が変化する場合はどうでしょうか？酵母の代謝サイクルは、これらのダイナミクスに寄与しているのでしょうか？また、このような環境下でYMC振動を観察することはできるのでしょうか？

MarRとIacRの回路構成要素にも使用されたODC分解タグを保持するKcsA*-EGFP融合コンストラクトを構築した。その結果、KcsAチャネルは、巨視的な文脈で調整された発現ピークを特徴とするdGFPやThT蛍光と同様のダイナミクスを示すことがわかった（図2-図7、159-166行）。したがって、我々が用いた分解タグは、dGFPとKcsAイオンチャネルの両方の半減期における強固な変化を提供する。なお、dGFPの構築に用いた分解タグはN末端デグロンルールに基づくものであり、KcsAが適切な膜ターゲティングのためにN末端シグナルペプチドを必要とするので、KcsAの構築には使用できない。

  1. 周期の時間ヒストグラムは、図 1 では直感的に理解できますが、なぜ図 2/3 ではパワー スペクトルを使う代わりに、それを継続しないのでしょうか？周期ヒストグラムを使用することで、より結果に信頼性が増すと思います。

修正原稿では、異なるシナリオ間の比較を容易にするために、すべての実験において、バイオリンプロットを用いて周期の分布を示しました。

  1. TOK1チャンネルは、文献データや著者らのデータから、構成的に発現しているのでしょうか？K1毒素のキレート剤を用いて、関連する拡散性シグナルとしての役割を確認することは可能ですか？または、外部からのK1毒素や他のチャネルブロッカーをパルスすることは可能ですか？

回答（小林 慶三） 確かに読者を混乱させる可能性があるため、新たな実験を盛り込み、K1 のデータ は原稿から削除しました。現在、K1毒素の半減期は、その細胞外、中間体的な性質から、制御できません。そこで、合成回路を用いて、TOK1 の発現を直接制御することにした（図 3 参照）。私たちは、酵母のネイティブカリウムチャネル（TOK1*）を人工的に作り、私たちの回路がTOK1の発現量を調節することでネイティブな電圧感受性チャネルを制御できるかどうかを調べました（図3F-H、198-220行）。その結果、TOK1の発現を調節することで、合成KcsA*で観察されたのと同様のThT蛍光の組織的変化が得られることがわかり、イオンチャネルの投与量の制御がPMPダイナミクスを制御するためのより一般的な戦略を提供することが示された。

  1. スケールバーとスケール情報は、特にコロニー実験に有用であろう。また、図3bの画像は改善され、（動画とともに）KcsA発現とK1毒素の電圧応答と毒性の不均質性を一般に示唆している可能性がある。この戦略は、毒性によってどれくらいの期間維持できるのでしょうか？生物工学／合成生物学的な応用への課題でしょうか？

図にスケールバーを付けました。毒性については、合成生物学的な応用において、毒性は認識できる課題です。したがって、このような合成システムにおいて毒性を低く維持するためには、エフェクターの分解速度を高めることが重要です。この問題は、我々の研究で KcsA* と TOK1* に degron タグを組み込んだ主な理由の 1 つです。

査読者2（著者への提言）:

全体として、これは eLife に掲載されるべき良い研究だと思います。なぜなら、コミュニティの多く が合成生物学への新しいアプローチから恩恵を受けることができるからです。著者らは、チャネルの発現を介した同期的な電気信号の制御という主張を裏付けていると私は考えています。しかし、全体として、何が達成されたかを明確に理解できるような表現に改善することができます。蛍光の同期が達成されていますが、これは、Vmemが細胞間で同一であることを意味するのでしょうか？あるいは、Vmemが同じ速度で変化しているということなのでしょうか？それとも、遺伝子の発現が同期しているということなのでしょうか？明示的には明らかにされていませんが、導入部や手法の重要な部分であるはずです。図1にチャネルの発現、チャネル機能、Vmemの変化、蛍光などのステップを描いた因果関係の連鎖を明確にすることが最大の付加価値となります。もし、真に他の人が使えるツールや道具箱が目的なら、これは必要なことです。さらに、電気的活性を特徴付ける厳密さが限られており、欠点／制限に関する議論が軽いため、「堅牢な合成転写ツールボックス」であるという主張のインパクトが弱くなっています。これは非常に素晴らしい仕事だと思いますが、もう少し考えて発表する必要があります。

