高脂肪食は腸内細菌由来の活性酸素を介し、腸のバリア機能を低下させる

2023年5月19日 15:21

高脂肪食は腸内細菌叢由来の活性酸素を介し腸のバリア機能を低下させる

https://www.sciengine.com/SCLS/doi/10.1007/s11427-022-2283-4;JSESSIONID=7536811d-2b15-4692-b3f6-2346dadb6fee

Nianyi Zeng 1,†, Fan Wu 1,†, Junqi Lu 2, Xiang Li 1, Shaomei Lin 1, Lang Zhou 1, Zhongwei Wang 1, Guangyan Wu 1, Qingfa Huang 1, Daowen Zheng 1、 Jie Gao 1, Shan Wu 2, Xiaojiao Chen 1, Muxuan Chen 1, Fanguo Meng 3, Haitao Shang 4, Yan He 1, Peng Chen 5, Hong Wei 4,, Zhuang Li 1,, Hongwei Zhou 1,2,*.
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受理された： 2022年11月25日受理された： 2023年2月19日発行 2023年5月11日発行
https://doi.org/10.1007/s11427-022-2283-4
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要旨
腸内バリアの破壊は、腸内細菌叢の異常と高脂肪食（HFD）に関連する代謝異常の橋渡しとなる重要なイベントである。しかし、その根本的なメカニズムは未だ解明されていない。本研究では、高脂肪食（HFD）投与マウスと通常食（ND）投与マウスを比較し、HFDが腸内細菌叢の組成を瞬時に変化させ、その後、腸管バリアの完全性を損なうことを明らかにした。メタゲノムシークエンスにより、HFDが酸化還元反応に関連する腸内細菌機能をアップレギュレートすることが明らかになりました。これは、in vitroでの糞便微生物叢培養および内腔での活性酸素種（ROS）レベルの増加により確認され、in vivoでの蛍光イメージングにより検出されました。HFDによって誘導されたこの微生物の活性酸素産生能力は、無菌（GF）マウスへの糞便微生物叢移植（FMT）により、腸管バリアのタイトジャンクションをダウンレギュレーションして移行することができます。同様に、GFマウスに単コロニー化したEnterococcus株は、他の低ROS産生Enterococcus株と比較して、ROS産生に優れ、腸バリアを損傷し、ミトコンドリア機能不全と腸管上皮細胞のアポトーシスを誘導し、脂肪肝を悪化させることがわかった。組換え高安定型スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の経口投与は、HFDに対して腸内活性酸素を有意に低減し、腸管バリアーを保護し、脂肪肝を改善することがわかった。結論として、本研究は、腸内細菌に由来する細胞外活性酸素が、HFDによる腸管バリア破壊に極めて重要な役割を果たし、HFDに関連する代謝疾患の治療ターゲットとなる可能性があることを示唆しています。

はじめに
腸内細菌は宿主と共生しており、様々な腸疾患や全身疾患との関連性が指摘されています。研究が相関関係から因果関係へと進むにつれ、腸内細菌叢と宿主の相互作用において、腸管バリアが重要な役割を果たすことを示唆する証拠が蓄積されている。腸関門は、粘液層、腸上皮細胞、タイトジャンクション、免疫細胞、腸内細菌叢からなる、個人における最も重要なバリアであり（Sharkey et al., 2018）、炭水化物や脂肪などの外部栄養素にさらされ影響を受けやすい。そのため、環境要因の乱れは腸管バリアに直接影響を与え、その後、病的な宿主腸（Martel et al.、2022）、不健康な状態をもたらす可能性があります。例えば、腸バリアは、高脂肪食（HFD）関連の消化管機能障害の潜在的なメディエーターである（Rohr et al.）
食餌性脂肪は、さまざまなアプローチで腸のバリアに影響を与えることが報告されている（Rohr et al.、2019年）。例えば、脂肪は上皮タイトジャンクションの分布を乱し（Caniら、2008）、胆汁酸を産生して粘膜バリアを損傷し（Gasalyら、2021）、腸の炎症を増加させ（Al-Sadiら、2008；Luckら、2015；Zouら、2018）、腸の粘液特性を変え、腸微生物叢異常症を誘導する。特に、HFD処理マウスの糞便微生物叢移植（FMT）研究では、レシピエントマウスの上皮バリア機能の損傷に起因する代謝症候群が示されました（Mouries et al.、2019）。具体的には、腸内微生物のLactobacillus属、Bifidobacterium属、Bacteroidetes属、Clostridiales属、Akkermansia muciniphiliaは腸のバリアを保護し、Oscillibacter属やDesulfovibrio属はそれを損傷することがわかっている（Bisanz et al., 2019; Tomas et al., 2016）. これらの知見を総合すると、HFDで損傷した腸のバリアを媒介する腸内細菌叢の重要な役割が示されているが、内在するメカニズムはまだ不明である。
HFDは腸内酸化還元の不均衡を促進することが示されており、一般に過剰な局所酸化ストレスをもたらし、上皮タイトジャンクションの損傷をもたらす（Cremonini et al., 2019）。腸の酸化ストレスは、主に免疫細胞と上皮細胞によって生成される活性酸素種（ROS）によって引き起こされることが認められている（Rohr et al.、2019）。驚くべきことに、いくつかの特定の海洋微生物も、最近、ROSを生成することが実証されている（Diaz et al., 2013; Korshunov and Imlay, 2006）。したがって、この証拠から、腸内細菌叢もROSを産生する能力を持ち、HFDで損傷した腸のバリアを媒介する役割を担っていると推測されます。ここでは、HFDに応答する腸内細菌叢の活性酸素産生能力を特徴付け、in vitroおよびin vivoで腸のバリアに対するその影響を評価した。
結果
