下部糞便微生物叢移植は、経口由来のFusobacterium nucleatumおよび病原因子を除去することにより潰瘍性大腸炎を改善する

哉百名

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腸内病原体

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下部糞便微生物叢移植は、経口由来のFusobacterium nucleatumおよび病原因子を除去することにより潰瘍性大腸炎を改善する


Gut Pathogens 16巻、記事番号：42（2024）この記事を引用する

概要

背景

近年、経口がん菌であるフソバクテリウム・ヌクレアタム（F. nucleatum）が潰瘍性大腸炎（UC）と関連している。我々は、便微生物叢移植（FMT）により腸内細菌叢を回復させ、経口由来のF. nucleatumおよび病原因子fadAを除去することで、潰瘍性大腸炎を軽減できるかどうかを検討することを目的とする。

方法

C57BL/6Jマウスを健常対照群（HC）、デキストラン硫酸ナトリウム群（DSS）、経口接種群（OR）、上部FMT群（UFMT）、下部FMT群（LFMT）に無作為に分けた。疾患活動性指数、体重、生存率、病理組織学的スコアを用いて大腸炎の重症度を測定した。腸粘膜バリア機能は、タイトジャンクションタンパク質Occludinの免疫組織化学染色を行うことで評価した。リアルタイムPCR法を用いて、nusG遺伝子と病原性遺伝子fadAの相対量を評価した。サイトカインレベルはELISAで検出した。16S rRNAの全長シークエンシングを用いて腸内細菌叢の変化と構成を解析した。

所見

F. nucleatumの経口培養は、大腸炎の重症度と腸内細菌叢異常をさらに悪化させた。ORマウスではペプトストレプトコッカス科、腸球菌科、大腸菌が有意に濃縮された。しかし、LFMTマウスはUFMTマウスよりも疾患活動性の明らかな低下を示し、腸内細菌叢の回復とF. nucleatumの排除に効果的であった。LFMTマウスではBacteroidota、Lachnospiraceae、Prevotellaceaeが主に濃縮されていた。また、Lactobacillus属、Allobaculum属、Bacteroidales属はTNF-α、IL-1β、IL-6と負の相関を示した。Romboutsia属、Escherichia Shigella属、Enterococcus属、Clostridium属は、TNF-α、IL-1β、IL-6と正の相関を示した。

結論

F. nucleatumの経口培養は、DSS誘発大腸炎マウスの重症度とdysbiosisをさらに悪化させる。さらに、下部消化管FMTは、腸内細菌叢の多様性を回復させ、F. nucleatumおよび病原因子fadAを除去することにより、大腸炎を改善することができる。

はじめに

潰瘍性大腸炎（UC）は、結腸および直腸の慢性、多因子性、非特異的な炎症性疾患であり、主な臨床症状として、下痢、血便、腹痛、テネスムス、腸管外症状などがある [1]。現在のところ、UCの病因は曖昧である。しかし、研究により、UCの発症は腸内細菌叢の不均衡によって引き起こされる腸管免疫系の異常と密接な関係があることが示されている。共生微生物叢の減少と病原性細菌の増加は、腸の微小生態学的バランスを崩壊させ、その崩壊は最終的に、炭水化物、ビタミン、短鎖脂肪酸（SCFA）などの細菌発酵産物の変化や、免疫不均衡などの生化学的プロセスの変化など、腸内細菌叢関連機能の変化につながる [2] 。いくつかの包括的な解析により、健常人とUC患者との間の微生物叢の有意な違いが明らかにされている。その報告によると、UCのディスバイオーシスパターンは、細菌の多様性の低下や、ビフィズス菌、バクテロイデス菌、真正細菌などの共生細菌の減少、ファーミキューテス菌（特にクロストリジウム）やプロテオバクテリアの増加として現れることが多いという [3,4,5]。残念なことに、UCの原因となる特定の細菌はまだ解明されていない。ヒトのサンプルやげっ歯類の動物モデルから、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）やクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、付着性/侵入性大腸菌（AIEC）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）といった特定の病原性細菌が高頻度に存在することが証明されている[6,7,8,9]が、これまでのところ、これらの病原体がUCの増悪の原因因子であるのか、あるいは単なる寄与因子であるのかは、現在進行中の問題である。

口腔-腸内細菌叢軸」は、口腔内細菌叢と腸内細菌叢の複雑な相互作用を解明するために近年提唱された概念である[10]。口腔微生物叢は、人体で2番目に大きな微生物叢として、口腔および全身の健康に重要な役割を果たしている。健康な人の場合、胃酸、胆汁酸、小腸のリズム運動により、口腔内細菌叢と腸内細菌叢はうまく分離されている [11] 。しかし、腸内細菌叢のアンバランス、腸粘膜バリア機能障害、およびUC患者におけるプロトンポンプ阻害薬の使用は、クレブシエラ属菌、ポルフィロモナス・ジンジバリス、F.ヌクレアタムなどの口腔関連細菌が腸に転移して異所性にコロニー形成し、疾患の進行に関与する可能性を提供する［12］。クレブシエラ属菌は健康なヒトの唾液から同定されている [13]。しかし、Guoらは、口腔内のクレブシエラ属菌のシャペロンウシャーピリが炎症を起こした腸粘膜に部位特異的に適応することを報告しており、口腔内の病原体が大腸に異所性にコロニー形成する可能性が高いことを示している［14］。一方、口腔症状はUCの潜在的徴候となりうる。口腔病変、特に再発性アフタ性潰瘍と歯周炎は、UCの発生と重症度を判定する粘膜皮膚徴候として利用でき、UCの早期診断を容易にすることが示唆された。これらの研究により、歯周炎とUCは、「口腔-腸」軸を構成し、互いに影響し合うことで悪循環をもたらすことから、同じ微生物と免疫病態によって引き起こされることが示された。