私たちは、Vmemを直接測定するのではなく、PMPが変化したときに移動するカチオン性色素を使用しています。その結果、ThTの蛍光が協調的に変化し、これがもちろんVmemの変化の代用となるのです。しかし、その根本的なメカニズムは、イオンチャネルの発現が同期していることです。我々は、細胞内のイオンチャネルの量を変化させることで、PMPの巨視的な組織的変化を引き起こすのに十分である可能性を示しています。また、イオンチャネルの発現量を変化させることで、PMPを時空間スケールで制御できると結論づけた一連の流れを、修正原稿で明らかにしました。

総論

  1. 単純なコントロール集団（Sup2-2, B）ではなく、周期性を消失させるような化学的刺激を与えるヌルモデルを実験してほしい。

私たちの合成回路は植物ホルモンの変化に直接反応するので、刺激の不規則な変化はイオンチャネルの規則的な発現を乱すと予想されます。現在のフロー設定では、カオス的な不規則刺激を発生させることはできない。しかし、パルスの時間を長くすることで、屈折のようなダイナミクスの基礎を明らかにすることができることを示した（図2B, C）。さらに、イオンチャネル発現に及ぼす回路構造の影響を調べるために、もう一つ重要な制御を行った。特に、フィードバック層を取り除き、開ループシステムを作成し、フィードバック積分回路に比べ、信頼性が大幅に低いことを実証した（図1と図3を比較してください）。

  1. 図3Dでは、このK1->TOKの信頼性が、前の2つの実験よりも若干低いように見えます。あまり同期していないようなコミュニティがいくつかあります。なぜでしょうか？これは議論されるべきです。

確かに読者を混乱させるかもしれないので、新しい実験を入れ、K1データを原稿から削除しました。実際、K1毒素は細胞外、中間体のため半減期をコントロールできず、KcsAのようなカリウムチャネルを直接利用する場合と比べ、毒性効果が顕著に現れるのです。その代わりに、酵母のネイティブカリウムチャネル（TOK1）を操作した合成回路（改訂図3参照）により、TOK1の発現制御に関する新しいデータを提供しました。TOK1 の発現量を制御することで、ネイティブな電圧感受性チャネルを制御できるかを検証した。その結果、TOK1の発現を調節することで、合成KcsA*で観察されたのと同様のThT蛍光の組織的変化が得られることがわかった。このことは、イオンチャネルの投与量の制御が、PMPダイナミクスを制御するより一般的な戦略を提供する可能性があることを示している（209-220行）。

  1. 周期が短いほど、この方法の信頼性は低くなるようです（図S1、5参照）。このことはどこにも書いてありませんでした。

30分という短いサイクルは、蛍光マーカーdGFPの半減期に近く、超高速蛍光変化の頑健な測定には限界があると思われます。実際、我々の以前の研究では、サイクルを速くすればするほど、分解装置の限界までシステムの信頼性が高まることを示しています（Perez-Garcia et al, 2021, Nat Comm）。