HFDは腸内細菌叢の組成を瞬時に変化させ、腸のバリアにダメージを与える
腸内細菌叢組成の動的変化に対するHFDと普通食（ND）の差異効果を比較するため、C57B6/JマウスにHFDまたはNDを133日間与え、0、1、3、14、49、56、84、105、119、133日目に16S配列決定用の糞便サンプルを収集しました。腸内細菌叢のBray-Curtis距離を用いた主座標分析（PCoA）（図1A）およびリッジプロット分析（図1B）により、HFDはNDと比較して1日目から14日まで急速に腸内細菌叢組成が変化し、その後は徐々に安定化した。一方、HFD投与マウスとND投与マウスに3、28、42、56、70日目にフルオレセインイソチオシアネート-デキストラン-4 kD（FD-4）を経口投与して、腸管透過性を評価しました。血漿中の蛍光を測定したところ、56日目と70日目にFITC蛍光シグナルが有意に増加し（図1C）、56日目に回腸遠位部のタイトジャンクションタンパク質（図1DとFのOCLDN、図1EとGのCLDN4）の発現低下が伴い、まとめて腸のバリアが損傷していると考えられた。そこで、56日目の腸内細菌叢組成をさらに解析したところ、HFDはNDと比較して、Chao1の指数、観察された運用分類単位（OTU）、PD_whole_tree、Shannon指数で示すα多様性を著しく低下させた（サポート情報内の図S1A-D）。さらに、HFDは腸内細菌叢の組成（β-diversity; Supporting Informationの図S1E-H）を変化させ、特にBacteroides、Oscillobacteria、Desulfovibrio、およびProteusを濃縮した（Supporting Informationの図S1I）。また、IL-1βやTNF-αなどの炎症性サイトカインがより多く検出され（Supporting Informationの図S1JとK）、肝臓に脂肪が蓄積していた（Supporting Informationの図S1LとM）。これらの結果から、HFDによる腸内細菌叢の変化により、腸管バリアが損なわれ、肝臓に脂肪が蓄積することが示唆されました。
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図1
HFDは腸内細菌叢の組成を瞬時に変化させ、腸のバリアにダメージを与える。A, 0、1、3、14、49、56、84、105、119、133日目にHFDを与えたマウス（n=12）が形作った腸内組成のPCoA。B、リッジプロット分析により、各時点でND処理と比較してHFD形状の腸内細菌叢組成の変化が明らかになった（n=12マウス/グループ）。C, FD-4を用いた腸管バリア透過性評価。DおよびE、56日間HFDを与えたマウスまたはNDを与えたマウスの遠位回腸タイトジャンクションタンパク質オクルディン（D）およびクラウディン4（E）を対象とした免疫蛍光染色の代表画像（n＝8マウス）。FおよびG、蛍光の任意単位とOccludin（F）およびClaudin 4（G）の相対mRNA発現量の統計解析、非対称t検定。 ns, nonsignificant; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001; ****, P<0.0001.
HFDはin vitroおよびin vivoで腸内細菌叢由来の活性酸素を促進する
次に、HFDに関連する腸内細菌叢が腸のバリアにどのような影響を与えるのか、その可能性を解明するために、8週間のHFDまたはND投与を受けたマウスの糞便微生物叢に対してメタゲノムシークエンシングを行いました。Clusters of Orthologous Group (COGs)により、グループ間で細胞プロセスやシグナル伝達が異なることが明らかになりました（Supporting Informationの図S2）。特に、HFDを与えたマウスの糞便では、NDを与えたマウスと比較して、エネルギー生産と変換に関連する酸化還元酵素および酸化還元反応がかなり増加しており（図2A）、酸化還元反応における微生物の機能が示唆された。そこで、これらの腸内微生物の活性酸素生成能力をin vitroの細菌培養により測定した。その結果、NDよりもHFDに関連する腸内微生物が産生するROSの蓄積量が多いことがわかった（図2B-D）。これと一致して、NDを与えられたマウスと比較して、HFDを与えられたマウスでは、in vivo蛍光イメージングを使用して内腔で（図2EおよびF）、およびジヒドロエチジウム（DHE）染色を使用して遠位回腸で（図2GおよびH）より高レベルのROSも検出された。これらの知見を総合すると、HFDは腸内細菌叢由来の活性酸素の産生を促進することが示唆される。
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図2
HFDはin vitroおよびin vivoで腸内細菌叢由来のROSを促進する。A, 56日間HFDを与えたマウスまたはNDを与えたマウス（n=5マウス/グループ）の糞便メタゲノム配列のエネルギー生産および変換関連クラスターは、2群間の比率の差を示した（WilcoxonランクSUM検定）。BおよびC、細胞外活性酸素を産生するND-（B）またはHFD-（C）形状の腸内細菌叢のin vitro評価の代表曲線、活性酸素を除去するSODを使用して検証（実験の5独立複製、それぞれの実験について、各グループから12のマウスの便サンプルを収集、均質化して5技術複製で試験）、不対t-検定。D、ND型またはHFD型微生物叢がin vitroで産生した活性酸素の比較、△Aは同一グループにおけるSODの有無の差を表し、不対t-testとした。E, 56日目の腸管内腔における活性酸素のin vivoイメージング（n=12マウス/グループ）。F, in vivoイメージングの平均輝度の統計解析、不対t-test.F, In vivoイメージングの平均輝度の統計解析、不対t-test. G, DHE染色により、56日目の回腸遠位部酸化ストレスを明らかにした（n=8 mouse/group）。H,DHE染色の相対的な任意単位（AU）の統計解析、アンペアt-test. ns, nonsignificant; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001; ****, P<0.0001.