F. nucleatumは口腔内に生息する日和見病原体であり、口腔プラークバイオフィルムの形成に中心的な役割を果たしている。歯肉炎や歯周炎などの歯周病患者では、F. nucleatumや fadAの陽性率が有意に上昇することが報告されている[16]。しかし、F. nucleatumは単なる口腔病原体ではない。現在のところ、F. nucleatumが大腸がんやUCなどの消化器疾患の一因であることを示す傾向がある[17,18,19]。Mara R.らは、大腸発癌における「2ヒット」モデルを提唱し、F. nucleatumは癌の進行を悪化させる2番目のヒットであるとし、F. nucleatumを癌の「促進因子」として同定した [17]。Lin Sらは、F. nucleatumが腸内細菌叢のアンバランスと代謝障害を促進することにより、UCを悪化させる可能性があることを明らかにした［18］。Su Wらは、F. nucleatumが自食細胞死を活性化することにより、UCに寄与する可能性を示唆した［19］。このような背景から、口腔病原体であるF. nucleatumがUCの疾患や腸内細菌異常症の促進に果たす役割を研究することは貴重である。

糞便微生物叢移植（FMT）は、患者の腸内細菌叢を回復させ、治療効果を得るために、大腸内視鏡検査や浣腸によって、健康なドナーの糞便ホモジネートを患者の消化管に移植する生物療法である［20］。FMTがUC患者の疾患活動性を低下させ、寛解をもたらすことは、複数の臨床エビデンスによって証明されている [21,22]。しかし、UCの治療においてFMTが重要な役割を果たす特定の細菌や効果的な成分は、まだほとんど知られていない。Houriganらは、FMT治療がC. difficile感染（CDI）患者の腸からClostridiumdifficile（C.difficile）を効果的に除去し、炎症性腸疾患（IBD）患者の細菌の多様性を高めることができ、FMT後3カ月および6カ月の便検体からC. difficileの cdtB病原性遺伝子が検出されなかったことを明らかにした[23]。Juliaらは、再発性CDI患者において、FMTの前後で発がん性細菌であるBacteroides fragilis、F. nucleatum、および大腸菌の病原性遺伝子（bft、fadA、pks）を検出し、これらの発がん性細菌の病原性遺伝子はFMT後にレベルが低下するか、検出されないことを明らかにした［24］。これらの研究は、FMTが特定の細菌を濃縮し、病原性細菌および病原性因子を減少させることにより、治療的役割を果たすことを示しており、これはUCの治療戦略を提供するものである。

我々の以前の研究では、経口F. nucleatumが大腸に播種し、病原性FadAアドヘシンを分泌し、粘膜上皮に存在するE-カドヘリンタンパク質と結合し、さらにNF-κシグナル伝達経路を活性化し、大腸炎を促進することを見出した。本研究の目的は、DSS誘発大腸炎マウスにおける腸内細菌叢の変化を評価し、経口F. nucleatumがどのように腸内細菌叢異常に寄与しているのか、またF. nucleatumおよびその病原因子を腸内から除去することによりFMTが大腸炎を軽減できるのかについて検討することである。

材料と方法

細菌培養

F. nucleatumATCC 25586株を用いた。ATCC 25586を血液寒天培地に接種し、37℃で2日間嫌気培養した後、シングルコロニーをビタミンK（0.2μg/ml）および塩化ヘミン（5μg/ml）を含む10 ml BHI培地に移し、2日間培養した。既述のように、ATCC25586を含む基質は、その後4000r/minで10分間遠心分離し、PBSで洗浄した後、再度10分間遠心分離し、PBSで1×109CFU/mlに希釈した。

大腸炎マウスの作製

本研究では、6～8週齢の雄性C57BL/6J Specific Pathogen Free（SPF）マウスを用いた。給餌および実験手順は、ARRIVEガイドライン（ARRIVE 2.0）および国際的な法律と方針（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）を厳守して実施した。微生物叢の一貫性を確保し、コロニー形成を促進するため、実験実施前にストレプトマイシン（2 mg/ml）を連続3日間飲水に添加した。大腸炎を誘発するため、2.5%（w/v）デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）溶液を14日間マウスの飲水に溶解して調製した。

