20240617: 腱ー骨付着部・石灰化線維軟骨・軟骨下骨・荷重環境適応
筋骨格装置の重要な要件は、腱から骨への力の伝達です。軟部組織と硬い石灰化した骨の組成、構造、材料挙動には大きな違いがあり、接続領域が高応力に対して脆弱になり、繰り返し負荷がかかると破損を引き起こす可能性があるため、これは困難な作業になる可能性があります。その結果、腱の骨への統合は、2 つの材料間の不適合性を緩和するために中間組織として線維軟骨を含む、付着部（enthesis）と呼ばれる特殊な多材料領域を介して行われることがよくあります。付着部は伝統的に、腱、非石灰化線維軟骨、石灰化した線維軟骨、骨の 4 つの連続した領域に細分化されます。付着部の定義に腱と骨が含まれていることは、これらの組織間に明確に定義されたインターフェイスが存在しないことを示しています。組成の観点から見ると、I型コラーゲンに基づく線維組織である腱や骨とは対照的に、付着部線維軟骨は、II型コラーゲンとプロテオグリカンの含有量が多いことが特徴です。後者は水との親和性が高く、線維軟骨に圧縮に対する耐性を向上させると考えられています。
腱から非石灰化線維軟骨への移行は、腱線維の直径が大幅に減少し、線維軟骨内でより小さな界面線維に分岐することによって特徴付けられます。
線維軟骨線維は、腱方向に沿ってやや整列しておらず、広がっているため、付着領域が広くなります。骨に到達する前に、線維軟骨マトリックスはミネラル結晶によって強化されます。石灰化していない線維軟骨と石灰化した線維軟骨の境界面は、平らではなくかなり波打っており、石灰化した線維軟骨と骨の接合部は高度に絡み合っています。このような組成や構造の変更は、付着部耐久性と堅牢性を改善するための注目すべき適応戦略であると考えられており、何百万回もの荷重サイクルにわたって体重よりも高い荷重を伝達することを可能にします。
付着部は、細かく調整された独自の生体力学的挙動にもかかわらず、いくつかの理由から臨床的にかなり重要です。付着部は、使いすぎによる損傷、、リウマチ性疾患、および変性変化を起こしやすいです。これらの状態のいくつかは、強い機械的負荷を受ける付着部でより多く見られるようであり、付着部における非常に不均一な局所的機械的環境と付着部症を発症する可能性との間にはおそらく関係があります（まだ十分には理解されていませんが）。付着部炎などの付着部疾患は、その組織学的および生体力学的特性のために、純粋な腱または骨の損傷よりも治療が複雑であり、潜在的な一般的な炎症の状況に含める必要があります。整形外科の観点からは、腱の外傷性または急性の損傷は、付着部領域に直接関係していなくても、多くの場合、軟部組織を骨に外科的に再付着する必要があります。しかし、付着部は骨やある程度の腱とは異なり、再生能力が遅く限られています。その結果、外科的治療は長期的にはかなり悪い結果をもたらす可能性があります。さらに、破損は付着部の柔らかい側だけでなく、付着部の下の軟骨下骨、さらには付着領域から遠く離れた骨でも発生する可能性があるという強力な生体力学的および臨床的証拠があります。これらの事実は、固定プロセスにおける骨の中心的役割を強調しています。
骨は、局所的な機械的環境に応じてその構造と材料特性を再編成する独自の能力を持っています。過去数年にわたって、多くの生体内機械生物学的実験により、組織レベルの機械的力が局所的な骨形成と再吸収を促進し、皮質骨と海綿骨の形態の再構成につながることが示されています。加齢やインプラント挿入後は、骨の機械感覚機構が乱れ、機械応答性が低下し、骨量減少につながる可能性があります。あまり理解されていないものの、石灰化プロセス、血管の方向、骨細胞小管の形状と配置、さらにより小さな長さのスケールでは骨細胞小管ネットワークの組織も荷重環境を反映している可能性が示唆されています。付着部下の骨は、腱から荷重を受け取り、それを付着点から遠ざけて再分配するという重要な生体力学的役割を担っています。驚くべきことに、付着部付近の骨の特性を評価するための取り組みはほとんど行われてきませんでした。したがって、本研究の主な目的は、骨全体から細胞小管まで、複数の長さのスケールで付着部付近の骨の微細構造を調べることです。整形外科や再生医療の観点から、軟部組織付着部付近の骨の適応に関する知識を向上させるには、このような特性評価が必要です。
