マラリアはアカゲザルの腸内細菌叢を崩壊させる

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ORIGINAL RESEARCH（オリジナル研究）論文
Front. Cell. Infect. Microbiol.、2023年1月13日
第2部 細菌と宿主
https://doi.org/10.3389/fcimb.2022.1058926
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宿主-病原体相互作用：代謝の分岐点

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マラリアはアカゲザルの腸内細菌叢を崩壊させる

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Danielle N. Farinella1、Sukhpreet Kaur1、ViLinh Tran2、Monica Cabrera-Mora2,3、Chester J. Joyner3,4、Stacey A. Lapp2,3、Suman B. Pakala5、Mustafa V. Nural5、Jeremy D. DeBarry5,6、MaHPIC Consortium7、Jessica C. Kissinger5,6,8、Dean P. Jones2、Alberto Moreno2,3,9,Mary R. Galinski2,3,9 and Regina Joice Cordy1,3* （敬称略、以下同じ
1ウェイクフォレスト大学生物学部、ウィンストン・セーラム、ノースカロライナ州、米国
2エモリー大学医学部呼吸器・アレルギー・クリティカルケア・睡眠医学部門、アトランタ、ジョージア州、アメリカ合衆国
3エモリー大学国立霊長類研究センター、アトランタ、ジョージア州、アメリカ合衆国
4ジョージア大学感染症学部、ジョージア州アテネ、アメリカ合衆国
5ジョージア大学バイオインフォマティクス研究所（アメリカ合衆国ジョージア州アセンス市
6ジョージア大学熱帯病・新興国疾病センター（米国ジョージア州アセンス市
7エモリーワクチンセンター、エモリー大学、ジョージア州アトランタ、米国
8ジョージア大学遺伝学部（米国ジョージア州アセンス市
9エモリー大学医学部感染症学科、アトランタ、ジョージア州、アメリカ合衆国
これまでの研究で、マラリアの重症度や感染力と腸内細菌叢の変動との間に関係があることが示唆されているが、マラリア感染時の腸内細菌叢の時間的動態については限られた情報しか存在しない。ここでは、再発性マラリアのアカゲザルモデルを用いて、マラリアが腸内細菌叢にどのような影響を与えるかを検討した。本研究では、アカゲザルの直腸スワブから分離したDNAについて、Plasmodium cynomolgiの実験的マラリア感染期間中に16Sシーケンスを行い、一次感染と再発感染における腸内細菌分類群の存在比を解析した。また、同じ時期の動物から採取した血漿のメタボロミクスを行い、代謝経路の経時的な変化を調べました。プロテオバクテリア（ヘリコバクター科）のメンバーは、感染ピーク時に動物の腸内マイクロバイオームにおける相対量が劇的に増加し、ファーミキューテス（ラクトバチルス科およびルミノコックス科）、バクテロイデット（プレボテラス科）、スピロヘータなどがベースラインレベルと比較して減少していました。アルファ多様性指標では、寄生虫血症のピーク時にマイクロバイオームの多様性が低下し、その後、治療後に多様性が回復することが示された。健常者との比較から，急性マラリア時の直腸マイクロバイオームには，健常者の粘膜に通常存在する常在菌が豊富に存在することが示唆された．P. cynomolgiの感染ピーク時には、トリプトファン・キヌレニン免疫調節経路に有意な変化が検出されたが、これはヒトにおけるP. vivax感染との関連で以前に報告された知見である。また、再発時には、寄生虫が存在するにもかかわらず、腸内細菌叢の崩壊は少なく、炎症と臨床的重症度が低いことが示された。これらのデータを総合すると、急性感染時に起こる代謝シフトは、それに伴って腸内細菌叢もシフトし、治療後には元に戻ることが示唆される。

1 はじめに
マラリア原虫による感染は、世界的な健康問題として根強く残っており、年間2億人以上のマラリア患者と約60万人の死者を出している（世界保健機関（2021））。マラリア原虫は、数万年にわたって昆虫および脊椎動物の宿主と共進化し、軽症／無症状から重症までの感染症を引き起こす（Ewald（1983）；Watersら（1991）；Mackintoshら（2004））。特にマラリアの流行が高い地域では、部分的に免疫のある人の不顕性感染が持続的な伝播に寄与しています（Ippolitoら（2018））。腸管透過性は、腸内細菌叢および粘膜免疫系の要素と密接に関連しています。バランスのとれた腸内細菌叢は、微生物の恒常性と免疫寛容の維持に役立つだけでなく、腸管透過性に影響を与える代謝プロセスの調節にも役立ちます（Limら（2018）；Zhengら（2020））。これは、腸細胞の発達に重要な役割を果たす短鎖脂肪酸の産生への影響や、腸管バリア機能に影響を与える細菌因子によって起こり得ます。

マラリア感染時の宿主と寄生虫の関係は、宿主からの免疫反応として顕著に現れます。このような免疫恒常性からの逸脱は、マラリア感染時の宿主微生物叢組成に直接的または間接的に影響を与える可能性がある（Mukherjeeら（2020））。この逸脱は、宿主-原虫-微生物叢の間に三者間相互作用が存在し、マラリア感染の結果に影響を及ぼす可能性があるという推測につながる（Ippolito et al. 生物医学的な配列決定技術の大きな進歩により、マラリア病態生理における腸内細菌叢の役割の解明に関する研究が可能になりました。かなりの数の研究が、蚊の腸内細菌叢が、腸内の原虫コロニー形成の妨害を通じて、また、蚊の生理学の様々な側面に影響を与え、特に蚊の寿命に影響を与えることによって、マラリア感染に影響を与えることを調査している（Boissiereら（2012）；RomoliおよびGendrin（2018）；Zoureら（2020））。しかしながら、急性マラリア感染および再発エピソードに伴う哺乳類宿主の腸内細菌叢の潜在的変化に関する報告は限られている。

