過酸化リノール酸、13-HPODEが腸管上皮細胞の遺伝子発現プロファイルを変化させる
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雑誌 Foods 第10巻 第2号 10.3390/foods10020314
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オープンアクセス論文
過酸化リノール酸、13-HPODEが腸管上皮細胞の遺伝子発現プロファイルを変化させる
https://www.mdpi.com/2304-8158/10/2/314
by Nisreen Faizo 1ORCID、Chandrakala Aluganti Narasimhulu 2、Anna Forsman 3ORCID、Shibu Yooseph 4、* andSampath Parthasarathy 2
1
米国フロリダ州オーランド、セントラルフロリダ大学医学部、ゲノム・バイオインフォマティクスクラスター、バーネット医科学大学院
2
米国フロリダ州オーランド、セントラルフロリダ大学医学部、バーネット生物医学科学部
3
米国フロリダ州オーランド、セントラルフロリダ大学ゲノミクス・バイオインフォマティクスクラスター生物学科
4
米国フロリダ州オーランド、セントラルフロリダ大学ゲノミクス・バイオインフォマティクスクラスター、コンピューターサイエンス学科
*
著者宛先
Foods 2021, 10(2), 314; https://doi.org/10.3390/foods10020314
投稿受理： 2020年12月29日／改訂：2021年1月29日／受理：2021年1月31日 2021年1月31日 / 掲載：2021年2月3日
(この記事は Food Physics and (Bio)Chemistry に所属しています。）
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要旨
過酸化脂質（LOOHs）は加工食品に多く含まれ、腸疾患、心血管疾患、癌疾患を含む様々な疾患の病態に関与している。近年、遺伝子発現のプロファイリングにRNAシーケンス（RNA-seq）が広く用いられている。過酸化リノール酸に曝露した際の遺伝子発現とパスウェイの調節異常を明らかにするため、腸管上皮細胞（Caco-2）を100 µMの13-hydroperoxyoctadecadienoic acid（13-HPODE）またはリノール酸（LA）と24時間インキュベートした。その結果、13-HPODE処理細胞では3094個の、LA処理細胞では2862個の、未処理細胞に対する差次発現遺伝子（DEG）が同定された。我々は、13-HPODEが、脂質の取り込みと輸送を変化させるステロイドホルモン生合成、PPARシグナル伝達、胆汁分泌を含む脂質代謝経路を増強することを示した。13-HPODEとLA処理は、チトクロームP450を含む解毒機構を促進した。逆に、両治療とも酸化的リン酸化を抑制した。我々はまた、両処理が細胞周期、DNA合成／修復、リボソームに関わる経路を抑制し、フォーカルアドヒージョンを増強することにより、吸収細胞の分化を促進し、増殖を抑える可能性があることを示した。代表的なDEGのqRT-PCR解析は、RNA-seq解析を検証した。本研究は、13-HPODEが細胞プロセスを変化させるメカニズムと、ミトコンドリア機能障害関連疾患への関与の可能性についての洞察を提供し、LOOH関連病態を治療するための潜在的な治療戦略を提案するものである。
キーワード：脂質過酸化；遺伝子発現；代謝
要旨
はじめに
植物油を含む食事性脂質には、最も一般的な食事性多価不飽和脂肪酸（PUFA）であるリノール酸（LA）がトリグリセリドの形で様々な量含まれており、胆汁やリパーゼによって加水分解される。この過程で、しばしばミリモル量の遊離脂肪酸（FFA）が大量に放出され、腸細胞に吸収される [1]。加工（例えば、揚げ物）によっては、摂取された脂質に含まれる過酸化PUFAやその分解産物の量は様々である [2]。食餌性過酸化脂質（LOOHs）は腸内で分解され、エポキシケトンなどの他の脂質過酸化生成物が生成され、過酸化脂肪酸（FAs）が放出され、腸細胞に到達して吸収される [3]。過熱された油に由来する食餌性LOOHが、リポタンパク質中の過酸化FAの存在に寄与していることが実証されており[4]、このことは、食餌性LOOHが一連の酵素的消化を受けても、過酸化FAが腸に到達して吸収されることを示している。
LOOHは、炎症性腸疾患（IBD）や悪性腫瘍など、消化器系の疾患と強く関連している[5]。研究により、LOOHは完全に分化した（Dif）腸上皮細胞に効率よく吸収され、リンパに輸送される一方で、未分化細胞にはあまり取り込まれないことが実証されている[3,6]。さらに、Dif Caco-2細胞による酸化FAsの取り込みは、ブラシボーダーの存在に依存し、Dif Caco-2細胞における酸化されていないFAsの取り込みと同等であることが実証されている[3]。13-ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸(13-HPODE)は、細胞内で速やかに4-ヒドロキシノネナール(4-HNE)やオキソノナン酸(ONA)などのアルデヒドに分解され、細胞毒性を示し、活性酸素種(ROS)の生成を引き起こす。これまでの研究で、LOOHは酸化ストレスを引き起こし、腸上皮の細胞完全性を喪失させることが示されている [7]。過酸化脂質の摂取もまた、腸における炎症性変化を引き起こすことが報告されている [8,9]。Caco-2細胞における鉄/アスコルビン酸を介したLOOHの産生は、炎症プロセスを制御するNF-κBの活性化をもたらすことが示されている [10]。食餌性LOOHは、心血管疾患にも関与している [3,11]。以前の研究では、過酸化脂 肪はカイロミクロンに含まれることが示されており [12]、これは食事中の過酸化脂 肪含有量と相関している [13]-これらは再包装され、リポタンパク 質に分配されると考えられている。カイロミクロン中の過酸化脂質の存在は、食事性コレステロールのアテローム性を高め [14] 、コレステロールの吸収を促進することが示されている [15] 。
Caco-2細胞株は、ヒト大腸腺がん由来のヒト腸管上皮細胞株である [16]。特定の培養条件下で、Caco-2細胞はヒト腸細胞に似た吸収機能とブラシボーダーを持つ細胞単層に分化する。この細胞株は、脂質を含む薬物や食物分子の細胞内取り込み、輸送、代謝に関する研究に広く用いられてきた[3,15,17]。Caco-2細胞株を用いて腸上皮による脂質の輸送と代謝を研究することは、in vivoの動物モデルを用いるよりも難易度が低い[18]。これまでの研究で、細胞毒性以下の濃度のLOOHは、Caco-2細胞に重大な傷害と分裂促進性の変化を引き起こし、一方、より高濃度のLOOHは細胞死を促進することが明らかにされている[19,20]。LOOHはまた、酸化還元不均衡を引き起こし、腸管上皮のターンオーバーを破壊することが示唆されている [21]。したがって、LOOHに対するCaco-2細胞の応答は、腸細胞がさらされるLOOHの量に依存する。さらに、LOOHは細胞膜の流動性を低下させ、腸上皮細胞の透過性を増加させた [22]。膜の流動性とダイナミクスの変化は、腸細胞による脂質の吸収や乳管への分泌など、いくつかの細胞プロセスに影響を与える可能性がある [24]。さらに、LOOHはDNA損傷も誘発するようである [7]。