生物学的システムとして、アキレス腱の踵骨への付着部を検討する。この解剖学的位置では、骨は 2 種類の線維軟骨に隣接している。1 つは腱の骨への付着を可能にする付着部線維軟骨、もう 1 つは付着部より上の骨表面を覆い、関節運動（例：背屈）中に腱と骨の間の滑りを促進する骨膜線維軟骨である。ここで、骨は腱の負荷に対処するために、付着部から離れた領域には存在しない独特の特徴を示すと仮定する。具体的には、付着部線維軟骨の下の骨の微細構造と微細多孔性は、骨膜線維軟骨の下に位置する骨とは異なり、異なる機械的環境を反映していると仮定する。私たちの中核となる研究は、2 つの異なる長さスケールでのマイクロ CT と高度な画像処理を組み合わせたものである。付着部はさまざまな組織で構成される複雑な領域であるため、組織学と後方散乱電子イメージング (BEI) を使用して、組織の種類、位置、組織に関する生物学的情報でマイクロ CT 分析を補完しました。付着部に近づくと、海綿骨の空間分解分析が行われました。次に、骨と線維軟骨内のそれぞれ軟骨下チャネルと線維軟骨細胞小窩の配置を特徴付けました。最後に、非石灰化線維軟骨と石灰化線維軟骨を固定する界面の局所的な粗さを測定しました。
足関節の概略図。関節機能に必要な解剖学的詳細とさまざまな種類の線維軟骨が強調表示されています。付着部と骨膜線維軟骨 (FC) に加えて、付着部に近い腱表面は種子線維軟骨の層で覆われており、骨との接触による圧縮応力とせん断応力に対する抵抗を提供することで腱を保護していると考えられます。非石灰化線維軟骨と石灰化線維軟骨は、それぞれ明るい色と暗い色で示されています。
画像のセグメンテーションと参照座標系。
( a ) 5 μm 解像度で再構成および再配置された踵骨の 3 次元レンダリングと一般的な矢状断面。切断面 (赤い破線) は、分析領域を区切っています。
( b ) 骨の挿入部位のクローズアップ。結節分析の対象となる断面は紫色で強調表示されています。結節を矢状面で識別するための解剖学的ランドマークも、結節のセグメンテーションに使用される切断方向 (破線) とともに示されています。
( c ) 微細構造の特徴の方向を定義するために使用される方位角 (ϕ) と極角 (θ) による球面座標系の表現。
( d ) 海綿骨ネットワークの空間分解分析用に定義された関心のある立方体の図解 (分析された海綿骨コンパートメントは黄色で強調表示)。立方体は頭尾方向（オレンジ色の矢印）と背足方向（青い矢印）の 2 つの方向に沿って移動しました。スケール バー: 500 µm
骨の微細多孔性の分析のために定義された 3 つの関心領域の表現と、抽出された軟骨下チャネル ネットワークおよび線維軟骨細胞小窩の 3 次元レンダリング。灰色の網掛け部分は、各領域内の検討対象の組織体積を表します。CB踵骨、ATアキレス腱。スケール バー: 500 µm (太字)、50 µm (細字)
結節性
アキレス腱は、踵骨尾部の顕著な骨結節部に挿入され、石灰化した線維軟骨だけでなく、軟骨下骨の大部分も含み、総組織容積 T.TV は 0.57 mm 3 ± 0.05 mm 3です。結節部の多孔度はかなり低く (T.Po = 14.84% ± 2.16%、1.25 μm ボクセルサイズで測定)、板状の軟骨下皮質骨が軟骨下海綿骨よりも優勢であることを示しました。突起は踵骨の慣性軸に対して明確な全体的方向性を持っており、極角T.θが94.79°±1.5°であることから矢状面に沿ってかなりよく整列しており、腱の方向に上向きで、傾斜（方位角T.ϕ）は21.26°±3.57°でした。
骨梁形態と空間分解解析