最近の研究では、腸内細菌叢が哺乳類における原虫感染を調節することが支持されている（Yoosephら（2015）；Villarinoら（2016）；Mukherjeeら（2020））。マウスモデルでは、腸内病原性大腸菌O86:B7によって誘導される抗α -gal抗体は、Plasmodiumスポロゾイトに対して細胞毒性を示すため、蚊に感染したPlasmodium感染からマウスを保護することが示されている（Yilmazら（2014年））。初期の研究は、疾患表現型、感染リスク、および腸内異臭に関連するマラリアと哺乳類マイクロバイオームとの双方向の関連性を示唆しています（Ippolitoら（2018年））。2015年、Mooneyらによる16S rRNA分析により、Plasmodium yoeliiの感染に伴うマウスの腸内細菌叢のディスバイオーシスが、臨床的な疾患転帰に関連することが実証されました。彼らは、マラリア寄生虫の同時感染時に非チフス性サルモネラの腸内コロニー形成に対する抵抗性の低下につながるマウスの腸内のファーミキューテス/バクテロイデス比とプロテオバクテリアの存在量の減少を観察した（Mooneyら（2015））。別の16S rRNA解析では、マウスの腸内マイクロバイオームにおいて、Plasmodium berghei ANKA感染とProteobacteriaの増加およびFirmicutesの減少が関連していた。著者らは、マウスのマラリア感染に伴う腸内マイクロバイオームプロファイルの変化が、大腸の上皮剥離や腸管透過性の上昇などの腸の病理学的変化と関連していることを示した（Taniguchi et al.（2015））。

哺乳類宿主の腸内細菌叢の変化が、宿主の免疫反応やマラリア感染症の臨床転帰に影響を及ぼす可能性が研究により示唆されています。齧歯類-P. yoeliiマラリアモデル系では、異なる業者から入手した、異なる腸内細菌叢を持つマウスは、疾患の重症度に顕著な違いを示しました。これらの違いは、感受性マウスと比較して体液性反応の上昇を示した耐性マウスにおいて、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属の存在量が増加した腸内細菌叢の特定の組成と関連していた（Villarinoら（2016年））。さらに、ヒトでは、腸内の細菌分類群ビフィドバクテリウムおよびストレプトコッカスの存在量の増加は、P. falciparum感染の低リスクと関連していた（Yooseph et al.（2015））。

宿主の微生物叢がマラリア疾患の進行に影響を与える一方で、原虫感染と疾患は宿主の微生物叢の機能と存在量にも影響を与える可能性があります。原虫感染時には、IFN-γ（Yangら（2014））およびTNF-αの増加などの宿主免疫応答が、オクルディン発現および他のタイトジャンクションタンパク質の減少につながり、膜透過性の増加を引き起こす可能性がある（Martiniら（2017））。この崩壊は、栄養素のシフトによる選択圧、または内腔への新しい分類群の導入による選択圧を引き起こし、腸内細菌叢の存在量の変化、ひいては腸内細菌叢機能の変化を引き起こす可能性がある。

微生物叢の存在量と機能の変化は、腸内および血流の代謝物量の変化にもつながる。必須アミノ酸であるトリプトファンは、原虫感染時に血流で減少することが知られており、以前から病気の重症度と関連していました（Leopoldら（2019））。腸内細菌はトリプトファンを分解して、インドール、インドールプロピオン酸、インドール酢酸などの化合物を生成することができます。トリプトファンはまた、宿主によって分解され、キノリン酸（キヌレニン経路経由）およびセロトニンを生成する（Bansalら（2010）；Liuら（2019））。これらの代謝物のいくつかは、腸管バリアの完全性に影響を与えることが知られている。例えば、インドールは、クローディンタンパク質コード化遺伝子の発現を誘導し、下流のタイトジャンクションタンパク質TJP1、TJP3、およびTJP4の発現を増加させることによって、腸管バリア保全性を改善することが示されている（Bansalら（2010））。

体内のトリプトファンのほとんどは、宿主のキヌレニン経路で分解される。この経路では、トリプトファンからキヌレニンへの反応が、ヘムを含む酵素であるトリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼ（TDO）またはインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）によって触媒される。先行研究では、IDOの発現が腸粘膜層で増加すると、胃の炎症が減少し、IDO発現菌が粘膜層に微生物的に定着することが分かっています（Larussaら（2015））。キヌレニンは強力な免疫調節因子であり、T細胞のアポトーシスとヘルパーT細胞の抗炎症性T細胞への転換を増加させる（Boros and Vecsei, 2019; Rothhammer and Quintana, 2019）。

ここでは、直腸スワブデータに基づき、マラリア再発のPlasmodium cynomolgi-rhesus macaqueモデルにおける宿主腸内細菌叢のディスバイオーシスについて説明します。マラリア未発症のアカゲザルのP. cynomolgi感染時の細菌群構造と機能の変化について、ベースラインから最初の寄生虫血症のピークまで、臨床的に軽度の再発（Joynerら（2019））；すなわち肝臓での下痢菌の活性化の結果として発症したその後の再発性寄生虫血症と比較してデータを提示します（Imwongら（2019））。また、健常なアカゲザルの公表データとマイクロバイオーム構成を比較した（Yasuda et al.（2016））。最後に、P. cynomolgi感染中のこれらの同じ動物の血流中の代謝物の時間的動態をプロファイルし、これらの感染経過中の宿主の代謝状態についてより良く理解する。

