糞便微生物叢移植と短鎖脂肪酸は抗生物質による腸内微生物叢の乱れをリモデリングして敗血症死亡率を低下させる

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ORIGINAL RESEARCH（オリジナル研究）論文
Front. Immunol.、2023年1月11日
Sec.微生物免疫学
第13巻 - 2022年｜https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1063543
糞便微生物叢移植と短鎖脂肪酸は抗生物質による腸内微生物叢の乱れをリモデリングして敗血症死亡率を低下させる
Xiran Lou1†, Jinfang Xue1†, Ruifei Shao1, Yan Yang1, Deyuan Ning1, Chunyan Mo1, Fuping Wang2 and Guobing Chen2*.
1昆明科学技術大学医学部、昆明、中国
2雲南省第一人民病院救急医療科（中国・昆明市
目的 敗血症は，重症患者の死因の第一位である。消化管は敗血症の病態生理に重要な役割を果たすと長い間考えられてきた。抗生物質治療は患者の常在菌を減少させ、その後の疾患発症リスクを高める可能性があり、そこでは腸内細菌叢の異常が重要な要因である可能性がある。

方法 本研究では、腸内細菌の変化が敗血症と関連しているかどうかを調べるために、健常者と敗血症患者の両方の糞便サンプルの16S rRNAを分析した。そして、糞便微生物叢移植（FMT）および短鎖脂肪酸（SCFA）が生存率、全身性炎症反応、腸内細菌叢、粘膜バリア機能に及ぼす影響を調べるために、セカル結紮穿刺（CLP）を用いた敗血症のモデルマウスを開発した。

結果 敗血症患者の腸内細菌叢の構成は、健常者と有意に異なっていた。門レベルでは、敗血症患者の腸内フローラにおけるProteobacteriaの量は対照群よりはるかに多く、一方Firmicutesの数は有意に少なかった。腸内細菌叢が乱れたマウス（ANC群）は、CLPマウスと比較して、死亡、炎症、臓器不全のリスクが上昇することがわかった。しかし、これらはすべてFMTとSCFAsによって回復させることができた。FMTとSCFAsは、Firmicutes、Proteobacteria、Escherichia Shigella、Lactobacillusなどの細菌量を調節し、健康なマウスと同レベルに回復させることができました。さらに、敗血症マウスの大腸でOccludinタンパク質の発現を増加させ、NLRP3およびGSDMD-Nタンパク質の発現を低下させ、炎症因子IL-1βおよびIL-18の放出を減少させて細胞のパイロプトーシスを抑制し、最終的に敗血症の保護的役割を果たすことが明らかになった。

Disccusion FMTとSCFAは敗血症のマウスモデルにおいて微生物に関連した生存利益をもたらし、敗血症の治療法として有効である可能性が示唆された。

1 はじめに
敗血症は、感染に対する宿主応答の異常によって引き起こされる生命を脅かす臓器不全であり、全世界の死亡原因の約20％を占めている（1, 2）。敗血症は、集中治療室（ICU）患者の間で広く見られる問題であり、ICUへの入院の理由としてもよく知られている。コロナウイルス症2019（COVID-19）の発生以来、多くの重症患者や重篤なCOVID-19患者が重度の代謝性アシドーシス、肝および腎機能の低下、重度の肺障害を示しています（3-5）。国際コンセンサスによれば、これらの患者は敗血症および敗血症性ショックの診断基準を満たし、細菌性敗血症と共通の多臓器障害の病態生理学的メカニズムを有している（6）。現在、敗血症の病態生理の解明は大きく進んでいる。しかし、抗生物質、集中的な水分補給、血管作動薬、外科的治療、支持療法が敗血症の治療の唯一の選択肢であるのが現状である。敗血症の標的治療は、現在のところ利用できません(6)。敗血症に罹患し死亡する人の数は増え続けており、その治療は世界的な問題として残っています。

細菌、ウイルス、真菌、原生動物、古細菌からなる腸内細菌叢は、宿主の免疫系と腸管上皮バリアの成長と機能に不可欠な役割を果たし、宿主の生涯にわたる健康に寄与しています(7)。腸内細菌叢は、健康と病気の双方において重要な役割を果たすことが明らかにされています（8）。実際、乱れた腸内細菌叢は感染や傷害の後に保護機能を失い、臓器障害や不全を増悪させることさえある（9）。最近の研究では、腸内細菌叢の変化が敗血症の病因や進行に重要な役割を果たす可能性が示唆されている（10, 11）。したがって、腸内細菌叢と敗血症の関係を理解することは極めて重要である。

敗血症の患者は、通常、抗生物質で治療される。ある研究では、ICU患者の約75％が毎日抗生物質を投与されていることが判明した(12)。広域抗生物質の長期使用は、感受性微生物を阻害し、より多くの薬剤耐性菌を産生し、最終的には腸内細菌叢の障害を引き起こし、疾患を悪化させるかもしれない(13)。また、抗生物質の使用により腸内細菌の転座が増加し、全身感染に対する脆弱性が高まる可能性が疫学調査により指摘されている(14)。しかし、現在、敗血症の治療には抗生物質が使用されており（15）、敗血症患者における抗生物質の過剰使用は、腸の微生物学的機能障害をもたらし、その結果、敗血症患者の死亡率を高めるのではないかと考えている。重症患者の初期には、常在菌の半分以上が失われ、腸内細菌叢の多様性を補充することはほぼ不可能である（16, 17）。糞便微生物叢移植（FMT）とは、何千もの細菌群集を含む健康な人の糞便を、病気の人に与えることである。これにより、死滅した常在菌を補うことができ、患者の微生物叢をより健康な状態へと導くことができると考えられています。FMTやプロバイオティクスを使用して腸内細菌叢を変化させることで、敗血症患者の保護に役立つことが研究で示されている(18)。炭素数2〜6の短鎖脂肪酸（SCFAs）は、腸内環境の健康維持に極めて重要である。SCFAは主に酢酸、プロピオン酸、酪酸から構成されており、食物繊維の消化中に腸内細菌によって生成されます（19）。SCFAは、腸の健全性を促進する重要な化合物である。いくつかの研究で、敗血症患者におけるSCFAs濃度の低下が報告されており、この低下が患者の重傷後の全身性炎症反応に影響を与える可能性が示唆されています（20、21）。SCFAsに焦点を当て続けることは、ICUにおける敗血症患者のケアに極めて重要であると思われる。したがって、腸内細菌の代謝産物と疾患との関連性をさらに研究することで、敗血症患者に対する新規治療法の開発につながる可能性がある。