  1. (2)、(3)と同様に、欠点/制限/等の議論が少ない。- は追加してください。

このアプローチの限界については、改訂版の結論の部分で述べています。

  1. 実験の難易度はわかりませんが、何度も各実験が「少なくとも2回」繰り返されたことを挙げていますね。なぜ正確なサンプルサイズを示さないのでしょうか？N = 2は少ないように思えますが、おそらく著者は、制限や困難が何であったかを述べたいのでしょう（これは、これがツールボックスであるという問題にも関係します-人々はNがいくつが妥当であるかを知る必要があるのです）。

synchrony indexのような多くの場合、nは解析されたコミュニティ（生物学的複製）の数である。各コミュニティは約10000個の細胞（500um×500umのトラップ）で構成されています。そして、各実験は、独立した日に少なくとも2回（技術的複製）繰り返された。例えば、n=25*個の群集を分析した場合、2500万個の生物学的複製×2回の技術的複製を考慮したことになる。振幅、周期、ピーク幅の測定は、各コミュニティの全データを取り込み、累積分布を表示した。そのため、統計的に健全な数値であると考えられる。生物学的複製と技術的複製の説明を修正原稿で明確にした。

    1. 位相差は良い指標であるが、周期的な信号には、他の同期性の指標を含む多くの分析方法（波形、振幅など）がある。これらの電気信号がどのように関連しているか、他の側面を測定/特徴付けることが有用かもしれない。図2Bや図3Cのように、平均的な暗線がデータの広がりをうまく表現していないことも、有用なのではないでしょうか。

さて、私たちは3種類の方法で共時性を分析しました。

  1. コミュニティ間の反応の累積自己相関を計算する。

  2. 自己相関解析を補完するために、以下のような定量的な指標を開発した。

ここでRは、細胞コミュニティ間のその後のThTピーク位置の差（位相）の、予想される周期に対する比率である。この指標は、共通の環境シグナルに誘導された菌類コロニー同士が、どの程度同期しているかを表す。

  1. すべての提示シナリオについて、振幅とピーク幅を分析した結果、周期とピーク幅はコミュニティ間で頑健であるが、振幅には顕著なばらつきがあることがわかった（すなわち、Figure 3E）。

これらを踏まえて、振動信号の特性の様々な側面を探るための多段階の厳密なアプローチを提示する。

行の備考

  1. 50-51行目：イオン発現がノイズ的であることには同意するが、生物学的縮退に起因する場合もある。この点について、どのように結果に影響を与えるかについて言及することは興味深いことです。

このような興味深いコメントをいただき、ありがとうございました。

ノイズフィルタリングの重要性を示すために、ノイズフィルタリング能力を持たない開ループシステム（フィードバックなし）が、マクロスケールでのPMP変調の観点から、閉ループの対応するシステムよりはるかに悪いパフォーマンスを示すことを示しました（図1と図3の比較）。これは、PMPをコヒーレントに操縦するためには、フィードバック制御されたイオン発現が必要であることを示している（193-196行）。

  1. 69-71行目 なぜMar受容体を選んだのか、なぜそれが重要なのか、アップサイド／ダウンサイドなどがわからない。これは「道具箱」であるという先ほどの主張のため、これらの選択について、また他にどのような選択が可能であったのか、もっと詳しく教えてください。現状では、これは1つの「ツール」です。

改訂原稿では、私たちの最近の研究（Perez-Garcia et al., 2021, Nat Comm）に直接関連するMarベースのシステムを使用する根拠を詳しく説明しました（75-85行目）。繰り返しになりますが、私たちは真核生物の電気生理を合理的に工学化するための新しいツールやツールボックスを開発するための基礎を提案していることを強調したいと思います。したがって、この研究は、「すぐに使える」モジュール式ツールボックスというよりは、むしろ初期の概念実証として扱われるべきで、この新しいアプローチの基準を確立するために、今後さらなる研究が必要であることに同意します（244-250行目）。誤解を招いたことをお詫びし、本文を修正します。

  1. 114-115行目：他にカリウムの放出に寄与するものはありますか？PMPがバランスを保つための他のメカニズムはありますか？もしあるとすれば、あなたの方法はそれらにどのような影響を与えますか？

私たちは、環境を徹底的にコントロールできる酵母において、このような選択的なPMPの制御が可能な他の機構を知りません。我々は、オープンループとクローズドループの回路バリエーションに大きな違いがあることから、我々が記録したPMPの変化は合成回路の構造に起因するものと考えています。特に、フィードバック積分回路表現では、環境刺激によるイオンチャネル発現を強固に制御することができる。