2 材料と方法
2.1 アカゲザルの研究モデルおよび寄生虫感染
アカゲザル（n=6）の直腸スワブをベースラインとP. cynomolgi感染中の経時的に分析した。この研究に割り当てられたサルは、マラリア未発症（動物コードRAd14、RBg14、RIb13、RJn13、ROc14、ROh14）、インド出身、男性、7〜13kg、5〜6歳であった。全体的な実験デザイン、P. cynomolgi M/B株スポロゾイト接種、臨床モニタリング、サンプル収集、および治療レジメンは、以前に記載されており（Joynerら（2019）；DeBarryら（2022））、そのスキームはここで図1Aに描かれています。直腸スワブはまた、全メタゲノミクスショットガン配列決定を行うために、4匹のマラリア未発症の対照アカゲザルから1回取得した。

図1
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図1 P. cynomolgi感染縦断研究中のアカゲザルの実験デザインおよび腸内細菌叢組成。(A) アカゲザルにおけるP. cynomolgi感染症の縦断的研究の実験概略図。P. cynomolgi M/Bスポロゾイト接種前の各サルのベースラインTP1Aは、残りの実験のための比較となる。特許寄生期間TP1Bは、血中の感染赤血球の漸増を表し、次いでTP2で感染のピークを示す。ピーク後のTP3では、ヘモグロビン値の低下、貧血の発症は、赤血球産生の低下または非感染赤血球の過剰な破壊（溶血）の兆候であると思われる。TP3Aは特許寄生期で、血中の感染赤血球が増加し、その後TP4で漸増する。TP5は、再発間の期間を代表するサンプルで、サブパテント寄生虫症を示す。TP7でのサブパテント寄生虫症は、顕微鏡的な閾値以下である。(B) この縦断的研究におけるアカゲザル (n=6) の腸内の優勢な細菌ファミリーの相対的存在量。使用した参照データベースはGreengenesである。

2.2 便サンプルの採取と DNA 抽出
直腸スワブ／便は、図1A（Joynerら（2019））に示すように、感染動態（ベースライン、特許寄生虫症、ピーク感染、ポストピーク、再発、サブ特許相）に基づいて選択された、予め定義されたタイムポイント（TP）で収集された。ゲノムDNAは、製造者のプロトコルに従ってPower Soil DNA isolation kit（MoBio Laboratories Inc.、Carlsbad、CA）を使用してサンプルから抽出し、さらなる下流処理のために-80℃で保存した。

2.3 マイクロバイオームライブラリーの調製と 16S rRNA 遺伝子配列の決定
細菌16S rRNA遺伝子は、超可変V3-V4領域の細菌特異的PCRプライマーを用いて増幅した（Klindworthら（2013））。増幅、バーコーディング、配列決定実験は、確立されたプロトコル（Caporasoら（2012）；Kozichら（2013））に従って行った。配列決定は、Emory UniversityのYerkes Genomics CoreのIllumina MiSeqプラットフォームで行い、2 x 275 bpペアエンドリードを得た。

2.4 16S rRNAデータのバイオインフォマティクス解析
Quantitative Insights into Microbial Ecology, QIIME 2 ソフトウェア（バージョン 2019.4）を用いて、42 サンプル（8 TP の 6 名の被験者、表 1）のリードの品質フィルタリングと全体の配列解析を実施した。Fastqファイルをマージし、デマルチプレックスし、各サンプルの配列深度を定量化した（Bolyen et al.（2019））。定義されたOperational Taxonomic unit（OTU's）は、類似度97％のGreengenes参照データベース（バージョン13.8）を使用して、分類学的同一性の割り当てのために選ばれました。その後、サンプルはQIIMEのコア多様性分析を20,387希釈深度で行い、ベータ多様性分析およびTP比較を行った。アルファ多様性指標とその比較は、Phyloseqパッケージ（McMurdie and Holmes (2013)）を使用してRで計算された。まず16Sリードの存在量を比例存在量に正規化し、各TPから各動物門の平均比例存在量を算出した(表S1)。P. cynomolgi感染時の様々なTPにおける、各被験者のファミリーレベルでの分類群の相対的な割合存在度を、Rでプロットした（図1B）。α多様性はqiime2内でフィールドで標準的な推定値を用いて計算した。Chao-1 Richness、Shannon、およびSimpson指数（Finotelloら（2018））。一元配置反復測定分散分析（ANOVA）を使用して、様々な時点におけるアカゲザル被験者間の細菌ファミリーの平均相対存在量に統計的に有意な差異があるかどうかを判断した。どの分類群が時点間で有意に存在量が増加または減少したかを特定するために、既定の基準（Kruskal-Wallis検定によるp <0.05；線形判別分析（LDA）スコア >2）と被験者のペアリングで線形判別分析効果量（LEFSe）分析を利用し、系統関係に基づくクラドグラムにプロットした（Segata et al.、2011年）。各TPは、LEfSe解析のためにその前のTPと比較された。既報の研究との比較のため、生シークエンスデータは一般に公開されているソースから入手した。実験データと安田ら（Yasuda et al. (2016)）の参照配列を1つの配列ファイルにマージし、SEPP Fragment Insertion QIIME2パイプラインを実行し、Green Genes 13.8 ツリーに挿入した。生成されたツリーに基づくUnifrac距離を使用して、主座標分析（PCoA）を実行した。PICRUSt2はOTUにおける遺伝子の機能性を推定するために使用された。QIIME2-2021.2 バージョンの PICRUSt2 プラグインを EPA-NG 配列配置と "mp" hidden-state 予測で利用した。データは、中心化対数比データ分布を作成するALDEx2を用いて解析された。対のTP解析にはBenjamini-Hochberg補正をかけたT-testを使用した。