最近発表された研究では、13-HPODEで処理したCaco-2細胞と、13-HPODEを摂取させたマウスとの間で同様の結果が示されたことから [26]、Caco-2細胞を13-HPODEで処理することは、食事性LOOH摂取の良いモデルとなる。そこで本研究では、Caco-2細胞を用いて、最も一般的な食餌性過酸化脂質である13-HPODEが、腸管上皮の代謝過程、細胞経路、表現型に及ぼす影響を調べた。RNA-seq法を用いて遺伝子発現プロファイルを作成し、Caco-2細胞が13-HPODEにどのように反応するかを明らかにした。これらのデータを用いて、健康状態に対する脂質過酸化の寄与を説明しうる分子メカニズムや、腸病理学における脂質の潜在的役割を同定した。LAは最も豊富な食事性PUFAであることから[27]、LA由来のリポキシダーゼ産物である特異的LOOH、13-HPODEで処理したCaco-2細胞のRNA配列決定を行った。生成されたRNA-seqデータのバイオインフォマティクス解析により、最も一般的な食餌性LOOHである13-HPODEに応答したCaco-2細胞における調節異常遺伝子と破壊されたパスウェイに関する貴重な情報が得られた。我々は、13-HPODE処理細胞から得られた結果を、非過酸化脂質を代表するLAで処理したCaco-2細胞の遺伝子発現プロファイルと比較した。LAは植物油や西洋食に含まれる最も一般的なオメガ6系PUFAであるため、Caco-2細胞をLAで処理することは、大豆油やキャノーラ油などの植物油やナッツ類の摂取を模倣することになる[28]。さらに、腸管培養細胞を純粋なリノール酸またはリパーゼ消化したゴマ油で処理した場合にも、同等の結果が見られた［29］。RNA-seq結果の検証はqRT-PCR解析で行われ、我々のRNA-seqデータと一致した結果が得られた。今後の研究により、過酸化リノール酸の摂取に関連する疾患を治療するための潜在的な治療戦略が得られる可能性がある。材料と方法
2.1. 細胞培養
Caco-2細胞はAmerican Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA)から購入した。細胞は、15％ウシ胎児血清（FBS；Invitrogen, Carlsbad, USA）、2mM L-グルタミン（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）、および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM；Invitrogen, Carlsbad, USA）で培養した。コンフルエントに達した後、7.5%FBSと同濃度のその他の成分を添加した同じ培地で細胞を培養した。コンフルエントになった細胞は、0.25% Trypsin-EDTA溶液（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いてトリプシン処理した。Caco-2細胞を6ウェルプレートに播種し、完全分化細胞（Dif; Day-14）で実験を行った。
2.2. 過酸化脂質の調製
リノール酸（LA）のストック溶液（Sigma #W338001 -25G, St.Louis, MO, USA）をエタノールで調製し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）中のLA（200μM）を調製して細胞にLA処理を行った。13-ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸（13-HPODE）は、以前に記載されたようにPBS中で新鮮に調製した[9,14,30]。簡単に言うと、PBS（pH7.4）中のLA（200μM）を、培地と混和しやすい10Uのダイズリポキシゲナーゼ（Sigma #L6632 -1MU）の添加で酸化した。酸化中の共役ジエンの生成は、分光光度計（Uvikon XL, Biotek Instruments, El Cajon, CA, USA）を用い、PBSを基準として200 nmから300 nmの吸光度をスキャンすることでモニターした。リノール酸の酸化型への変換は、234 nmにおける光学密度の増加として観察された。過酸化物含量は、ロイコメチレンブルー（LMB）アッセイを用いて測定した[31]。調製したての13-HPODEは、汚染のリスクを減らすために溶液全体をフィルター滅菌し、過酸化物の自然分解を最小限に抑えるために、調製後2時間以内に細胞培養実験に使用した。
2.3. 13-HPODE/LAによる細胞の処理
前述のように[26]、Dif Caco-2細胞は処理前に無血清培地で3時間飢餓状態にした。未処理のコントロール細胞は、処理と同量のPBSで維持した。24時間培養後、細胞をPBSで洗浄し、TRIzolに回収して全RNAを単離した。実験は3連で行った。
2.4. 全RNA抽出と定量
TRIzol試薬（Invitrogen, 15596026）を用いて、6ウェル培養プレートで細胞を直接溶解した。細胞溶解液をチューブに移し、クロロホルムを加えた。サンプルをボルテックスし、室温で3分間インキュベートした後、12,400×gで15分間遠心した。RNAを含む上層の水相を新しいチューブに移した。サンプルにイソプロピルアルコールを加え、12,000×gで10分間遠心し、水相からRNAを沈殿させた。全RNAを7500×gのエタノールで5分間洗浄し、2-3分間風乾した。RNAをRNaseフリーの水に懸濁し、NanoDrop分光光度計（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いてサンプルの濃度、純度、品質を測定した。共抽出されたDNAは、TURBO DNA-free kit（Invitrogen, AM1907, Carlsbad, CA, USA）を用いて、製造元の指示に従ってRNAサンプルから除去した。
2.5. RNA-seqライブラリーの調製と塩基配列決定
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module（New England Biolabs, E7490S, Ipswich, MA, USA）を用いて、サンプルあたり約500 ngの全RNAをインプットし、全RNAサンプルからmRNAを単離した。RNA-seqライブラリーは、NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep kit for Illumina（New England Biolabs、E7760S）を用いてmRNAサンプルから調製した。サンプルは94℃で15分間断片化し、200塩基対（bp）の標的断片サイズにした。イルミナシーケンス用のインデックスアダプター（New England Biolabs、E7710、E7730）を、PCRを8サイクル行ってライブラリーにライゲーションした。ライブラリーの品質は、TapeStation 2200装置（Agilent Technologies, 5067-5585, Santa Clara, CA, USA）でHigh Sensitivity D1000試薬（Agilent Technologies, 5067-5585, Santa Clara, CA, USA）を用いて評価した。ライブラリー濃度は、NEBNext Library Quant Kit for Illumina（New England Biolabs、E7630S）を用いて、製造元の指示に従って測定した。各ライブラリーの3希釈液（1:1000、1:10,000、1:100,000）を調製し、メーカー提供の標準品（20 µL反応）とともに96ウェルqPCRプレートに3連プレートした。濃度データを用いて、マルチプレキシングに使用するライブラリ間の等モルプールを確認した。最終ライブラリープールは、High Sensitivity D1000 ScreenTapeアッセイを使用して品質をチェックし、最大ピークサイズ337 bp（図S1）の良好な品質を示し、GENEWIZ（米国ニュージャージー州サウスプレーンフィールド）に送付してシーケンシングを行った（HiSeq4000 2 × 150 bp）。シーケンスリード数は4800万から7900万リードで、平均品質スコアは37以上であった。