  1. 179-181行目。179-181行目：この方法論が非侵襲的であるという主張が理解できません。化学物質で周期的に細胞を刺激する方法が必要なのではないでしょうか？

混乱させたことをお詫びします。現在、改訂版原稿からその主張を削除しました。

  1. 186～187行目です。電気的なコミュニケーションを阻害する可能性があることについて、著者の考えを議論してほしいです。例えば、神経科学では、電気信号伝達は、脳が適切に機能するために最も重要である。時間的な電気通信に依存するシステムは、この方法の対象にはならないのでしょうか？

私たちのシステムは、ネイティブのイオンチャンネルを制御して、細胞の電気生理を乱したり、調整したりするために統合することができます。さらに、レビュアーが提案したように、Mar protein dynamics のタイミングを制御して、出力をタイミングよく入力に同期させるために、ネイティブシステムを接続することができるかもしれません。この推測を修正原稿に盛り込みました（238-250 行目）。

図の備考。

全体的に、図にはもう少し工夫と配慮が必要だと思います。このような図があると、せっかくの貴重な研究が台無しになってしまいます。

  1. 図1：なぜ、細胞内にシアンのチャネルがあるのですか？

この点については、改訂版で明確にしました。

  1. 図1-最も重要なのは、何が起こっているのかを全体的に説明する「流れ図」を追加することです。図A-Bは、私の想像に任せる部分が多すぎます。特に、このテーマに精通していない人にとっては。具体的には、化学物質による刺激の下流での因果関係、つまりチャネル、PMP、そして最終的には蛍光に何が起こるのか、この回路で何が駆動しているのかを明示したブロック図（とテキスト）です。

これは改訂版で改善されました（図1A、2A、3F）。

  1. 図1（およびその他）Cの上のSA/IAAと書かれた小さなボックスは、見ても何をやっているのかわかりません。この方法論を提示することがこの論文の全てのポイントであるため、ここでも、方法と結果の説明にもっと注意を払うべきである。

改訂版で修正しました。ツールボックス」の作成がこの論文のキーポイントではなく、イオンチャネルの発現を利用して細胞集団の電気生理を制御するというコンセプトであることをコメントさせていただきます。

    1. 図 1D には、何が起こっているかをよりよく説明するための「流れの矢印」があるとよい。

図 1C のパネルと凡例の改訂版で修正しました。

    1. 図1-ヒートマップのY軸にラベルがなく、また、特定のコミュニティ番号を何度か参照している。

改訂版で修正。

  1. 6.図1E-色のついた破線により、読みにくくなっている。

改訂版で修正した。

  1. Figure S1, 3-4：直接比較できるグラフだが、Y軸が反転している。なぜですか？

これらの図は直接比較できるものではありません。(3)は、定常期に入った時点のSA-IAA濃度勾配のヒートマップですが、(4)は、時間成分が追加されているためです。

    1. 図2E - 私の勘違いかもしれないが、PSDが変である。点線のピークは約0.002Hzで、約8.3分である。しかし、これは1時間の誘導期間です。これは10分の1ずれているのでしょうか？0.0002は1.3時間に近いです。

しかし、解析の明快さと簡便さを高めるために、改訂版ではPSDダイアグラムを使用しないことにしました。

    1. 図2E - このグラフのポイントは、与えられた周波数で信号を作ることができることを示すことです。しかし、そのピークが何であるかは、ラベルがなく、X軸が読者に推測させているため、知る由もない。

改訂版で修正しました。

  1. 図 S1, 6 A - ピークをマークするか、推測しやすい x 軸を与えてください。

このパネルは、他のすべての PSD 図と同様に改訂版で削除されました。

    1. 図 S1, 6 D - ここでの変動は小さいとは思えません。実際、この図のタイトルは誤解を招きそうです。確かに、刺激期間や形状による変化は少ないが、実際の値はかなり変化している。