30匹のC57BL/6J SPFマウスを無作為にHealthy control群(HC)、デキストラン硫酸ナトリウム群(DSS)、経口接種群(OR)、Upper FMT群(UFMT)、Lower FMT群(LFMT)に分け、各群6匹ずつとした。HC群マウスには通常の飲料水と飼料を、DSS群マウスには2.5％DSS溶液を14日間、OR群マウスにはDSS溶液摂取の他にATCC25586を含むPBS懸濁液（濃度：1×109CFU/ml）を2週間毎日経口接種した。UFMTマウスには、DSS摂取および経口接種に加えて、健常マウスドナー由来の糞便懸濁液を経口投与した。LFMTマウスには、DSS摂取および経口接種に加えて、ドナー糞便懸濁液を毎日浣腸した。

マウスの体重、便形成、血便、死亡率を毎日記録した。糞便は毎日採取し、-80℃で保存した。マウスは犠牲とし、介入14日後にさらなる検出のためにサンプルを採取した。

FMTの実施

健康なマウス4匹から新鮮な糞便を採取した。採取した糞便を0.125g/mlの滅菌生理食塩水と容器中で混合し、直ちにホモジナイズした。ホモジネートを1200/rpmで5分間遠心分離し、移植用の糞沈渣を回収する。適切なサイズの針を用いて胃洗浄または浣腸を行った。胃洗浄または浣腸の量はマウス1匹あたり0.2ml/10gとし、逆流しないように注意した。

大腸炎重症度の測定

マウスの疾患活動性は、体重減少、造便性、血便の程度で評価した。疾患活動性指数（DAI）は、体重減少、造便性、血便の複合スコアとして0から12の範囲で算出した。ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色を行い、病理組織学的スコアを算出した。病理組織学的スコアは以下のように算出される：損傷範囲： 0：なし、1：25％以下、2：50％以下、3：75％以下、4：100％以下。腺粘膜の欠損： 0=なし、1=軽度、2および3=中等度、4=重度。組織の損傷： 0 = 粘膜損傷なし, 1 = 散在する上皮性病変, 2 = 表層粘膜びらんまたは限局性潰瘍, 3 = 深部構造に及ぶ広範な粘膜損傷。炎症細胞浸潤： 0 = 扁平上皮に炎症細胞が時折みられる、1 = 扁平上皮に炎症細胞が増加する、2 = 炎症細胞の合流と粘膜下層への進展、3 = 浸潤と粘膜貫通進展。総スコアは各カテゴリーのスコアの合計で決定される。

免疫組織化学染色

マウスの結腸標本は脱水後ワックスに包埋し、ミクロトームを用いて4μmの組織スライスに切り出した。脱脂・水和後、組織切片をビーカー内の耐高温切片ラックに置き、抗原修復のために適量の修復液（0.01M EDTA緩衝液、pH9.0）を加えた。内因性ペルオキシダーゼをブロックするために調製した3％過酸化水素を加え、室温で15分間インキュベートした後、PBSで3回洗浄した。希釈した正常ヤギ血清を加え、室温で30分間ブロッキングした。次に一次抗体を加え、4℃で一晩インキュベートした。HRP標識ヤギ抗ウサギ/マウス二次抗体を加え、37℃で30分間インキュベートした。DAB発色液を加え、メイヤー・ヘマトキシリンで2分間カウンター染色した。スライドをシールした後、顕微鏡で観察した。

リアルタイムPCR

大腸組織標本を液体窒素を満たした乳鉢で十分に粉砕し、DNA抽出キットを用いて全細菌DNAを抽出した。手順は、製造者の指示に厳密に従った。抽出DNAの濃度測定にはNano-Drop 2000を用いた。リアルタイム増幅システムは、10µLのSYBR Green Master、1µLの上流および下流プライマー、6µLの超純水、2µLのDNA鋳型を用いて、自動サーモサイクラーで行った。反応条件は以下の通りである： 95℃、10分、95℃、15秒、60℃、15秒、72℃、30秒、72℃、40サイクル。F. nucleatum用のプライマーセットは、特定の保存されたnusG遺伝子をターゲットとして設計された。プライマーの設計にはPremier 5.0ソフトウェアを用いた。nusG: Forward: 5'-GTT AGA GGA AAG CCC AAG AAG GTC-3'; Reverse: 5'-AGG AAT AG GTC-3'： 5'-AGG AAT AGG GTC AGA ACC AAC TCC-3';fadA: フォワード: 5'-CAC AAG CTG ACG CTG CTA GA-3', リバース： 5'-TTA CCA GCT CTT AAA GCT TG-3'.