2.6. シーケンスデータの処理
ペアエンドシーケンスリードの解析には以下のパイプラインを用いた。FastQC（バージョン0.11.7）を用いて、リードの品質（品質スコア＞30）をチェックし、アダプターや過剰発現配列の有無を確認した[32]。Trimmomatic (version 0.36)を用いて、アダプターや質の低い塩基を除去した[33]。Hisat2（バージョン2.1.0）を用いて、リードをヒト参照ゲノム（Ensembl/Genome Reference Consortium Human Build 38, GRCh38）にアライメントした[34]。次に、FeatureCounts（バージョン1.5.0）を実行して、特定の遺伝子/エクソンにマップされたフラグメントの数をカウントした[35]。DESeq2（バージョン1.30.0）は、リードカウントをモデル化するために負の二項分布を使用するRパッケージで、異なるグループ間で差次的に発現した遺伝子（DEGs; 調整後p < 0.05）を同定するために使用した[36]。遺伝子記号はEnsemblデータベースから使用した。
2.7. エンリッチメント解析
RパッケージのclusterProfiler（バージョン3.18.0）のenrichGO関数[37]、およびGenerally Applicable Gene-set Enrichment（GAGE, バージョン2.40.0; 同じくRパッケージ）[38]を用いて、それぞれ遺伝子オントロジーおよび濃縮解析を行い、差次的発現遺伝子をさらに評価した。ジーンオントロジー（GO）解析は、生物学的プロセス、分子機能、細胞構成要素を含む濃縮されたGOタームを同定するために、処理された細胞グループのDEGsリスト（DESeq2からの調整されたp < 0.05）上でenrichGO関数を実行することによって実施された。DEGsとそのlog2 fold change scoreのリストに対してgage関数を実行することにより、パスウェイと遺伝子セットの濃縮分析（GSEA）を実施した。これにより、調節不全のKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)パスウェイのリスト、p値、方向性（ダウンレギュレートまたはアップレギュレート）が作成された。
2.8. qRT-PCRによる検証
RNA-seqの結果は、RNA-seq研究に用いたのと同じRNAサンプルを用いて、qRT-PCRで技術的に確認した。13-HPODE処理細胞では14の代表的なDEGが、LA処理細胞では11のDEGが、qRT-PCRを行うために選ばれた。SsoAdvancedTM Universal SYBR® Green Supermix (BioRad, 1725271)、2.5μMのプライマー（フォワードとリバース各々）、0.1ngのcDNAを10μLのPCR反応に用いた。プロトコールは95℃、30秒（初期変性）、95℃、15秒（変性）、60℃、30秒（アニーリング/伸長）を40サイクル行った。ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いた。相対mRNA発現量は
Δ
Δ
Ct法を用いた。処理群と未処理群間の統計的差異を決定するためにt検定を用い、データは平均値±SDで示した。プライマー配列は表S1に示す。結果
我々は、Dif Caco-2細胞を100 µMの13-HPODEまたはLAと24時間インキュベートした。近位腸はミリモル濃度のFAにさらされ、我々の予備的な結果では細胞毒性はほとんどないことが示されたため、この濃度を選択した[3,15]。対照（無処置）群はPBSで維持した。実験は3連で行った（詳細はセクション2で説明）。RNA抽出、処理、塩基配列決定後、遺伝子発現差解析と濃縮解析を行った。主成分分析によると、複製サンプルは治療に対する遺伝子発現の類似性を示し、未治療群と治療群の間に良好な分離が見られた（図S2）。log ratio vs. mean average (MA)プロット（図S3）は、未処置細胞群と処理細胞群の平均発現量が大きい差次的発現遺伝子（DEG；赤い点）が有意性を示すことを示している。
3.1. 13-HPODE処理Caco-2細胞
3.1.1. 差次的遺伝子発現
DESeq2を用いて、13-HPODE処理細胞と未処理細胞の間で3094のDEG（調整p < 0.05）を同定した（表S2）；未処理細胞に対して13-HPODE処理細胞では1692遺伝子がダウンレギュレートされ、1402遺伝子がアップレギュレートされた。アップレギュレートされた遺伝子の中には、PLIN2、FABP1、CPT1A、PCK1などの脂質代謝に関与する遺伝子が含まれていた。これらの遺伝子は、一方では肥満、糖尿病、心血管疾患において抗炎症作用を発揮することが示されているが[39]、他方では抗増殖作用と発がん作用の両方を持つ可能性があるPPARシグナルに関与している[40]。脂肪酸のミトコンドリアβ酸化に関与するCPT1AおよびACADVL、ならびに脂質およびグルコース代謝に関与するPDK4およびPCK1が発現上昇した。これらの遺伝子の誘導は、脂肪代謝と糖新生の両方を促進する可能性がある。CREB3L3やNDRG1などのストレス応答に関与する遺伝子も誘導された。グルタチオンペルオキシダーゼGPX1とGPX7の発現低下が観察されたが、グルタチオン（GSH）合成に必須なGCLCの発現上昇が見られたことから、GSH含量の増加が示唆された。グルタチオンペルオキシダーゼ活性の低下は、大腸がん[41]、心血管系疾患[42]、肥満、インスリン抵抗性[43]と関連している。また、HMOX1、CAT、UGT2B4、TXNRD1など、抗酸化防御系で役割を果たす核内因子赤血球2関連因子2（Nrf2）標的遺伝子のアップレギュレーションも観察された。塩化物トランスポーターであるSLC26A3、アミノ酸トランスポーターであるSLC38A4、ミオイノシトールトランスポーターであるSLC5A3など、いくつかの溶質輸送体（SLC）トランスポーターがアップレギュレートされており、細胞膜を介した基質輸送の変化を示していた。さらに、SLCトランスポーターは、IBDや代謝性疾患を含む様々な疾患に関与している [44,45] 。その他の発現上昇遺伝子には、上皮細胞基底膜と細胞外マトリックスの間に線維を形成するCOL7A1、および上皮細胞表面タンパク質を制御し、コレステロール代謝に関与するPDZK1があった。ダウンレギュレートされた遺伝子の中には、ODC1とPOLD2があり、それぞれポリアミン合成とDNA複製に重要である。グリセロリン脂質の生合成に関与するGPCPD1とプロスタグランジンEの合成に関与するPTGES2もダウンレギュレートされた。13-HPODE処理により、活性酸素を生成するNADPHオキシダーゼであるNOX1や、Wntシグナル伝達を阻害するDKK1も減少した[46]。図1は、13-HPODEで処理したCaco-2細胞におけるDEGの上位50個を、未処理の細胞と比較して示したものである。