改訂版では、CV解析を削除し、ピーク周期、幅、振幅の直接解析に焦点を当て、波動パターンの全体的な解析を明確かつ簡素化して、すべてのコミュニティ（空間）と時間における累積分布を示すようにした。

小さな誤字

  1. 37 行目、「その結果、(a?) パワーリザーバーが提供される」。

適宜修正。

査読者 3 番（著者への提言）。

この論文に感銘を受け、熱中していることを改めてお伝えしたいと思います。

まず、私たちが挙げた 2 つの大きな問題に対処するための提案を紹介します。

  • この最初の問題に対処するために、本文中のシグナル伝達やコミュニケーションに関する言及を削除し、膜電位の化学的制御に焦点を当てることが可能であると考えます。繰り返しになりますが、この結果自体はインパクトがあると思います。本文と図では、このデータが、同じ駆動刺激に独立に反応する細胞群を示していることをより明確にする必要があります。これは工学的なコミュニケーションではありません。しかし、その目標に向けた一歩です。

提案の通り、イオンチャネル発現の協調的制御と、それが集団の中の個々の細胞の電気生理に与える影響に焦点を当て、ストーリーを展開しました。細胞間のコミュニケーションやシグナル伝達の意味合いは排除しました。

また、空間的なシグナル伝達を示す既存データの解析結果を提示することも考えられます。

図2補足3は、空間的に伝播する興奮性信号が明確に観測されない限り、論文に 含めるべきでないと考えている。

  • 我々は、励起ダイナミクスを論証するために、複数のアプローチを提案する。まず、著者らは、マイクロ流体システムを使って、興奮性モデルのいくつかの予測を実験的に検証することができます。不応期は観察されるか？植物ホルモンを1つだけ追加したり、取り除いたりした場合に、モデルから予想される挙動が観察されるか？図1の補足3、4はいくつかの裏付けとなるが、これらの結果は特定の予測や非励起性シナリオと比較されていない。

我々のシステムで推定される興奮性を探るために、2つの観測結果を紹介する。第一に、静的環境で記録されたdGFP発現の一過性のピーク（図2 -図4）であり、開ループシステムを含む我々の以前の研究（Perez-Garciaら、2021、Nat Comm）では見られなかったものであった。次に、12時間の長いオーキシンのピークとそれに続く第2のピークで細胞を刺激したところ、その後の刺激に対する応答能力の欠如を特徴とする屈折のようなダイナミクスが明らかになりました（図2B、2C）。これらのデータは、私たちの二重フィードバック回路に興奮性が存在することのさらなる証拠になると考えています。

全体的な質問と提案があります。

  • 装置についてもっと詳しく説明してください。各ウェルは物理的にどれくらいの大きさですか？各ウェルにはだいたい何個の細胞が入っていますか？コロニーからの平均蛍光値を報告する場合、おおよそ何個の細胞を平均しているのでしょうか？

この記述は改訂版で改善されました。各トラップ/コミュニティには約 10000 個の細胞が含まれています。トラップは約500umx500umx7umです。

  • 本文中では、ノイズについて、また、システムがどのようにノイズをバッファリングしているかについて、しばしば言及されています。しかし、図1のビデオでは、GFPの発現に顕著な不均質性が見られます。ある細胞ではシグナルが低く、他の細胞では非常に高い。これは、興奮回路に期待されることなのでしょうか？同時に、図2のThTの動画は不均一性が少ないように見えますが、これは、この実験が同じ基礎回路を持つことを考えると、興味深いことです。これは、膜電位を維持する生理作用によるノイズの緩衝作用によるものなのでしょうか？また、細胞同士がカリウムを放出したり、取り込んだりする際の緩衝作用によるものなのでしょうか？著者らはこのことについてどう考えているのだろうか？あるいは、不均一性の観察について間違っているのでしょうか？本文には解析が示されていないので、動画を見て推測するしかない。

