如何に早くコンストラクトを作るか

多くの実験はコンスト作りから始まります。
でもここでつまずいてしまうと、後の実験が何一つ前に進まない。
スピードが大切なのは言わずもがな、ですね。

最近の分子生物学では、制限酵素はほぼ使われません。
制限酵素の組み合わせで使用するべきバッファーを
カタログのappendixの表から調べていた時代が懐かしい・・・。

1日目：プライマー設計・注文

さて、とりあえず、新しくコンストを作るぞ！となったら
まずはプライマーを注文しましょう。１にも２にもプライマー。
設計のコツは流儀色々ありますが、

１）Tm値を60℃あたりに揃える
２）極端なGC含量にしない
３）長さは20~40bpほどに
４）Hisタグのような繰り返し配列は避ける

Tm値は揃えてしまえば、
PCRの条件検討をほぼしなくて良いので楽チンです。
当日の間にプライマーだけは注文してしまいましょう。

cDNAなどから遺伝子を釣って来る時は、長さや元々の発現量によって
すごく大変な事もあるので、そこそこ覚悟をしておくように。

金に糸目をつけなければ、合成してもらうのも手です。
人生捗ります。

2日目：PCR、DpnI処理

プライマーが届いたら早速PCRをかけましょう。
終わったらゲル泳動でバンドチェックをして、
残りの全量をDpnI処理しましょう。
37℃ O/Nがおすすめですが、５時間とかでも良いです。

3日目：精製、大腸菌へTF

DpnIが終わったPCR液からDNAを抽出して、
SLiCEしたり、目的に合わせてライゲーションしたら、
大腸菌にトラフォしましょう。３７℃ O/N。

4日目：コロニーチェック、ミニプレ培養

5日目：ミニプレップ、シーケンスへ

これで一週間かかりますね。
でももう少し急ぐにはどうしたら良いでしょうか。

1日目：プライマー設計、注文
2日目：PCR、DpnI処理、精製、大腸菌へTF
3日目：コロニーチェック、ミニプレ培養、ミニプレップ、シーケンスへ

これなら3日で出来ます。

ポイントは、２、３日目の実験をとにかく早い時間から始める事。

DpnI処理５時間はもちろんのこと、
ミニプレ培養は８時間もやれば基本的に十分です。
シーケンスの締め切りは午後のことが多いので、
逆算して培養開始してください。

TIPS１：顕微鏡でコロニーのぞいてつつくのもあり

基本的に新しく作ったコンストをトラフォした場合、
コロニーが出来るのは翌日以降ですが、
既に出来ているプラスミドをトラフォする場合は、
５〜８時間ぐらいでも、双眼実体顕微鏡で覗けば
コロニーが見えることがあります。

顕微鏡でのぞいて、つついて、ミニプレに持ち込みましょう。

TIPS２：シーケンス結果を待っている間に先に進めよう

DpnI処理をしっかりするようになってから、
外れコロニーの出現頻度は激減しました。
そこで、続けてタンパク質発現を行いたい場合には、
シーケンス結果を待たずに、発現用大腸菌にトラフォして、
発現準備をしてしまうのがオススメです。

上で言う3日目に、候補２〜４つぐらい、そのまま発現用大腸菌へトラフォ、
LBプレートと、
ゴリ押しですが、トラフォ液をLBに投入して前培養も同時に開始します。
翌朝にはシーケンス結果が出て来るので、
アタリのプラスミド分だけ先に進めて本培養に持ち込みましょう。
（トラフォ液を投入した前培養はミスる事もあるので、
　LBプレートへの塗布も忘れずに、失敗しても遅れはとりません）
早ければ4日目には菌体が回収出来ますね。

シーケンス結果を待っていると、
4日目に発現用大腸菌へトラフォ、
5日目にプレートから前培養、
6日目に本培養、となるので、

時短法でやれば、更に２日間は節約出来ます。

コンスト作製から考えると、計４日間の節約。
余った時間はあなたの自由です。

休暇を取っても良いし、次の実験を開始しても良い。
この1日、1日の積み重ねが、研究をしながら、
自分の時間を確保するコツです。