Foods 10 00314 g001 550図1. 13-HPODE処理細胞と未処理のコントロール細胞間の遺伝子発現の差。ヒートマップは、未処理の対照細胞（14D.C1、14D.C2、14D.C3）と比較した、13-HPODE処理Caco-2細胞（14D.H1、14D.H2、14D.H3）における上位50の発現差遺伝子（DEG；調整p < 0.05）を示す。緑は発現上昇、赤は発現低下。
3.1.2. 遺伝子オントロジー
clusterProfiler R-packageのenrichGO機能を用いて遺伝子オントロジー解析を行った。その結果、翻訳、リボソーム生合成、RNAプロセシング、低酸素と酸化ストレスへの応答、ミトコンドリア翻訳、遺伝子発現に関わる多様な生物学的プロセスが濃縮されていることが明らかになった（調整後p < 0.05）。プリンヌクレオシド一リン酸、アルコール、およびアミノ酸代謝プロセス（図2）、ならびに炭水化物および脂質代謝プロセス（図示せず）も、13-HPODE処理により濃縮された。
食品 10 00314 g002 550図2. Caco-2細胞を13-HPODEで処理した際の生物学的プロセスの濃縮。未処理の対照細胞に対する13-HPODE処理分化Caco-2細胞で濃縮された遺伝子オントロジー（GO）生物学的プロセスの上位（調整p < 0.05）。
13-HPODEで処理したCaco-2細胞で濃縮された分子機能（調整p < 0.05）の中には、ATPase、酸化還元酵素、抗酸化剤、電子伝達、RNAポリメラーゼI、およびヘリカーゼ活性があった。さらに、補酵素、カルボン酸、熱ショックタンパク質、カドヘリンおよびシャペロン結合機能が濃縮された（図S4）。
濃縮された細胞成分（調整p < 0.05）には、ミトコンドリア内膜、マトリックス、リボソーム、タンパク質複合体、さらにリボソームサブユニット、スプライソソーム複合体、フォーカルアドヒージョン、細胞-基質アドヘレンスジャンクションが含まれた（図S5）。ブラシボーダーとアピカルな細胞膜も濃縮された（図示せず）。
3.1.3. パスウェイ濃縮解析
gage R-packageを用いてパスウェイ濃縮解析を行った（表1）。13-HPODEを処理した細胞では、未処理の細胞に比べ、KEGGパスウェイのうち、ステロイドホルモンの生合成、胆汁分泌、タンパク質の消化・吸収が上位にアップレギュレートされた（p < 0.05）。また、チトクロームP450、接着斑、PPARシグナル伝達など、重要な関連経路のアップレギュレーションも観察されたが、p値はわずかに高かった。
表1. 13-HPODE処理Caco-2細胞におけるパスウェイ濃縮解析。パスウェイの濃縮は、未処理細胞に対する13-HPODE処理Caco-2分化細胞のKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)パスウェイのアップレギュレーションとダウンレギュレーションを示す。
表
未処理細胞に対して13-HPODE処理細胞で観察されたダウンレギュレートされたパスウェイのうち（p < 0.05）、スプライソソーム、RNA輸送、リボソーム生合成、およびRNAポリメラーゼ経路、ならびにプリンおよびピリミジン代謝であった。酸化ストレスは塩基修飾とDNA損傷を引き起こす可能性がある [47]。細胞周期、DNA複製、切除修復の経路も同様に抑制されているようであった。細胞内タンパク質のタンパク質分解に関与するプロテアソーム経路もまたダウンレギュレートされた。また、酸化的リン酸化経路の減少も見られた。
3.2. LA処理Caco-2細胞
3.2.1. 差次的遺伝子発現
LA処理細胞では、未処理細胞と比較して2862個のDEG（調整p＜0.05）が同定された（表S3）。LA処理細胞では1179遺伝子が発現上昇し、1683遺伝子が発現低下した。13-HPODE処理細胞と同様に、PDZK1が誘導された。腸管上皮ブラシボーダーの重要な構成要素として報告されているTTN [48]も発現が上昇した。LA処理細胞で発現低下した遺伝子の中には、細胞周期制御因子であるRGCC、増殖を促進するロング・ノンコーディングRNAであるCYTOR、腫瘍の進行を促進する細胞接着分子であるCEACAM6があった。コレステロール生合成に関与するHMGCS1、スプライソソームとリボソームRNAプロセッシングに関与するDDX47、翻訳伸長因子であるEIF5A、ODC1も同様に抑制された。これらの遺伝子の発現低下は、LA処理による細胞増殖の低下を示しているのかもしれない。脂質合成とグルコースホメオスタシスを制御するINSIG1や、糖質代謝に関与するRPIA遺伝子など、代謝経路の制御に関与する遺伝子もダウンレギュレートされた。さらに、遺伝子発現を制御する転写因子JUN、マイトジェン活性化プロテインキナーゼの二重特異性リン酸化酵素DUSP4、DKK1など、細胞の運命やプロセスの制御に関与する遺伝子の発現が抑制された。その他のダウンレギュレート遺伝子には、ペプチダーゼ阻害剤（抗菌剤）のPI3、グルコーストランスポーターのSLC2A1、リン酸トランスポーターのSLC20A1などがあった[46]。図3は、LAで処理したDif Caco-2細胞における上位50のDEGを、未処理細胞と比較して示したものである。
Foods 10 00314 g003 550図3. リノール酸（LA）処理細胞と未処理の対照細胞との間の遺伝子発現の差。ヒートマップは、未処理細胞（14D.C1、14D.C2、および14D.C3）と比較した、LA処理Caco-2細胞（14D.LA1、14D.LA2、および14D.LA3）における上位50のDEG（調整p < 0.05）を示す。緑は発現上昇、赤は発現低下。
3.2.2. 遺伝子オントロジー
未処理細胞に対してLA処理細胞で濃縮された生物学的プロセスの中には、リボソームの生合成、rRNAとncRNAのプロセシング、低分子、アミノ酸、補酵素の代謝プロセス、リボ核タンパク質複合体のアセンブリー、ミトコンドリアの翻訳と遺伝子発現があった。加えて、LA処理細胞では、酸素濃度低下に対する応答、プリンヌクレオチド生合成、DNA二重鎖の巻き戻し、陰イオン輸送、糖質代謝過程が豊富であった（図4）。
食品 10 00314 g004 550図4. Caco-2細胞をLAで処理した際の生物学的プロセスの濃縮。未処理細胞に対するLA処理分化Caco-2細胞で濃縮されたGO生物学的プロセスの上位（調整p < 0.05）。
LA処理Dif Caco-2細胞で濃縮された分子機能には、有機酸膜貫通トランスポーター活性、ヘリカーゼ、リガーゼ、RNAポリメラーゼ、ATPアーゼ活性が含まれた。さらに、リボ核タンパク質複合体、カドヘリン、ATPase、補酵素、有機酸、細胞接着分子、RNA結合も濃縮された（図S6）。