我々は、デュアルフィードバックは、非フィードバックに比べ、ノイズフィルタリング能力と応答性を提供すると考えています（改訂版図1、図3参照）。これは、比較的興奮しやすいシステムの顕著な特徴です。また、周期やピーク幅はコミュニティによって大きく異なるが、振幅は大きく変動することがわかった（図3E）。したがって、我々の回路は、望ましくない周波数はフィルタリングするが、応答の振幅のノイズは通過させる（193196行、結論のコメント、本文の各所）。

  • 以上のように、野生型細胞と人工KcsA*株の共培養実験を行い、化学刺激で人工株を駆動することは可能でしょうか。この場合、操作された細胞による集団的なカリウムリークが発生すると思われます。図2補足1は、これがWT細胞の膜電位を変調させる可能性を示唆している。図3の実験と似ていますが、より電気的コミュニケーションの実証に近づくかもしれません。

以上のように、現時点では、ストーリーの構成を見直し、電気通信の意味合いを取り除き、イオンチャネルの発現制御と細胞の電気生理の非共役な調整に焦点を当て、全体的に分かりやすくすることにした。このエキサイティングな可能性は、今後の研究で探っていきたいと思います。

  • 序盤のTOK1に関する議論は散漫な印象がありました。TOK1 は、Figure 3 で紹介できると思います。

TOK1 は、Figure 3 で紹介できると思います。また、TOK1を回路に組み込むことにより（図3F-H）、私たちの概念が、より一般的にネイティブなカリウムチャネルに適用できることを示しました。

  • 酵母における膜電位の関連性について、私たちは何を知っているのでしょうか？また、このシステムは、酵母の生理学を制御する方法を提供するものでしょうか？もし、著者がこのことについて何か考えているのであれば、それを結語に含めるとよいでしょう。

回答（小林 慶三） 改訂原稿では、このコンセプトをより一般的な細胞の電気生理の制御に利用できること を述べました（229-250 行目）。

この論文で強調されている要素もありますが、その重要性を十分に把握できて いませんでした。その重要性をもっと説明していただければと思います。以下、その重要性をもっと理解したい構成要素です。

  • 回答（小林 慶三） なぜ、興奮回路を作ることがこの結果の中心なのでしょうか？回答（小林 慶三） 細胞を同期させるため、あるいは空間的に伝播する波を作るため、といった理由 が考えられます。しかし、これまで述べてきたように、このシステムがこれらのことを行っているようにはデータからは見えません。

修正原稿では、二重フィードバック設計による推定される興奮性が、開ループシステムとの直接比較によって裏付けられたノイズバッファリング能力を提供する可能性があると論じている（図1、図3）。

  • 位相ドリフト測定の重要性は何ですか？異なる刺激パターンに対する異なる位相ドリフトは、合成回路について何かを教えてくれるのだろうか？

混乱を避けるため、改訂版では以下の尺度で共時性を解析している。

  1. 各コミュニティ間の応答の累積自己相関を計算する。

  2. 自己相関解析を補完するために、以下の定量的指標を開発した。

ここで、R は細胞コミュニティ間のその後の ThT ピーク位置の差（位相）の期待周期に対する比である。この指標は、共通の環境シグナルに誘導された菌類コロニー同士が、どの程度同期しているかを表す。

  1. すべての提示シナリオについて、振幅とピーク幅を分析した。

これらの指標から、回路は応答の周期と幅の点では堅牢であるが、振幅にはばらつきがあることがわかった。図3Dのように、刺激の周波数が変わっても、全体の同期性に大きな変化は見られない。しかし、フィードバック層を取り除くとSIが大きく減少することがわかり（図1I）、回路構成がシステムの性能の中心であることを物語っている。