16 S rRNA全長配列決定

糞便サンプルを採取し、-80℃で保存した。サンプルからゲノムDNAをQIAamp Fast DNA Stool Mini Kitを用いて抽出した。抽出したDNAの濃度と純度はアガロースゲル電気泳動で分析した。プライマー（27 F: AGR GTT TGA TYN TGG CTC AGおよび1492 R: TAS GGH TAC CTT GTT ASG ACT T）を用いて全長の16 S rRNA遺伝子を増幅した。精製したPCR産物を用いて、PacBioプラットフォーム（Biomarker-technologies Company、北京）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってシーケンスライブラリーを構築した。構築されたライブラリーはライブラリー品質検査にかけられ、適格なライブラリーはPacBio Sequelで塩基配列が決定された。得られた高品質配列は、類似度97％の操作的分類単位（OTU）にクラスタリングされた。α-diversity, β-diversity, Metastats解析はBMK Cloud(www.biocloud.net)を用いて行った。

酵素結合免疫吸着アッセイ

大腸組織中のサイトカインレベルは、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を用いて測定した。大腸タンパク質を抽出するために、大腸組織を小片にスライスし、ホモジナイザーで粉砕し、400μlの組織溶解液と混合した後、超音波でホモジナイズした。その後、溶解液を1.5 ml遠心チューブに移し、12,000/rpm、4℃で5分間遠心し、上清を回収し、メーカーのキットに従ってタンパク質濃度を測定した。

統計分析

カテゴリー変数はPearsonのカイ二乗検定およびFisherの正確検定を用いて解析した。正規分布と分散の均一性に適合する連続データは、一元配置分散分析（One-way ANOVA）を用いて分析した。正規分布に合致しない測定データは、ノンパラメトリック検定（Kruskal-Wallis）として記述した。すべての統計処理は、IBM SPSS Statistics 21.0を用いて行った。p< 0.05の値を統計的に有意とみなした。

結果

F. nucleatumはDSS誘発大腸炎マウスの炎症および腸管バリア障害をさらに悪化させた

F. nucleatumが黄砂誘発大腸炎マウスの炎症および腸管バリア障害を促進するかどうかを検討するため、2.5％黄砂水溶液摂取に加えて、ATCC25586株をSPF C57BL/6Jマウスに毎日経口投与した。動物実験の手順を図1Aに示す。群間で体重、生存率、疾患活動性指数をモニターした。HCマウスでは、体重は時間とともに徐々に増加し、DSSマウスとORマウスでは、最初の4日間はわずかに増加し、5日目から減少した。ORマウスの体重は、実験終了時にHCマウスやDSSマウスとは対照的に明らかに減少した（p<0.01、図1B）。HC群ではすべてのマウスが生存し、DSSおよびORマウスより有意に生存率が高かった。さらに、DSSマウスはORマウスよりも高い生存率を示した（p<0.01、図1C）。ORマウスの疾患活動性指数は、HCマウスおよびDSSマウスよりも有意に高かった（p<0.05、図1D）。HE染色では、HCマウスの腸管構造は連続的で無傷であり、炎症細胞の浸潤は認められなかった。DSSマウスでは腸管構造の破壊と炎症細胞の浸潤が観察された。OR群では、広範な粘膜損傷と重度の腺粘膜欠損が観察され、炎症細胞浸潤が併存していた。病理組織学的スコアは図1Eに示すように算出した。免疫組織化学染色により、オクルジンタンパク質はHCマウスでは上皮に持続的に発現していたが、DSSマウスおよびORマウスでは発現が中断していた。さらに、DSSマウスでの発現はORマウスよりも有意に高かった（p<0.05、図1E）。炎症性サイトカインであるTNF-α、IL-1β、IL-6のレベルも2つの大腸炎群で上昇した（図1F）。さらに、これらのサイトカインレベルは、DSSマウスとは対照的にORマウスで顕著に上昇した（p<0.05、図1F）。

図1

経口感染したF. nucleatumは、DSS誘発大腸炎マウスの炎症と腸管バリア障害をさらに悪化させた。A,本研究における動物実験のフローチャート。B,HC、DSSおよびOR群間におけるマウスの体重の変化。C,3群の生存率（%）。D,3群の疾患活動性指標スコア。E,HEによる病理組織学的染色とオクルジンタンパク質の免疫組織化学的染色の代表的画像。病理組織学的スコアとオクルジンタンパク質の相対発現量も算出した。F、ELISAによるTNF-α、IL-1βおよびIL-6の大腸レベル。p値は分散分析によって決定され、**p<0.01 vs. HC、## p<0.01 vs. OR。 C,データはピアソンのカイ二乗検定によって分析された。**p値は分散分析により決定した、*p<0.05、**p<0.01。

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F. nucleatumはDSS誘発大腸炎マウスにおいてdysbiosisを促進する

