【論文紹介】CRISPRエフェクターCam1はファージ防御のための膜脱分極を媒介する | Nature

The CRISPR effector Cam1 mediates membrane depolarization for phage defence - Nature

公開日　：2024年1月10日
研究機関：ロックフェラー大学
主体ラボ：Luciano A. Marraffini

抄録

Prokaryotic type III CRISPR–Cas systems provide immunity against viruses and plasmids using CRISPR-associated Rossman fold (CARF) protein effectors1,2,3,4,5. Recognition of transcripts of these invaders with sequences that are complementary to CRISPR RNA guides leads to the production of cyclic oligoadenylate second messengers, which bind CARF domains and trigger the activity of an effector domain6,7. Whereas most effectors degrade host and invader nucleic acids, some are predicted to contain transmembrane helices without an enzymatic function. Whether and how these CARF–transmembrane helix fusion proteins facilitate the type III CRISPR–Cas immune response remains unknown. Here we investigate the role of cyclic oligoadenylate-activated membrane protein 1 (Cam1) during type III CRISPR immunity. Structural and biochemical analyses reveal that the CARF domains of a Cam1 dimer bind cyclic tetra-adenylate second messengers. In vivo, Cam1 localizes to the membrane, is predicted to form a tetrameric transmembrane pore, and provides defence against viral infection through the induction of membrane depolarization and growth arrest. These results reveal that CRISPR immunity does not always operate through the degradation of nucleic acids, but is instead mediated via a wider range of cellular responses.

原核生物のIII型CRISPR-Casシステムは、CRISPR-associated Rossman fold (CARF)タンパク質エフェクターを用いてウイルスやプラスミドに対する免疫を提供する1,2,3,4,5。CRISPRのRNAガイドと相補的な配列を持つこれらの侵入者の転写産物を認識すると、環状オリゴアデニル酸セカンドメッセンジャーが産生され、CARFドメインと結合してエフェクタードメインの活性を引き起こす6,7。ほとんどのエフェクターは宿主や侵入者の核酸を分解するが、中には酵素機能を持たない膜貫通らせんを含むものもあると予測されている。このようなCARF-膜貫通らせん融合タンパク質が、III型CRISPR-Cas免疫応答を促進するかどうか、またどのように促進するかは、未だ不明である。ここで我々は、III型CRISPR免疫における環状オリゴアデニル酸活性化膜タンパク質1（Cam1）の役割を調べた。構造解析と生化学的解析から、Cam1二量体のCARFドメインが環状テトラアデニル酸セカンドメッセンジャーと結合することが明らかになった。生体内では、Cam1は膜に局在し、4量体の膜貫通孔を形成すると予測され、膜の脱分極と成長停止を誘導することでウイルス感染に対する防御を行う。これらの結果から、CRISPR免疫は必ずしも核酸の分解を介して作用するのではなく、より広範な細胞応答を介することが明らかになった。

Paper Interpreterの出力

タイトル: The CRISPR effector Cam1 mediates membrane depolarization for phage defence【7†source】。

アブストラクト: 本研究では、原核生物のタイプIII CRISPR-Casシステムが、CRISPR関連ロスマン・フォールド（CARF）タンパク質エフェクターを使用してウイルスやプラスミドに対する免疫を提供していることを明らかにしています。これらの侵入者の転写物がCRISPR RNAガイドと相補的な配列を認識することにより、サイクリックオリゴアデニル酸の第二メッセンジャーが生成され、CARFドメインに結合してエフェクタードメインの活性を引き起こします。これまでのエフェクターは宿主や侵入者の核酸を分解するものが多かったが、膜貫通ヘリックスを含むCARF融合タンパク質は、酵素的な機能を持たないと予測されています。本研究では、タイプIII CRISPR免疫中のCam1（サイクリックオリゴアデニル酸活性化膜タンパク質1）の役割を調査しました。構造および生化学的解析により、Cam1ダイマーのCARFドメインがサイクリックテトラアデニル酸の第二メッセンジャーに結合することが明らかになりました。実験では、Cam1が膜に局在し、四量体の膜貫通ポアを形成すると予測されており、膜の脱分極および増殖停止を誘導することでウイルス感染に対する防御を提供します。これらの結果から、CRISPR免疫は常に核酸の分解を介して作用するわけではなく、より広範な細胞応答を介して媒介されることが明らかになりました【8†source】。

背景: タイプIII CRISPR-Casシステムは、ウイルスやプラスミドに対する免疫を提供するために、CRISPR関連ロスマン・フォールド（CARF）タンパク質エフェクターを使用しています。これらの侵入者の転写物がCRISPR RNAガイドと相補的な配列を認識すると、サイクリックオリゴアデニル酸の第二メッセンジャーが生成され、CARFドメインに結合してエフェクタードメインの活性を引き起こします【8†source】。

方法: 本研究では、N. halophilus Cam1（NhCam1）と呼ばれるCam1の機能を、Staphylococcus epidermidis RP62のタイプIII-Aローカスにおいて研究しました。NhCam1は分子量が22.3kDaで、206個のアミノ酸からなり、N末端には24個のアミノ酸からなる膜貫通ヘリックス（TMH）があります【9†source】。さらに、NhCam1 CARFドメイン（残基67-206）にサイクリックオリゴアデニル酸を結合させる実験を行い、その結合定数を測定しました【10†source】。

結果: 本研究の結果、NhCam1は膜に局在していることが示されました。また、AlphaFold2シミュレーションにより、NhCam1が二つのCARFダイマーと四つのN末端膜貫通αヘリックスからなる四量体複合体を形成することが示唆されています。この四量体は、膜貫通ヘリックスのD17残基によって負の電荷を持つ膜貫通ポアを形成すると予測されています【11†source】。さらに、Western blot分析により、NhCam1が細胞膜に結合していることが確認されました【12†source】。

議論: Cam1は、核酸を分解することによって成長停止を引き起こす従来のCARFエフェクターとは異なり、TMHドメインを含んでおり、これが感染細胞の膜脱分極と成長停止を引き起こすために必要な四量体ポアの形成を促進しています。Cam1は複数の異なる生物に存在し、ほとんどのCRISPR-Casローカスが異なる種間で水平伝播することができるため、本研究の発見は、Cam1のネイティブホストでも同様に適用されると考えられます。ウイルス感染中のCam1の機能は、タイプIII-A CRISPR-Cas応答と結びついており、膜脱分極は、Cas10 PalmドメインがcA4リガンドを合成するまで開始されません。この機構は、ウイルス濃度が低く、培養中のすべての細胞が感染していない場合に効果的な免疫を提供します。Cam1は、核酸を分解する他のCARFエフェクターとは対照的に、ウイルスの遅い段階で効率的に干渉することができない可能性がありますが、Cas10との併用により、培養中の非感染細胞の成長を可能にします【15†source】。