未処理細胞に比べてLA処理細胞で濃縮された細胞成分の中には、プレリボソーム、オルガネラとミトコンドリアのリボソームがあった。ミトコンドリア外膜／内膜とマトリックス、細胞膜と器官膜外膜、エンベロープ内腔の成分も濃縮された。さらに、プロテアソーム、スプライソソーム、エンドペプチダーゼ複合体などの複合体がLA処理細胞で濃縮され、フォーカルアドヒージョンやアドヘレンスジャンクションも濃縮された（図S7）。ブラシボーダーとアピカル細胞膜も濃縮された（図示していない）。
3.2.3. パスウェイの濃縮解析
Dif Caco-2のリノール酸処理により、未処理細胞に比べて、チトクロームP450によるレチノール、異種物質、薬物代謝を含む代謝過程のアップレギュレーション（p < 0.05）が起こった。タンパク質の消化吸収経路もまたアップレギュレートされた。
LA処理細胞では、未処理細胞に比べて、リボソーム生合成経路、スプライソソーム経路、RNA輸送経路、RNAポリメラーゼ経路が低下した（p < 0.05）。13-HPODE処理細胞と同様に、プリンおよびピリミジン代謝、酸化的リン酸化、プロテアソーム、細胞周期、切除修復経路もLA処理細胞で抑制された。自然免疫を活性化するToll様受容体シグナル伝達はダウンレギュレートされた（表2）。
表2. LA処理Caco-2細胞におけるパスウェイ濃縮解析。LA処理Caco-2分化細胞では、未処理細胞と比較して、KEGGパスウェイの発現が上昇し、発現が低下していることがパスウェイの濃縮によって示された。
表
3.3. 13-HPODE処理細胞とLA処理細胞間の遺伝子発現の差
13-HPODE処理細胞とLA処理細胞の間で291のDEG（調整p < 0.05）を同定した（図S8；表S4）。その結果、PPARシグナル伝達に関与する遺伝子は、LA処理細胞と比較して13-HPODE処理細胞で高い発現レベルを示した。これらの遺伝子のうち、FAの酸化に関与するCPT1A、脂質滴を被覆するPLIN2、FAの輸送に関与するACSL5およびFABP1、ケト生成に関与するHMGCS2、およびPCK1であった。後者の遺伝子とPDK4のアップレギュレーションは、先に述べたように、糖新生を促進する可能性がある。これらの結果は、13-HPODEがLAよりもPPARシグナルの強力な活性化因子であることを示唆しているのかもしれないが、酸化および非酸化LAの両方がPPARを活性化することが以前の研究で示されている[30,49]。PPARシグナルは、FAおよびグルコース代謝、ならびに細胞増殖および分化を含む代謝プロセスを制御することが示されているため[50,51]、このことはまた、グルコースおよび脂質の代謝および輸送に対する13-HPODEの有意な効果を示している。SLC25A20およびACADVLを含むFA酸化に関与する追加遺伝子は、LA処理細胞と比較して13-HPODE処理細胞で発現が上昇した。一方、FAとコレステロールの生合成に関与するG6PDも、LA処理細胞に比べて13-HPODE処理細胞で高発現を示した。酸化された低密度リポタンパク質（LDL）の取り込みを阻害することで動脈硬化を予防する役割を持つAPOH [52]の低発現は、LA処理細胞に対して13-HPODE処理細胞で観察された。13-HPODE処理細胞では、LA処理細胞と比較して、防御機構に関与する遺伝子の発現の増加が観察された。その中には、CREB3L3、細胞から毒素を排出するABCG2、そして毒素やアルデヒドを代謝するCYP2B6とAKR1B1が含まれていた。
LA処理細胞では、13-HPODE処理細胞と比較して、解毒に関与する遺伝子の発現増加が観察された。これらの遺伝子の中には、異種物質代謝に関与するEPHX2、アルコールと脂質過酸化産物を代謝するADH6、アルデヒドの保護的解毒に関与するALDH6A1が含まれていた。スクラーゼ・イソマルターゼ遺伝子SIは、食餌性炭水化物の消化に関与し、腸管ブラシボーダーで発現しているが、LA処理細胞では13-HPODE処理細胞に比べて発現が上昇していた。興味深いことに、腫瘍の進行と転移のバイオマーカーと考えられている細胞接着分子CEACAM1/M6/M5は、LA処理細胞では13-HPODE処理細胞に比べて低い発現レベルを示した。
3.4. RNA-seq結果の検証
RNA-seqの結果はqRT-PCRによって検証された。未処理群に対する処理群の遺伝子発現およびパスウェイ解析の差に従って、各処理において異なる遺伝子セットを検証用に選択した。13-HPODE処理細胞では14の代表的なDEGが、LA処理細胞では11のDEGがqRT-PCRを行うために選択された。PPARシグナル伝達、およびPLIN2、FABP1、CPT1Aなどのミトコンドリアβ酸化に関与する遺伝子は、未処理細胞に比べて13-HPODE処理細胞で発現が上昇した（図5a,c）。脂質およびグルコース代謝の制御に関与するPDK4およびPCK1遺伝子もまた、13-HPODE処理細胞で発現が上昇し、未処理細胞に比べてこれらの細胞で糖新生が亢進していることが示唆された（図5d,e）。炎症応答遺伝子であるCREB3L3および胆汁酸合成に関与するBAATは、未処理細胞と比較して13-HPODEによって発現が上昇した（図5f,g）。13-HPODE投与は、それぞれフォーカルアドヒージョンとブラシボーダー細胞骨格に関与する、VII型コラーゲンα1鎖であるCOL7A1とVIL1遺伝子の発現上昇と関連しており（図5h,i）、細胞の分化が促進されたことを示しているのかもしれない。ステロイドホルモンと胆汁酸の合成に関与するアルド/ケト還元酵素AKR1C2は、13-HPODEによって誘導された（図5j）。CYP2B6も13-HPODE処理細胞で発現が上昇した（図5k）。13-HPODEはNADPHオキシダーゼNOX1の発現を低下させた（図5l）。13-HPODE処理で発現が低下した他の遺伝子には、それぞれWntシグナル伝達とrRNAプロセシングに関与するDKK1とRPP40が含まれた（図5m,n）。
食品 10 00314 g005a 550食品 10 00314 g005b 550図5. 13-HPODE処理細胞におけるRNA-seq結果の定量的リアルタイムPCRによる検証（a-n）。RNA-seqデータからの代表的なDEGのqRT-PCR。遺伝子の相対的mRNA発現は、13-HPODE処理（HPODE）Caco-2細胞において、未処理（コントロール）細胞と比較して* p < 0.05の統計的有意性で示した。結果はGAPDHで正規化した。
LA処理細胞におけるPCK1およびDKK1の相対発現は、いずれも未処理細胞と比較した場合、13-HPODE処理細胞と同様であった（図6a,b）。さらに、チトクロームP450モノオキシゲナーゼであるCYP2C9、無毒化UDPグルクロノシルトランスフェラーゼであるUGT2B4、およびCOL7A1は、未処理細胞に比べてLA処理細胞で発現が上昇した（図6c-e）。RGCCとODC1の発現低下は、増殖能の低下と分化の亢進に起因すると考えられた（図6f,g）。LA処理により、INSIG1とTOMM5遺伝子のダウンレギュレーションが起こり、代謝過程とミトコンドリア機能に影響を与えた可能性がある（図6h,i）。細胞接着分子CEACAM6と同様にDUSP4もLA処理細胞で減少しており、これは腫瘍の進行に対する防御反応である可能性がある（図6j,k）。これらの結果は、RNA-seqデータと一致している。