表1
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表1 P. cynomolgi感染症の縦断研究中の7つの異なるTPにおける全アカゲザル被験者の糞便微生物叢コミュニティ指標。

2.5 種同定のためのホールメタゲノミクスショットガンシーケンス
6頭のサル感染コホートの16S解析で有意に変動したクレードから菌種を同定するために、マラリア未発症の対照アカゲザル4頭の直腸スワブDNAに対してホールメタゲノミクスショットガンシーケンスを実施した。直腸スワブからのDNAは、QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro Kitを用い、メーカーのプロトコールに従って単離した。抽出したDNAサンプルは、Qubit 4蛍光光度計とQubit™ dsDNA HS Assay Kit (Thermofisher Scientific) を用いて定量化した。各サンプルについて、1000万から2000万の高品質リードが生成された。未組み立てのシーケンシングリードを、他の場所（Hasanら（2014）；Laxら（2014）；Ottesenら（2016）；Ponnusamyら（2016））に記載されているCosmosID-HUB Microbiome Platform（CosmosID社、Germantown、MD）で直接解析し、マルチドメイン微生物園解析と抗生物質耐性および病原性遺伝子のプロファイリングと微生物の相対存在量の定量を実施した。このシステムは、キュレーションされたゲノムデータベースと高性能データマイニングアルゴリズムを利用し、数億のメタゲノム配列リードを特定の配列に由来する個別の微生物に迅速に曖昧さをなくす。これらの対照動物の腸内細菌叢で最も豊富な細菌種を特定するため、サンプル中の全細菌の相対存在量を求め、各サンプル中の各細菌の相対存在量を算出した。次に、各微生物の相対存在量の平均値を取り、4匹の対照動物で平均し、存在量の多い順にランキングした。最も存在量の多い上位20の細菌種が、感染していない健康なアカゲザルの腸内細菌叢に最も多く含まれる種であると判断された。

2.6 血漿サンプルの非標的メタボローム解析
血漿抽出および液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）分析手順は、以前に記載されたように行った（Cordyら（2019））。簡単に言うと、血漿50μlに安定同位体標識内部標準物質2.5μlをスパイクし、100μlのアセトニトリルを加えてタンパク質を沈殿させた。血漿混合物を14,000 g、4℃で10分間遠心分離した後、清浄抽出物を回収した。4℃に保たれたオートサンプラーを使用して、Thermo Fisher Scientific Q Exactive HF高磁場質量分析計に10μ lを3回に分けて注入した。LC-MSのサンプル調製前にサンプルの順番をランダム化し、順次バッチで分析用に調製した。代謝物はHILICカラム (Thermo Fisher Scientific Accucore 50 × 2.1 mm) を用いて、5分間のギ酸/アセトニトリルグラジエントでクロマトグラフィー的に分離された。エレクトロスプレーイオン化法はポジティブイオンモードで使用された。データの品質は、20サンプルごとに10μ lの品質管理サンプル (NIST SRM 1950 および内部標準) を注入することでモニターされました。生データは、apLCMS (Yu et al. (2009)) および xMSanalyzer (Uppal et al. (2013)) を使用して前処理を行い、保持時間、m/z、および強度の情報を抽出した。本原稿では、m/z フィーチャーとは、m/z と保持時間のユニークな組み合わせを意味します。前処理されたデータは、さらにComBat (Johnson et al. (2007)) を用いてバッチ効果を補正する処理を行いました。代謝の特徴は、xMSannotator (Uppal et al. (2013))を使用してアノテーションおよび同定されました。アンターゲットLC-MSホスト血漿メタボロミクスデータは、RパッケージxmsPANDA（Uppal（2021））を使用して解析されました。xmsPANDAの出力は、次に、実験サンプルと同じLC-MS機械で分析された標準化代謝物からのMS/MS情報を使用して、アノテーションpythonスクリプトを介して実行された。このアノテーションプログラムの誤差範囲は、保持時間が 30 秒、質量/電荷比が 0.02 です。代謝物データの定量には、3 回の LC-MS レプリケートの中央値を使用しました。LC-MSの強度データは、キヌレニンおよびトリプトファン代謝物の値をプロットするために使用された。トリプトファンとキヌレニンの比率分析では、検出限界以下の値は、そのTPで見られる最小値の半分として分析されました。比率分析には、paired student's t-test を使用した。