次に、F. nucleatumがDSSマウスの微生物叢を乱す影響を検討した。ATCC25585株をC57BL/6Jマウスに経口培養した。OTUのベン図解析の結果、3群で408 OTUが同定された。HC群、DSS群、OR群には、それぞれ30、5、11のユニークなOTUが含まれていた（図2A）。種の順位曲線は、HC群でより滑らかで広い曲線を示し、OR群で最も急激な減少が見られた（図2B）。レアファクション曲線は、シークエンシングの質がさらなる解析に必要な条件を満たしていることを示していた（図2C）。さらに、糞便微生物叢の構成を門レベルおよび属レベルで解析した（図2DおよびE）。HCマウスでは、ファーミキューテス門、バクテロイデーテス門、ベルーコミクロビオータが優勢であった。しかし、DSSマウスとORマウスでは、ファーミキューテス門と プロテオバクテリアが増加していた。DSSマウスとORマウスでは、ファーミキューテス属、バクテロイデス属、プロテオバクテリア属が優勢であった。同時に、微生物叢の構成と多様性の違いを評価するために、α多様性とβ多様性を利用した。シャノン指数とチャオ1指数を含むα多様性は、DSSマウスとORマウスでHCマウスに比べて著しく減少し、ORマウスはDSSマウスに比べて有意に低かった（p<0.05、図2FとG）。Non-Metric Multidimensional Scaling（NMDS）およびPrincipal Coordinates Analysis（PCoA）を含むβ多様性は、腸内細菌叢の分布が各群間でクラスタ分離されていることを反映した（図2HおよびI）。門レベルから属レベルまでのヒストグラムから、ORマウスで有意に濃縮された細菌は、主にDubosiella、Peptostreptococcaceae、Romboutsia、Enterococcaceae、Escherichia coliであった。DSSマウスでは、主にLactobacillaceae（乳酸桿菌科）、Allobaculum（乳酸桿菌科）、Muribaculaceae（乳酸桿菌科）が濃縮された（図2J）。

図2

F. nucleatumはDSS誘発大腸炎マウスのdysbiosisをさらに悪化させた。A, HC、DSS、OR群間のOTUのベン図分析。B,Rank-abundance曲線は、DSSおよびORマウスよりもHCマウス（赤曲線）で高い種の豊富さを反映している。DSSマウスはORマウスよりも種濃度が高い。C,3群間のレアファクション曲線。D, E, 門レベルおよび種レベルでの微生物叢組成の相対的存在量。F,G,α多様性（Taxa richness (Chao1 index)とspecies diversity (Shannon index)を含む）は、HCマウスの微生物相の豊富さと多様性がDSSマウスやORマウスよりも高いことを反映している。H,非計量的多次元尺度法（NMDS）解析は、サンプルの微生物組成の類似性を反映している。I,主座標解析（PCoA）は、グループ間のサンプル種の多様性の違いを反映した。J, ヒストグラムは、DSS群とOR群の濃縮微生物相を門レベルから種レベルまで表したものである。F-G,データは平均値±S.D.で示した。p値は分散分析により求めた。

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LFMTはDSS誘発大腸炎マウスの炎症と腸管バリア障害を緩和する

F. nucleatumがDSSマウスにおいて炎症と腸管構造障害をさらに促進することが示されたので、次に炎症と腸管バリア機能障害に対する上部FMTと下部FMTの効果を調べた。UFMTおよびLFMTの体重はORマウスほど急激には減少しなかった（図3A）。生存曲線はORマウスとUFMTマウスで著しく低下し、LFMTマウスの生存率は平坦な曲線を保った（図3B）。HE染色による病理組織学的変化は、ORマウスでは重度の粘膜損傷と多数の炎症細胞の浸潤を反映していた。一方、LFMTマウスでは、腸上皮の完全性は維持され、炎症細胞の浸潤は散在していた。また、UFMTマウスでは腸管上皮に改善が認められたものの、腸管構造は依然として損傷を受けており、腺構造はほとんど残存していなかった。病理組織学的スコアもこの結果を裏付けていた（図3CおよびD）。また、LFMTマウスではOccludinタンパク質の発現増加が観察され、OR群およびUFMT群とは有意に異なっていた（p<0.05、図3CおよびE）。LFMTマウスの疾患活動性は、最初の1週間は増加し続け、その後1週目から有意に減少した。実験終了時、LFMTマウスの疾患活動性はDSS群、OR群、UFMT群と有意に異なっていた（p<0.01、図3F）。UFMTマウスの疾患活動性指標は10日目から変化しなかった。実験終了時の疾患活動性はORマウスが最も高く、他の群とは有意差があった（p<0.01、図3F）。UFMTおよびLFMTマウスでは、TNF-αおよびIL-6レベルの顕著な減少が観察された（p<0.05、図3GおよびI）。ORおよびUFMTと比較して、LFMTマウスではIL1-βレベルが有意に低下した（p<0.05、図3H）。

図3

下部消化管を介した糞便微生物叢移植は、黄砂誘発大腸炎マウスの炎症と腸管バリア障害を緩和した。A,OR群、UFMT群、LFMT群の体重変化。B,生存率(%)。C,HEによる病理組織学的染色とオクルジンタンパク質の免疫組織化学的染色の代表像。D, E,病理組織学的スコアとオクルジンタンパク質の相対発現。F,DSS、OR、UFMT、LFMT群間の疾患活動性指数の変化。G、H、I、ELISAによるTNF-α、IL-1β、IL-6の大腸レベル。p値は分散分析によって決定され、**p<0.01 vs. LFMT、## p<0.01 vs. OR。B,データはピアソンのカイ二乗検定によって行われた。**p<0.01対OR、##p< 0.01対LFMT。D, F,Kruskal-Wallis検定。**p<0.01対OR、##p< 0.01対LFMT。p値は分散分析によって決定され、*p<0.05、**p<0.01。

