20240321 : 軟骨修復・脂肪組織・間葉系細胞

関節軟骨は無血管、無神経、リンパ性であり、固有の修復または再生の能力が限られています。過去数十年にわたって、科学者たちは、局所的な軟骨欠損の治療のためのいくつかの治療選択肢を提案してきました。より小さな軟骨病変の場合、これらの治療法には、デブリードマン、微小骨折、擦過傷、ドリリングおよびナノ骨折による骨髄刺激、高度な足場増強骨髄刺激技術 (AMIC、BST-Cargel、GelrinC))、および骨軟骨自家移植片移植 (OATS) / モザイク形成術が含まれます。より大きな病変に対しては、骨軟骨同種移植および自家軟骨細胞移植（ACI）が導入されており、非常に効果的であるようです。あらゆる軟骨修復処置の目標は、正常な硝子軟骨の組織学的、生化学的、生体力学的特性を一致させることによって関節表面を修復し、患者の症状と機能を改善し、局所的な軟骨損傷の進行を予防または少なくとも遅らせて終結に至ることです。
近年、細胞、間葉系幹細胞（MSC）および成長因子を用いたオルソバイオロジー治療で関節軟骨を修復または再生する試みが、筋肉、腱、骨、特に軟骨に関するさまざまな病状に対する新たな主要な興味深い治療選択肢となっています。MSC は確かに最も研究され、使用されている細胞タイプであり、考えられるほとんどの適用プロトコルで重要な役割を果たしています。最近の発見では、間葉系幹細胞が血管の近くに位置する「周皮細胞」と呼ばれる血管周囲細胞に由来することが証明されています。周皮細胞は、いわゆる「血管周囲ニッチ」に属し、そこでは静止状態で生息しています。通常、傷害の際に起こるように、血管が損傷すると、周皮細胞が放出され、静止期から活性化期に移行し、最終的にMSC表現型を獲得します。活性化されたMSCは、過剰な免疫反応に対抗するために生理活性分子のカスケードを放出し始め 、再生微小環境を確立する栄養因子に対抗して、血管新生を促進し、組織特異的前駆細胞の増殖を刺激します。
MSCの活性に関する最新の解釈は、これらの細胞が生体内で非常に効果的な機能を示し、その治療作用が主にこれらの細胞が実行できる実証済みの重要な傍分泌作用と栄養作用によるものであるという事実を強調している。このため、間葉系幹細胞は、周囲の微小環境に広範囲の成長因子やサイトカインを放出する能力が、局所的に投与される非常に強力な薬剤の効果を実際に模倣するため、最近「ドラッグストア」として定義されています。

オルソバイオロジクスには、骨髄吸引液濃縮物 (BMAC)、脂肪組織由来間質細胞 (ADSC)、多血小板血漿 (PRP)、および微粉化された同種異系軟骨が含まれます。オルソバイオロジクスの使用と並行して、最近導入され広範に研究されている別の有望な戦略は、軟骨細胞における分化を促進し、硝子軟骨を形成するために、足場のみを使用するか、MSCを播種した足場を使用することです。実際、ここ数年間科学者たちが足場ベースの ACI の改善に焦点を当ててきたとしたら、さまざまな MSC を使用して損傷した関節軟骨を再生するためのさまざまな解決策を探すことへの関心が絶えず高まっていることを確認しています。
MSC の臨床応用は、培養条件下でプラスチック付着性であることなど 、国際細胞療法学会が定めた最低限の基準を満たす必要があります。分化クラスター105（CD105）、CD73、およびCD90を発現し、CD45、CD34、CD14またはCD11b、CD79またはCD19、およびヒト白血球抗原-DRアイソタイプ（HLA-DR）表面分子の発現を欠いている； 骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨芽細胞への三系統分化を有する。
損傷した組織を再構築するための生物学的療法を提供する現代の生物医学技術の革新的な分野であるオルソバイオロジーでは、利用される間葉系幹細胞はほとんどの場合骨髄または脂肪組織から得られます。
過去 10 年間で、脂肪組織は形成外科や再生医療において非常に興味深い成体幹細胞の供給源となってきました。より最近では、一貫した血管構造を備えた脂肪組織が、患者への侵襲性が低く、年齢による制限が少なく、容易に大量に収集できる、これらの細胞の賢い供給源として徐々に認識されてきました。脂肪組織移植片および ADSC は、上腕、大腿内側、臀部、転子部、表面深腹部デポおよび膝蓋下脂肪体から分離できます。
皮下脂肪組織は、脂肪吸引によって容易にアクセスでき、多くの患者に比較的豊富に存在し、低侵襲手順で採取でき、自家または同種移植のいずれかに安全かつ効果的に移植できるため、今日、細胞単離の第一選択となっています。このタイプの組織は、即時投与のための間質血管画分 (SVF) 細胞の豊富な供給源を提供します。
SVF 画分には、前脂肪細胞、間葉系 (MSC)、内皮前駆細胞 (EPC)、線維芽細胞、周皮細胞、血管平滑筋細胞など、複数の非培養細胞タイプが含まれています。不均一な細胞の再現可能で一貫した組成を保証する SVF 単離用に市販されているさまざまな単離システムがあります。処理および投与されると、脂肪由来 SVF 細胞はさまざまな組織タイプに分化し、血管新生をサポートし、細胞を置換し、損傷した組織を修復します。