ラットの踵骨尾部の海綿骨はかなり密度が高く（BV/TV = 62.08% ± 3.3%）、海綿骨は特に厚くはない（Tb.Th = 103.5 µm ± 4.87 µm）が、かなり密集している（Tb.Sp = 98.7 µm ± 9.15 µm）。全体的に、海綿骨ネットワークもかなり異方性がある（DA = 0.48 ± 0.05）。これらの値は、ラットの海綿骨に関する以前の研究と一致している。
骨梁微細構造の局所的空間的変動を調査し、強調表示された結節から離れた骨微細構造が腱付着に関係する可能性のある明確なパターンを示しているかどうかを評価しました。構造記述子は、頭尾方向 (CC) と背足底方向 (DP) に沿って特徴付けられました 。頭尾方向に沿った骨梁微細構造の定量的評価により、成長板に近づくと、いくつかの形態学的パラメータに有意な変動 (p < 0.05) が強調されました 。たとえば、BV/TV は 54.5% から 64.4% に約 4%/mm の傾きで増加しましたが、これは主に骨梁間隔の減少によるもので、骨梁の厚さは実質的に一定でした。成長板に近づくにつれて、骨梁ネットワークの局所的な優位な方位角（Pref.Or.ϕ）は約 - 19.5° から - 5° に変化しました。これは、骨梁が最初は結節に向かっていたが、その後回転して頭尾方向に沿って整列したことを意味します。極角 Pref.Or.θ は有意な変化を示さず、約 90° のままであり、骨梁ネットワークが矢状面と平行であることを示唆しています。骨梁方向の変化は、異方性の程度の約 20% の有意な増加を伴いました（0.44 から 0.52 へ、p < 0.05）。腱付着部と関連する結節の存在にもかかわらず、背側と足底の位置を比較した場合、骨梁パラメータのほとんどに有意差は見られませんでした。極角 (Pref.Or.θ) のみが大幅に増加し、足底骨梁が矢状面とわずかに一致するようになったことを示しています。
軟骨下チャネルネットワーク
骨の微細多孔性を調べるために導入された 3 つの領域 は同じ骨に属し、互いに隣接しているにもかかわらず、全体的な形態学的分析 で強調されているように、軟骨下チャネル ネットワークに大きな違いが見られました。骨膜線維軟骨の下の軟骨下骨 (領域 II ) は、結節 (領域 I )、皮質骨 (領域 III ) がそれに続きました。後者では、結節よりも約 42% 小さかったです (p < 0.01)。線維軟骨の下の 2 つの領域 (つまり、領域 IとII ) のチャネル密度が高いのは、皮質骨と比較してチャネルの数は少ないが大きく、離れているためです。興味深いことに、3 つの領域は異方性の程度に大きな相違があり、挿入部位 (領域 I ) は骨膜部位 (領域 II )よりも 2 倍以上高く、皮質骨内 (領域 III )よりもわずか 26% 小さいことがわかりました。
結節部では、すべての分布が明確なピークを示したが、ピークの位置と幅は異なっていた。結節部のアキレス腱付着部側に主に位置する極端に細いチャネルを考慮すると、最も頻繁な方位角方向は、それほど細くないチャネルよりも 45% 高く、付着部に向かう傾斜が増していることを示しています。さらに、ピークが狭いことからわかるように、配向の不均一性もいくらか減少しています。皮質骨領域では、太いチャネルと細いチャネルの両方で頻度分布が Ch.ϕ = 2° でピークに達し、チャネルのアスペクト比とは無関係に、優先的な縦方向配置（つまり、頭尾方向の軸に沿った配置）を示しています。骨膜線維軟骨の下の軟骨下骨では、チャネルがかなりランダムな（等方性の）配向を示しており、明らかに異なる動作が観察されました。さらに、さまざまな領域でのチャネルの長さ、直径、接続性の頻度分布は、同様のベル型のパターンを示し、結節部のチャネルは皮質領域と比較して細く、より分岐している傾向があります。分析したすべての骨に共通する結節部のもう一つの顕著な特徴は、結節部に達するとほぼ直角に小さなチャネルに分岐するかなり大きな中央チャネルの存在であった