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LFMTはDSS誘発大腸炎マウスの腸内細菌叢異常を回復させる

DSS誘発大腸炎マウスの腸内細菌叢異常に対するFMTの効果を調べるため、C57BL/6マウスで上部および下部FMTを行い、糞便サンプルを採取して16 S-rRNA全長配列決定を行った。OTUのベン図から、OR、UFMT、LFMTマウスで410のOTUが同定された。OR群、UFMT群、LFMT群にはそれぞれ3、1、33のユニークなOTUが含まれていた（図4A）。種順位曲線は、LFMT群でより滑らかで広い曲線が観察され、OR群で最も急激な減少が見られた（図4B）。希少化曲線を図4Cに示す。種の多様性はLFMT群でシャノン指数が上昇したが、OR群およびUFMT群と比べて有意な差は見られなかった（p>0.05、図4D）。分類群の豊かさ（Chao1 index）は、UFMTとLFMTで顕著に増加し、ORマウスはDSSマウスより有意に低かった（p<0.01、図4E）。さらに、糞便サンプルの微生物組成を門レベルおよび属レベルで分析した。図4Fに示すように、UFMTマウスとLFMTマウスでは、バクテロイーダ菌と 疣贅菌が増加していた。また、UFMTマウスとLFMTマウスでは、ファーミキューテス属と プロテオバクテリア属の減少が観察された。さらに、門レベルから属レベルまでのヒストグラムから、UFMTマウスで有意に濃縮された細菌はLactobacillales、Enterococcaceae、Clostridiumであった。LFMTマウスに濃縮された細菌は、主にバクテロイデス門、ラクノスピラ科、プレボテラ科であった（図4G）。NMDSおよびPCoA解析から、LFMTの腸内細菌叢分布はDSSおよびUFMT群とクラスター分離していることが示された（図4HおよびI）。

図4

下部消化管からの糞便微生物叢移植は、DSS誘発大腸炎マウスの腸内細菌叢異常症を回復させた。A,OR群、UFMT群、LFMT群のOTUのベン図解析。B,Rank-abundance曲線は、LFMTマウス（緑色の曲線）の方がORマウス（赤色の曲線）およびUFMTマウス（青色の曲線）よりも高い種の豊富さを反映している。C,3群間の希少化曲線。D, E,分類群の豊かさ（Chao1 index）および種の多様性（Shannon index）は、LFMTマウスの微生物の豊かさおよび多様性がORマウスおよびUFMTマウスよりも高いことを反映している。F,門レベルおよび種レベルでの微生物叢組成の相対的存在量。G,ヒストグラムはUFMT群とLFMT群で濃縮された微生物叢を門レベルから種レベルまで表したものである。H,NMDS分析はサンプルの微生物組成の類似性を反映している。I,PCoA解析は、グループ間のサンプル種の多様性の違いを反映している。D-E,データは平均値±S.D.で示した。p値は分散分析により求めた。

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F. nucleatumおよび病原性fadAレベルは、LFMT治療時間と負の相関を示した。

相関ヒートマップは、炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6と、5群間およびUFMT群とLFMT群間の上位50属の存在量との関係を示した。Lactobacillus属、Allobaculum属、Bacteroidales属のようなIBDのプロバイオティクスに通常欠乏する属は、TNF-α、IL-1β、IL-6と負の相関を示した。Romboutsia属、Escherichia Shigella属、Enterococcus属、Clostridium属などは、TNF-α、IL-1β、IL-6と正の相関を示した（図5AおよびB）。また、リアルタイムPCR法を用いて、異なる時点でのnusGと fadAのレベルも解析した。その結果、nusGと fadAはORマウスで持続的に増加しており、UFMTやLFMTよりも有意に高かった（p<0.01、図5CとD）。UFMTとLFMTでは顕著な減少が見られたが、UFMTの減少傾向はLFMTマウスほど明らかではなかった（p<0.05、図5CとD）。さらに、糞便中のnusGおよびfadA遺伝子レベルは、LFMT治療時間と負の相関を示した（r= 0.9531、p<0.001、図5E）（r= 0.9610、p<0.001、図5F）。

図5

下部消化管FMTは、F. nucleatum（nusG遺伝子として示される）および病原性fadAのレベルを低下させることができ、F. nucleatumおよび病原性fadAのレベルは、FMT治療時間と負の相関を示した。A,相関ヒートマップは、炎症性サイトカインTNF-α、IL-1β、IL-6と、5群間の存在量上位50属との相関を明らかにする。B,OR群、UFMT群、LFMT群間の相関ヒートマップ。C,各群におけるFMT時間の増加に伴うnusG遺伝子レベルの変化。D,各群におけるFMT回数の増加に伴うfadA遺伝子レベルの変化。E,便中nusG遺伝子量はFMT回数と負の相関を示した（r= 0.9531、p<0.001）。F,便中fadA値はFMT回数と負の相関を示した（r= 0.9610、p<0.001）。C、D、データは平均値±SDで示され、p値は分散分析によって決定された。E,F,データはSpearman相関により求めた。