3 結果
3.1 ベースライン、初感染、および再発マラリア感染時の宿主腸内細菌群構造
マラリア感染時の腸内細菌叢を同定しカタログ化するために、縦断的P. cynomolgi感染研究（Joynerら、2019）においてベースラインおよび事前に定義したTPで得られた6匹のナイーブなアカゲザルの直腸スワブ／糞試料に由来する1,862,024本のイルミナ16S rRNAリードを解読し分析しました。フィラレベルでの配列解析は、Firmicutes、Bacteroidetes、ProteobacteriaおよびSpirochaetesが、任意のTPにおけるすべての被験者の4つの主要フィラであり、すべてのサンプルの総細菌群集の90％以上を占めた（Table S1）。すべてのTPを比較すると（図1A）、ベースライン（TP1A）と感染のピーク（TP2）の差が注目された。プロテオバクテリアはTP2による感染ピーク時に劇的に増加し、ファーミキューテス、バクテロイデット、スピロヘータなどの細菌はベースラインや他のTPと比べて減少した（図1B, 表S1）。ProteobacteriaのEpsilonに属するHelicobacteraceaeのメンバーは、ベースラインの微生物群集構造と比較して、ピーク感染時に著しく数が多かった（図1B、青色で描かれている）。ファーミキューテス門、クロストリジア綱に属するRuminococcaceaeのメンバーは、TP2によってかなり減少した（表S2）。また、バクテロイデーテス門に属するPrevotellaceaeは、TP2によって著しく減少した（図1B、表S2）。ファミリーレベルのANOVAでは、図5に示すように、HelicobacteraceaeがTP2によって有意に増加したことが明らかになった。逆に、Streptocca ceae、Lactobacillaceae、Prevotellaceae、Lachnospiraceaeなどの選択されたファミリーは、ピーク感染時に統計的に数が減少していた（図5）。アルファ多様性指標は上記の結果を支持し、感染のピーク時に多様性と豊かさ、そして均一性が低下することを確認した（表1；図2）。

図2
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図2 アカゲザルのP. cynomolgi感染時の各TPにおける腸内細菌群集のα多様性指標（Shannon、Simpson、Chao 1 richness indices）。その結果，P. cynomolgi 感染のピーク時には，すべてのパネルで，微生物多様性，豊かさ，均一性が低下していることが示された．

3.2 アカゲザルの腸内細菌多様性
6匹のサル集団から得た全42サンプルについて、97%の類似度でクラスタリングした結果、累積37,727のOTUが得られた（表1）。全サンプルについて、配列数の増加に伴い希薄化曲線（最小サンプル数でサブサンプリング）が漸近することにより、良好な配列深度が示された（図S1）。7つの実験TP全体における微生物相の豊かさと多様性を評価するために、α多様性指数を算出した。各TPの全被験者のChao 1 richness indexの平均値は、存在する細菌種の数で種の豊かさを推定するために計算された。腸内細菌群集の均等性と相対的存在度を評価するために、シャノンおよびシンプソン多様性指標を算出した（Kimら（2017））。α多様性指標に基づき、TP2での感染ピーク時には、感染のベースラインおよび再発段階と比較して、全体の糞便微生物叢の豊かさおよび多様性がかなり減少した（表1、図2）。この減少は、マラリアのピーク時に微生物の多様性が失われ、宿主の腸内環境異常につながることを示唆している。最も異なる2つのTP、1Aと2間の腸内細菌群集の類似性を評価するために、図S2に示すように、重み付きUnifrac距離に基づくPCoAプロットを使用して、ベータ多様性を調べた。PCoAプロットは、マラリア感染ピーク時の腸内細菌叢がベースラインおよび再発時の微生物叢と異なることを確認した我々の以前の結果を裏付けるものであった。本研究のTP間の腸内細菌叢の変化は、LEfSe（LDAスコア>2、p<0.05）を用いて解析した。LEfSeの結果は、TP2におけるHelicobacteraceaeの増加とFirmicutesの減少という所見を支持するものであった（図3B）。この解析はまた、最初の再発TPであるTP3A（図3D）においてLactobacillaceaeが増加していることも明らかにした。Lactobacillaceaeは、しばしば腸の健康と関連しているTurroni et al.、2014。分類群の存在量の変化は、再発感染と比較して一次感染で圧倒的に多く観察された。TP3Aと4（再発初期と再発ピーク）、TP4と5（再発ピークと再発解消）の間では、有意な変化は検出されなかった。興味深いことに、TP1B（ピーク前）とTP2（ピーク）の間で減少した28種の分類群のうち、19種がTP2（ピーク）とTP3（ピーク後）の間で増加した。これらの増加は、ピーク後の腸内細菌叢が部分的に回復していることを示している（図3C）。感染ピーク時の嫌気性粘膜細菌科HelicobacteraceaeとTissierellaceae（ほとんどのメンバーが嫌気性または耐好性）の増加。感染ピーク時に嫌気性粘膜細菌であるHelicobacteraceaeや嫌気性・好気性細菌であるTissierellaceaeが増加していることは、腸管内皮の損傷を示唆していると考えられる（図3B）。この解析の結果、粘膜菌と管腔菌のより大きな変化が注目される可能性が示された。

図3
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図3 アカゲザルのP. cynomolgi感染症の縦断的研究における、TP間の統計的に一貫した差異の分類学的表示。LDA解析によるlefSeクラドグラムは、TP間で有意に増加したクレードと減少したクレードを示している。(A)ピーク前(TP1B)では、ベースラインと比較してLactobacillusが減少し、Actinobacteria門が増加したが、その中に含まれるクレードはいずれも増加していない。(B)ピーク前(TP1B)からピーク(TP2)にかけて、28のファミリーの存在量が減少した。増加したのは2ファミリー。ヘリコバクター科とティシエラ科は、嫌気性または好気性である。(C) 感染のピーク前とピーク時で減少した多くの分類群（TPs 1B と 2）は、ピーク時とピーク後（TPs 2 と 3）で増加し、ピーク後の腸内細菌叢が少なくとも部分的に回復していることが示された。(D）乳酸菌は、ピーク後と再発初期（TPs 3および3A）の間で増加し続けている。(E）再発ピーク（TP4）、再発解消（TP5）では有意な変化は見られなかったが、再発解消（TP5および7）と比較して、サブパテントサンプルではバクテロイデス門が増加している。TP3A/TP4とTP4/TP5の比較から得られた重要でないデータは、この図には示されていない。