各脂肪細胞は毛細管系に完全に囲まれており、これにより、脂肪組織中の MSC の量が骨髄の MSC の量よりも 5 倍多いことが説明されています。間質の同定と、幹細胞/間質細胞が多く存在するこの間質血管画分を治療用途に使用できる可能性により、前述したように、脂肪組織が臨床応用に適した供給源となった。
実際、脂肪組織には、BM-MSC の 500 倍もの多数の幹細胞 (ADSC) が含まれています。ADSCは、単独で、または生体材料、成長因子、またはさまざまな種類の足場と組み合わせて、自己再生して脂肪細胞、軟骨細胞、筋細胞、骨芽細胞に分化する可能性があり、再建または組織工学医学において重要な役割を果たすことができる成人間葉系幹細胞の集団を代表します。 。発表された研究によると、足場増強による軟骨修復は、微小骨折単独と比較して、臨床転帰、放射線学的充填、および組織学的修復を改善しました。特に、すでに 2017 年に、Pot ら は、 細胞および細胞足場に関する系統的レビューとメタアナリシスにおいて、ADSC を播種した足場を用いた軟骨再生は、無細胞足場と比較して再生を改善すると結論付けています。
コラーゲンは軟骨 ECM の主要成分の 1 つであり、コラーゲンベースの足場は MSC を保持し、高い生体適合性と軟骨形成環境を提供し、機能的な軟骨再生をサポートすることが証明されています。特に、コラーゲン材料は細胞侵入に適切な環境を提供し、材料の細孔を通した細胞定着を促進し、最終的には軟骨細胞の分化を促進することが証明されています。したがって、コラーゲン足場に存在するMSCは、軟骨形成培養条件下で軟骨細胞の表現型を維持し、新しいコラーゲンを産生することができます。

その後、ADSC による軟骨欠損修復が始まり、2001 年と 2002 年に Zuk ら は 処理された吸引脂肪細胞 (PLA) を同定することができ、それらが MSC と同様に軟骨形成系統に分化する能力を確認した。実際、PLA細胞が独特のCDマーカーセットを発現でき、軟骨基質を合成し、軟骨形成系統遺伝子を発現できることが証明されている。
最小限の操作で細胞を分離するには、遠心分離、圧力、濾過、微小断片化などの機械的ステップを利用して、脂肪組織から細胞を分離します。これらの最小限の操作技術に基づくさまざまな閉鎖システムは、MSC の使用に関する厳しい規制を満たす臨床現場で患者自身の脂肪組織を採取、濃縮、移植するために開発されています。

最近では、OA 治療としての股関節および膝への関節内注射およびオルソバイオロジック複合足場再建手術の両方として ADSC を使用して得られた良好な結果が文献によって確認されています。
いわゆる LIPO-AMIC 手順 を個人的に開発しました。この手順では、同じ操作手順で、軟骨欠損に対して慎重なデブリドマン、正確な微小骨折、そして最後にコラーゲン膜被覆関節形成術が行われ、特に研究された 3Dmatrix 二層足場が注意深く使用されます。治療する欠損と同じサイズと形状に切断し、ADSC と間質血管画分を含む微小断片化脂肪組織移植片に 10 ～ 15 分間浸します。脂肪組織移植片を取得するには、腹部脂肪組織リザーバーから得られた少量の脂肪吸引液（約 50 ～ 80 ml）が、吸引とその後の処理のために市販されている専用の使い捨てキットを介して閉鎖システムで処理されます。脂肪組織移植（濾過および微小断片化）は、サンプルの機械的破壊に基づいており、油および破片を廃棄し、細胞のニッチおよびセクレトームを維持し、すぐに使用できるシリンジに移植片を送り込むことができます。LIPO-AMIC 技術は、国際軟骨再生・関節保存協会 (ICRS) の分類に従って、サイズが 1 cm2 (平均病変サイズ、3、 1 cm²）、大腿骨顆の内側または外側、または膝蓋骨または大腿滑車の後方表面に影響を及ぼします。