パイロプトーシスは、細胞内容物と炎症性サイトカインの放出を伴うプログラムされた細胞死の一種である。これは、病原体や微生物感染から身を守る自然免疫反応の重要な部分である(22)。それには、インフラマソームのプライミング、NOD様受容体タンパク質-3（NLRP3）インフラマソームの集合と活性化、ガスダミンD（GSDMD）の切断と孔の形成、炎症性分子の放出が関与している（23）。いったんパイロプトーシスが過剰発現すると、周囲の細胞や組織で炎症反応が引き起こされ、傷害を悪化させ、最終的には全身性の炎症反応により臓器不全や敗血症性ショックに至る(24)。敗血症モデルでは、好中球がパイロプトーシスを起こし、インターロイキン18（IL-18）とインターロイキン1β（IL-1β）レベルが上昇することが、かなりの証拠となっている（25, 26）。

本研究では、敗血症患者の糞便サンプルの16S rRNAシーケンス解析を行い、腸内細菌叢の変化を探った。また、敗血症のマウスモデルを作成し、FMTやSCFAが敗血症を抑制するかどうか、そのメカニズムを明らかにすることを目的とした。その結果、抗生物質が正常なマウスの腸内細菌叢を変化させること、FMTやSCFAが抗生物質投与後の腸内細菌叢の乱れを改善し、敗血症マウスの死亡率を低下させることを発見しました。本研究は、敗血症に関連する腸内細菌叢の乱れを治療する新しい方法の探索に役立つと考えられます。

2 材料と方法
2.1 臨床サンプル情報
本研究では、対照群（n = 12）と敗血症群（n = 22）が含まれる。対照群には、敗血症の既往や外傷がなかった。過去8週間以内に抗生物質またはプロバイオティクスを服用した者は除外した。2020年12月から2021年12月にかけて、雲南省第一人民病院の集中治療室で敗血症患者22名から糞便サンプルを採取した。研究期間中、対象基準を満たしたすべての患者を連続的に登録した。患者は、Society of Critical Care Medicine/European Society of Intensive Care Medicine（SCCM/ESICM）（27）が定めたSepsis-3基準を満たした。さらに、一連の除外基準が存在した。18歳未満、妊娠、臓器移植、長期免疫抑制、悪性腫瘍、肝炎ウイルス感染、慢性腎不全は禁忌である。すべての敗血症患者は、セフォペラゾン・タゾバクタム、メロペネム、ピペラシリン・タゾバクタムなどの基本的な抗生物質療法を受け入れた。すべての実験は地元の医療倫理委員会により承認された（プロジェクト番号：KHLL2021-036）。患者および健常者ボランティアは、書面にてインフォームドコンセントを得た。

2.2 実験の手順
本研究は、米国国立衛生研究所のガイドラインに従い、昆明医科大学研究倫理委員会（Project No: KMMU20221600）の認可を受けた。

2.3 動物実験
体重20±2gの雄のC57BL/6マウスを、温度22±1℃、相対湿度65±5％（いずれも昆明医科大学動物学部より提供）で、昆明医科大学実験動物センターにて病原体を含まないケージに収容した。実験中、マウスは12時間の明暗周期でケージに入れられ、水と餌に自由にアクセスできるようにした。マウスは1週間の適応給餌の後、ランダムに5群に分けられた。Sham群（偽手術）、CLP群（CLP誘発敗血症モデル）、ANC群（抗生物質＋普通食塩水＋CLP）、AFC群（抗生物質＋FMT＋CLP）、ASC群（抗生物質＋SCFAs＋CLP）であった。マウスに0.2mlの広域抗生物質混合液（バンコマイシン1.5g/70kg、イミペネム2g/70kg、中国北京のSolarbio社から購入）を1日1回4日間経口投与し、腸内フローラを攪乱させた。次に、ANC群のマウスには通常生理食塩水0.3mlを1日1回3日間、AFC群のマウスには糞便菌液0.3mlを1日1回3日間、ASC群のマウスには短鎖脂肪酸混合物（シグマ社、米国）を0.3ml経口摂取してもらった。このSCFA混合物（67.5 mM酢酸、25.9 mMプロピオン酸、40 mM酪酸）の生理的関連性は示されている（28）。7日目に、すべてのマウスをCLP誘発敗血症モデルに供し、CLPまたは偽手術の16時間後に犠牲にして、さらなる分子生物学実験に必要なサンプルを採取した。敗血症の発症は、Cecal ligation and puncture (CLP)によって誘発された。ペントバルビタールナトリウム（50mg/kg）を用いて、CLP処置の前に動物に麻酔を導入する。無菌設定下で、下腹部に1.5cmの切開を行い、盲腸を露出させた。盲腸遠位部1cmを3.0の絹糸で完全に結紮し、18ゲージ針で1回穿刺した後、腹腔内に戻した。その後、皮膚と腹膜壁の切開部を縫合糸で閉じた。手術後、マウスは1mlの滅菌生理食塩水（0.9％溶液）の腹腔内注射を受けた。Sham群では、噴門の露出と腹部切開を行ったが、結紮や穿刺は行わなかった。マウスは処置後、飲食が可能であった。

2.4 FMTアッセイ
通常の実験用フードと水道水を飼料とする体重18〜22gの健康な雄のC57BL/6マウスから糞便細菌溶液を得た。ガイドラインに従い、一人当たり30gの糞を提供し、それを3〜5倍の滅菌生理食塩水で希釈する（例えば、30gの糞を150mlの普通食塩水で希釈）(29)。関連文献に従って糞便細菌溶液を調製する。具体的な手順は以下の通りである。(1) マウスの肛門を刺激する方法を用いて、健康なマウスの新鮮な糞を採取し、EPチューブに入れる (2) 希釈し、0.2gの糞を秤量する。 2gの糞を秤量し、ミキサーに入れ、1mlの滅菌生理食塩水を加え、均一に撹拌混合する；（3）遠心分離：15ml遠沈管で2000rpm、5分間遠心分離し、上清を回収し、これを3回繰り返す；（4）吐出により、新しい菌液は1.5ml EPチューブにサブパックされた。AFC群マウスには、0.3mlの糞便細菌溶液を3日間投与した。3日後、マウスにCLPを行い、16時間後に犠牲にして組織を採取した。

2.5 細菌数
腹腔内の好気性細菌量を評価するために、滅菌生理食塩水5 mlで腹腔内を洗浄した。対数連続希釈を行った。各希釈液の一部（500 ul）を血液寒天培地プレート（20210714B，BioMe'rieux，上海，中国）上にプレートした後，37℃，24時間好気的条件下で培養した．血液寒天培地に洗浄液のシリアル希釈液をプレートした後，希釈倍率と細菌コロニーの数に基づいて総菌数を推定した．結果は、1mlあたりのコロニー形成単位（CFUs/mL）で表した。

