軟部組織修復と筋膜マトリックス

哺乳動物の傷跡は、専門の線維芽細胞が傷口に移動して細胞外マトリックスの塊を生成することによって発生します。異常な傷跡は、治らない慢性の傷や線維症を引き起こし、患者と世界の医療システムに大きな負担をかけています。米国だけでも、傷跡が悪化することに関連する費用は年間数十億ドルに上ります。
線維芽細胞の傷口内での起源とその作用メカニズムは未だ不明です。可能な源としては、乳頭（上層）および網状（下層）真皮層[7]、ペリサイト、脂肪細胞、骨髄由来の単球などが挙げられています。以前に、背中の皮膚のすべての瘢痕は、胚発生中にエングレイルド1遺伝子（En1）を発現する特定の線維芽細胞系統から派生しており、これらの細胞をEn1系統陽性線維芽細胞（EPFs）と呼んでいます。この系統は皮膚だけでなく、その下の層である筋膜にも存在します。
筋膜は、皮膚と体の硬い構造の間に摩擦のない滑らかなインターフェースを作り出すゼラチン質の粘弾性のある膜です。マウスの背中の皮膚の筋膜は、皮膚から腹肉膜（PC）筋によって分離された単一のシートとして伸びていますが、人間の背中の皮膚では中間の筋肉がなく、筋膜はいくつかの厚いシートで構成されており、これらは皮膚と連続しています。人間の筋膜層には、線維芽細胞、リンパ管、脂肪組織、神経血管シート、感覚神経が含まれています。
筋膜を傷口内の細胞、特に線維芽細胞の主要な源として特定しました。特に、傷口の仮設マトリックスが筋膜内の事前に作成されたマトリックスから起こり、可動性のあるシーラントとして傷口に引き寄せられ、血管、免疫細胞、神経を引き連れて皮膚内に向かって上昇することを発見しました。

人間の創傷治癒は通常、炎症、増殖、再構築を経て行われます。出血を止めるために、損傷直後にフィブリン凝固が形成され、サイトカインや血小板由来増殖因子 (PDGF) などの増殖因子を含むいくつかのケミカルメディエーターの放出を通じて炎症反応を引き起こします。これらの化学シグナルに応答して、好中球、単球、マクロファージがフィブリン凝固に動員され、破片や感染を除去します。炎症段階が治まった後、増殖が引き継ぎ、肉芽組織を形成して創床を埋めます。線維芽細胞は増殖に関与する主要な細胞であるため、瘢痕形成に大きく寄与します。線維芽細胞はコラーゲンを生成して、再生組織に構造的完全性を提供するとともに、創傷の端に収縮力を及ぼしてその表面積を減少させます。
成熟した皮膚瘢痕の約 50% は I 型および II 型コラーゲンであり、皮膚表面に平行に配置された線維束の形で配置されています。これは、コラーゲン線維が網目状の多方向構造で配置されている通常の皮膚とは異なります。皮膚瘢痕には、毛包や皮脂腺などの真皮付属物や、これらの構造内に通常存在する幹細胞も含まれていません。また、成熟した瘢痕の細胞外マトリックスで生成される線維芽細胞とエラスチンも少なく、これが瘢痕を硬くする原因となります。
皮膚の瘢痕形成は多岐にわたり、損傷後の瘢痕形成にはさまざまなエンドポイントが考えられます。胎児の創傷は瘢痕形成がほとんどまたはまったくなく急速に治癒しますが、「正常な」創傷は適切な量の収縮で治癒しますが、過剰な瘢痕組織の形成、収縮、皮膚の緊張がある場合にはケロイドおよび肥厚性瘢痕が形成されます。