HFD関連腸内細菌叢の移植は、GFマウスにおいて腸の酸化ストレスを促進し、腸のバリア機能を損傷させる
HFD関連腸内細菌叢の活性酸素産生能がFMTによって移行できるかどうかをさらに調べるため、HFDおよびND処理したドナーマウスの糞便微生物叢を無菌（GF）レシピエントマウスに移植し、その後1週間のND飼育を行った（図3A）。HFD関連腸内細菌叢をコロニー形成したGFマウス（GF-HFD-FMT）は、ND関連腸内細菌叢を投与したマウス（GF-ND-FMT）と比較して内腔の酸化ストレスが上昇したが、飲料水中の抗酸化物質（スーパーオキシドディスムターゼ（SOD））投与により回復した（図3BおよびC）。GF-HFD-FMTとGF-ND-FMTの酸化ストレスの差は回腸では観察されなかったが（図3DおよびE）、トランスクリプトームシーケンスにより、酸化還元酵素活性関連遺伝子の発現がすでに変化していることがわかった（援用情報の図S3A-E）。同様に、遺伝子セット濃縮解析（GSEA）でも、ND-FMTを受けたマウスと比較して、HFD-FMTを受けたマウスでは酸化還元酵素活性経路が濃縮されていた（参考情報の図S3Fおよび図G）。これらの結果は、HFD関連腸内細菌叢の移植が腸の酸化ストレスを促進することを示す。さらに、HFD-FMTは回腸においてタイトジャンクション関連遺伝子、すなわちCLDN3（図3F）およびCLDN4（図3G）の発現を著しく低下させ、これはSOD投与により回復した。これは、HFD-FMTによって誘発された腸の酸化ストレスの結果、腸バリアのタイトジャンクションが損傷していることを示すものである。
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図3
HFD関連腸内細菌叢の移植は、GFマウスにおいて腸の酸化ストレスを促進し、腸のバリアを損傷させる。A、GFマウスへの糞便微生物叢の移植の実験デザイン。B, ND型またはHFD型微生物叢をコロニー形成したGFマウスの管腔酸化ストレスのin vivo評価。C, in vivo撮影の平均輝度の統計解析、不対t-test。D、GFマウスの遠位回腸組織のDHE染色の代表画像。E, DHE染色の相対的な任意単位(AU)の統計解析、不対t-test. FおよびG、GFマウスの遠位回腸組織のRNA配列決定に基づくタイトジャンクションタンパク質Claudin3およびClaudin4関連遺伝子発現、非対称t-テスト。 ns 無意味； *，P<0.05； **，P<0.01.
活性酸素を産生するE. faecalisは腸管バリアを損傷し、GFマウスの脂肪肝を増悪させる
活性酸素産生能が菌株によって異なるかどうかを調べるため、ヒトの糞便から分離された18菌株の活性酸素産生能をin vitro培養によって解析した（図4A）。興味深いことに、Enterococcus faecalisとEnterococcus aviumのように同じ門に分類される菌株もあったが、活性酸素の生成能力は著しく異なっていた（図4AおよびB）。そこで、これら2つの腸球菌が、HFDを摂取したマウスにおいて、腸管バリアを損傷し、脂肪肝を悪化させる作用に差があるのかどうかを評価した。GFマウスのモノコロニー化を3回行い、その後8週間のHFD処理を行った（図4C）。その結果、活性酸素産生能の低いE. aviumと比較して、活性酸素産生能に優れ、糞便アルブミンの増加（図4D）、クローディン4のmRNAおよびタンパク質レベルの低下（図4EおよびF）、肝臓への脂肪蓄積をもたらすE. faecalisはNAFLD Activity Score（NAS）の上昇（図4GおよびH）をもたらすことがわかりました。これらのE. faecalisの腸管バリアおよび肝臓への影響は、SODの投与により回復したことから、E. faecalisは、活性酸素の生成により腸管酸化ストレスを誘導することで、腸管バリアを損傷し、脂肪肝を悪化させると考えられる。このことは、回腸のRNA-sequencing（RNA-seq）解析により確認され、Gene Ontology（GO）の濃縮（参考資料の図S4A）、GSEA（参考資料の図S4B）、遺伝子濃縮解析（参考資料の図S4C）によりE. faecalisに富む酸化還元酵素活性と酸化還元プロセスを強調した。
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図4
活性酸素を産生するE. faecalisは、GFマウスの腸管バリアを損傷し、脂肪肝を悪化させる。A, ヒトの糞便サンプルから分離された18の細菌株のクラドグラムで、ROS産生能についてテストした。紫色の濃淡は、SODを添加または無添加で培養して算出した∆Aに関する活性酸素産生能を示す。オレンジは正の活性酸素産生を、青は負の活性酸素産生を示す。B, Enterococcus aviumとEnterococcus faecalisの活性酸素産生能の代表曲線。非対称t-test。C,GFマウスへの細菌単独培養の実験デザイン。D, 異なる腸球菌でコロニー形成されたGFマウスの糞便アルブミン、不対t-test. E, GFマウスの回腸組織におけるClaudin4 mRNA相対発現レベル、不対t-test. F, クローディン4タンパク質発現のウェスタンブロッティング解析。G、GFマウスの肝組織のHEおよびOil Red O染色。H, HEおよびOil Red O染色に基づくNASスコアリング、Wilcoxon rank-sum検定. *, p<0.05; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.