食品 10 00314 g006a 550食品 10 00314 g006b 550図6. LA処理細胞におけるRNA-seq結果の定量的リアルタイムPCRによる検証（a-k）。RNA-seqデータからの代表的なDEGのqRT-PCR。遺伝子の相対的mRNA発現は、LA処理（LA）Caco-2細胞において、未処理（コントロール）細胞と比較して* p < 0.05の統計的有意性で示した。結果はGAPDHで正規化した。考察
ヒトの食事から摂取される必須PUFAであるLAは、重要な細胞成分である。LAは、13-HPODEの還元型であるヒドロキシオクタデカジエン酸（HODE）を含む過酸化脂質の前駆体である[53]。LOOHは、心血管疾患、変性疾患、悪性腫瘍など、いくつかの病的状態に関連している [54]。食事はLOOHの主要な供給源であり、食事の過酸化物は吸収され、輸送され、これらの脂質を細胞や組織に運ぶリポタンパク質に取り込まれる。我々は、mRNA配列決定を用いて、最も一般的な食餌性LOOHである13-HPODEが、Dif Caco-2細胞の遺伝子発現プロファイルをどのように調節するかを調べた。過酸化LAである13-HPODEでCaco-2細胞を処理すると、代謝およびシグナル伝達経路、ならびにさまざまな細胞プロセスが著しく変化する。
今回の研究では、13-HPODEがAKR1C2などのステロイドホルモン合成に必須なアルド/ケト還元酵素の発現を増加させることを明らかにした。研究により、腸がステロイドホルモンを合成する能力があることが報告されている[55,56]。ステロイドホルモンは腸管上皮バリアの維持に関与していることが以前の研究で示されている [57]。一方、T細胞応答の阻害を引き起こすだけでなく [55]、免疫機能を促進し [58]、炎症性疾患の一因となる可能性もある。酸化LAがラットやヒトの副腎細胞においてステロイドホルモン合成を誘導することは、以前に報告されている[59,60]。アルド/ケト還元酵素のアップレギュレーションは、13-HPODEが腸上皮細胞でアルデヒド生成物に変換され、反応性カルボニル種の解毒と4-HNEの還元を促進し、適応反応を高める可能性があることを示しているのかもしれない[61]。さらに、酸化LA代謝物は肥満と関連しており、ステロイドの合成を誘導することが示されている [62]。酸化LAは、胆汁酸活性と脂肪と混合ミセルを形成する能力を持っている可能性があり、コレステロールの可溶化と吸収を増加させる [15]。胆汁分泌は肝臓で起こるが、パスウェイ解析の結果、13-HPODEで処理したCaco-2細胞ではこのパスウェイが濃縮されていた。脂肪溶解性を高める胆汁酸抱合を担うBAAT遺伝子が、13-HPODE処理細胞で発現上昇していることがわかった。このことは、13-HPODEが脂質の可溶化を促進する別のメカニズムを示唆している。以前の研究では、高脂肪食に反応して胆汁が分泌されると腸上皮が傷害され、腸内細菌叢によって産生される二次的な胆汁酸が腫瘍形成を誘導する可能性があることが示された[63]。一方、BAAT遺伝子は、LA処理細胞では未処理細胞と比較して発現に差は見られなかった。13-HPODEとLA処理の両方が、カイロミクロンとLDLの主要成分であるアポリポタンパク質BであるAPOBの発現を、食事性脂肪の吸収を促進するApoB48の生成に不可欠なApoB mRNA編集酵素複合体の相補因子であるA1CFとともに亢進させたことも特筆に値する[64]。
13-HPODEで細胞を処理した際のPPARシグナル伝達経路のアップレギュレーションは、0.1というわずかに高いp値を示したが、脂肪酸と脂質のホメオスタシスに関与するいくつかの下流遺伝子は、未処理細胞に対して13-HPODE処理細胞で差次的にアップレギュレートされた遺伝子の上位に含まれていた（調整p < 0.05）。その中には、脂質滴の被膜を形成するPLIN2と、コレステロールの取り込みを促進し、LOOHによる酸化ストレスから保護する可能性のあるFABP1があった[65]。ケト生成に関与し、Caco-2細胞の細胞分化を促進することが見出されているHMGCS2 [66]もまた、発現が上昇した。CPT1AとPCK1もまた、PPARシグナル伝達の異なる発現上昇遺伝子の一つであり、これは脂肪酸酸化と糖新生が促進されていることを示しているのかもしれない。酸化LAはPPARシグナルを活性化するリガンドと考えられ、PPARシグナルは代謝、抗炎症、抗発がんおよび発がん作用の間で複数の役割を担っていることから、PPARシグナルは13-HPODEと過酸化脂質関連疾患の間のクロストークの強力な形態と考えられ、さらに研究されるべきである。さらに、CREB3L3は、PPAR�と協働する転写因子である。
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と協働し[67]、展開ストレス応答と脂質代謝に関与する転写因子であるCREB3L3は、13-HPODE処理細胞で発現が上昇した。LA処理細胞では、PLIN2、PCK1、CPT1Aなど、PPARシグナルとFA酸化に関与するいくつかの遺伝子の発現上昇が観察されたが、これらの遺伝子の発現は、LA処理細胞と比較して13-HPODE処理細胞でより高いようであった。このことは、13-HPODEが、非酸化LAよりも、PPARシグナル伝達およびFA酸化に対してより強力な効果を有する可能性を示唆している。また、13-HPODE処理細胞では、LA処理細胞と比較して、FAおよびコレステロールの生合成に必要なG6PDの発現が高く、アテローム保護作用のあるAPOHの発現が低いことが観察され、LOOHが心血管疾患の発症に寄与するメカニズムが示唆された。
この結果は、13-HPODEが、摂取した薬物や毒素の代謝、およびステロイドホルモン、胆汁酸、その他の脂肪の合成に関与するチトクロームP450酵素による解毒を促進する可能性を示している[68,69]。ステロイドホルモン合成におけるアルド/ケト還元酵素の機能に加えて、チトクロームP450による異種生物代謝、胆汁酸合成および輸送にも関与している [70,71]。今回の研究では、LAはCYP2C9を含むチトクロームP450酵素も誘導した。さらに、LA処理細胞では、13-HPODE処理細胞と比較して、アルコール脱水素酵素ADH6とアルデヒド脱水素酵素ALDH6A1の発現が高かった。このことは、LAが腸管細胞内で酸化を受け、それに対して細胞が解毒メカニズムを強化することで応答していることを示唆しているのかもしれない。