手術技術の詳細

患者は、このような治療に適した欠損の存在を関節鏡視下で確認した後、微小骨折、脂肪組織移植片、ADSC、および全層欠損のコラーゲン膜被覆を使用したワンステップの生物学的リサーフェシング処置を受けます。すべての外科的処置は、局所麻酔下で、滅菌手術野の日常的な準備の後、単一の外科的ステップで実行されます。

手順の第 1 段階では、前内側および前外側の標準ポータルを介して通常の診断用関節鏡検査を実行し、病変の位置とサイズに関する磁気共鳴画像所見を確認します。この段階では、膝蓋上嚢、内側溝と外側溝、膝蓋大腿関節、顆間切痕と中央ピボット、内側区画と外側区画を含む膝のすべての区画が検査され、特に膝蓋骨の検査と評価が行われます。大腿顆の軟骨の内層と内側半月板と外側半月板の後角。診断段階が完了すると、軟骨または骨軟骨欠損の部位、範囲および深さ、関連する半月板または滑膜の病変が標準的な関節鏡手術中に治療されることも確認されます。

続いて、腹部局所麻酔下、クライン液を浸潤させた後、市販の吸引・吸引用Lipogems®専用使い捨てキットを使用し、臍周囲脂肪組織から50～80mlの脂肪吸引液を簡便な方法で抽出します。その後の処理（濾過および微小断片化）および脂肪組織の移植。その使用については、製造業者が提供する指示に従います。このデバイスは、脂肪組織クラスターのサイズを段階的に縮小し、同時に血液残留物や炎症誘発性の油性物質を除去し、プロセス全体を生理的溶液内で実行することにより、間葉幹を損傷するリスクを最小限に抑えます。
脂肪移植片の採取プロセスが完了すると、次の手術ステップは、局所的な軟骨または骨軟骨欠損の修復です。全層の軟骨欠損が特定され、欠損の徹底的かつ広範なデブリードマンが完了しました。この段階では、周囲の健康な軟骨組織に到達するまで損傷した軟骨や不安定な軟骨をすべて除去し、しっかりとした正味のマージンを作成することに重点を置くことが非常に重要です。この処置では、一般に、直線または曲線のキュレット、特別に設計されたコンドロトーム、および関節鏡視下全半径カッターを使用して、欠損の端で変性した軟骨または部分的にしか結合していない軟骨を慎重に除去します。常にキュレットを使用して石灰化した軟骨層を除去するように注意し、軟骨下板を侵害しないように細心の注意を払うことが重要です。

デブリードマンと軟骨欠損の慎重なグルーミングが完了したら、欠損を測定し、全層軟骨欠損の修復に使用するコラーゲン膜キットに付属の滅菌アルミニウムテンプレートを使用して正確な形状を作成します 。したがって、欠損の正確な跡が切り取られます。欠損に適用するために間違った形状のメンブレンを入手することを避けるために、常にテンプレートの側面、次に欠陥に接触して配置されるメンブレンの側面を確認することを忘れないでください。次に、この同じテンプレートを使用して、生物学的リサーフェシングに使用される足場を準備します。

切断した膜を脂肪組織移植片に浸しながら、さまざまな角度のドリルを使用して、病変の軟骨下層で軟骨下骨に到達するまで微小破壊を行います。微小破壊は、欠損の周囲から開始して欠陥自体の中心に向かって同心円状に進み、3〜4 mmの距離を保ちます。ミシン目と他のミシン目の間を移動し、ミシン目が他のものに集中しないように細心の注意を払います。適切な深さ（通常 2 ～ 4 mm）に達すると、血液または脂肪の液滴の漏れが見られ、この技術が適切に実行されたことが確認されます。微小破壊を完了し、欠損全体に侵入していることを確認した後、生成された破片をすべて慎重に除去することが重要です。
微小破壊が完了すると、Chondro-Gide® コラーゲン二重層膜が、事前に準備された形状と正確に同じサイズおよび形状になるように切断されます。切断後、脂肪組織移植片の含浸による膜の体積の増加（10%～15%）を考慮して、サイズが完璧であることを確認するために乾燥膜を欠損部に置きます。 この足場は二重層膜であり、滑らかな面は防水性があり細胞を保持することができ、もう一方の面はしわがあり多孔質です。
次のステップは欠損の修復です。この段階にはいくつかの連続したステップが含まれます。最初のステップは欠損床への ADSC の注入です。次に、濃縮された膜が関節に挿入され、欠損を直接かつ正確に覆います。したがって、細胞の捕捉を正しく促進するために、足場の細胞接着性多孔質層を欠損床に向かって確実に適用することが重要です。
脂肪組織から採取した細胞の残りの部分を病変部位に浸潤させ、膜と脂肪移植片および間葉系幹細胞をフィブリン接着剤を使用して周囲の軟骨に封入して固定します。
コラーゲン膜は、その多孔質の性質により細胞が細胞内に巣を作り、成長と分化に最適な環境を見つけることができるため、理想的な足場を構成します。このようにして、膜は二重の作用を発揮します。髄血から間葉系細​​胞を保持できる障壁であることに加えて、間葉系脂肪細胞が豊富で活性化され、軟骨細胞の発生と分化のプロセスを促進する足場を構成します。 
足場が完全に接着した後、関節を数回完全に曲げたり伸ばしたりし、適用された膜の安定性をチェックします。外科的処置が完了すると、圧迫包帯が適用されます。