活性酸素を産生するE. faecalisと細胞外活性酸素の両方が、ミトコンドリアの機能不全を誘導することで上皮のアポトーシスを促進する
腸管バリア破壊に対するE. faecalisの影響をさらに確認するため、回腸の上皮を透過型電子顕微鏡（TEM）を用いてスクリーニングした。注目すべきは、E. faecalisが上皮細胞のミトコンドリア数を増加させたことである（図5A）。これは、上皮のタイトジャンクションに対するE. faecalisの影響が、上皮の機能不全に関連している可能性を示す。これを探るため、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング（TUNEL）染色を行ったところ、E. faecalisはアポトーシスシグナルを有意に上昇させることがわかった（図5BおよびC）。これに伴い、上皮細胞のトランスクリプトームでは、E. faecalisがアポトーシス関連の差分遺伝子を濃縮することが示された（図5D）。特に、上皮のアポトーシスに対するE. faecalisの刺激効果は、SODによって反転した（図5A-D）。これらの結果から、E. faecalisが産生する細胞外活性酸素は、上皮のミトコンドリアを標的とし、上皮のアポトーシスを誘導することが示唆された。
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図5
ROSを産生するE. faecalisは、いずれもミトコンドリアの機能不全を誘導することで上皮のアポトーシスを促進する。A, TEM解析により、上皮細胞のミトコンドリアが増加していることが明らかになった。矢印はミトコンドリアを示す。B, TUNEL染色（n=4マウス/グループ）により、異なる腸球菌でモノコロンを形成したGFマウスの回腸遠位部におけるアポトーシスシグナルを示した。C、定量化したTUNEL染色蛍光シグナルの統計解析、不対t-test。D, 遠位回腸組織のRNA配列解析に基づくヒートマップでは、アポトーシス関連遺伝子の発現が有意に変化していた。
活性酸素産生株が腸管バリアにダメージを与えるのか、それとも細胞外活性酸素の産生を通じてダメージを与えるのかを解明するために、キサンチン・キサンチンオキシダーゼ（XXO）を用いて刺激した細胞外活性酸素が腸管バリア透過性に与える影響を、in vitro単層上皮バリアモデル（図6A）で経上皮電気抵抗（TEER）の評価により評価した。腸内細菌-活性酸素による腸関門の損傷に関する上記の知見に従い、XXO由来の細胞外活性酸素は、経上皮抵抗の低下（図6B）、単層バリアのFSA-透過性の増加（図6C）、クローディン4およびオクルディンの発現低下（サポート情報の図S5A-D）によって示されるように、腸バリアの完全性を傷つけることを見出した。SODの投与は、細胞外の活性酸素を消去することにより、腸管バリア傷害を有意に改善することが示された。
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図6
細胞外活性酸素は、ミトコンドリア機能不全に関連した上皮のアポトーシスを促進することにより、腸バリアの完全性を傷つけた。A, Caco-2細胞株のin vitro単層上皮バリアモデル。B, XXO由来の細胞外活性酸素はTEERを低下させた（n=3ウェル/グループ）。C、XXO由来の細胞外活性酸素はFSA透過性を上昇させた。D, ミトコンドリア酸化ストレスを標的としたMitoSOXプローブは、XXO由来の細胞外活性酸素で処理したCaco-2細胞でシグナルが増加した（n=6 dish/group）。E, MitoSOX蛍光シグナルの統計解析、unpaired t-test. F, Seahorse Mito Stress test。GおよびH、シトクロムCタンパク質発現のウェスタンブロッティング解析、不対t-test. I、Bax/Bcl2の相対的mRNA発現量、不対t-test. *, p<0.05; **, p<0.01.
さらに、Caco-2細胞のミトコンドリア酸化ストレスを検出するMitoSOXプローブを用いて、XXO由来の細胞外ROSがミトコンドリア機能に及ぼす影響を評価したところ、細胞外ROSがミトコンドリアの酸化ストレスを増加させることがわかった（図6D）。また、Seahorse Mito Stress Test（図6F）により、プロトンリークの増加（Supporting Informationの図S5E）、ATP産生の低下（Supporting Informationの図S5F）、予備呼吸能力の低下（Supporting Informationの図S5G）からわかるように、細胞外ROSによりミトコンドリアの誤作動を引き起こすことがわかった。さらに、細胞外ROSは、シトクロムCタンパク質レベルおよびBax/Bcl2のmRNA発現を増加させ（図6G-I）、細胞アポトーシスの促進を示唆した。SODは、ミトコンドリアの機能不全と細胞アポトーシスに対する細胞外ROSの影響を完全にブロックした。これらのデータを総合すると、腸内細菌が産生する活性酸素は、ミトコンドリアの機能不全に関連する上皮のアポトーシスを促進することによって、腸のバリアにダメージを与えることが示唆された。
考察
HFDは、腸内細菌叢の異常、宿主の代謝異常（Liら、2023）、大腸腫瘍の発生（Yangら、2022）と密接に関連しており、その中で、腸管バリアの損傷が共通していることが認識されている。しかし、腸管バリアー損傷の本質的なメカニズムは依然として不明である。研究では、脂肪酸代謝（Aspenström-Fagerlundら、2009年；Usamiら、2003年）、胆汁酸分泌（Gasalyら、2021年；Zhengら、2017年）、および炎症反応（Al-Sadiら、2008年；Luckら、2015年；Zouら、2018年）などHFD誘発腸壁損傷の基盤となるいくつかの生体過程が示されています。これらの特定のメカニズムと並行して、本研究では、より一般的な方法で腸のバリアに対するHFDのダメージを解明しました：腸内細菌叢がROSを生成して腸の酸化ストレスを誘発するのです。注目すべきことに、特定の腸の機能不全で起こる分子イベントは、主に腸の酸化ストレスと関連しており（Camilleri, 2019）、HFDに応答する微生物産生ROSが、HFDの腸バリアへの破壊作用の基盤である可能性を示しています。
先行研究では、腸内酸化還元シグナルのアンバランスは、主に免疫細胞（Grasberger et al., 2015）や上皮細胞（Chanin et al., 2020）が産生するROSに起因することが示されました。さらに、腸内細菌叢もHFDによる腸内嫌気性環境と関連しているが（Yoo et al., 2021）、それが微生物産生ROSに依存するかはまだ不明である。本研究は、細菌のROS産生能を初めて明らかにしたわけではないが、HFDが腸内細菌叢の組成を変化させることで、微生物産生ROSを促進することを明らかにした。さらに、ヒトの便サンプルから分離された系統を超えた18株の活性酸素産生能を比較し、系統学的に比較可能な菌株でありながら、様々な菌株で活性酸素産生に多様性があることを明らかにしました。