2.6 組織学的解析および免疫組織化学
CLP手術後16時間でマウスを犠牲にし、結腸、肺、肝臓、腎臓の組織を採取し、4％パラフォルムアルデヒドで24時間固定した後、パラフィンに包埋した。5μmの組織切片をH&Eで染色し、光学顕微鏡で観察した。抗原は、10mMクエン酸バッファー（Beyotime、上海、中国）中98℃で10分間サンプルを処理することによって免疫組織化学のために回収された。内因性ペルオキシダーゼは10％H2O2で20分間阻害し，非特異的抗原は免疫組織化学的検査の前に血清で30分間室温で阻害した。4℃で12時間、スライドは特定の一次抗体で処理された。利用した抗体は、Occludin (1:250, 66378-1-lg, proteintech, USA)を含んでいた。その後、HRPを結合させた2次抗体をスライドに塗布した。

2.7 酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA)
すべての動物をペントバルビタールナトリウム 50mg/kg で麻酔してから眼窩静脈血を採取した。血液は、3000rpm、15分間、4℃で遠心分離し、その後の使用のために血清を分離した。血清中のジアミン酸化酵素（DAO）、D-乳酸、IL-1βの濃度はELISAキット（MEIMIAN、江蘇省、中国）により測定した。

2.8 ウェスタンブロット
マウスに強力な麻酔薬を投与し、CLP処置の16時間後に屠殺した。腸内試料は速やかに採取し、将来の使用に備えて-80℃で凍結した。サンプルは、RIPA溶解バッファー（Beyotime Biotechnology, Shanghai, China）を用いて、12, 000 xg, 4°C, 20分間ホモジナイズした。標準曲線を作成するために、上清をBbicinchonininc acid (BCA) kit (Beyotime, Shanghai, China) で処理し、570 nmで吸光度を測定した。試料タンパク質濃度は10g/lに維持した。等量のタンパク質（20 mg）を10% SDS-PAGEで分離し、数機種のPVDF膜（Invitrogen, USA）に移した。この膜をブロッキング溶液（TBST中5％BSA）で室温で1時間ブロックし、NLRP3（1：1000、Abcam、米国）、GSDMD（1：1000、Abcam、米国）、GSDMD-N（1：1000、Cell Signaling、米国）、IL-18（1：1500、Abcam、米国）およびβ-アクチン（1：5000、Cell Signaling、米国）抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。その後、西洋わさびペルオキシダーゼと結合したIgG二次抗体で室温にて1時間処理した。ChemiDoc XRS 技術を使用して、タンパク質バンドを生成し、写真撮影した（Bio-Rad, USA）。Image J を用いて、ブロットの相対密度を測定した。

2.9 透過電子顕微鏡法 (TEM)
TEM では、各群から腸管組織の 0.5×0.5 cm のミニ切片を 2 枚取り出し、4℃の固定液に 2-4 時間浸漬した。切片は 0.1 M PBS で 15 分間 3 回洗浄し、PBS 中 1%の四酸化オスミウムでポスト固定し、エタノール溶液で徐々に脱水し、60℃のオーブンで 48hr 包含した。切片の評価には電子顕微鏡を用いた（JEM-1400Flash, Japan）。

2.10 16S rRNA多様性配列決定
大腸組織から糞便サンプルを採取し、直ちに-80℃で保存した。Mag-Bind Soil DNA kit (Omega, M5635-02, USA) を用いて、製造元の説明書に従って便から微生物 DNA を抽出した。次に、V3-V4超可変領域を、プライマー対338F（59-ACTCCTACGGAGGCAGCAG-39）および806Rを用いて16S rRNAアンプリコンを分析した。(59-GGACTACHVGGTWTCTAAT-39）を使用した。製造者の指示に従い、Illumina MiSeqシステムを使用して配列決定した（Illumina MiSeq、USA）。Researchソフトウェアを用いて、有効なタグを類似度97%の運用型分類単位（OTU）にクラスタリングした（バージョン11.0.667）。バイオインフォマティクス解析には、ソフトウェアとしてMothurとQIIME2.0を利用した。アルファ多様性の評価には、Shannon、Simpson、Chao、ACEインデックスを用いた。Bray-Curtis 距離に基づくベータ多様性を調べるために PCoA を利用し、P 値の検定には Adonis を利用した。微生物分類学を用いて、サンプル構成の比較とグループ間の特定のコミュニティーの差異を検討した。

2.11 メタボロミクス解析
80℃冷蔵庫保管の試料を氷上で解凍した。20 mg の試料を内部標準を含む 400 l の溶液（メタノール：水＝7：3、V/V）に加え、3 分間ボルテックスした。氷浴中で10分間超音波処理し、1分間ボルテックスした後、-20℃で30分間凍結した。で 12,000 rpm、10 分間遠心分離した。その後、沈殿物を除去し、上清を12,000 rpm、4℃で3分間遠心分離した。LC-MS分析のために、上清の200 lアリコートを移した。LC-MSは機械的な指示に従い、全サンプルを取得した。分析条件は以下の通り。UPLC：カラム、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 (1.8 µm, 2.1 mm*100 mm); カラム温度、40℃; 流量、0.4 mL/min; 注入量、2 μL; 溶媒系、水 (0. 1% ギ酸): アセトアミド(0. 1%ギ酸）：アセトニトリル（0.1%ギ酸）；グラジエントプログラム，0 分で 95:5 V/V，11.0 分で 10:90 V/V，12.0 分で 10:90 V/V，12.1 分で 95:5 V/V，14.0 分で 95:5 V/V；を行った。

2.12 統計解析
統計解析には SPSS 20.0 を使用した。すべての実験情報は、平均値±SDで表示した。群間差を調べるために、対になっていないスチューデントのt検定（正規分布）またはマン・ホイットニーのU検定（非正規分布）を採用した。複数群の比較にはANOVA検定とLSD検定を用いた。ANOVA検定では、ポストホック分析を行った。P < 0.05は統計的に有意とみなされた。

3 結果
3.1 敗血症患者には腸内細菌組成の乱れがある
本研究では、12人の健康なボランティアと22人の敗血症患者がいた。コホートの平均SD年齢は53.00±21.46歳であった。敗血症患者の平均APACHE IIスコアは18.18±5.42であった。表1は、敗血症患者の詳細な人口統計学的および臨床的情報を示している。敗血症群では、血清乳酸（Lac）およびプロカルシトニン（PCT）濃度が有意に高値であった。年齢や性別には、群間で統計的に有意な差はなかった。