図に関していくつかコメントがあります。

  • 図1A、図1Bは分かりにくい。図1Aは、この論文のポイントであるイオンチャネルの制御を示していますが、図1にはありません。これでは、図1の結果がイオンチャネルを用いたものであるかのような期待を持たせてしまいます。図1Bは非常に読みにくい。回路の2つの部分の制御矢印を色分けすれば、もっとわかりやすくなるのではないでしょうか？あるいは、図2Aのような簡略化したものを見せるとか？このままでは、図1Bの内容を理解するために、多くの検討と思考が必要です。

改訂版では回路図を簡略化・明確化し、より読者を誘導できるようにしました。

  • 植物ホルモンのパルスがタイムトレースのグラフのどこで起こっているのか、タイムトレース全体を通して背景に陰影をつけて表示することはできないのでしょうか？今の図では、化学刺激に周期性があることがわかりにくいです。

植物ホルモンのパルスを各時間経過データの上部に表示するようにした（SAは黒枠、IAAは緑枠）。

  • 自己相関のグラフで、ある曲線は太い黒線、他の曲線は薄い色の点線になっているのはなぜですか？これでは色のついた線が読みづらく、それらの条件と黒い線とが根本的に違うのではないかと読者に思わせてしまう。

色は観測可能な期間の違いに対応しています。図が改善されました。

  • 小さなコメント：ThTとGFPのヒートマップで異なるカラースケールを使用することは可能ですか？あるいは、ヒートマップに「GFP Intensity」や「ThT Intensity」のようなラベルを付けて、カラーバーのスケールを追加することは可能でしょうか？

現在、dGFPとThTのヒートマップは別々のラベルで表示しています。

付録のいくつかのパネルは、メインの図に取り込むことができると考えています。

  • 図1-補足1BとDは、回路の興奮ダイナミクスを説明するために本文の図1に追加される可能性があります。

これは改訂された図1で修正されました。

  • 図2補遺2AおよびBは必須であり、ここでの最も印象的な結果である、細胞膜電位を動的に制御する能力 を工学的に実現したことを裏付けるものです。おそらく、この補足図にある2つの例についても、ACFを計算し、比較することが可能でしょう。

さて、2つの異なるイオンチャネルと2つの回路アーキテクチャ（開ループ（図1）と閉ループ（図2、3））について、周期的な刺激による重要なデータセットを追加しました。また、コントロール状態のデータもFigure 1に追加した。）

https://doi.org/10.7554/eLife.78075.sa2
論文・著者情報
著者詳細
Mario García-Navarrete
マドリード工科大学・国立農業技術研究所植物バイオテクノロジー・ゲノム研究センター（スペイン、ポズエロ・デ・アラルコン）。
貢献度 データキュレーション、ソフトウェア、形式分析、検証、調査、可視化、方法論、執筆（原案）。
Merisa Avdovic、Sara Pérez-Garciaと均等に貢献した。
競合する利害関係 競合する利害関係を宣言していない
ORCIDアイコン 0000-0002-1899-8206
メリサ・アヴドヴィッチ
植物生体工学・ゲノム科学研究センター（マドリード工科大学・国立農業技術研究所）、ポズエロ・デ・アラルコン、スペイン
貢献度 データキュレーション、形式分析、検証、調査、可視化、方法論、執筆 - 原案、執筆 - 査読と編集
Mario García-Navarrete、Sara Pérez-Garciaと共同執筆した。
競合する利益 競合する利益は宣言していない
サラ・ペレス＝ガルシア
植物生体工学・ゲノム研究センター（マドリード工科大学・国立農業技術研究所）、ポズエロ・デ・アラルコン、スペイン
貢献度 データキュレーション、ソフトウェア、形式分析、検証、調査、可視化、方法論
Mario García-Navarrete、Merisa Avdovic と共同研究した。
競合する利益 競合する利益の宣言はない
Diego Ruiz Sanchis
スペイン、ポズエロ・デ・アラルコン、マドリード工科大学・国立農業技術研究所、植物バイオテクノロジー＆ゲノミカセンター
貢献度 形式分析、調査、方法論、執筆（原案
競合する利益 競合する利益は宣言していない
クシシュトフ・ワブニク
マドリード工科大学・国立農業技術研究所植物分子生物学研究センター（スペイン、ポズエロ・デ・アラルコン
貢献 概念化、形式分析、監修、資金獲得、調査、執筆-原案、プロジェクト管理、執筆-レビューと編集
連絡先 k.wabnik@upm.es
競合する利益 競合する利益は宣言していない
ORCIDアイコン 0000-0001-7263-0560
資金提供
マドリード自治体（Programa de Atraccion de Talento 2017-2023 2017-T1/BIO-5654)
クシシュトフ・ワブニク
シエンチア、イノベイション、イ・ユニバーシダス大臣（PGC2018-093387-A-I00）
クシシュトフ・ワブニク
Agencia Estatal de Investigación (SEV-2016-0672)
クシシュトフ・ワブニク
Agencia Estatal de Investigación (SEV-2016-0672-18-3:PRE2018-084946)
メリサ・アヴドヴィッチ
マドリード工科大学（プラン・プロピオ・プレドクトラル・フェロー）
マリオ・ガルシア＝ナバレテ
資金提供者は、研究デザイン、データ収集、解釈、論文投稿の決定には一切関与していない。