傷跡のない創傷治癒

特殊な場合には、創傷は傷跡を残さずに治癒することができ、この現象の背後にある細胞プロセスは、創傷および瘢痕予防治療法を理解および開発するための鍵となります。
多くの人間や動物の胎児の外科的切開では、傷跡のない治癒が実証されており、得られた皮膚は傷がつく前の状態とほぼ同じであり、正常なコラーゲンと上皮が集合しています。創傷の大きさにもよりますが、人間の胎児における瘢痕化のない治癒は、妊娠 24 週までに起こります。
胎児と成人の創傷治癒の違いは主に炎症段階にあり、炎症誘発性細胞、サイトカイン、成長因子のレベルが異なります。胎児の創傷では、成人の創傷よりも好中球とマクロファージの数がはるかに少なく、インターロイキン 6 と 8 のレベルも低くなります。胎児線維芽細胞はまた、より高い速度で細胞外物質を放出し、より多くのヒアルロン酸を含みます。筋線維芽細胞も胎児の傷には存在しません。
胎児の創傷と同様に、口腔粘膜の創傷は瘢痕組織を形成せずに治癒する傾向があり、この場合、皮膚の治癒と比較して炎症段階が早くて短いことに起因すると考えられます。創傷環境における唾液の存在も、治癒の促進に寄与することが示されています。この独特の治癒形態は、口腔内に移植された皮膚組織が依然として瘢痕組織を形成するため、創傷環境というよりは天然の口腔細胞に特有のものである。

傷口の細胞は筋膜から上昇する

筋膜線維芽細胞が瘢痕の深刻さを決定することを分析しました。
線維芽細胞は主要な筋膜細胞タイプでした（71.1％）、一方で真皮は線維芽細胞の割合が有意に低かった（56.4％、Extended Data Fig. 2a、b）。
筋膜はまた、内皮細胞やリンパ管などの再生細胞のタイプが豊富であり、一方でマクロファージや神経細胞は両方のコンパートメントで類似していました。したがって、筋膜は線維芽細胞、内皮細胞、リンパ細胞の比率が高く、EPF対ENF比率が低いことが真皮との違いを際立たせています。
2光子顕微鏡観察により、筋膜EPFsが背面軸に垂直な連続するシートの単層に組み立てられていることが明らかになりました。EPFsは、筋膜から背中全体にわたり、PCを横切って地形連続を形成しています。PCが終了する領域や神経束や血管がPCを横切る場所では、明確な境界がないEPFsの連続が見られました。筋膜EPFsが傷害後に真皮層にアクセスできるかどうかを検証するために、表層切除傷を生成しました。PCの亀裂から傷口に上昇するEPFsの集合が、わずか3日後に観察されました。総合的に、我々の観察からは、筋膜EPFsが傷害時に容易に真皮層に上昇し、PC筋によって妨げられないことが示唆されています。

傷の深さに応じて瘢痕のサイズが増加する

この相関が筋膜に起因するかどうかを、傷口の深さに応じて筋膜および真皮からの線維芽細胞の寄与の程度を分析することで調査しました。これには、遺伝的な系統追跡（En1 ;R26 ）を解剖学的な運命マッピングキメラ移植と組み合わせ、表層に深い傷害を負わせました。傷害後14日目に、深い傷害の平均傷口サイズは表層傷害の1.7倍でした。深い傷害では筋膜EPFsが2倍多く、一方で真皮EPFsの数は両方の条件で一定でした。筋膜EPFsの豊富さは傷口サイズと瘢痕の深刻さと直接相関しており、真皮EPFsはそのような相関を示していませんでした。未傷害の対照では、これらのコンパートメント間でのEPFsの交差は観察されず、筋膜EPFsの流入は傷害によって引き起こされたことを示しています。

傷口内の筋膜EPFsの長期追跡では、傷害後10週間でこれらの細胞が後退することが示されました。成熟した瘢痕からのこの撤退は、細胞死率が早い時間点で低い（<5％）ことにより、アポトーシスに依存しないメカニズムを通じて行われました。次に、既知の系統マーカーの枠組みに筋膜EPFsを配置しました。これらのマーカーは、CD24、CD34、DPP4、DLK1、LY6Aなど、異なる種類の傷口線維芽細胞のポピュレーションを定義するために使用されています。これらのマーカーはすべて、筋膜EPFsで顕著であり、移植実験で傷口に入ると驚くほどダウンレギュレーションされました。フローサイトメトリーは、筋膜においてDPP4、ITGB1、LY6A、PDGFRαの発現が皮膚線維芽細胞よりも高いことを確認しました。ソートされた筋膜EPFsも低い細胞の異質性を示し、その中でLY6G PDGFRα（87.0％）およびDPP4 ITGB1（72.8％）が優勢な細胞でした。この広範なマーカーの収束は、筋膜EPFsを傷口線維芽細胞の主要な源として特定します。
次に、筋膜マトリックス自体を調査しました。2次の誘導発生（SHG）信号と走査型電子顕微鏡（SEM）により、筋膜には多量の巻きついたコラーゲン線維があり、リラックスした未成熟なマトリックスを示していました。線維の配置のフラクタル測定では、筋膜には伸縮性があり編まれた真皮マトリックスよりもより凝縮されたマトリックス構造が示されました。