表1
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TABLE 1 患者コホートの一般的特徴

腸内細菌の変化が敗血症と関連しているかどうかを調べるために、健常者と敗血症患者の両方の糞便サンプルの16S rRNAを分析した。サンプル内のα-多様性を評価するために、Ace指数、Chao指数、Shannon指数、Simpson指数をグループごとに計算し、細菌の豊かさと多様性を特徴付けることが示された。敗血症グループはコントロールグループと比較して、有意に低いα-diversityを示した（図1A）。サンプル間のBray-Curtis非類似度に基づくNMDSプロットは、敗血症患者の細菌叢組成が健常対照群と有意に異なることを示した（図1B、C）。敗血症患者では、血清中のSCFAが劇的に低下している（図1D）。全サンプルの門脈レベルの相対存在量を示した（Figure 1E, F）。門レベルでは、ProteobacteriaとBacteroidetesは対照群より敗血症群で多く、Firmicutesは敗血症群で少なかった。属レベルで見ると、解析した細菌の構成は、門レベルで見たよりもさらに患者間で大きな差があった。敗血症の患者は、健康な対照群と比較して、腸内腸球菌の存在量が有意に多かった（図1G）。これらの結果から、敗血症患者の腸内細菌叢の構成は、健常者のそれとは大きく異なることがわかりました。重症者は、病気を引き起こす病原性細菌でいっぱいの悪い微生物叢を持っています。病原性のあるプロテオバクテリアが優勢で、ファーミキューテスのような常在菌種は姿を消している。

図1
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図1 ヒト敗血症に関連した腸内細菌叢の変化。(A）健常者（n = 12）と敗血症患者（n = 22）のα多様性プロファイルを比較するために、Ace、Chao、Shannon、Simpsonの各指数を使用した。(B, C) 門と属レベルのβ多様性のNMDS分析。異なる色調は異なるグループを象徴している。2つのサンプルの種は、2つのサンプル点が互いに近いほど、より類似している。(D)2つのグループ間の血清SCFAsレベルの比較。(E)生物門レベルでの群集の分布。色の違いは明瞭な種を示し、列の長さはグループサンプル（Y軸で表す）におけるそれらの種の相対的な存在度を示す。(F, G) グループ間の腸内細菌叢の変動は、門と属のレベルで統計的に有意であった。**p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001。

3.2 FMTは抗生物質介入後の敗血症マウスの生存率および細菌クリアランスを増加させた
敗血症における腸内細菌叢の機能をより深く理解するために、動物を用いた実験を行った。野生型株のマウスに広域抗生物質（イミペネムとバンコマイシン）を4日間投与して腸内細菌叢を破壊し、その後、FMTとSCFAを3日間投与して腸内細菌叢の一部を回復させました。最後に、セカール結紮・穿刺を行い、敗血症モデルを作製した（図2A）。抗生物質を4日間投与したマウスは、盲腸がかなり大きくなり、シワがないことを発見した（図2B）。敗血症モデル作成から7日後、Sham、CLP、ANC、AFC、ASCの各群の生存率を比較した。Sham手術群では、致死率はゼロであった。24時間後のCLP群の生存率は85.7％であり，7日後の生存率は64.3％であった．しかし、ANC群では24時間生存率は58％、7日生存率は8％であった。また、ANC群ではCLP群に比べ、活動性が低く、刺激に対する反応も鈍かった。AFC群では、24時間生存率が71％、7日生存率が35.7％と、生存率が著しく向上した（P < 0.05； Figure 2C）。治癒のためには、細菌を取り除くことが不可欠である。そこで、腹腔内の細菌数を数え、FMTとSCFAが細菌集団にどのような影響を与えるかを分析した。CLP後16時間目に、腹腔洗浄液中の微生物数を評価した。コロニーは血液寒天培地プレート上にプレーティングしてから24時間後にカウントされた。Sham群には細菌は存在しなかった。しかし，AFC群およびASC群のコロニー数は，ANC群に比べはるかに少なかった．コロニー形成単位（CFU）情報は103CFU/mLとして示した（図2D）。

図2
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図2 糞便微生物叢移植（FMT）および短鎖脂肪酸（SCFA）の補充は、CLP誘発敗血症を減弱させる。(A）実験デザインを模式的に示した図。(B）FMTおよびSCFAsは、盲腸結紮穿刺（CLP）後の生存率を改善する。AFCおよびASC群のマウスは、ANC群のマウスよりも高い生存率を示した。(C) 抗生物質処理前と4日後の代表的な盲腸。(D) FMTとSCFAは敗血症マウスの細菌クリアランスを増加させた。*p < 0.05; ***p < 0.001。

3.3 FMTは抗生物質介入後の敗血症マウスの臓器障害から保護する
敗血症に対する腸内細菌叢の保護効果が臓器障害にまで及ぶかどうかを調べるために、敗血症後の各群のマウスの組織切片を分析した。Sham群の大腸、肺、肝臓、腎臓は正常な形態学的特徴を有していた（図3A-D）。大腸のヘマトキシリン・エオジン（HE）染色標本を用いて、炎症反応と腸の損傷が、抗生物質で処理された敗血症マウスで著しく悪化していることを確認した。同時に、FMTとSCFAsで治療した敗血症マウスでは緩和された。ANC群では、腸絨毛がまばらに分布し、部分的に絨毛上部が分離していた（図3A）。

図3
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図3 糞便微生物叢移植（FMT）および短鎖脂肪酸（SCFA）の補充は、臓器不全に対するマウスの敗血症を予防する。(A-D）H&E染色により、ANC群の結腸、肺、肝臓、腎臓組織では、Sham群に比べ炎症性浸潤、浮腫、出血がかなり多く見られたが、AFC群およびASC群ではこれらの異常が激減した（原倍率、×100）。

ANC群の肺組織の画像では、肺胞隔壁が拡大・鬱血し、一部の肺胞腔から炎症細胞が漏出し、一部の肺胞が合体して水疱を形成していた。しかし、FMTとSCFAsの投与により、肺胞隔壁の拡大、鬱血、および炎症細胞の浸潤の減少が抑制された（図3B）。肝組織は、局所的な壊死と炎症細胞の浸潤を示した。しかし、ANC群と比較して、AFC群では肝変化が抑制された（図3C）。腎臓の病理組織学的検査では、ANC群は対照群と比較して、糸球体の萎縮と硬化が大きく、数がかなり減少し、毛細血管のループの開きが不十分で、腎臓の間質性出血が限局するなど腎臓の特徴に形態的異常が見られた。しかし、ANC群と比較して、AFC群では腎臓の特性が改善された（図3D）。結論として、FMTとSCFAsによる治療がCLPによって誘発される全身性炎症の程度を軽減することが示された。

3.4 FMTはCLPによる損傷からマウスの腸管上皮のタイトジャンクションを保護する
TEMを用いて、マウスの大腸の微絨毛とタイトジャンクション（TJ）の超微細構造を観察した。Sham群では、微絨毛は正常であり、微絨毛直下のTJは狭小で無傷であった。CLP群およびANC群では、腸管上皮細胞および細胞質内小器官が著しく肥大化し、微絨毛が部分的に消失していた。細胞間隙の拡大とミトコンドリアの肥大化はANC群で最も顕著であった。しかし、FMTとSCFAsはCLP誘発敗血症マウスの腸管超微細構造の破壊を減衰させる（図4A）。