HFDが腸内細菌叢に及ぼす影響は十分に報告されているが、HFDに応答した腸内細菌叢組成の動的変化はほとんど観察されていない。今回のHFD縦断治療研究では、0日目から133日目までの腸内細菌叢組成の変化の動的な流れを規定しました。その結果、HFDは介入初日から腸内細菌叢組成を徐々に変化させ、これは腸内細菌叢組成がHFDによって連続的に変化することを示すこれまでの知見と一致しました（Zheng et al., 2017; Zhuge et al., 2022）。注目すべきは、14日目に腸内細菌叢の組成が安定に向かう傾向が見られたことです。これは、腸内細菌叢がHFDによって急速かつ劇的に変化し、その結果、新しい環境に適応して約2週間後に平衡に達することを示唆しています。興味深いことに、腸内細菌叢の急速な変化とは対照的に、HFD投与8週間後に腸管バリア透過性の破壊が観察されました。HFDが微生物が産生する活性酸素を誘導するという我々の知見と合わせると、HFDは腸内に一定量の活性酸素が蓄積された場合にのみ、腸のバリアにダメージを与えると考えられる。このことは、HFDが代謝および腸の障害に慢性的な影響を及ぼす理由を説明し、HFDの頻度に関する食事の好みについて助言してくれるかもしれません。
私たちは、私たちの研究にはいくつかの限界があることを認めます。腸内細菌叢が産生するROSに加えて、HFDは宿主の腸内細胞、すなわち大腸上皮細胞およびラミナプロプリア細胞を標的としたROS産生の促進を通じて、腸の酸化還元シグナルを乱すことも実証されています（Li et al., 2019）。しかし、腸内細菌由来のROSと宿主由来のROSのどちらがHFD誘発腸内酸化ストレスに支配的な役割を果たすかはまだ不明である。とはいえ、我々のデータでは、FMT試験とモノバクテリアコロニー化試験の両方で、ROSを産生した腸内細菌叢が無菌マウスの腸管バリアを損傷することを示し、腸内細菌叢由来のROSが腸管バリアを破壊するほど強力であることを示しています。さらに、HFDがなぜ腸内細菌叢を修飾するのかを解明する必要がある。これまで、HFDによる宿主の腸内酸化還元シグナルが障害されると好気的な環境になり、腸内細菌叢の組成が大きく変化することが研究で示されており（Yoo et al., 2021）、腸内酸化ストレスが腸内細菌叢の変化の理由であることが示唆されています。しかし、本研究では、腸内細菌叢の変質は、活性酸素による腸管バリアーの損傷よりも早く起こることが示され、相手を示しています。また、これらの知見は主にマウスや細胞培養の研究で観察されたものである。我々は、ヒトの糞便サンプルから分離したいくつかの細菌株の活性酸素産生能を検証したが、ヒトの腸内細菌叢が活性酸素を産生し、腸のバリアを損傷する同様の機能を発揮するかどうかは、臨床的にさらに確認する必要がある。
結論として、HFDに応答する腸内細菌叢は、ミトコンドリアの誤作動に伴う上皮のアポトーシスを促進することによって、腸バリアを損傷し、脂肪肝を悪化させる過剰な活性酸素を産生する可能性があることが明らかになりました。腸内細菌が活性酸素を産生するという今回の発見は、宿主生理に関与する腸内細菌の機能に関する現在の理解を広げ、HFD関連疾患の治療ターゲットとなる可能性を提案するものである。
材料と方法
実験動物およびデザイン
すべての動物実験は、南方医科大学珠江病院（中国広州市）の動物飼育研究倫理委員会の承認を得ており、すべての手順は実験動物の飼育と実験のためのガイドラインに従って行われた。雄の特定病原体フリー（SPF）C57BL/6Jマウス（6週齢）を広東医学実験動物センター（中国・広州）から入手し、12時間の明暗サイクル、温度（22～25℃）および湿度（50～70％）の制御、餌および水への自由なアクセスというSPF条件下で飼育した。マウスは、60%脂肪食（HF60、Guangdong Medical Laboratory Animal Center）に切り替えるか、標準食（Guangdong Medical Laboratory Animal Center）で維持する前に、1週間実験室の環境に慣らした。
GF C57BL/6Jマウス（6週齢）は、Sun Yat-sen University First Affiliated Hospital（広州、中国）から入手し、実験期間中はバリアフリー設備で飼育した。GFマウスへのFMTのために、HFDまたはNDを与えたSPFマウスの便サンプルを56日目に採取し、-80℃で保存した。使用に際しては、同一グループの便を混合して生理食塩水に懸濁し、100μmのストレーナー（Falcon, BD Biosciences, USA）でろ過して微生物叢以外の固体残留物を取り除き、一度洗浄してから生理食塩水に再懸濁し、経口投与によりGFマウスに投与した。GFマウスの細菌コロニー形成は、分離した細菌を回収し、血液寒天培地で嫌気条件下で培養し、生理食塩水で1×109CFU mL-1に調整し、GFマウスに経口投与した。各GFマウスに対して、200μLの菌体懸濁液を交互に3回経口投与し、十分なコロニー形成を確認した。
本研究で使用したSODは、Hangzhou Redox Pharmatech Co., Ltd.から購入したpH-、温度-、およびプロテアーゼ-安定酵素（Ms_SOD）（Meng、2018；Xuら、2021）。(Ltd.（中国・杭州市）から購入した。マウスには、毎日375UのSODを飲水で投与した。
FITC-Dextranによるin vivo腸管透過性評価
In vivoでの腸管透過性を解析するために、マウスに100 mg mL-1の濃度のFITC-デキストラン-4 kD（FD-4）（Sigma-Aldrich、米国）を、血液サンプル採取の4時間前に0.6 mg g-1 （体重）経口投与した。後眼窩静脈から血漿を採取し、蛍光を測定した（Em：485nm、Ex：528nm；BioTek Instruments、USA）。FITC-デキストランの濃度は、FD-4をPBSで連続希釈して作成した標準曲線を用いて算出した。
免疫蛍光染色