本研究では、ラットのアキレス腱が踵骨に付着する臨床的に重要な部位の骨と石灰化線維軟骨の微細構造と微細多孔性を解析した。この領域は非常に不均一で、薄く不規則な石灰化線維軟骨層、緻密な軟骨下板、多孔質の軟骨下海綿骨、成長板の後の海綿骨区画など、さまざまな石灰化組織が特徴である。これらの領域のさまざまな機能的側面を強調するために、微細構造 または微細多孔性 のいずれかを特徴付けた。具体的には、石灰化線維軟骨や軟骨下板などの緻密な組織は微細多孔性の観点から解析し、多孔質の海綿骨領域および石灰化線維軟骨と非石灰化線維軟骨間の不規則な界面は微細構造の観点から特徴付けた。ヒトでは、この領域は使いすぎによる損傷、リウマチ性疾患、骨折に悩まされているが、腱や骨に比べて研究がはるかに少ない。臨床的関連性に加えて、踵骨は機械生物学的な問題を調査するための魅力的な特徴を示す。第一に、腱の力を足関節に伝達するという明らかな生体力学的課題を解決し、片持ち梁の場合と同様に、背側には圧縮荷重がかかり、足底側には引張荷重がかかる。軸外荷重の場合は、せん断ひずみも発生する可能性がある。このかなり単純な荷重条件のため、踵骨はさまざまな種における機械的力への材料および構造的適応を特徴付けるために使用されてきた。さらに、骨は腱からの荷重を非常に局所的な領域で受けるため、挿入部位に近い石灰化組織の局所適応戦略を調査する機会がさらに得られる。
ここで、ラットの踵骨には、腱（の一部）を固定するための結節と呼ばれる専用の突起があることを発見しました。付着部における特殊な骨領域の存在は他の骨に共通しており、関節機能に役割を果たしています。たとえば、ヒトのアキレス腱付着部では、踵骨の尾側の結節が腱のてこ腕を増加させ、生体力学的利点を提供すると考えられています。結節は、筋肉の活動の可能性のある指標でもあります。つまり、力学生物学的観点から、顕著な結節は筋肉への負荷の増加を反映している可能性があります。このため、骨の結節は、過去の集団の身体活動を知るために考古学的な文脈で調査されてきました。注目すべきことに、（マウスの）踵骨の結節に付着する腱線維は、周囲の線維とは異なる配置になっています。これは、突起が近くの骨とは異なる負荷条件を経験する可能性があることを示唆しています。荷重伝達における結節の役割をさらに調査するため、我々は踵骨の海綿骨微細構造の空間分解解析を行ったところ、頭尾方向に沿って成長板に向かって移動する際には勾配が見られるものの、背足底方向に沿って結節に近づく際には勾配が見られないことが明らかになった。海綿骨ネットワーク、特に多孔性における微細構造勾配の存在は、より柔軟な海綿骨領域から硬い皮質骨に移行する際の応力不適合性を緩和するのに役立つ可能性がある。これは長骨の既知の特徴である。しかし、腱付着部に近づいているにもかかわらず、背足底方向に沿った海綿骨構造に大きな変化が見られないことから、結節がアキレス腱から足底筋膜靭帯への「力の流れ」を促進し、海綿骨ネットワークをそのような役割からいくらか解放している可能性が示唆される。この仮定を確認するには、例えば微細構造有限要素シミュレーションに基づく追加の機械的解析を実行する必要があります。
踵骨尾部には 3 種類の線維軟骨があり、そのうち 2 つは隣接していますが、特定の生体力学的機能と発生起源を持っています。腱を骨に固定する付着部線維軟骨は、踵骨の軟骨原基に由来し、軟骨内骨化中に形成される成長板と類似しています。一方、腱の滑りを促進し、骨を保護する骨膜線維軟骨は、踵骨軟骨膜から発生します。その役割により、2 つの組織は異なる負荷条件にさらされます。付着部線維軟骨は主に腱の大きな引張力に適応し、界面で局所的な圧縮ひずみと剪断ひずみが発生します。骨膜線維軟骨は、全体的な圧縮荷重とせん断荷重に耐える必要がありますが、その大きさは付着部線維軟骨よりも小さいと考えられます。付着部と骨膜線維軟骨の石灰化領域を比較すると、表面粗さと微細構造の多孔性に大きな違いがあることがわかりました。