図4
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図4 糞便微生物叢移植（FMT）および短鎖脂肪酸（SCFAs）の補給は、CLP誘発の損傷からマウス腸管上皮タイトジャンクションを保護する。(A)異なる処理を施したマウスから採取した大腸セグメントの電子顕微鏡写真。グループは図示のようにラベルされている。スケールバー =500 nm。(B、C）結腸組織におけるタイトジャンクションタンパク質Occludinの免疫組織化学的染色（X 100、スケールバー、100μm）。有意な結果を箱ひげ図に示す。(D) 血清中のD-乳酸およびジアミン酸化酵素(DAO)レベル。*p < 0.05; ***p < 0.001; ****p < 0.0001。

TJバリアの生理的変化がTJタンパク質分布の変化と関連しているかどうかを調べるために、膜貫通型TJタンパク質オクルディンをマウス大腸で免疫組織化学的に標識した。(図4B）。CLPを16時間行った後、各群のOccludinの平均積分ODを比較した。その結果、ANC群におけるOccludinの発現は、AFC群およびASC群に比べ、かなり低いことが明らかになった。一方、FMTとSCFAは、CLP後のOccludinの発現を増強することができる。

胃の粘液バリアが健全であることを示すサインとして、D-乳酸とDAOがある。ELISAを用いて、5つのグループそれぞれのD-乳酸とDAOの量を測定し、比較した。その結果、Sham群ではCLP群、ANC群に比べ、D-乳酸とDAOの血中濃度が低いことがわかった。AFC群では、D-乳酸とDAOの血清濃度がANC群よりかなり低かった。D-乳酸とDAOの濃度は、ANC群とCLP群の間で有意な差はなかった（P > 0.05）。この結果から、FMTおよびSCFAは、マウスのCLPによって生じる腸管透過性の上昇を減少させることがわかった（図4C、D）。

3.5 FMTは抗生物質による腸内細菌叢の乱れを回復できる
抗生物質マウス3群にFMT、SCFA、通常生理食塩水をそれぞれ3日間経口投与し、糞便を採取して、FMTとSCFAが抗生物質マウスの腸内フローラを調節できるかどうかを検討した。細菌の16S rRNA遺伝子を配列決定することで、動物の腸内細菌叢を定義した。細菌のα多様性（微生物叢の種の豊富さと多様性）は、多くの集団についてAce、Chao、Shannon、Simpsonの各指標を用いて計算された。ベータ多様性（PCoA）を決定するために主座標分析を適用した。抗生物質治療後、マウスの腸内細菌叢の多様性と存在量は減少した。それにもかかわらず、FMTとSCFAは、経口投与後に回復傾向を示し（図5A、B）、FMTとSCFAが抗生物質治療マウスの腸内細菌叢の組成をかなり変化させることが実証された。分類群のベン図では、A0群では573種、A4群では297種、AF群では592種、AS群では571種であることがわかった。抗生物質投与4日後、マウスの腸内フローラは劇的に減少した（図5C）。群集存在比組成では、抗生物質介入後にBacteroidetesの割合が減少し、Proteobacteriaの割合が増加し、抗生物質投与マウスの腸内細菌叢は正常マウスのそれと大きく異なっていた。しかし、FMTとSCFAは、異常な腸内細菌叢を修復し、より正常な状態に戻すことができる（図5D）。総存在量の上位50種をフィルターにかけ、LEfSeデータで評価した。Bacteroides, Prevotella, Allobaculum, Parasutterella, Clostridium-XIVa, Alloprevotella, Saccharibacteria-genus-incertae-sides, Ruminococcaceae, and Erysipelotrichaceae-incertae-sedis は抗生物質治療後減少していた。しかし，FMTとSCFAsの経口投与により，すべて回復した．抗生物質投与マウス（A4群）では、ファミリーレベルで腸内細菌科細菌の数が多くなった（図5E）。腸内細菌科細菌の存在は、様々な病気の予後を悪化させることにつながっている（10, 30）。しかし、FMTまたはSCFAsで処置したマウスは、腸内細菌科の存在量が減少していた。アロバクラム（図5F）やバクテロイデス（図5G）などのSCFAs産生菌は、AFC群およびASC群と比較して、ANC群ではかなり少なかった。

図5
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図5 マウス糞便の微生物相の多様性。(A）A0（青）、A4（赤）、AF（緑）、AS（紫）群のα多様性を、Ace、Chao、Shannon、Simpsonの各指数で示した。(B）腸内細菌叢のβ多様性を主成分分析（PCoA）散布図によって表示した。(C）平行な円と重なり合った円をベン図で示した。グループ間で共有されている種は重なり合った部分で、各グループに固有の種は重なり合わない部分で示されている。(D）OTUプロファイルのWeighted Unifrac Distanceに基づく階層的クラスタリングにより、各サンプルの門レベルでの群集組成が示される。(E) 属レベルでは、各グループのLEfSeに含まれる種の多さを示す。色のグラデーションは相関値を表す。n = 6マウス/群。(F, G) SCFAs産生菌の相対的存在量 (F) Allobaculum (G) Bacteroides群。A0群（抗生物質なし）、A4群（抗生物質4日＋通常生理食塩水3日）、AF群（抗生物質4日＋FMT3日）、AS群（抗生物質4日＋SCFAs3日）。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001. ns, not significant.

3.6 FMTはGSDMDを介したパイロプトーシスを抑制することにより敗血症を改善した。
パイロプトーシスは、カスパーゼ-1/11とガスデルミンDによって引き起こされる炎症性プロセスと関連するプログラムされた細胞死の一種である。パイロプトーシスは、細菌のコロニー形成に対する宿主の防御機構として機能している。本研究では、敗血症マウスの大腸組織における NLRP3 inflammasome 関連蛋白とパイロプ トシス関連蛋白の発現をウエスタンブロット法および ELISA 法で解析した。ウェスタンブロッティングの結果、敗血症はカラー組織のNLRP3、IL-18、GSDMD-Nの発現を促進したが、FMTとSCFAs投与はCLPによるこれらのタンパク質の発現を抑制した（図6A-D）。CLPおよびANC群では、炎症性サイトカインであるIL-1βの血清レベルがかなり上昇した。FMTおよびSCFAは、CLPによって炎症が誘発されたマウスのIL-1βの血中濃度を低下させた（P < 0.001；図6E）。これらの知見は、FMTおよびSCFAsの投与が、CLPによって誘発されるNLRP3インフラマソームの活性化および大腸組織におけるパイロプトーシスを抑制したことを示唆している。

図6
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図6 マウス敗血症後のパイロプトーシス関連遺伝子の大腸タンパク質発現：Fecal microbiota transplantation（FMT）および短鎖脂肪酸（SCFAs）の役割 A）NLRP3、IL-18、GSDMD-fl、およびGSDMD-Nの検出のためのウェスタンブロット法である。(B〜D）NLRP3/β-actin、GSDMD-N/GSDMD-fl、IL-18/β-actinの発現比率を、Sham群を基準値として、定量的に検討した。(E）血清中のIL-1βの濃度をELISA法を用いて測定した。データは、平均±SDで表される。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns: 無意図。