PCoAプロットを用いて、アカゲザルの腸粘膜・管腔マイクロバイオームの生物地理に関する既報データ（Yasuda et al.（2016））と比較しました。図6に示すように、TP2の腸内細菌叢サンプルは、先行研究の参照粘膜マイクロバイオームサンプルと一緒にクラスタリングしていることがわかった。しかし、他のTPは粘膜マイクロバイオームサンプルとも管腔マイクロバイオームサンプルとも目立った相関はないようであった。これらの結果から、マラリアのピーク時には、Helicobacter spp.などの粘膜由来のタクサが増加することが示唆された。

さらに、すべてのTPにおいて、主要な細菌群の酸素要求量プロファイルを解析した。その結果、微好気性細菌、偏性嫌気性細菌、通性嫌気性細菌の3つのカテゴリーが観察された（図S3）。興味深いことに、TP2において微好気性微生物の相対量が増加し（Solnick and Vandamme (2001); Gueneau and Loiseauxdegoer (2002)）、微好気性細菌でもあるP. cynomolgiのピーク量と一致している。

3.3 メタゲノム配列解析による微生物種の同定
腸内細菌叢で最も豊富な細菌種の同定を行うため、4匹の対照アカゲザルから採取した直腸ぬぐい液サンプルを用いて全メタゲノム配列決定を行った。ヘリコバクター科で最も豊富に見つかった細菌種は、アカゲザルの既知の常在微生物であるHelicobacter macacaeで、Yasudaらの報告などで以前に同定されているが、典型的には粘膜に付着しており内腔内容物に多く存在しないことが示された（Yasudaら（2016））。追加で同定された細菌種は、Prevotellaceaeファミリー（Prevotella copri）およびLactobacillaceaeファミリー（Lactobacillus johnsonii,Ligilactobacillus animalis,Limosilactobacillus reuteri）のメンバーだった（図 S4）。

3.4 宿主代謝解析
直腸スワブを採取したのと同じTPで同じ動物から採取した静脈血から血漿を対象に、アンターゲットメタボロミクスを実施した。LC-MSと高解像度メタボロミクスワークフロー（Cordyら（2019））を用いて、複数の代謝物の動的シフトが、感染のピーク時、TP2で発生することが示された。TP1AとTP2の間で、95の代謝物の存在量が有意に変化していることが判明した（図4A）。同じマシンで実行された参照化合物の質量電荷（m/z）比と保持時間の比較を含む既知の方法論を使用して、そのうちの7つをアノテーションすることができました（表2）。この7つのうち、キヌレニン経路の2つのメンバー、アセチルトリプトファンとヒドロキシキヌレニンが同定された。アセチルトリプトファンはTP1Bでピークに達し、TP2で有意に低下した。一方、ヒドロキシキヌレニンはTP2でピークに達し、TP3Aで有意に低下した（図4B-D、表2）。その他の代謝変化としては、寄生虫血症のピーク時にヒポキサンチンが減少し、複数の脂肪アシルカルニチンが増加することが測定された。

図4
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図4 宿主のトリプトファン／キヌレニン経路のシフトは、腸内におけるトリプトファンの微生物産生と関連している可能性がある。このデータは、赤が有意な増加を、青が有意な減少を示す、宿主メタボロームの大きなシフトを示す（A）。一次感染時の宿主代謝物サンプルのLC-MSデータ（TP1A-TP3、n=9）では、キヌリニンがTP2でピークを示し、トリプトファンがTP2で減少していることがわかる。トレンドの明確化のため、データを被験者ごとに分離し、色分けして表示しています。このキヌレニン/トリプトファン比のシフトはIDO活性を示す(B, C)。一次感染（TP1A-TP3、n=9）にわたるトリプトファン／キヌレニン比は、TP2において、宿主のトリプトファンからキヌレニンへの有意なシフト（p=0.0073）を示している（D）。スピアマン相関は、宿主キヌレニンレベルと宿主トリプトファンレベルが、一次感染全体で腸内細菌群のトリプトファン生成に関連していることを示す（p=0.0358、p=0.0499）(E)。

図5
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図5 アカゲザルの研究モデルでマラリア感染時に有意に変動する細菌ファミリーを選択。各タイムポイントにおける各ファミリーの相対的なパーセント配列存在度のデータ（平均±SE）は、一元配置分散分析反復測定（ANOVA）テストを用いて比較した（p ≤ 0.05）。P値は、1つのファミリーのすべてのTPを比較したANOVAの結果を示す。

図6
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図6 P. cynomolgiの縦断的感染から得られた腸内細菌群集を、アカゲザルの内腔および粘膜細菌多様性に関する既報のデータと、様々なTPにおいて比較したPCoAプロット。各マーカーは1つのサンプルを表し、色は異なるTPを描写するものである。PCoAは、感染ピーク時（TP2）のマイクロバイオームサンプルが、健康な管腔サンプルよりも健康な粘膜サンプルと微生物組成が似ていることを示す。

表2
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表2 xmsPANDAによって見出された重要な宿主代謝物の質量電荷比と保持時間の入力値。