まず、石灰化前線と停止した線維軟骨細胞によって引き起こされる、石灰化組織と非石灰化組織間の界面の粗さは、結節部で最も高くなります。機械的な観点から、ランダムな粗さまたは制御された噛み合いの形で表面パターンを導入することは、2つの材料の接合部の破壊抵抗を高めるためのよく知られた戦略です。腱と骨の付着部には、実際には 2 つの興味深い界面があります。1 つは、潮位痕または石灰化前線と呼ばれる、石灰化されていない線維軟骨と石灰化された線維軟骨の間の遷移部分、もう 1 つは、石灰化された線維軟骨を骨に接着する部分 (セメント線と呼ばれる薄い層間を持つことが多い) です。明らかに、この研究で特徴付けられた粗さは石灰化前線にありますが、どちらの界面も平坦にはほど遠いものです。石灰化された線維軟骨と骨の界面は、2 つの石灰化された組織間の深い噛み合いによって最も粗くなっていると考えられます。界面の波状性は、腱、靭帯、軟骨、半月板などの骨と軟部組織との付着部の一般的な特徴です。腱付着部では、粗さは種によってよく保存されていますが、動物のサイズや筋肉の負荷によってはあまり増加しないようです。これは、負荷が大きいほど付着面積が大きくなるため、表面特性を適応させる必要がなく、界面応力がかなり一定になるためと考えられます. それでも、付着部と骨膜部位の粗さを比較すると、前者はより高い応力に耐える必要があるためか、大きな違いが見られました。他の研究者も、脛骨に付着する ACL の 2 つの束の粗さに違いがあることを発見しており、これは部位固有の生体力学的要件を反映している可能性があります。ここで測定された粗さプロファイルは、計算モデルと組み合わせて、界面強度と骨折挙動への影響を推定できます。
2 つの石灰化した線維軟骨では、線維軟骨細胞小窩の特定の配置も確認され、明確な形状と方向を持つクラスターを形成していました。骨細胞と同様に、線維軟骨細胞は石灰化したマトリックスの厳しい環境に埋もれて生息しています。骨では、骨細胞の配置は完全にランダムではなく、コラーゲン マトリックスの 3 次元組織を反映しており、局所的な機械的環境だけでなく、老化や疾患などの全身的要因によっても影響を受けます。線維軟骨には骨と同じリモデリング能力はありませんが、同じ考慮事項が (少なくとも部分的に) 線維軟骨細胞小窩に当てはまる可能性があります。機械的負荷は付着部の成長と成熟に必要であることが示されているが、界面の治癒にも重要な役割を果たします。発達の過程では、軟骨細胞の増殖、肥大、骨形成の全過程が生物学的シグナルによって厳密に制御され、加えられる荷重によって影響を受ける。例えば、おそらく付着部発達の調節に関係する特定の細胞集団が、周産期の早い時期に線維軟骨付着部で特定されている。これらの細胞の特徴のいくつかは、筋肉の荷重によって影響を受けるようである110。機械生物学的観点からは、付着部発達と治癒は局所的な機械的刺激と密接に関係している。同様に、付着部における成熟組織の組織化は、局所的な機械的環境を反映している可能性がある。付着部領域では、歩行周期や動作によって方向が変化するものの、腱によってかなり明確で局所的な優位な荷重条件が提供され、ここが小窩が最も高い整列を示す場所であり、また、これらの大きな孔の周囲に危険な応力が集中するのを最小限に抑える可能性のある方法でもある。これは、高度に整列した軟骨下チャネルの場合にも当てはまる可能性がある。哺乳類の筋骨格系以外を見ると、軟骨の石灰化組織内の軟骨細胞も顕著な空間的組織化と配向を示しており、おそらく局所的な荷重環境の違いを反映していると思われる。線維軟骨細胞の空間的組織化は、基礎にあるコラーゲンネットワークの配置を反映している可能性がある。実際、付着部線維軟骨では、コラーゲン原線維が平行な束に集まり、細胞はそれらの束の間に挟まれた細長い柱状の構造を形成する。逆に、骨膜線維軟骨では、コラーゲンはより無秩序で絡み合ったネットワークを示し、細胞はより丸みを帯び、秩序が失われる傾向がある。