3.7 マウスの糞便代謝結果の解析
LC-MSにより糞便サンプルの代謝物プロファイルを解析した。A0群およびA4群におけるPC1およびPC2の変動は、それぞれ45.81%および13.99%であった（図7A）。また、ANC群、AFC群、ASC群の間でも、代謝物の多様性に有意な変動が検出された（図7B、C）。次に、OPLS-DAモデル（31）により、各群間の差異につながる化合物をさらに解析した。スコアの結果、各グループは2つの異なる領域に分布していることがわかった（図7D〜F）。OPLS-DA モデルは、適合度や予測能力の値から、優れた適合性と良好な予測能力を有していることがわかる。

図7
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図 7 敗血症マウスの糞便代謝における糞便微生物叢移植（FMT）および短鎖脂肪酸（SCFA）の役割。(A-C）代謝物の主成分分析（PCA）の散布図から、A0群はA4群とは全く異なる代謝プロファイルを有していることがわかる。(D-F) 代謝物プロファイルのOPLS-DA解析。OPLS-DAスコアプロットとOPLS-DAモデルテストチャートは、グループ間の良好な識別性を示しました。A0群とA4群の間（G）、ANC群とAFC群の間（H）、ANC群とASC群の間（I）の代謝物の差異を示すVolcano Plot。A0とA4群間（J）、ANCとAFC群間（K）、ANCとASC群間（L）の上位20代謝物の線形識別分析（LDA）効果量分析。LDAスコア＞1、Wilcoxonのsigned-rank検定によりp＜0.05の有意性を示す。

本研究では、重要予測変数である重要負荷評価パラメータ（VIP）を閾値として、治療群間でレベル差がある代謝物、すなわち差分代謝物をさらにスクリーニングしました（32）。差分代謝物とは、以下の基準を満たした代謝物を指します。VIP ≥ 1.0, fold change ≥ 2 or ≤ 0.5, および p < 0.05 の条件を満たす代謝物を差次代謝物とした (Fig. 7G-L)．ANC群とAFC群では56種類、ANC群とASC群では53種類の代謝物質が同定された。AFC群では、ANC群と比較して41種類の代謝物が上昇し、15種類の代謝物が低下していた。ASC群では、49の代謝物が増加し、4つの代謝物が減少しました。代謝経路の構築と評価にKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）データベースを活用し、抗生物質と敗血症腸内細菌叢の間の重要な代謝経路をさらに明らかにするために、差分代謝物を組み込んだ。その結果、フェニルアラニン、アラキドン酸、ピリミジン、チロシン、システイン、メチオニン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ブタン酸、アルギニン、プロリン、およびフェロプソスが関与する代謝経路など、重要な代謝経路を示していました（図8A～C）。

図8
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図8（A-C）A0とA4群（A）、ANCとAFC群（B）、ANCとASC群（C）の代謝経路の比較。

4 考察
臓器の致命的な機能障害となりうる敗血症は、公衆衛生上の大きな問題である(33)。敗血症や臓器不全の発症における腸内細菌叢の重要性はますます明らかになりつつある(11)。しかし、臨床では、敗血症の臓器不全は、主に肺、心臓血管、肝、腎、神経、血液系で評価される。診断の特異性に欠けるため、消化器症状は解析に含まれていない(34)。したがって、敗血症におけるマイクロバイオームの変化を包括的に理解することは、微生物標的治療の開発にとって極めて重要である。

本研究では、16S rRNAシーケンシングを採用し、ヒト腸内細菌叢に対する敗血症の影響を十分に評価した。その結果、敗血症は腸内細菌叢に大きな影響を与えること、また、腸内細菌の異常は敗血症時の臓器障害の発現に極めて重要であることが明らかとなった。NMDS解析の結果、敗血症患者の微生物コミュニティーは健常者のそれとは大きく異なり、異なる象限に位置していることがわかりました。また、敗血症患者はマイクロバイオームの多様性がかなり低く、これは以前の研究（35）と一致した。敗血症患者は、有益な細菌が減少する一方で、病原性細菌の量が劇的に増加する。門レベルでは、敗血症患者の腸内フローラにおけるProteobacteriaの量は対照群よりもはるかに多く、一方、Firmicutesの数は著しく少なかった。さらに、Roseburia, Blautia, Clostridium, AnaerostipesはSCFAs産生菌であり、著しく減少している属の一つである(36)。驚くべきことに、敗血症患者は健常対照者と比較して、腸内エンテロコッカスの存在量が劇的に多いことが観察された。SCFAs産生菌が枯渇すると、バンコマイシン耐性腸球菌の集団が重症患者で増殖することが分かっている(37)。抗炎症シグナルやグルコースおよび脂質代謝を制御するエフェクター化学物質である酪酸の減少は、結腸内のEnterococcus種の存在と関連している(38)。我々の結果は、敗血症における腸内細菌叢の異常は、以下の2つの特徴的な特徴を有することを示唆している。第一に、敗血症が発症するとマイクロバイオームの構造が変化し、マイクロバイオータの豊富さと多様性が低下する。第二に、腸内細菌叢の変化は、潜在的に有害な細菌の増殖を促進し、SCFAsの生成を低下させることにより、敗血症を発症しやすくする可能性がある。したがって、敗血症と腸内細菌および代謝産物との関係を研究することが必要である。

これまでの研究で、FMTが抗生物質の過剰使用と関連する人々のClostridioides difficile感染症（CDI）に対して有効であることが示されている（39）。これは、健康なドナーの機能性細菌を患者の消化管に移植し、腸内微生物の生態バランスを修復し、微生物のアンバランスに関連する障害を治療するものです(40)。最近の臨床試験では、FMTが血液悪性腫瘍患者のコロニー化した薬剤耐性菌を駆除し、大腸炎の治療を回復させる効果があることが実証されています（41, 42）。また、重度の肥満やメタボリックシンドロームの患者において、FMTと低発酵性食物繊維を毎日摂取することを組み合わせると、インスリン感受性が改善されます(43)。健康におけるマイクロバイオームの重要性が増していることから、自己免疫疾患、メタボリックシンドローム、敗血症を含む様々な疾患の治療に向けた取り組みが活発化しています（44、45）。敗血症の際にマイクロバイオームが変化することから、研究者や医師は、敗血症治療の補助としてFMTに着目している。治療抵抗性の敗血症と下痢の患者を治療するためのFMTの使用は、2つのケースレポートで説明されている（46, 47）。しかし、FMT後にどのような細菌種が生着するかについては十分に理解されておらず、また、潜在的に危険な細菌についてドナーサンプルをスクリーニングするための適切なアプローチもない。したがって、敗血症におけるFMTの役割を確認するためには、より広範な前向き研究や動物実験が必要である。同様に、腸内フローラの代謝物であるSCFAが免疫系に大きな影響を与え、敗血症やフローラ修復時の修正といったプロセスの調節不全につながることが研究で示されています（19）。健康な腸内フローラと正常な量のSCFAを維持することで、より寛容な免疫系がもたらされます。