術後プロトコル

術後のプロトコールでは、松葉杖の補助による進行性の即時部分荷重が予定されます。術後最初の日、患者はすぐに関節 ROM の回復を開始します。各患者のコンプライアンス特性を注意深く評価することにより、受動的関節可動化 (CPM) を使用するか否かが決まります。CPM は、関節に栄養を与え、関節内癒着形成を軽減することで軟骨の治癒を促進します。可動域と体重負荷プロトコルは、大腿顆または膝蓋大腿関節の欠損位置に応じて異なります。膝蓋大腿関節欠損の場合は、松葉杖による漸進的な体重負荷が直ちに許可され、最初の 3 週間は ROM が 0 度から 60 度の屈曲に制限されます。大腿骨顆欠損の場合、術後最初の 4 週間は体重負荷が制限され、通常 6 週間までに制限のない完全な体重負荷に達します。正常な歩行パターンを早期に取り戻すことが非常に重要です。筋肉の強化が完了し、関節の動きが完全に回復すると、理学療法士とトレーナーの厳格な指導の下、特定のスポーツ活動の練習が開始されます。

まとめ

LIPO-AMIC 技術で治療された軟骨損傷患者はすべて前向きに追跡調査され、臨床的評価と磁気共鳴画像法の両方で 6 か月と 12 か月で段階的に追跡調査され、2 か月と 5 か月で追跡評価が可能です。2年後と5年後の臨床およびMRI追跡調査により、欠損を完全に埋めることができる軟骨組織の修復と再成長という良好な結果が確認されました。MR画像の評価では、追跡対照で軟骨欠損の面積が大幅に減少し、肥大や骨浮腫の兆候が見られず、大部分の症例で欠損が完全に充填されていることが徐々に示されました。
臨床研究と並行して、関節軟骨欠損の安全かつ効果的な修復を保証する能力を確認するために、生物学的製剤、完全性および生存能力を評価するために採取された脂肪組織脂肪吸引サンプルから単離された新鮮なADSCの分析も実施しました。未処理の吸引脂肪サンプルからの SVF 細胞成分は、細胞組成と生存率の保存を評価するために、微小断片化によって処理された吸引脂肪サンプル由来の対応する細胞と比較されています。出力は、マルチカラー フローサイトメトリー (FC) 分析を使用して特性評価されました。我々は、脂肪吸引未処理サンプルと比較して、微小断片化システムによって処理されたサンプルにおける内皮細胞および周皮細胞のパーセンテージが一貫して増加していることを発見し、これにより、機械的吸引手順が大きな細胞集団の不均一性を維持し、ニッチ組織構造を保存する可能性があることが確認された。ここ数年、文献では、ADSC調製物の最適化、良好な臨床結果、およびさまざまな足場を使用したADSCの注入または移植手順の安全性が確認された、いくつかの第I相、第II相、そして現在では第III相ADSC試験が発表されています。シングルステップの LIPO-AMIC 手術によって得られた ADSC 移植は、2 年および 5 年の中間追跡調査において、症状緩和の許容可能かつより、持続的な持続期間という有望な結果をもたらしており、したがって、より短期間で標準的な自己軟骨細胞移植に代わる可能性があることを示しています。
足場増強技術による軟骨再生は、今日、軟骨修復の結果を改善し、関節保存の必要性を促進するための重要な可能性を秘めた現実となっており、将来的には、ますます低侵襲性の関節鏡視下移植技術を改良し、新しい次世代生物製剤の添加により、組織修復の質が向上し、修復組織の統合と成熟プロセスが速くなる可能性があります。

したがって、整形外科医は、関節の劣化やOAの発症と闘い、患者が日常生活やスポーツ活動を継続できるように患者が脚を立てた状態に保ち、関節全体の処置の範囲を広げるために、軟骨修復を信じ、経験を積まなければなりません