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考察

F. nucleatumは日和見病原体であり、通常口腔および消化管に生息すると考えられている。口腔病原体は、歯周炎、歯肉炎、口腔がん、炎症性腸疾患、大腸がんなど多くの疾患に関与している[25,26,27]。また、未熟児の臍帯血から検出されたF. nucleatumが、死産や分娩終了などの出生時の有害事象と関連しているという報告もある[29]。これらの研究は、F. nucleatumが単なる経口病原体ではないことを示唆している。しかし、宿主細胞への付着はF. nucleatumの病原性の必須条件である。接着性微生物であるF. nucleatumは、上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、単球／マクロファージなど様々な宿主細胞表面に接着し、唾液高分子、細胞外マトリックスタンパク質、抗体と結合し、一連の宿主免疫応答を引き起こす。F. nucleatumの表面に発現する重要なビルレンスFadAアドヘシンは、バイオフィルム形成の足場として機能し、F. nucleatumの耐酸性と耐外性を向上させる[30]。Rubinsteinらは、FadAが大腸がん細胞のE-カドヘリンタンパク質と結合することにより、大腸がん細胞の接着と浸潤を媒介し、大腸がんの発がんを促進することを報告した[31]。Hongらは、病原性決定因子FadAを含むF. nucleatum外膜小胞が関節内に移動し、局所的な炎症反応を引き起こすと報告している［32］。これらの研究は、FadAがF. nucleatumの重要な病原因子であることを明らかにした。

UCは、調節不全に陥った免疫微生物叢と宿主免疫系との複雑な相互作用によって引き起こされる慢性炎症性疾患である。

上皮バリアの破壊と腸内細菌叢の異常は、口腔病原体のコロニー形成と侵入の前提条件となり、これらの病原体が腸に移行すると、腸内で炎症促進因子となる。いくつかの研究で、F. nucleatumがUC患者に蓄積し、臨床的特徴と関連していることが示されている [33,34]。Liらは、糞便中のF. nucleatumが保有する病原性fadA遺伝子が、対照群と比較してUC患者で増加し、UCの重症度や部位と関連していることを報告した[33]。Chenらは、F. nucleatumがUC組織の51.78％に濃縮され、UCの臨床経過、臨床活動性、難治性と相関していたことを報告している[34]。本研究では、まずDSS誘発大腸炎モデル動物において、F. nucleatumの経口感染がUCの炎症を悪化させるかどうかを検討した。その結果、F. nucleatumの経口接種は、DSS誘発マウスの疾患活動性と上皮バリア障害をさらに悪化させることが示された。

UC患者の腸内細菌叢は健常人とは異なる。健常人と比較して、IBD患者の微生物プロフィールは、共生細菌の減少と日和見病原体の増加として現れた。Hiranoらは、IBD患者の炎症および非炎症結腸組織の両方で、微生物叢の多様性が減少していることを明らかにした[35]。El-Bazらは、UC患者において大腸菌と フソバクテリウムが有意に増加し、ビフィズス菌が減少していることを認めた [36]。Lin Sらは、F. nucleatumがDSS溶液によって誘発された大腸炎モデルにおいて炎症とバリア障害をさらに悪化させ、ビフィズス菌と フェーカリバクテリウムのレベルを低下させ、大腸菌と 赤痢菌の存在量を増加させることを確認した[18]。この実験では、DSSマウスは、ファーミキューテス、プロテオバクテリアの存在量が増加し、バクテロイデーテス、ベルーオバクテリアの存在量が減少するという顕著な微生物叢異常症を示した。F.ヌクレアタムは、腸内微生物群集のディスバイオーシスをさらに促進した。ORマウスにおける微生物叢のα-多様性およびβ-多様性は、DSSマウスに比べて著しく減少していた。また、ORマウスの糞便中には、Dubosiella、Peptostreptococcaceae、Romboutsia、Enterococcaceae、Escherichia coliなどの病原性細菌が集まっていた。

近年、FMTは選択されたドナーの糞便を試験管内で凍結乾燥物質に調製し、患者の腸管内に灌流することで治療効果を得る新しい治療法である。FMTは当初、難治性CDI患者の治療に使用され、顕著な治癒効果を示した[37]。したがって、FMTは有望な治療法となる。しかし、FMTの長期的な有効性と副作用については、完全には解明されていない。FMTにおいて治療的役割を果たす特定の微生物や代謝産物、FMTの有効性の予測因子や評価因子については、依然として不明な点が多い。Paramsothyらは、UC治療におけるFMTの効果に特定の細菌や代謝産物が関係していることを報告している。彼らは、FMT後に寛解を得たUC患者では、そうでない患者と比較して、Eubacterium halliiと Roseburia inulivoransが濃縮されていることを見出した[38]。このことは、FMTの治療効果が特定の細菌の濃縮に関係している可能性を示唆している。それに加えて、治療方法も無視できない問題である。FMTによる治療を受けたCDI患者305例を含む14の研究の共同解析では、下部消化管ルート（LGI）患者208例と上部消化管ルート（UGI）患者97例で、LGI患者に比べUGI患者では臨床的失敗が高いことが明らかになった（17.9％対8.5％）。さらに、LGI患者よりもUGI患者の方が臨床的失敗の危険性が3倍高かった[39]。我々の研究では、LFMTマウスはUFMTマウスよりも疾患活動性が低下し、腸粘膜バリア破壊が緩和され（図3DおよびE）、細菌の多様性が回復した（図4DおよびE）。UFMTマウスとLFMTマウスではBacteroidotaと Verrucomicrobiotaの増加が観察された（図4F）。また、UFMTマウスとLFMTマウスでは、ファーミキューテス属と プロテオバクテリア属の減少が観察された（図4F）。この変化はLFMTマウスでより顕著であった。さらに、LFMTマウスで濃縮された細菌には、主にバクテロイデス門、ラクノスピラ科、Prevotellaceaeなどの共生細菌が含まれており（図4G）、これらの常在細菌がFMT治療において治療効果を発揮する可能性が示唆された。