敗血症における微生物叢の役割についてより多くのことが解明されれば、従来の治療法とは異なる治療法が有利に働くようになるであろう。ディスバイオーシスの危険性がある患者には、特定の常在菌や短鎖脂肪酸産生菌を補充するテーラーメイドの微生物叢療法が、敗血症への感受性を下げるかもしれない（48、49）。これらの知見に基づき、関連する動物実験が行われた。FMTまたはSCFAは、ディスバイオーシスを緩和し、腸内細菌のバリアメンディングを促進し、最終的に敗血症の治療に貢献する可能性があると推測された。これらの結果は、抗生物質の使用が腸内細菌叢の種構成と多様性を変化させる可能性を示唆するものであった。腸内細菌叢に異常のあるマウス（ANC群）は、CLPマウスと比較して、死亡、炎症、臓器不全のリスクが高いことが判明した。死亡率、組織学的検査、炎症性サイトカインレベルのすべてが、敗血症モデルが活性化され、深刻な病理学的損傷をもたらすことを実証した。同時に、これらはすべてFMTとSCFAsによって回復させることができた。敗血症の臓器への影響は、関連するマイクロバイオームの変化を拡大する可能性がある。敗血症の治療として腸内細菌叢をターゲットにすることで、炎症性障害を最小限に抑え、臓器機能を維持することができる。粘膜上皮の完全性を維持することは、緊密な結合に依存している（50, 51）。我々は、透過型電子顕微鏡の結果を5つのグループ間で比較した。その結果、ANC群のTJはAFC群およびASC群よりも不鮮明で、大きな絨毛の脱落や末端リソソームおよびオルガネラの腫脹が認められた。我々は、このマウスが腸管バリアと細胞の機能不全を呈していたと仮定している。オクルーディンの主な役割は、TJを所定の位置に維持し、封鎖することである(52)。次に、免疫組織化学を用いて、5群の大腸組織におけるOccludinタンパク質の発現を見た。その結果、ANC群のOccludinタンパク質の量は、Sham群に比べ、かなり少ないことがわかった。AFCとASCグループは、ANCグループよりも高い指数スコア、あるいはShamグループと同じスコアであった。

Pyroptosisは、敗血症の発症と発生に重要な役割を果たす必須の免疫学的反応である。敗血症の初期段階において、身体はパイロプトーシスを開始し、感染症の細胞内増殖を遅らせ、そのクリアランスを促進する(53)。感染がコントロールされないと、免疫系の認識と除去を逃れるために、いくつかの微生物が血液や細胞に浸潤する。この過程で、病原体関連分子パターンやDAMPsが産生され、広範なパイロプトーシスを生じ、IL-18やIL-1βレベルを上昇させ、全身性の炎症反応を悪化させ、ついには臓器不全や敗血症性ショックに至る（54, 55）。GSDMDはパイロプトーシスのエフェクター分子である。GSDMDの切断細胞毒性が活性化され、GSDMD-N-末端切断産物が細胞膜に局在すると、穴が形成されIL-1βやIL-18が放出される（56, 57）。我々の結果は、AFCとASC群ではANC群と比較してNLRP3、GSDMD-N、IL-18タンパク質の発現、血清IL-1βレベルがかなり低下しており、FMTとSCFAが細胞のパイロプトーシスを抑制し、敗血症の保護機能を持つことを示している（図5A-E）。

本研究では、FMTとSCFAが敗血症マウスの腸管バリア機能を保護し、腸内細菌叢を維持することができるかどうかを明らかにすることを目的とした。まず、16S rRNAのハイスループットシークエンスを用いて、腸内細菌叢の構成を調べた。敗血症を模擬した後、抗生物質を4日間投与したところ、細菌叢のバランスが崩れ、ANC群が最も腸の傷害が重篤であることを発見しました。BacteroidesとFirmicutesの相対量は、マウスへの抗生物質投与後に大きく減少したが、FMTとSCFAsの投与後に劇的に増加した。BacteroidetesとFirmicutesは大腸に定着して食物繊維を発酵させる主要な細菌種であり、検証されている酪酸の主要生産者であり、腸の健康に寄与する(58)。さらに、Proteobacteriaの相対量は、マウスの抗生物質投与後に劇的に増加したが、FMTおよびSCFAs投与後には有意に減少した。グラム陰性Proteobacteriaには、Escherichia coliのような多数の有害菌やリポ多糖を含む菌が含まれる。マウスの糞便微生物多様性に関するシークエンス結果によると、抗生物質を投与した後、胃の中のEscherichia-Shigellaの相対量がかなり増加した。Escherichia-Shigellaは、大腸上皮の侵襲と破壊を特徴とする最も一般的な腸管病原性細菌の一つである。腸内腸内細菌科細菌の増加は、患者の予後を悪化させる要因とされている（10）。腸内腸内細菌科細菌の増加は、脳梗塞や全身性炎症など脳卒中患者の症状悪化に寄与する可能性が示唆されている(30)。さらに、腸内腸内細菌科細菌の過剰増殖は、敗血症や死亡リスクを高める(59)。本研究の結果、FMTとSCFAは抗生物質投与マウスの微生物叢の存在量と多様性を増加させただけでなく、腸内細菌科の数を有意に減少させたことから、FMTとSCFAは腸内細菌科の過剰増殖を抑制することで敗血症による死亡を改善すると示唆された。AS群では、Akkermansia属の増加が認められた。この特定の菌株は、動物およびヒトの研究においてプロバイオティクスとして有望視されている（53, 54）。ある研究によると、Akkermansiaは腸管上皮に付着し、腸内細胞の単層性を高めることによって、腸の健康を促進することができるそうです(56)。したがって、SCFAはアッケシソウを増加させることにより、敗血症に対して保護的な役割を果たす可能性があることを推奨する。別の研究では、Ruminococcaceae, Faecalibacterium, Roseburiaなどの酪酸産生菌が潰瘍性大腸炎で減少することが示されている(60)。そこで、本実験ではRuminococcaceaeの相対的な存在比を比較した。その結果、抗生物質投与群ではかなり低下していたが、糞便細菌移植群と短鎖脂肪酸投与群では正常マウスと同程度の結果が得られた。Ruminococcaceaeが炎症反応に関与していることは明らかであり、FMTとSCFAは細菌の組成を効果的に変更し、それによって炎症状態を緩和することができるのである。我々の調査は、FMTとSCFAがFirmicutes、Proteobacteria、Escherichia Shigella、Lactobacillusなどの細菌量を調節し、健康なマウスと同レベルに回復させることを示し、これらの細菌がFMTとSCFAのポジティブな効果を媒介する可能性を示しました。FMTとSCFAは、有用な細菌を増やし、有害な細菌を下げることによって、敗血症マウスの腸内細菌叢を修正する可能性がある。結論として、腸内細菌叢が減少したマウスは、CLP群と比較して、細菌の分散、炎症、臓器不全、早期の死亡率が大きかったことが示された。