脱パラフィン、水和後、マウス回腸遠位部切片を15分間インキュベートし、抗原回収を行った。その後、ブロッキングバッファー（5％BSA）を用いて、非特異的結合をブロックした。一次抗体である抗オクルディン抗体（1:100, Abcam, UK）および抗クラウディン-4抗体（1:200, Abcam）を用いて、4℃で一晩インキュベートした。その後、切片をPBSで5分ずつ3回洗浄し、二次抗体Alexa Fluor®594 donkey anti-rabbit lgG（1:8,000, Life Technologies, USA）とブロッキング溶液で60分間、室温でインキュベートした。PBSで3回洗浄した後、最後にDAPI（Solarbio, Beijing, China）を使用して核を染色した。画像は倒立型蛍光顕微鏡（Nikon, Ti2-E, Japan）で撮影した。
ウェスタンブロッティング
マウス腸管組織および細胞溶解液は、全タンパク質抽出キット（KeyGEN BioTECH, Nanjing, China）を用いて抽出した。サンプルを18,800×g、4℃で15分間遠心分離し、上清を保持した。タンパク質濃度をBCAアッセイ（KeyGEN BioTECH）で測定し、SDS-PAGEゲルで分離し、ポリビニリデンジフルオロライド膜（Millipore、米国）に電気泳動した。メンブレンは、0.1% Tween 20を含むTBSバッファー中の5%スキムミルク（BD Biosciences）で1時間以上ブロッキングし、一次抗体はTBST中の5%スキムミルクで希釈して4℃で一晩インキュベートした。二次抗体はTBST中の5％スキムミルクで1：8,000希釈し、室温で1時間インキュベートし、強化化学発光（KeyGEN BioTECH）を用いて化学発光法を実施した。膜を露光し、イメージングシステム（Bio-Rad, ChemiDoc XRS+, USA）を用いて可視化した。相対的なタンパク質発現レベルは、ImageJソフトウェア（v.1.53a）により解析した。
qPCR解析
組織は、Trizol（Invitrogen, USA）中で、滅菌スチールボールを備えた組織ホモジナイザー（OMNI-TH）を用いて、50Hzで3分間ホモジナイズした。その後、製造者の指示に従って全RNAを抽出した。cDNAはTaKaRa逆転写試薬を用いて作成した。定量的リアルタイムPCRは、SYBR Green PCRマスターミックス（Vazyme, Nanjing, China）を用いて行い、データはRoche Light Cycler 480 IIリアルタイムPCRシステムで取得した。各標的遺伝子の相対的なmRNA発現量は、比較Ct法を用いて各サンプルのハウスキーピング遺伝子に正規化したフォールドチェンジを算出することで評価した。本研究で使用したプライマーは、Supporting InformationのTable S1に記載されている。
活性酸素量の検出
DHEを使用して、ROS産生の形で酸化ストレスを測定した。簡単に説明すると、マウス遠位回腸を凍結解剖し、30μmol L-1 DHE（Thermo Fisher Scientific, USA）と暗所で20分間、室温で直接インキュベートした。その後、核をさらにDAPIで染色した。
腸管内腔のROSを検出するために、以前に記載されたように、修正されたインビボインドシアニングリーンヒドロボレーション（ICG-H）蛍光ベースの方法を使用した（Kuhn et al.、2018）。簡単に説明すると、撮像前にマウスの腹部周辺の体毛を除去した。ICG-Hは、撮像の3時間前に6mg kg-1体重で経口投与された。マウスは、1.5％イソフルラン混合ガスを酸素流量3L min-1で吸入した後、イメージングシステム（Perkin Elmer, USA）に設置した。動物は、760nmの励起照明に続いて腹部側で撮像し、830nmの発光を記録し、Living Imageソフトウェア（Perkin Elmer）で捕捉した信号の定量分析が完了した。
スーパーオキサイドアッセイキット（Beyotime Biotechnology, Shanghai, China）を用いて、製造元の取扱説明書を改変して、糞便微生物群の活性酸素生成能を測定した。簡単に説明すると、便サンプルを新鮮に採取し、生理食塩水に懸濁し、100μmストレーナー（BD Biosciences, USA）で濾過して、固体残留物以外の微生物群を取り除き、2回洗浄して作業液に再懸濁し、マニュアルに従って作業を進めた。すべての手順は、37℃の嫌気的条件下で実施した。450nmと600nmのA値は、4-6時間まで1時間ごとに測定した。SODは、糞便微生物が産生する細胞外スーパーオキシドを確認するために使用された。
細菌の活性酸素産生能は、糞便微生物叢と同じキット（Beyotime Biotechnology）を用いて測定した。簡単に説明すると、37℃で一晩嫌気培養した細菌を採取し、生理食塩水で一度洗浄した後、A600=0.1前後の濁度で作業液に懸濁した。すべての手順は、嫌気的条件下で37℃にて行った。450nmと600nmのA値を4-6時間まで1時間ごとに測定し、細菌が産生する細胞外スーパーオキシドの確認にSODを用いた。
糞便16S rRNA遺伝子の塩基配列決定
0、1、3、14、49、56、84、105、119、133日目のSPFマウスの便サンプルを採取し、QIAamp Power-Fecal DNA Kit（Qiagen、ドイツ）を用いて製造者の指示に従い全DNAを抽出するまで-80℃フリーザーで保管した。バーコード付きプライマー514F（GTGYCAGCMGCCGCGTAA）および805R（GGACTACNV- GGTWTCTAAT）を用いて、16S rRNA遺伝子V4可変領域を増幅させた。すべてのPCRアンプリコンを混合し、Illumina NovaSeqシーケンサーを使用して配列決定した。生の配列データは、ユニークなバーコードに基づいてサンプルのペアエンドfastqファイルにデマルチプレックスされ、カスタマイズしたPerlスクリプトを使用してバーコードとプライマー配列を切り落とすことによって切り捨てられた。次に、リードは、QIIME2（Bolyen et al., 2019）のDADA2デノイズペアリングプラグイン（Version 2021.4）を使用して、次のステップを含むデノイズ処理、デレプリケーション、ASV（アンプリコン配列変異）テーブルを作成したキメラフィルタリングが行われました。ASVテーブルの配列は、Greengenes（Version 138）に基づくScikit-learnベースの分類子をあらかじめフィットさせたものを用いてQIIME2でアノテーションされました。
糞便メタゲノムシーケンス