謝辞
本研究で使用した実験用酵母BY4741株を提供していただいたLuis Rubio博士に感謝する。本研究は、Programa de Atraccion de Talento 2017 (Comunidad de Madrid, 2017-T1/BIO-5654 to KW), Severo Ochoa (SO) Programme for Centres of Excellence in R&D from the Agencia Estatal de Investigacion of Spain (grant SEV-2016-0672 (2017-2021) to KW via the CBGP) によって支援されています。SEV-2016-0672の資金提供の枠で、MAは博士号フェローシップを受けた（SEV-2016-0672-18-3：PRE2018-084946）。KWは、MICIUからPrograma Estatal de Generacion del Conocimiento y Fortalecimiento Cientıfico y Tecnologico del Sistema de I+D+I 2019 (PGC2018-093387-A-I00) によって支援を受けた（KWに）。UPMプラン・プロピオ・プレドクトラル・フェローはMGNに資金を提供。

シニアエディター
ナーマ・バーカイ（ワイツマン科学研究所、イスラエル
査読委員
アーサー・プリンドル（ノースウェスタン大学、米国
査読者
Joseph Larkin, ボストン大学, 米国
出版経緯
プレプリント掲載 2022年1月20日（プレプリントを見る）
受理：2022年2月22日 2022年2月22日
受理：2022年2月22日 採択：2022年10月21日
Accepted Manuscript 公開。2022年11月9日（第1版）
Version of Record 公開：2022年11月9日（Ver: 2022年11月30日（第2版）
著作権
© 2022, García-Navarrete, Avdovic, Pérez-Garcia et al.

この記事は、原著者と出典を明記することを条件に、無制限の使用と再配布を許可するクリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの条項の下で配布されています。

メトリクス

カテゴリーとタグ
研究論文計算機システム生物学生命システム物理学ソーシン生体電位イオンチャンネル膜電位アスピリン同調作用
研究対象生物
S. cerevisiae
参考文献
計算機システム生物学 構造生物学・分子生物物理学
チロシンキナーゼとセリン・スレオニンキナーゼのコンフォメーションランドスケープにおける進化的乖離
ジョアン・ジッツィオ、アビシェック・タクル ... ロナルド M レヴィ
研究論文 2022年12月23日
がん生物学 計算科学・システムバイオロジー
進行頭頸部がんにおける全身療法後の無増悪生存期間の予測。ベイズ回帰とモデル開発
Paul R Barber, Rami Mustapha ... トニー・ウン
研究論文 2022年12月23日
計算・システムバイオロジー 遺伝学・ゲノミクス
骨粗しょう症。骨がもろくなる遺伝子の発見
エリカ・カグ
インサイト 2022年12月23日
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