細胞小孔に加えて、結節内部のチャネルネットワークが強い異方性を持つことも示しました。チャネルは、付着領域を指す主な方向に沿ってかなりよく配向しており、対照皮質骨の位置の配置や、よりランダムに配置されている骨膜位置のチャネルの構成とは異なります。機械的負荷に対する骨の適応は、臓器および組織レベルでは広範囲に研究されていますが、軟骨下チャネルネットワークレベルでの研究は非常に少ないです。しかし、固定された骨は負荷がかかった骨よりも放射状に配向したチャネルを示すことから、荷重が一次皮質骨であってもチャネルの方向に影響を及ぼすという証拠があります。ここでは、腱の荷重がチャネルネットワークの 3 次元構成にも影響を与える可能性があることを強調しました。最後に、コラーゲン線維の配列が血管ネットワークの形成と配列を (in vitro で) 制御することが示されている。これらのメカニズムは結節でも役割を果たしている可能性があります。そうは言っても、付着部は、主に特定のさまざまな荷重環境のために、非常に不均一で解剖学的に部位に依存する組織であることが知られていることを念頭に置く必要があります。たとえば、前十字靭帯は、大腿骨付着部と脛骨付着部を比較すると、構造的および機械的な違いが見られます。
結論として、この研究は、腱付着部位の近くでは、骨と石灰化した線維軟骨が、強い異方性や噛み合いなどの特定の微細構造特性を示すことを実証しました。これは、骨腱システムの将来の組織工学複製を設計する際、または新しい再付着戦略の文脈で考慮する必要があります。たとえば、高齢または病気の動物を考慮した将来の研究では、私たちのアプローチを利用して、組織変性によって微細構造の側面がどのように影響を受けるかを調査し、付着部関連病理における骨と線維軟骨の複雑であまり理解されていない相互作用に取り組むことができます。
まとめ
付着部は、いくつかの注目すべき戦略のおかげで、腱を骨に挿入することを可能にします。この複雑で臨床的に重要な部位は、高度に不均一な機械的環境に対処するために、腱と骨の間に挟まれた線維軟骨の薄い層を特徴とすることがよくあります。この研究の主な目的は、付着部に近い石灰化線維軟骨と骨が、おそらく腱から骨への荷重伝達を可能にするために、独特の3次元微細構造的特徴を示すかどうかを調べることです。モデルとして、成体ラットのアキレス腱-踵骨系を、組織学、後方散乱電子イメージング、およびマイクロコンピューター断層撮影で調べました。付着部線維軟骨、骨膜線維軟骨、および付着部から離れた骨を含むさまざまな場所の骨と石灰化線維軟骨の微細構造多孔性を特徴付けました。腱が挿入される踵骨には、低多孔性の専用の突起があることを示しました。海綿骨ネットワークの空間分解解析から、このような突出により腱から足底靭帯への力の流れが促進され、同時に海綿骨がそのような役割から部分的に解放される可能性があることが示唆された。結節に焦点を当てると、非常に特異的な微細構造的側面が強調された。第一に、石灰化線維軟骨と非石灰化線維軟骨との界面は結節で最も粗さが高く、大きな応力がかかる領域の破損抵抗を高める可能性がある。第二に、石灰化線維軟骨内の線維軟骨細胞小窩は、骨内の骨細胞小窩と同様に、付着部で優勢な配列を示し、そこから離れたところではむしろランダムに組織化されていた。最後に、結節内の軟骨下チャネルのネットワークは、隣接領域と比較すると非常に異方性であった。付着部における軟骨下チャネルと細胞小窩のこの二重の異方性は、基礎となるコラーゲンネットワークの配列を反映している可能性がある。私たちの研究結果は、線維軟骨の微細構造が荷重環境と関連している可能性があることを示唆している。今後の研究では、老化や病気の状態における微細構造の側面を特徴付け、付着部関連病理における骨と線維軟骨のあまり理解されていない役割を解明する必要があります。
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