3.5 機能的能力解析
16S データのみから微生物群集内の微生物の機能を予測するソフトウェアを用いて、宿主で起きている代謝変化に微生物が関与している可能性があるかどうかを評価しました。Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt2) (Douglas et al. (2020)) を用いて、各TPにおける腸内細菌群の活性代謝経路の推定を行った。これにより、TP1AとTP2の間で124の有意なMetaCycパスウェイ（t検定、p≦0.05）、TP1AとTP2の間でEnzyme Commission number（EC）により分類された592の有意な個々の予測酵素が明らかにされた。TP2で見られる宿主代謝シフトとの関連を調べるために、以前に記載したトリプトファン代謝に関連するECを特に分析したが、すべての酵素は我々のデータには存在しないか、重要でなかった。しかし、パスウェイ解析により、TP2におけるL-トリプトファン生合成経路（MetaCyc ID : TRPSYN-PWY）およびそのスーパーパスウェイ（MetaCyc ID: COMPLETE-ARO-PWY）が有意に増加し、ピーク寄生虫症を経験中のマカクの腸内細菌叢によるトリプトファン生産能力が増加した可能性が示唆された。一次感染時（TP1A-TP3）の腸内トリプトファン生合成経路の有病率と宿主トリプトファンおよびキヌレニンレベルとの関連性の可能性を評価するために、スピアマン相関を使用した。この解析により、宿主のキヌレニンおよびトリプトファンレベルは、互いに有意な相関はないものの、腸内のトリプトファン産生と高い相関があることが明らかになった（図4E）。

4 考察
マラリアの経過に伴う哺乳類宿主微生物叢に対する原虫感染の影響の可能性を理解しようとする研究は限られている（Mukherjeeら、2020）。本研究は、P. cynomolgi-Rhesus macaque感染モデルに基づき、この地平を拡大することに焦点を当てたものである。我々は、P. cynomolgi感染がアカゲザルの微生物叢の構成に一定期間影響を与えるかどうかを評価するための系統的な縦断研究を発表する。表S1に示すように、門レベルでは、寄生虫血症のピーク時（TP2）には、ベースライン時（TP1A）に比べてProteobacteriaの相対的存在比率が3倍高かった。この門には、いくつかの病原性微生物と日和見病原性微生物が含まれている。Proteobacteriaの中では、感染ピーク時にHelicobacteraceaeファミリーの数が増加し（表S2）、TP2時の腸内細菌叢の90％近くを占めた。同じ動物施設のアカゲザルの別のセット（マラリア感染していない）にショットガンシーケンスを適用して、これらの動物におけるHelicobacter属の細菌の存在を確認することができ、その種はHelicobacter macacaeであることが確認された。Helicobacter属のメンバーは主に微好気性で、大気中に存在するよりも低いレベルの酸素を含む環境を必要とし、胃のコロニー形成に関連している（Dewhirstら（2000）；Itenら（2001）；GueneauとLoiseauxdegoer（2002））。興味深いことに、Plasmodiumは微好気性でもあり、低酸素条件下で最も急速に成長する。この研究では酸素は直接測定されなかったが、この発見は、PlasmodiumやH. macacaeのような微好気性細菌の生存と複製の増加を選択するような宿主の環境における全体的な代謝変化の可能性を指摘するものである。

TP2では、Ruminococcaceae（Firmicutes門）とPrevotellaceae（Bacteroidetes門）の細菌科のメンバーが減少した。RuminococcaceaeとPrevotellaceaeの両方は、以前に腸の健康と関連付けられています（Rinninellaら（2019））。我々のデータの線形判別分析では、感染の再発段階の最初のTPであるTP3AでLactobacillusが増加することが明らかになりました。Lactobacillusは腸内環境と相関することが多く、この増加は一次感染期と再発期の間に腸内環境が良好な時期があることを示している可能性があります。HelicobacteraceaeとTissierellaceaeの細菌の増加は、腸管内腔環境が粘膜微生物にとってよりホスピタブルになったか、あるいは粘膜微生物が内皮粘膜から追い出されたことを示唆するものである。寄生虫血症のピーク時のこのような腸内環境の異常は、バランスのとれた腸内細菌群によって制御されている代謝過程を変化させている可能性がある。

我々の実験的TPデータセットを既報のデータ（Yasuda et al.（2016））と比較すると、マラリアTP2ピーク時に、腸内マイクロバイオーム試料は健常アカゲザルの参照粘膜マイクロバイオームと密接にクラスタリングすることが判明した。このクラスタリングは、原虫感染が腸内皮を損傷し、粘膜組織とそれに関連するマイクロバイオータを置き換える「sloughing off」効果を示唆するものであると考えられる。この "sloughing off "効果はまた、腸管と宿主の血流間の代謝物の交換をより可能にする膜の弱さを示している可能性がある。したがって、宿主感染が腸内細菌叢に与える影響を評価する際には、腸内細菌叢の機能経路と宿主のメタボロームの両方を考慮することが極めて重要である。