13-HPODEが細胞膜に接触すると、ビタミンE（トコフェロール；TP）が酸化され、抗アンドロゲン作用[72]があり、結腸がん細胞の増殖を抑制するアポトーシス作用[73]が報告されているトコフェリルキノン（TQ）が形成されると予想される。さらに、13-HPODEがグルタチオンペルオキシダーゼGPX1およびGPX7のダウンレギュレーションと、グルタチオン（GSH）合成に必須なグルタミン酸-システインリガーゼGCLCの触媒サブユニットのアップレギュレーションを引き起こすことが観察されたため、細胞はGSHを蓄積する可能性がある。後者は以前、トコフェロキシルラジカルをTPに戻し、ビタミンEの酸化を介した活性酸素種（ROS）の消去効果を維持することで、さらなる脂質の酸化を防ぎ、細胞増殖を抑制することが示されている[74]。TPの再生はまた、チオレドキシンレダクターゼと関連しており [75]、13-HPODE処理細胞で発現が上昇した。TPはヒト大動脈内皮細胞（HAEC）におけるケモカインを減少させることが示されており [76]、ケモカインCXCL1の発現を減少させることが示されている [77]。我々の研究では、13-HPODE処理細胞において、CXCL1、CXCL8（IL-8）、およびCCL20ケモカインのダウンレギュレーションが観察された。トコフェリルヒドロキノン（TQH）はTQよりも強力な抗酸化物質であることが示唆されている[78,79]。我々の研究では、13-HPODE処理細胞において、TQHの生成を触媒すると報告されているチトクロームp450酸化還元酵素（POR遺伝子）[78]の発現上昇が観察された。TQは、カスパーゼ3カスケードの活性化を介してアポトーシスを誘導し、抗アポトーシスBcl-2を減少させることが示されている [80]。この文脈で、我々は13-HPODE細胞において、CASP3や、BMF、BCL2L11、BNIP5（この遺伝子はまだ研究されていない）などのアポトーシス活性を持つ多くのBclファミリーメンバーのアップレギュレーションと、抗アポトーシスBAG1遺伝子のダウンレギュレーションを観察した。これは、100μMの13-HPODEで処理したCaco-2細胞のアネキシンV染色で細胞生存率の低下を示した最近発表された研究[26]と一致している。
活性化因子タンパク質-1（AP-1）やNFE2L2（Nrf2）のメンバーの発現変化は観察されなかったが、13-HPODE処理細胞では、HMOX1、CAT、UGT2B4、TXNRD1などの抗酸化防御系で役割を果たすいくつかの標的遺伝子のアップレギュレーションと、SOD1のダウンレギュレーションが観察された。このことは、13-HPODEによって、ある程度の抗酸化防御反応が増強されたことを示している。さらに、FOXO3およびFOXO4転写因子の発現増加が観察され、これによって13-HPODEはインスリンシグナル伝達および抗酸化応答を調節し、アポトーシスを誘発する可能性がある [81]。CATに加えて、もう一つのFOXO制御遺伝子であるCDKN1A（p21）は、DNA損傷に応答して細胞増殖を抑制するが、これも13-HPODE処理細胞でアップレギュレートされた。
13-HPODE処理により、Caco-2細胞の分化過程で減少すると報告されている事象のダウンレギュレーションが引き起こされた [82]。13-HPODE処理によってダウンレギュレートされたパスウェイの中には、RNA輸送、スプライソソーム、翻訳機構があった。これと並行して、細胞周期、DNA複製と修復、プロテアソーム経路を含むタンパク質分解のイベントも抑制された。培養条件下では、Caco-2細胞は分化の過程で広範な遺伝子初期化を受け、腫瘍形成性の表現型を失う[16]。この遺伝子初期化には、細胞周期の進行、DNAの複製・修復、RNAスプライシング・輸送、タンパク質分解に関与する遺伝子のダウンレギュレーションが含まれ、これは増殖の減少を示す；これはMariadasonらによって報告された[82]。従って、本研究で観察されたように、細胞を13-HPODEまたはLAで処理すると、これらの事象がダウンレギュレーションされることは、増殖能のさらなる低下と分化へのシフトを示唆する可能性がある。13-HPODE処理細胞およびLA処理細胞の両方で発現低下した遺伝子には、DNA複製に関与するPOLD2、MCM7、PCNA、細胞周期の進行に重要なCDC25A、RNAプロセシングと翻訳に関与するRPP40とEIF5Aがあった。一方、APC、KLF4、FOXO4などのがん抑制遺伝子は、13-HPODE処理細胞で発現が上昇した。LA処理細胞では、がん原遺伝子JUNのダウンレギュレーションと、がん抑制遺伝子KLF7とFOXO4のアップレギュレーションが観察された。興味深いことに、LA処理により、腫瘍進行のバイオマーカーと考えられている細胞接着分子CEACAM1/M5/M6の発現が減少した [83]。LOOH由来の酸化ストレスは、ヌクレオチドとマロンジアルデヒド （MDA）の相互作用によるDNA付加物の形成により、塩基修飾とDNA 損傷 [47]を引き起こす可能性があるため、LOOH最終産物による更なる DNA損傷を防ぐためには、DNA合成の減少という保護反応が必要であった [84]。LOOH誘発DNA損傷に関する様々な研究があるにもかかわらず、LOOHがDNA合成を減少させるメカニズムについては、さらなる研究が必要である。
分化への移行を裏付けるように、細胞の運動性、分化、および他のプロセスに関与するフォーカルアドヒージョン経路は、未処理細胞に対して13-HPODE処理細胞で増強された（p値0.06）。関連する誘導遺伝子の中にCOL7A1があった。腸では、この経路は上皮バリアの恒常性と修復、タイトジャンクションの構成に役割を果たしている[85]。このことは、13-HPODE処理細胞でVIL1遺伝子が発現上昇したことから明らかなように、ブラシボーダーの発達を促進する細胞分化の亢進を示しているのかもしれない。VIL1の発現上昇に加え、腸管分化のもう一つのマーカーであるスクラーゼイソマルターゼ遺伝子SI [86]は、13-HPODE処理細胞と比較してLA処理細胞で発現上昇を示し、細胞分化の亢進を示した。さらに、LA処理細胞では、未処理細胞と比較して、レチノール代謝のアップレギュレーションが観察された。レチノールは、成長や分化を含む腸上皮細胞のプロセスに関与することが示されている[87]。さらに、レチノール代謝経路で役割を果たす解毒酵素であるUGT2B4が検出され、LA処理細胞で発現が上昇した。
我々の結果は、13-HPODEとLAを処理した細胞の両方で、未処理細胞に比べて酸化的リン酸化経路の減少を示した。酸化的リン酸化の障害は、酸化リノール酸を摂取させたマウスで以前に報告されている[88]。さらに、ミトコンドリア膜やマトリックスを含むミトコンドリア成分は、13-HPODE処理細胞およびLA処理細胞の両方で、未処理細胞に対して上位に濃縮されたGO用語の中に含まれており、これはミトコンドリア機能に対する13-HPODEおよびLAの有意な効果を示している。ミトコンドリア外膜のトランスロカーゼであるTOMM5遺伝子は、両方の処理でダウンレギュレートされた。PUFAは、ミトコンドリア膜の組成と組織に変化を引き起こし、活性酸素の産生を増加させ、膜リン脂質の過酸化とミトコンドリア機能不全を引き起こすことが報告されている[89]。
Toll様受容体（TLR）シグナル伝達は、LA処理したCaco-2細胞では未処理の細胞と比較してダウンレギュレートされ、これは以前に報告されたTLR活性化と炎症遺伝子発現に対するPUFAの抑制効果を支持するものである［90］。特に、n-3系PUFAはn-6系PUFAよりもTLRシグナル伝達を強力に阻害するようであった［91］。LAで処理した細胞と13-HPODEで処理した細胞のデータ結果には比較的類似性があり、LAが腸管上皮で酸化されている可能性が示唆され、これは以前に報告されている [92]（表3）。
表3. 遺伝子発現差の比較。未処理細胞群に対する2つの処理細胞群における選択遺伝子の発現差（↑アップレギュレーションまたは↓ダウンレギュレーション）の比較。
表結論