FMTは、微生物叢の多様性を回復させることによってUCを治療するだけでなく、腸内の病原性細菌や病原性因子を除去することによって大腸炎を治療する可能性もある。Houriganらは、IBDの有無にかかわらず、FMTによってC. difficileの除菌が持続的に行われることを発見した。また、C. difficileの cdtB病原性遺伝子は、FMTの3ヵ月後と6ヵ月後の患者の糞便からは検出されなかった[23]。Juliaらは、CDI患者においてFMT前とFMT後にBacteroides fragilis、F. nucleatum、Escherichia coli、およびそれらの病原性遺伝子（bft、fadA、pks）を検出し、FMT後にこれらのオンコバクテリアと病原性遺伝子のレベルが減少するか検出されないことを見出した[24]。我々の実験では、Lactobacillus 属、Allobaculum属、Bacteroidales属が炎症性サイトカインと負の相関を示した（図5A）。一方、Romboutsia属、Escherichia Shigella属、Enterococcus属、Clostridium属は、炎症性サイトカインと正の相関を示した（図5A）。また、F. nucleatum（nusG遺伝子として示される）およびfadAのレベルは、FMTの時間が長くなるにつれて徐々に減少し、LFMTの減少曲線はUFMTよりも明らかであった（図5CおよびD）。一方、F. nucleatumおよびfadAのレベルは、LFMTの頻度と負の相関を示した（図5EおよびF）。これらの結果から、FMTは病原性細菌および病原性因子を減少させることで疾病に寄与していることが示唆された。

結論

概して、我々の結果は、口腔病原体が特定の状況下で腸内細菌叢に影響を及ぼし、UCの病因に関与する可能性を明らかにした。一方、新規の治療法として、FMTはUCの治療において有望な有効性と安全性を示した。また、腸内F. nucleatumと病原因子を除去し、腸内細菌叢の多様性を回復させることで治療効果が得られる可能性が示唆された。しかし、FMTがF. nucleatumおよび病原因子を除去するメカニズムについては、さらなる検討が必要である。また、細菌の代謝物分析は実験に組み込まれていなかった。これらの限界はあるものの、本研究は「口腔-腸-マイクロバイオーム軸」を理解するための新たな視点を提供し、特定の口腔関連細菌をバイオマーカーとして用いることにより、FMTの治療効果を予測する方向性を示した。

データの利用可能性

本研究の結果を裏付ける16S rRNAシーケンスの生データは、Science Data Bank（https://doi.org/10.57760/sciencedb.16482）で入手可能である。

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資金提供

本研究は、公的、営利、非営利のいずれの分野の助成機関からも特定の助成を受けていない。

著者情報

著者および所属

  1. 中国人民解放軍空軍医療センター消化器科、北京、中国Dong-Hao Li, Zong-Wei Li, Qi Sun, Lei Wang & Shou-Bin Ning

寄稿

Zong-Wei LiとDong-Hao Liが研究を計画した。Lei Wangはサンプル収集とデータ収集に参加した。Dong-Hao Liは実験を行い、原稿を執筆した。Qi Sunが原稿を修正した。Shou-Bin Ningが原稿のデザインと修正を行った。

責任著者

Shou-Bin Ningまで。

倫理申告

倫理承認と参加同意

本研究および実験手順は、中国人民解放軍空軍医療センター倫理委員会の承認を得た（承認ID 2023-246-S01）。

発表の同意

著者は、記載された研究が過去に発表されていないか、他で検討中であることを確認し、その発表が共著者全員によって承認されていることを確認する。

競合利益

著者は、競合する利益はないと宣言している。

追加情報

出版社ノート

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権利と許可

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Li, DH., Li, ZW., Sun, Q.et al.下部糞便微生物叢移植は、経口由来のFusobacterium nucleatumおよび病原因子を除去することにより潰瘍性大腸炎を改善する。Gut Pathog 16, 42 (2024). https://doi.org/10.1186/s13099-024-00633-9

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  • 受理2024年04月02日

  • 受理2024年7月17日

  • 公開2024年08月08日

  • DOIhttps://doi.org/10.1186/s13099-024-00633-9

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キーワード

腸内病原体

ISSN: 1757-4749

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