便サンプルを採取し、使用時に-80℃のフリーザーで保存した。E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-tek, USA)を用いて、メーカーの説明書に従って糞便サンプルから全ゲノムDNAを抽出した。品質チェックされたDNA抽出物は、ペアエンドライブラリー構築のために平均約400bpのサイズに断片化された。ペアエンドライブラリーは、NEXTflex® Rapid DNA-Seq (Bioo Scientific, USA)を用いて構築しました。配列決定プライマーのハイブリダイゼーション部位を完全に含むアダプターをフラグメントの鈍端にライゲーションした。ペアエンドシーケンスは、Illumina NovaSeq (Illumina Inc., USA)で製造者の説明書に従って実施した。データは、Majorbio Cloud Platform（www.majorbio.com）の無料オンラインプラットフォームで解析した。簡単に説明すると、ペアエンドのイルミナリードはアダプターをトリミングし、低品質リード（長さ<50 bpまたは品質値<20またはN塩基を有する）はfastp (Chen et al., 2018) (https://github.com/OpenGene/fastp, version 0.20.0）によって除去された。リードは、BWA (Li and Durbin, 2009) (http://bio-bwa.sourceforge.net, version 0.7.9a) によってヒトゲノムにアライメントし、リードとその交配リードに関連するヒットは削除した。メタゲノミクスデータは、MEGAHIT (Li et al., 2015) (https://github.com/voutcn/megahit, version 1.1.2) を用いてアセンブルした。長さ≧300 bpのコンティグを最終的なアセンブル結果として選択し、そのコンティグをさらなる遺伝子予測およびアノテーションに使用した。非冗長遺伝子カタログの代表的な配列を、分類学的アノテーションのためにDiamond (Buchfink et al., 2015) (http://www.diamondsearch.org/index.php, version 0.8.35) を用いて1×10-5のe値カットオフでNRデータベースにアラインした。代表的な配列に対するタンパク質アノテーションのCOGは、e-value cutoff of 1×10-5でeggNOGデータベースに対してDiamond (Buchfink et al., 2015) (http://www.diamondsearch.org/index.php, version 0.8.35) を用いて実施しました。KEGGアノテーションは、1×10-5のe-valueカットオフでKyoto Encyclopedia of Genes and Genomesデータベース（http://www.genome.jp/keeg/）に対してDiamond（Buchfink et al., 2015）（http://www.diamondsearch.org/index.php, version 0.8.35）を使用して実施された。
RNA-シークエンス
Total RNAは、製造者の指示に従って、commensal kit (TIANMO Biotech, Beijing, China)を使用して遠位回腸から抽出された。RNAの品質評価にはAgilent 2100 Bioanalyzerを使用した。cDNAライブラリーはAgilentが提供するプロトコルに従って作成し、Illumina NovaSeq 6000プラットフォームで配列決定した。生データはFastQCを用いて品質管理し、fastp（Chen et al.、2018）で濾過した。その後、クリーンリード配列を、Hisat2（Kim et al.、2018）スプライスマッピングアルゴリズムを使用して参照ゲノムと整列し、FPKM（fragments per kilobase million）を使用して、異なる遺伝子の発現量を特徴付けました。EdgeR (Robinson et al., 2010)を用いて、遺伝子発現を定量的に算出した。 edgeRで見つかったP値<0.01、fold change≧1.5の転写物を、差次発現遺伝子として割り当てた。これらの遺伝子は、KEGGパスウェイ解析およびGO濃縮解析に使用され、P値<0.05のパスウェイは、統計的に有意とみなされた。GSEA (https://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp) を実施し、Gene Ontologyの枝の関心遺伝子セットが2群間で有意に異なるかどうかを判定した。
バクテリアの培養条件
本研究で使用したすべての細菌株は、Supporting InformationのTable S2に記載されており、血液寒天培地で37℃、嫌気性条件下で培養した。
細胞培養
ヒト結腸癌細胞株Caco-2（#HTB-37）をAmerican Type Culture Collection（ATCC）から購入し、ATCCの推奨に従って、1％Glutamax（Gibco）、1％MEM非必須アミノ酸（Gibco）、1％Sodium Pyruvate（Gibco）および15％胎児牛血清（Gibco）を添加した最小必須媒体（Gibco、米国）中で37℃、5％CO2で増殖した。
インビトロでの上皮透過性
Caco-2細胞を0.4μmの孔を有するトランスウェルインサート（Corning-costar、米国）に21日間播種し、単層完全性をTEER（Millipore、Millicells Voltmeter）により測定した。TEERは、TEER＝（Rm-Ri）×Aとして計算され、ここでRmは膜貫通抵抗；Riは無細胞培地の固有抵抗；およびAはcm2の膜面積を表す（Busa et al.、2010）。TEER値が200Ωcm-2（±10）以上であれば、バリアの完全性を表す（Erlejman et al.、2006）。FSA透過性の解析は、200μg mL-1 FITC標識fluorescein-5-（and-6）-sulfonic acid trisodium salt（Invitrogen）をトランスウェルチャンバーのアピカルに加え、基底側液を採取しマイクロプレートリーダーで測定（Em：485 nm; Ex：520 nm）。
Caco-2細胞のミトストレス試験