腸内細菌の機能解析の結果、H. macacaeが上昇する感染ピーク時（TP2）にはトリプトファン合成の遺伝的能力が著しく上昇し、これはTP1AからTP3にわたる感染の第一段階において宿主のトリプトファンからのキヌレニン産生の上昇と一致していた（図4B～E）。細菌のトリプトファン合成経路はトリプトファンによって負に制御されているため、宿主がキヌレニンを生成するためにトリプトファンを使い果たすと、腸内細菌叢が経路に供給するトリプトファンをさらに生成するという、興味深い可能性が考えられる。これは、急性マラリアにおける血漿メタボロームの先行研究において、キヌレニンが有意に濃縮される一方で、トリプトファンが有意に枯渇しない理由を説明し得る（Cordyら（2019））。ヘリコバクター・ピロリ粘膜感染からのエビデンスも、この仮説を支持しています。複数の研究により、H.ピロリ粘膜感染症の被験者ではIDOの発現が増強されていることが判明しています（Azadegan-Dehkordi et al.（2021））。この知見は、我々のデータで検出されたIDOのアップレギュレーションは、寄生虫血症のピーク時のヘリコバクター科細菌の増加による部分があり、おそらくH. macacaeがIDOによってキヌレニンに変換されるトリプトファンを生産する能力に関連している可能性を示唆している。TP2期間中に直腸スワブ中のヘリコバクターがどのような環境圧力で増加するのかは不明であり、したがって、この血流キヌレニン経路活性との相関は偶然かもしれないが、今後の追跡調査に値する興味深い仮説であることは確かである。これらの結果から、トリプトファンはマラリア感染時に産生される重要な代謝物であり、特に原虫-宿主-微生物叢の三者関係に関連していることが示唆された。さらに、寄生率のピーク時に検出された微生物相のシフトは、腸内細菌相が一次寄生虫症のピーク時に最も影響を受け、その後の再発寄生虫症では、その程度は低いことを示している。このことから、腸内細菌叢は、単なる寄生虫の存在よりも、宿主の急性全身代謝・免疫反応に大きな影響を受けていることが示唆された。

データの利用可能性に関する声明
本研究で発表した16SデータはSequence Reads Archive (SRA) に寄託されており、アクセッション番号はPRJNA907388である。本研究で発表したショットガンシーケンスのデータは、Sequence Reads Archive (SRA)、アクセッション番号 PRJNA907397に寄託されています。メタボロミクスデータは、MetaboLightsリポジトリ（アクセッション番号：MTBLS54265）に登録されています。

倫理に関する記述
本動物実験は、エモリー大学のInstitutional Animal Care and Use Committee (IACUC)による審査・承認を受けた。

著者による貢献
実験の構想および設計を行った。MC、CJ、SL、AM、MG、RC、およびMaHPIC-Consortiumのメンバー。実験の実施。VT、MC、CJ、SL、RC。データ解析。データ解析：DF、SK、RC。データ解析の解釈。DF、SK、RC。データセットの検証、品質管理、データおよびメタデータの寄託を管理、指導した。VT、SP、MN、JD、JK、RC。図表の作成。図版の作成：DF、SK、RC。論文執筆。DF、SK、RC。原稿の編集に貢献した。原稿の編集に協力した：MC, CJ, JD, JK, SL, AM, MG. 最終原稿は全著者が読み、承認した。

資金提供
このプロジェクトは、MaHPICを設立したNational Institute of Allergy and Infectious Diseases; National Institutes of Health, Department of Health and Human Services (Contract No. HHSN272201200031C; MG) とNational Heart, Lung & Blood Institute; National Institutes of Health, Department of Health and Human Services (Grant No. HL143112; RC) から一部資金援助を受けている。Emory NPRC Genomics Coreは、NIH P51 OD011132の一部支援を受けている。Danielle N. Farinellaは、Wake Forest Center for Molecular Signaling FellowshipおよびWake Forest Undergraduate Research Fellowshipの支援を受けている。

謝辞
著者らは、NHPを含む処置についてYNPRCの獣医スタッフに、マイクロバイオーム配列データの作成についてYerkes Genomics Core servicesとSteven BosingerおよびGreg Tharpに感謝する。また、Ken Liuによる代謝物のアノテーションに関する有益なフィードバックに感謝する。また、YNPRCは最近Emory National Primate Research Centerと改名されたことを認識したい。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

出版社からのコメント
本論文で述べられたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品，あるいはそのメーカーが行う可能性のある主張は，出版社によって保証または承認されたものではない．

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2022.1058926/full#supplementary-material に掲載されています。

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キーワード：マイクロバイオーム、マラリア、霊長類、再発、原虫、メタボロミクス

引用元 Farinella DN, Kaur S, Tran V, Cabrera-Mora M, Joyner CJ, Lapp SA, Pakala SB, Nural MV, DeBarry JD, MaHPIC Consortium, Kissinger JC, Jones DP, Moreno A, Galinski MR and Cordy RJ (2023) Malaria disrupts the rhesus macaque gut microbiome. Front. Cell. Infect. Microbiol. 12:1058926.論文番号: 10.3389/fcimb.2022.1058926

Received: 2022年9月30日; Accepted: 2022年9月30日 2022年9月30日; Accepted: 2022年12月12日。
公開：2023年1月13日

編集者

トラビス・ボレ、クレイトン大学、アメリカ合衆国
査読者：Daniel Cerqueda-García

Daniel Cerqueda-García, Instituto de Ecología (INECOL)(メキシコ)
Ghizal Siddiqui, モナシュ大学, オーストラリア
Copyright © 2023 Farinella, Kaur, Tran, Cabrera-Mora, Joyner, Lapp, Pakala, Nural, DeBarry, MaHPIC Consortium, Kissinger, Jones, Moreno, Galinski and Cordy. 本記事は、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権者のクレジットを表示し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。本規定に従わない使用・配布・複製は認めない。

*Correspondence: Regina Joice Cordy, cordyrj@wfu.edu

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は，あくまでも著者のものであり，必ずしも所属組織の主張，あるいは出版社，編集者，査読者の主張を代弁するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはそのメーカーが行う可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。

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