同時に、マウスの糞便を対象にノンターゲットメタボローム解析を実施した。その結果、抗生物質治療が糞便の代謝プロファイルを劇的に変化させ、敗血症の転帰に影響を与えることが明らかになった。主な代謝経路は、チロシン代謝、アラキドン酸代謝、システインおよびメチオニン代謝、アラニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸代謝、ブタン酸代謝、アルギニンおよびプロリン代謝、フェロプトーシスであった。アミノ酸代謝異常は、敗血症のような消耗性疾患において広く観察されている(61)。また、Huangらは、敗血症におけるフェニルアラニン濃度の上昇が予後不良につながることを発見した(62)。本研究でも、ANC群のフェニルアラニン濃度がAFC群、ASC群に比べ非常に高いことを発見し、ANCマウスの予後不良に関連している可能性が示唆された。

5 おわりに
結論として、我々は敗血症患者において腸内細菌叢のディスバイオーシスを発見した。FMTおよびSCFAは、抗生物質で治療した敗血症マウスの死亡率を劇的に低下させ、腸管障害および腸内細菌叢の乱れも抑制した。さらに、FMTは敗血症マウスの大腸でOccludinタンパク質の発現を増加させ、NLRP3およびGSDMD-Nタンパク質の発現を低下させ、炎症因子IL-1βおよびIL-18の放出を減少させて細胞のパイロプトーシスを抑制し、最終的に敗血症の保護的役割を担った。FMTとSCFAは、敗血症に対する実行可能で効果的な補助療法の選択肢である。FMTまたはSCFAsの早期投与により、敗血症のマウスの死亡率が大幅に低下するが、これは腸内細菌叢の回復の結果であると考えられる（図9）。今回の成果は、敗血症の発症における腸内細菌叢の機能についての理解を深め、腸内細菌叢の操作に基づく予防法の開発に貢献するものと期待される。

図9
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図9 敗血症の治療における糞便微生物叢移植（FMT）および短鎖脂肪酸（SCFA）の役割の可能性。敗血症の病態では、腸内フローラのバランスが崩れ、腸内フローラ代謝産物からのSCFA産生が減少し、SCFAがGPR43に結合する能力が低下しています。また、NOD様受容体タンパク質-3（NLRP3）インフラマソームがさらに作られ、IL-1βやIL-18がより多く放出されるように誘導し、組織や細胞の炎症反応を悪化させるのです。さらに、NLRP3はカスパーゼ-1の活性化を誘発し、それがガスダミンD（GSDMD）タンパク質を切断して細胞のパイロプトーシスを誘発し、それゆえ敗血症を悪化させ悪循環を永続させるのです。FMTとSCFAは、腸管機能を保護し、腸内フローラの分布と量を調整し、優勢な腸内フローラを回復し、SCFAの生産を高め、炎症反応と細胞のパイロプトーシスを抑制し、結果として敗血症を保護することができます。(BioRender.comで作成）。

データ提供について
本研究で発表されたデータは、NCBIリポジトリ（アクセッション番号 PRJNA891660）に登録されています。

倫理に関する声明
本実験は、雲南省第一人民病院医療倫理委員会（プロジェクト番号：KHLL2021-036）により承認された。患者/参加者は、この研究に参加するために、書面によるインフォームドコンセントを提供した。この研究は、米国国立衛生研究所のガイドラインに従って実施され、昆明医科大学研究倫理委員会（プロジェクト番号：KMMU20221600）により承認された。

著者の貢献
XLとJXが研究のデザインと準備に責任を持ち、原稿を起草した。GCは実験の監督と原稿の改訂を担当した。RSとYYは実験を行った。DN、CM、FWはデータの解析と数値の計算を行った。すべての著者が論文に貢献し、提出された原稿を承認した。

資金提供
本研究は，中国国家自然科学基金（プロジェクト番号82160366）および雲南臨床医学センター開放プロジェクト（番号2021LCZXXF-HX03）の支援を受けて実施された。

謝辞
昆明医科大学口腔医学研究所と雲南省第一人民病院臨床医学センターの実験台と先生方の強力なサポートに感謝する。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

出版社からのコメント
本論文で述べられたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品，あるいはそのメーカーによる主張は，出版社によって保証または承認されたものではない．

略語
CLP、cecal ligation and puncture、FMT、fecal microbiota transplantation、SCFAs、short-chain fatty acids、ICU、intensive care unit、NLRP3、NOD-like receptor protein-3、GSDMD、gasdermin D.。GSDMD-NT、GSDMDのN末端フラグメント；GSDMD-fl、全長GSDMD；IL-1β、インターロイキン1β；IL-18、インターロイキン18；DAO、ジアミン酸化酵素；LEfSe、線形判別分析効果量。OPLS-DA、Orthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis、PCoA、主座標分析、PCA、主成分分析、VIP、投影における変数の重要度、APACHE、Acute Physiologic Assessment and Chronic Health Evaluation、SOFA、Sequential Organ Failure Assessment、Lac、乳酸、PCT、Procalitonin、など。

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キーワード：敗血症、腸内細菌叢、抗生物質、糞便微生物叢移植、短鎖脂肪酸

引用元 Lou X, Xue J, Shao R, Yang Y, Ning D, Mo C, Wang F and Chen G (2023) Fecal microbiota transplantation and short-chain fatty acids reduce sepsis mortality by remodeling antibiotic-induced gut microbiota disturbance. Front. Immunol. 13:1063543.論文番号: 10.3389/fimmu.2022.1063543

Received: 2022年10月07日、受理：2022年12月22日。
公開：2023年1月11日

編集者

王 浩、山東大学斉魯病院、中国
査読者：Wimonrat Panpetch, Shandong University, China

Wimonrat Panpetch, Chulalongkorn University, Thailand (タイ)
Leonardo Augusto de Almeida, Federal University of Alfenas, Brazil （アルフェナス連邦大学、ブラジル
Copyright © 2023 Lou, Xue, Shao, Yang, Ning, Mo, Wang and Chen. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文です。原著者および著作権者のクレジットを表示し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。本規定に従わない使用・配布・複製は認めない。

*Correspondence: Guobing Chen, rocktom38chen@163.com

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免責事項：この論文で述べられたすべての主張は，著者のものであり，必ずしも所属機関のもの，あるいは出版社，編集者，査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはそのメーカーが行う可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。

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