実験は、Cell Mito Stress Test Kit（Agilent, USA）を用いて、製造者の説明書に従い、Agilent Seahorse XFe96 Analyzerを使用して実施した。X/XO処理の3日前に、10,000個のCaco-2細胞をXF細胞培養マイクロプレート（Agilent）にコンフルエントに播種し、37℃、5％CO2のインキュベーターに入れた。細胞培養液は1日ごとに交換した。アッセイ24時間前に、細胞をX/XO（200mmol L-1/1 U）またはコントロールで処理した。アッセイの1日前に、ユーティリティプレート（Agilent）を、非CO2インキュベーター内で37℃、組織培養グレードの水で水和した。アッセイを完了する直前に、ユーティリティプレートから水を除去し、200μLの予め温められた37℃のXF Calibrant（Agilent）に置き換え、非CO2インキュベーターに1時間置いた。使用済みの培養液は、Seahorse XF DMEM Medium, pH 7. 4 (Agilent) に10 mmol L-1 グルコース (Agilent), 2 mmol L-1 グルタミン (Gibco), 1 mmol L-1 ピルビン酸 (Gibco) を補充し（以下、Agilent Complete Mediumと称する）、細胞を37℃の非CO2インキュベータで1時間静置した。ストック化合物を調製し、製造者の指示に従ってセンサーカートリッジ（Agilent）ポートにロードし、最終ウェル濃度を 1.5 μmol L-1 オリゴマイシン、1.0 μmol L-1 FCCP および 0.5 μmol L-1 ロテノン/アンチマイシン A に維持した。 Hoechst（Thermo Fisher Scientific）の後に BioTek Cytation 5（バイオテックインスツルメント）を使用してその場で細胞カウントを行い Agilent Seahorse XF Dataの標準化を行った。Mito Stress実験終了時の染色。データはWaveソフトウェア（Agilent）により解析した。
細胞のMitoSOX
ミトコンドリア酸化ストレスの産生は、ミトコンドリアスーパーオキシドインジケータMitoSOX Red（Thermo Fisher Scientific）を用いて検出した。簡単に説明すると、Caco-2細胞をガラス底の容器にプレーティングし、5μmol L-1 MitoSOX Redと共に37℃、暗所で10分間インキュベートした。核はHoechst（Thermo Fisher Scientific）で染色した。MitoSOX Redの蛍光は、レーザー共焦点顕微鏡（Leica、ドイツ）を用いて可視化した。
糞便アルブミンのELISAアッセイ
GFマウスの便サンプルを採取し、使用するまで-80℃のフリーザーで保存した。糞便を希釈（1mg：10μL）して再懸濁し、16,200×g、4℃で5分間遠心分離し、製造元の指示に従い検出用上清を回収した（Bethyl Laboratories, USA）。糞便アルブミンは、酵素結合免疫吸着法で分析した。
透過型電子顕微鏡観察
新鮮なマウス遠位回腸組織サンプルを入手し、既述のように素早く固定した（Duan et al.、2020）。簡単に言えば、遠位回腸組織を固定し、埋め込み、超薄切片を約50μmの厚さで切り出し、勾配エタノール系列で脱水し、エポキシ樹脂に埋めた。酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡（日立、日本）を用いて同定した。
統計解析
すべてのデータは、平均値±標準偏差で示した。データ解析および実証には、GraphPad Prism 9.0 ソフトウェア、Adobe Illustrator (Version 26.1) および R studio を採用した。データは、グループ間の統計的な有意差を決定するために分析された。パラメトリックデータについては、両側無対称のStudent's t-test。ノンパラメトリックデータについては、Wilcoxon rank-sum検定を使用して、グループ間の差異を比較した。0.05未満のP値は有意とした（ns, nonsignificant; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001; ****, P<0.0001）.
補足情報
サポーティング・インフォメーション
補足情報は、https://doi.org/10.1007/s11427-022-2283-4、オンラインで入手可能です。補足資料は、タイプセットや編集を行わず、投稿されたまま掲載されます。科学的な正確さと内容に関する責任は、すべて著者にあります。
謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金（81925026、82130068、82200936）および広州市脳科学重点研究計画（202206060001）の支援を受けた。
利益相反
著者は、利益相反がないことを宣言する。
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高脂肪食は腸内細菌由来の活性酸素を介し、腸のバリア機能を低下させる。

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Nianyi Zeng et al. Sci China Life Sci. 2023.
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要旨
腸管バリアの障害は、腸内細菌叢の異常と高脂肪食（HFD）に関連する代謝異常の橋渡しとなる重要なイベントである。しかし、そのメカニズムは未だ解明されていない。本研究では、高脂肪食（HFD）投与マウスと通常食（ND）投与マウスを比較し、HFDが腸内細菌叢の組成を瞬時に変化させ、その後、腸管バリアの完全性を損なうことを明らかにした。メタゲノムシークエンスにより、HFDが酸化還元反応に関連する腸内細菌機能をアップレギュレートすることが明らかになりました。これは、in vitroでの糞便微生物叢培養および内腔での活性酸素種（ROS）レベルの増加により確認され、in vivoでの蛍光イメージングにより検出されました。HFDによって誘導されたこの微生物の活性酸素産生能力は、無菌（GF）マウスへの糞便微生物叢移植（FMT）により、腸管バリアのタイトジャンクションをダウンレギュレーションして移行することができます。同様に、GFマウスに単コロニー化した腸球菌株は、他の低ROS産生腸球菌株と比較して、ROS産生に優れ、腸バリアを損傷し、ミトコンドリア機能不全と腸管上皮細胞のアポトーシスを誘導し、脂肪肝を悪化させることがわかった。組換え高安定型スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の経口投与は、HFDに対して腸内活性酸素を有意に低減し、腸管バリアーを保護し、脂肪肝を改善することがわかった。結論として、本研究は、腸内細菌に由来する細胞外活性酸素がHFDによる腸管バリア破壊に極めて重要な役割を果たし、HFDに関連する代謝疾患の治療ターゲットとなる可能性があることを示唆している。
キーワード：脂肪肝疾患、腸バリア、腸内細菌叢、高脂肪食、酸化ストレス、活性酸素。
© 2023. Science China Press.
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