筋膜マトリックスの未熟さを考慮し、それが瘢痕組織の貯蔵庫として機能するかどうかを確認しました。数日にわたる筋膜生検のライブイメージングを可能にする培養チャンバーを開発しました（Methods）。SHG信号の記録により、マトリックスは1時間あたり11.4μmの速度で方向転換していることが示されました。同様の速度を仮定すると、筋膜マトリックスは7日間で約2mm移動でき、哺乳動物の仮想マトリックス堆積のダイナミクスを考慮しています。
筋膜マトリックスが実際に傷口に向かって進むかどうかを確認するために、NHSエステルを使用してキメラ移植で筋膜マトリックスを追跡する方法を開発しました。追跡されたマトリックスの流れが筋膜から上に伸び、7 dpwから傷口を塞ぐことが観察されました。筋膜由来のマトリックスは、傷口全体の総コラーゲン含有量の74.78 ± 12.94％をカバーしていました。データは、個々の筋膜マトリックス線維が引っ張られているのではなく、柔軟なマトリックスが上向きに拡張されて傷口を形成していることを示しています。進行した傷口ステージでは、傷口の特定の領域でラベルの減少が見られ、筋膜由来のマトリックスのアクティブなリモデリングプロセスを示唆しています
次に、デルマルマトリックスが二重ラベリングによって操縦できるかどうかをテストしました。筋膜マトリックスだけが深い傷口に挿入され、その他のデルマルマトリックスは深いおよび浅い傷害の両方で不動のままでした。表層の傷害は新しいマトリックスの堆積を介して治癒しました

筋膜マトリックスが傷口に移動することを示すさらなる証拠を提供するために、我々は傷害前に筋膜マトリックスにラベルを付けました。ラベル付きマトリックスは傷口のほとんどを構成しました、傷害後最初の2週間でリモデリングを経験しました。フラクタル測定では、筋膜線維の界面が3 dpwで拡張され、平行なシートの配置から高度に多孔質なプラグに変化しました。この拡張は、厚くて複雑な成熟した瘢痕マトリックスアーキテクチャへの収縮に続きました。
驚くべきことに、追跡されたマトリックスはエスカーにも存在しました。エスカー形成の前に、活性化された血小板が筋膜線維内に浸透し、集束していました、これは凝固カスケードが筋膜マトリックスの操縦と並行して発生していることを示しています。

驚くべきことに、インプラントのある傷口は完全に開いたままであり、対照のシャムは21日以内に閉じました。二か月後、EPFsが傷口の端からメンブレンの下に伸び、瘢痕を生成しなかったことが観察されました。インプラントは一過性の炎症を引き起こし、傷口が開いたままでも解決しました。インプラントのある傷口は、白血球およびプロ・抗炎症性インターロイキンレベルが正常であり、ePTFEが免疫学的に不活性なメンブレンとして臨床で使用されていることと一致しています。凝固カスケードも真皮とメンブレンの境界で変化がなく、ePTFEメンブレンを使用した場合の瘢痕のない結果は慢性炎症や凝固不良を反映していないことを示しています。代わりに、これは筋膜線維芽細胞によって媒介される筋膜操縦の阻害を反映しています。これらの結果は、瘢痕組織の大部分が筋膜由来であり、筋膜の動きがない場合にはデルマルEPFsまたはデルマルマトリックスが傷口を修復できないことをさらに裏付けています。