標準的なin vitro条件下で実施したCaco-2細胞のトランスクリプトーム・プロファイリングの結果は、遺伝子発現とパスウェイの濃縮という観点から、13-HPODEまたはLAに対する腸管上皮細胞の反応に光を当てた。本研究で示された結果から、最も一般的な食餌性過酸化脂質である13-HPODEは、一方では胆汁酸抱合を促進し、脂質の取り込みを変化させ、腸管傷害の一因となる可能性が示唆された。一方、13-HPODEは、ステロイドホルモン合成を含む脂質代謝の複数の経路に影響を及ぼす可能性があり、腸管バリアや免疫機能に影響を及ぼす可能性がある。また、PPARシグナル伝達は、脂肪酸やグルコース代謝、エネルギー産生、ミトコンドリア機能を変化させ、腸の生理学的変化につながる。さらに、13-HPODEとLAは、腸管上皮細胞における抗酸化反応とチトクロームP450による解毒を促進する能力を持っている可能性がある。さらに、両者とも増殖能を低下させ、細胞周期、DNA合成／修復に関与する経路を抑制し、焦点接着経路を強化することから、吸収細胞の分化および生存運命に関与している可能性がある。肝臓細胞でも同様の作用が見られるが、過酸化LAがエネルギー産生と脂質貯蔵に障害を与える可能性も考えられる。結論として、Caco-2細胞を用いたこの試験管内研究は、13-HPODEに暴露された際に腸管上皮で起こりうる生理的変化と、それが疾病に関与する可能性のあるメカニズムについての洞察を提供するものである。この研究の今後の方向性としては、INFOGEST法[93]のような、生体内の腸内環境をシミュレートした実験環境を用いて、LOOHに対するCaco-2細胞の反応を研究することが挙げられる。
補足資料
以下は、https://www.mdpi.com/2304-8158/10/2/314/s1、オンラインで入手可能である。図S1：ライブラリー品質評価。High Sensitivity D1000 ScreenTape assayを用いた相補的DNAライブラリープールの品質評価では、最大ピークサイズ337 bpの良質なライブラリーが得られた。図S2. 主成分分析（PCA）。PCAプロットは、未処理と13-ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸（HPODE）処理（a）またはリノール酸（LA）処理（b）のCaco-2細胞間のサンプル間距離を可視化し、処理に関する類似性と未処理グループと処理グループの良好な分離を示した。図S3： 対数比対平均平均（MA）プロット。MAプロットは、未処理のCaco-2細胞と(a)13-ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸(HPODE)処理、または(b)リノール酸(LA)処理したCaco-2細胞との間のDEG(赤い点。調整p < 0.05)を示す。x軸は未処理と処理した細胞群間の平均発現を表し、y軸は未処理群と処理群間のlog2倍変化を表す。図S4： Caco-2細胞を13-HPODEで処理した際の分子機能の濃縮。未処理細胞に対する13-HPODE処理分化Caco-2細胞におけるGO分子機能の濃縮上位（調整p < 0.05）。図S5: Caco-2細胞を13-HPODEで処理した際の細胞成分の濃縮。未処理細胞に対する13-HPODE処理分化Caco-2細胞のGO細胞成分の濃縮度（調整p < 0.05）。図S6： LAでCaco-2細胞を処理した場合の分子機能濃縮。未処理細胞に対するLA処理分化Caco-2細胞におけるGO分子機能の濃縮度上位（調整後p < 0.05）。図S7： LAでCaco-2細胞を処理した際の細胞成分の濃縮。LAで処理した分化Caco-2細胞では、未処理細胞に比べてGO細胞成分が濃縮された（調整p < 0.05）。図S8：13-HPODE処理細胞とLA処理細胞間の遺伝子発現の差。ヒートマップは、13-HPODE処理Caco-2細胞（14D.H1、14D.H2、および14D.H3）とLA処理細胞（14D.LA1、14D.LA2、および14D.LA3）の間の上位50のDEG（調整p < 0.05）を示す。緑は発現上昇、赤は発現低下。表S1：プライマー配列。定量的RT-PCRで使用したフォワードおよびリバースプライマー配列。表S2：13-HPODE処理細胞におけるDESeq2 Rパッケージの示差的遺伝子発現結果。未処理のコントロール細胞（14D.C1、14D.C2、14D.C3）と比較した、13-HPODE処理Caco-2細胞（14D.H1、14D.H2、14D.H3）における示差的発現遺伝子（DEG；調整p < 0.05）。表S3： LA処理細胞におけるDESeq2 Rパッケージの差次的遺伝子発現結果。未処理細胞（14D.C1、14D.C2、14D.C3）と比較したLA処理Caco-2細胞（14D.LA1、14D.LA2、14D.LA3）におけるDEG（調整p < 0.05）。表S4： 13-HPODE処理細胞とLA処理細胞間の遺伝子発現の差。13-HPODE処理Caco-2細胞（14D.H1、14D.H2、14D.H3）とLA処理Caco-2細胞（14D.LA1、14D.LA2、14D.LA3）の間のDEG（調整p < 0.05）。
著者貢献
すべての著者が、報告された研究に大きく貢献した。概念化、N.F.、S.Y.、S.P.、方法論、N.F.、S.Y.、S.P.、A.F.、C.A.N.、ソフトウェア、N.F.、S.Y.、検証、N.F.、S.Y.、S.P.、形式的解析、N.F.、S.Y.、調査、N.F.、 S.Y.、A.F.、C.A.N.；リソース、N.F.、S.Y.、S.P.、A.F.、C.A.N.；データキュレーション、N.F.、S.Y.；執筆-原案作成、N.F、 プロジェクト管理、N.F.、A.F.、C.A.N.、S.Y.、S.P.、資金獲得、S.Y.、S.P. 著者全員が本原稿の出版版を読み、同意した。
資金提供
本研究は外部資金援助を受けていない。
施設審査委員会声明
該当なし。
インフォームド・コンセント
該当なし。
データ利用声明
全ての配列ファイルおよびメタデータはNCBIのBioProject accession PRJNA682114で入手可能である。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA682114。
謝辞
N.F.は、King Abdulaziz University（サウジアラビア、ジッダ）からの卒業研究費の支援を受けている。
利益相反
著者らは利益相反はないと宣言している。
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過酸化リノール酸、13-HPODEは腸上皮細胞における遺伝子発現プロファイルを変化させる。Foods 2021, 10, 314. https://doi.org/10.3390/foods10020314
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Faizo, Nisreen, Chandrakala Aluganti Narasimhulu, Anna Forsman, Shibu Yooseph, and Sampath Parthasarathy. 2021. "Peroxidized Linoleic Acid, 13-HPODE, Alters Gene Expression Profile in Intestinal Epithelial Cells" Foods 10, no. 2: 314. https://doi.org/10.3390/foods10020314.
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