次に、障壁インプラントなしで皮膚と筋膜の間の機械的な分離だけが、マトリックス操縦と瘢痕形成に影響するかどうかを調査しました。この質問に対処するために、野生型マウスで全摘出性の傷を作成し、傷口周囲のPCの下で筋膜を物理的に解放しました。解放筋膜傷からの傷口の閉鎖は著しく遅れ、傷口は初期に開いたままであり、これは膜の挿入後と同様でした。
DTによる1時間の急性暴露の6日後に培養生検での筋膜EPFsの消失を確認しました。有効なDTの量は、対照サンプルで観察されたコラーゲン線維密度の正常な増加を防ぎ、細胞密度を2.5倍低下させました。これにより筋膜EPFsがマトリックス操縦に不可欠であることが確認されました。
マトリックス操縦の前兆としての線維芽細胞増殖があるかどうかを確認するために、我々はマトリックス追跡実験での増殖率を分析しました。傷害後の最初の数日間には傷口の下で筋膜ゲルの拡大が起こり、細胞の増殖は1週間後にピークに達しました。これは、増殖がマトリックス操縦には必要ないことを示唆しています。さらに、増殖阻害剤の処理は vitro では筋膜マトリックス操縦に影響を与えませんでした。我々の結果は、筋膜マトリックスが細胞増殖に独立して迅速に深い傷口を詰まらせる拡張性のあるシーラントとして機能することを示しています。

創傷治癒の現在のモデル -

創傷治癒に関する現在の理解では、皮膚線維芽細胞 (皮膚の細胞の一種) が創傷の中に移動し、凝固カスケード (血液凝固の過程) によって提供される肉芽組織 (創傷治癒中に形成される組織の一種) に新しいマトリックス (構造骨格) を沈着させることが示唆されている。 -この新しく沈着した基質は、時間をかけて改造され、成熟した瘢痕を形成します。

研究者が提案した改訂モデル

-研究者らは、この研究での発見に基づいて、創傷治癒の改訂モデルを提案しています。 -この改訂モデルによると、深部外傷では、筋膜線維芽細胞 (筋膜に見られる特定の種類の線維芽細胞、皮膚の下の結合組織の層) が、局所的な複合マトリックス (細胞や細胞外基質などのさまざまな成分の組み合わせ) を創傷に導きます。 -このプロセスは、暫定マトリックス（創傷治癒中に形成される初期マトリックス）の形成に役立つ凝固カスケードと連携して行われます。 -筋膜線維芽細胞が新しい基質を沈着させる代わりに、筋膜線維芽細胞は、複合基質を創傷に導き、「瘢痕原基」（瘢痕形成の初期段階）の形成を誘導します。 -このモデルでは、筋膜が傷跡を形成する仮基質の外部貯蔵庫の役割を果たすため、大きく開いた傷口を効率的に密閉できます。

マトリックス運動の独特な特徴

以前の研究では、マトリックス運動は初期の発達と器官の形態形成（器官の形成と形成の過程）の間に起こることが示されています。 -しかし、この研究で観察されたマトリクスの動きの程度と大きさは、傷害や再生の場面ではこれまで観察されていませんでした。 -培養された真皮線維芽細胞は、実験室で個々のコラーゲンまたはフィブロネクチン繊維を局所的に引っ張って向きを変えることが示されています。 -これとは対照的に、研究者の発見では、損傷時の複合組織基質の非常に動的で大規模な動きが明らかになった。この動きは、筋膜の特殊な線維芽細胞によってのみ媒介される。

最近の研究結果は、筋膜が大きな瘢痕に寄与し、その遮断が慢性的な開放性傷口につながることを示しており、皮膚の不良および過剰な瘢痕のスペクトラム、例えば糖尿病および潰瘍性傷口、肥厚性および特にケロイド瘢痕などはすべて筋膜に帰属する可能性があります。実際、皮下筋膜は種、性別、年齢、解剖学的な皮膚の位置によって幅広く異なります。一部の哺乳動物では、表層筋膜は緩んでいますが、人間、犬、馬などの瘢痕しやすい種では、表層筋膜が厚くなります。人間の筋膜は体の異なる領域で厚みが異なります。例えば、下胸部、背部、太もも、腕などは、厚く、多層の膜状のシートを持っており、これらの解剖学的な部位が肥厚性およびケロイド瘢痕を形成しやすいです。筋膜層の形態解剖学を理解することは、瘢痕のフェノタイプや重症度、肥厚性およびケロイド瘢痕の発生を説明するのに役立つかもしれません。